Você está na página 1de 27

Toxicidad del oxgeno

Prof.Dr. Hector Coirini

TOXICIDAD DEL OXGENO Y RADICALES LIBRES

LAS DOS CARAS DEL OXGENO

aplique O2. Sin embargo cuando se administra en exceso, el O2 perjudica al nio, causndole, por ejemplo, una fibropata retrolental o problemas respiratorios. Hay muchos datos que indican que el O2 es txico y lo es a cualquier concentracin. As, por ejemplo, muchos microorganismos se alejan del O2 y se estratifican dentro de un gradiente de O2 segn sus requerimientos y capacidades antioxidantes. Las plantas crecen mejor en ausencia del O2. Las radiaciones ionizantes son ms txicas en presencia de altas concentraciones de O2, siendo esta particularidad aprovechada en el tratamiento de algunos tumores cancerosos. En resumen, la utilizacin de O2 por las clulas es esencial, sin embargo algunos productos que derivan del proceso fisiolgico normal del metabolismo del O2 representan una amenaza para la homeostasis celular. Estos productos son llamados en trminos generales especies reactivas del oxgeno o EROs, y son capaces de provocar injuria celular.
CONCEPTO DE FORMACIN RADICALES LIBRES Y SU

La mayora de los organismos vivos, entre ellos nosotros, utilizan el oxgeno molecular (O2) para respirar y muchos no

podemos vivir sin l. El xito de los organismos aerbicos reside en el hecho de que gracias al oxgeno podemos extraer ms energa de los alimentos que aquella que pueden obtener lo organismos anaerbicos. Todos estos procesos se dan en el interior de la clula y se conocen como beta-oxidacin, gluclisis, ciclo de Krebs y respiracin celular. En definitiva reducimos el O2 en agua y la energa de esta reaccin, la utilizamos para formar el trifosfato de adenina (ATP). Finalmente utilizamos estas molculas energticas para, sntesis de macromolculas, para realizar todo tipo de trabajo mecnico o para transportar iones y metabolitos a travs de las membranas celulares. Aproximadamente el 80% del ATP que utilizamos se forma en las mitocondrias en donde se consume entre el 85 y el 90% del O2. Es por ello que no podemos vivir sin respirar y dado que dependemos del O2, hemos considerado a esta molcula como sinnimo de vida. Sin embargo las caractersticas del proceso de reduccin del O2 en agua, produce intermediarios capaces de generar importantes alteraciones funcionales. La gran concentracin del O2 en la atmsfera y su baja reactividad en condiciones ambientales ha generado la impresin de que el O2 es inocuo. Esta concepcin se ha extendido inclusive entre los mdicos. As, es comn que al recin nacido, sobre todo si es prematuro, se le

Los electrones de un tomo ocupan regiones del espacio denominadas orbitales atmicos. Cada orbital puede tener un mximo de dos electrones que estn apareados, y que poseen spines antiparalelos. Los radicales libres son especies qumicas de existencia independiente que poseen un electrn no apareado, es decir un solo electrn en un orbital. La presencia de este

Toxicidad del oxgeno Coirini

Prof.Dr. Hector

electrn desapareado hace que los radicales libres sean altamente reactivos e inespecficos. En frmulas, los radicales libres se representan con un punto ubicado en forma exponencial, que simboliza su electrn no apareado. Estas especies qumicas pueden formarse de tres maneras diferentes: 1.- Por ruptura homoltica de un enlace covalente de una molcula normal, siendo este el mecanismo mas comn.
. X + Y .

que en su estructura atmica presentan un electrn desapareado o impar en el en el orbital mas externo, dndole una configuracin especial que genera una alta inestabilidad. Son entonces entidades qumicas que presentan, contrario a la normal tendencia espontnea de los electrones localizados en los tomos y molculas, a la formacin de parejas con otro electrn desapareado. Esto los hace muy inestables, extraordinariamente reactivos y de vida efmera, con una enorme capacidad para combinarse inespecficamente, carbohidratos, con la diversidad de molculas integrantes de estructura celular: lpidos, protenas, cidos nucleicos y derivados de cada uno de ellos. Los orbtales moleculares mas externos

X:Y

2.- Por la prdida de un electrn de una molcula normal


A A+ . + e-

del O2 se encuentran ocupados por dos electrones no apareados, cada uno de ellos, situado en un orbital (pi) diferente formando lo que se denomina un bi-radical. Esto es, tiene dos

3.- Por la adicin de un electrn a una molcula normal.


A + e A.

electrones libres o desapareados, pero estos electrones tienen el mismo giro o spin, por lo que slo pueden interaccionar con los electrones de otros elementos y compuestos que estn libres y que tengan el giro opuesto. Esto significa que para aceptar un par de electrones de un sustrato, el O2 debe invertir el spin o giro de uno de sus electrones, lo cual requiere una gran cantidad de energa. Esta es la razn por la cual el O2 no es muy reactivo y que la materia orgnica no entra en combustin espontnea en contacto con O2. La toxicidad del O2 se explica entonces debido a la formacin de especies reactivas del oxgeno (EROs). Estas especies son derivados del O2 que son ms reactivos que ste en su estado basal.

De aqu se puede ver que los radicales libres pueden ser negativamente cargados, positivamente cargados o elctricamente neutros. Tengamos en cuenta que en la fisin heteroltica de un enlace covalente se forman iones y no radicales libres
X:Y X:- + Y+

RELACIN ENTRE LA MOLCULA DEL OXGENO Y LOS RADICALES LIBRES CELULARES

Como hemos dicho anteriormente, se consideran radicales libres a aquellas molculas

Toxicidad del oxgeno Coirini

Prof.Dr. Hector

en singulete, y las especies de oxgeno que estn Las principales son: las especies que se producen de la ruptura o de la excitacin del O2, o sea, el oxgeno atmico, el ozono y el oxgeno parcialmente reducidas, esto es, el radical superxido, el perxido de hidrgeno y el radical hidroxilo.

El oxgeno singulete (1O2:) es una forma excitada de oxgeno molecular, que se forma en determinadas reacciones en el proceso de peroxidacin de lpidos, que veremos ms adelante. espectro Esta lumnico especie (efecto qumica de puede desexcitarse emitiendo una energa dentro del quimioluminiscencia). En el presente apunte no se ahondar en el anlisis de esta especie molecular por escapar de los objetivos del mismo. Los radicales libres ms importantes presentes en los sistemas biolgicos son entonces especies derivadas del oxgeno. La mayor parte del oxgeno utilizado por el organismo humano es reducido a agua por accin del complejo citocromo-oxidasa de la

cadena

respiratoria

mitocondrial,

segn

la

reaccin global siguiente:


O2 + 4 H+ + 4e- 2H2O

Como fue explicado en clases anteriores, la reaccin se hace en cuatro pasos univalentes:
O2 O2 H2O2

.-

OH + H2O H2O

e- = electrn + H = hidrogeniones . O2 - = radical anin superxido H2O2 = perxido de hidrgeno . OH = radical hidroxilo H2O = agua

Por lo tanto la reduccin del oxgeno por la transferencia de un nico electrn produce el radical libre anin superxido (O2. )
O2 + e- O2.
-

Toxicidad del oxgeno Coirini

Prof.Dr. Hector

La reduccin del oxgeno por la transferencia de dos electrones da perxido de hidrgeno. En los sistemas biolgicos, el perxido de hidrgeno es generado a travs de la produccin de anin superxido; dos molculas de superxido reaccionan para dar perxido de hidrgeno y oxgeno
O2. + 2 H+ H2O2 + O 2

(Reaccin de Haber- Weiss)

FUENTES LIBRES

CELULARES

DE

RADICALES

Como fue mencionado, la generacin de especies reactivas de oxgeno est relacionada con la respiracin celular y otros procesos de transferencia de electrones, la regulacin de la actividad de sistemas enzimticos, la respuesta a estmulos de clulas especializadas (por ejemplo fagocitocis) y diversas situaciones de importancia en patologa y toxicologa. As, la mayor produccin mitocondrias, peroxisomas. El principal proceso biolgico que lleva a la generacin de anin superxido es la cadena de transporte de electrones a nivel mitocondrial (respiracin celular). Normalmente, la reduccin de oxgeno a agua en la cadena respiratoria requiere la transferencia secuencial de electrones, y generalmente esto se acompaa por la formacin de radicales libres. Cuando la concentracin de ADP es baja los intermediarios de la cadena respiratoria estn en estado reducido, y en esa situacin hay una gran produccin radical de es La anin a superxido. nivel de Se ha establecido que el lugar donde se produce este libre ubiquinona de anin citocromo-b.
-11

Debido a que la reaccin de dos radicales libres produce productos no-radicales, esta reaccin se conoce como reaccin de dismutacin. Puede ocurrir espontneamente (aunque de manera muy lenta) o puede estar catalizado por una enzima llamada superxido dismutasa (SOD). El perxido de hidrgeno no es un radical libre pero es considerado una especie reactiva del oxgeno. Las especies reactivas de oxgeno son un grupo de compuestos que comprenden a los radicales libres y tambin a otras especies qumicas no-radicales involucradas en la produccin de los mismos. El perxido de hidrgeno reacciona fcilmente en presencia de metales de transicin, para producir un radical libre de oxgeno muy reactivo y daino: el radical hidroxilo (.OH)
H2O2 + Fe 2+

de

radicales retculo

libres

ocurre

en y

endoplsmico

.OH + OH- + Fe 3+

(Reaccin de Fenton) Tambin el radical hidroxilo puede obtenerse a partir de la siguiente reaccin, si bien ocurre en forma ms lenta en los sistemas biolgicos
O2. + H2O 2 .OH + OH- + O2

concentracin

superxido en la mitocondrial es del orden de 10 M. Las membranas microsomal y nuclear tambin contienen sistemas de transporte de electrones, citocromos P450 y b5, los cuales

Toxicidad del oxgeno Coirini

Prof.Dr. Hector

tambin Durante

pueden la

producir del

radicales

libres. los

oxgeno, esenciales para la defensa del husped contra la bacteria invasora. Durante la fagocitosis, una oxidasa unida a membranas es activada en estas clulas, llevando a un aumento en la captacin de oxgeno y en la produccin de O2. y H2O2. Se cree que las clulas fagocticas activadas generan importantes cantidades de H2O2 y que ste es el principal compuesto responsable del potencial citotxico observado en la inflamacin tisular localizada. Adems de la generacin de perxido de hidrgeno el radical hidroxilo (.OH) tambin puede ser generado durante la fagocitosis. Este radical se produce a travs de la reaccin de Haber-Wiess o la reaccin de Fenton catalizada por hierro.
-

oxidacin

NADPH,

microsomas hepticos generan anin superxido y perxido de hidrgeno.

Numerosas enzimas citoslicas pueden contribuir a la formacin de O2. ,. OH y H2O2. Varias oxidasas estn en contienen de presentes en altas Los altas que
-

concentraciones peroxisomas concentraciones

peroxisomas. tambin enzima catalasa,

neutraliza el potencial efecto daino del H2O2. Otro sitio importante de produccin de radicales libres en se la encuentra actividad y durante la en clulas La involucradas macr6fagos, explosin fagoctica: actividad

neutrfilos respiratoria

eosinfilos.

fagoctica (burst) genera especies reactivas de

NADPH + H+
NADPH oxidasa

O2

NADP+ Bacteria

O2
SOD

H2O2 HOCl Cl-

Fe2+ Reaccin de Fenton Fe3+ OH

M I EL O PERO X I D A SA

Invaginacin de la membrana de un NEUTROFILO

Bacteria

Toxicidad del oxgeno Coirini

Prof.Dr. Hector

La enzima xantino oxidasa representa otra fuente de radicales libres. Esta enzima participa en el camino degradativo de las bases pricas, catalizando la transformacin de hipoxantina en xantina y esta en cido rico en dos pasos sucesivos de oxidacin. La amplia distribucin de esta enzima citoslica, sugiere un rol importante en las condiciones patolgicas tales como dao por isquemia de una amplia variedad de rganos, particularmente en la mucosa intestinal. La xantino oxidasa es una flavoprotena que contiene molibdeno, hierro y azufre.
xantina

liberar altas concentraciones de radicales libres al entorno. Estas enzimas utilizan iones metlicos, flavinas y otros cofactores para superar la barrera cintica impuesta por la restriccin de spin y la barrera de energa en el proceso de reduccin Los intermediarios de oxgeno que se generan, usualmente se mantienen unidos al sitio activo de estas enzimas, formando complejos metal-oxgeno, hasta que la reaccin termina. El nico que generalmente se libera es el perxido de hidrgeno. Las enzimas que catalizan reacciones que involucran oxgeno pueden ser clasificadas como oxidasas y oxigenasas. Oxidasas Las oxidasas transfieren electrones al oxgeno, el cual es reducido a agua o perxido de

O HN O N H O HN O N H N N H
urato

N N H + H2O MoVI S-Fe2+ O2

hidrgeno. Un ejemplo de este tipo de enzimas es la Citocromo C oxidasa, el complejo terminal de la cadena de transporte de electrones. Esta enzima cataliza la reduccin del oxgeno a agua. En la reaccin el oxgeno se une al in Cu++ y al Fe++ del hemo en el sitio activo, superando as la restriccin de spin. En una primera etapa se le transfieren dos electrones, dando perxido de hidrgeno; y luego, con la transferencia de otros dos electrones, se reduce finalmente a agua. Este mecanismo permite que la reaccin ocurra de manera controlada, sin la interaccin entre radicales libres de oxgeno y otros componentes de la cadena respiratoria adyacentes. La mayora de las oxidasas de la clula forman perxido de hidrgeno en vez de agua. Estas enzimas estn generalmente en peroxisomas o mitocondrias, donde el perxido de hidrgeno es removido por catalasas o peroxidasas.

MoIV O + 2 H+
-

S-Fe3+

O2

.-

Fuentes adicionales de formacin de radical superxido son las reacciones de autooxidacin no enzimtica de la ubiquinona, catecolaminas y tioles, y el transporte y captacin de oxgeno por hemoglobina y mioglobina. El aporte de radical superxido de todas estas fuentes es mucho menor que el que corresponde a la cadena de transporte de electrones mitocondrial.
REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS CON OXGENO MOLECULAR COMO SUSTRATO

Las enzimas que utilizan oxgeno corno sustrato pueden reducirlo de una manera controlada sin

Toxicidad del oxgeno Coirini

Prof.Dr. Hector

Oxigenasas: Las oxigenasas incorporan oxgeno al sustrato; monooxigenasas son aquellas que incorporan un solo tomo de oxgeno al sustrato y reduce el otro a agua mientras que las dioxigenasas incorporan ambos tomos de oxgeno. Las monooxigenasas, llamadas tambin hidrolasas, requieren de un sustrato que done electrones, como por ejemplo NADPH; una coenzima como el FAD que puede transferir un nico electrn, y un metal o compuesto similar para formar un complejo con el oxgeno. Citocromo P450: Se llaman as a un conjunto de monooxigenasas relacionadas estructuralmente, que hidroxilan muchos compuestos fisiolgicos, tales como esteroides y cidos grasos, y muchos compuestos xenobiticos tales como drogas o agentes carcingenos. Como otras monooxigenasas incorporan un tomo de oxgeno en el sustrato, el cual se hidroxila en este proceso, con la formacin simultnea de agua. El donor de electrones usualmente es el NADPH. Dioxigenasas: Se encuentran, generalmente en el camino metablico que convierte cido araquidnico en prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos. Tambin, catalizan reacciones de ruptura de enlaces Carbono - Carbono en la degradacin de aminocidos.
ESPECIES REACTIVAS DE OXGENO Y DAO A BIOMOLCULAS

colisionan con una biomolcula, le sustraen un electrn, oxidndola, perdiendo de esta manera la biomolcula su funcin especfica en la clula. Si se trata de los lpidos (en particular los formados por cidos grasos polinsaturados), se daan las estructuras ricas en ellas como las membranas celulares y las lipoprotenas. En las primeras se altera la permeabilidad conduciendo al edema y la muerte celular y en las segundas, las oxidaciones producidas principalmente sobre las LDL, resulta en la gnesis de la placa ateromatosa como veremos mas adelante. En caso de las protenas se oxidan preferentemente los aminocidos (fenilalanina, tirosina, triptofano, prolina, histidina, arginina, cistena y metionina) y como consecuencia se forman entrecruzamientos de cadenas peptdicas, fragmentacin de la protena y formacin de grupos carbonilos, impidiendo de el normal desarrollo de las funcio-nes de estas protenas (transportadores inicos membranas, receptores y mensajeros celulares, enzimas que regulan el metabolismo celular, etc.). Otra molcula que es daada por los radicales libres es el ADN; el dao a los cidos nucleicos produce bases modificadas, lo que tiene serias consecuencias en el desarrollo de mutaciones y carcinognesis por una parte, o la prdida de expresin por dao al gen especfico. Los radicales libres pueden entonces ejercer efectos tiles o nocivos para el

En 1954 una investigadora argentina, Rebeca Gerschman, sugiri por primera vez que los radicales libres eran agentes txicos y generadores de enfermedades. Por la alta inestabilidad atmica de estas sustancias cuando

organismo. As, vimos anteriormente que la produccin de estos compuestos es fundamental en el proceso de fagocitosis. Adems, algunas reacciones del organismo se producen por un

Toxicidad del oxgeno Coirini

Prof.Dr. Hector

mecanismo en el que se forman especies radicales pero que rpidamente ejemplos son son las

hidrgeno. Las EROs que pueden producir la prdida de estos hidrgenos son el radical hidroxilo ( OH) y el radical peroxilo. Las caractersticas de la oxidacin lipdica por radicales libres, provoca una reaccin en cadena en la que el cido graso al oxidarse, se convierte en un radical de cido graso con capacidad de oxidar a otra molcula vecina. Este proceso es conocido como peroxidacin lipdica, generando numerosos subproductos, entre ellos el malondialdehdo, cuya determinacin en tejidos, plasma u orina es uno de los mtodos de evaluar el estrs oxidativo. La formacin de radicales libres
.

neutralizados,

algunos

reacciones de la ciclooxigenasa o de la tromboxano numerosos sintetasa. los efectos Sin embargo, que son estos

nocivos

compuestos pueden causar en el organismo. Es por ello, que se han desarrollado diversos sistemas de defensa contra las especies reactivas de oxgeno. Cuando existe un aumento en la formacin de los radicales libres o una

disminucin de los sistemas de defensa aparece una situacin metablica denominada estrs oxidativo. Protenas, lpidos, carbohidratos y cidos nucleicos estn sujetos a daos causados por especies reactivas de oxgeno. Son

peroxilo requiere la presencia de un iniciador (tal como el radical hidroxilo) para comenzar la reaccin en cadena. La peroxidacin usualmente empieza con la produccin local del radical hidroxilo a partir de perxido de hidrgeno, mediada por . 2+ Fe , este radical libre ( OH), es el responsable de la extraccin de un tomo de hidrgeno unido a un carbono entre dobles enlaces conjugados (presentes en los cidos grasos insaturados) lo cual da inicio a la reaccin en cadena. La

numerosas las patologas que han sido asociadas a estrs oxidativo. Este proceso ocurre cuando las especies reactivas de oxgeno son producidas ms rpido de lo que son removidas por las defensas celulares y como veremos mas adelante estos mecanismos de defensas incluyen a ciertas enzimas y vitaminas.
FORMACIN DE RADICALES LIBRES DE LPIDOS Y LIPOPERXIDOS

formacin de un radical lipdico sobre un tomo de carbono provoca un reordenamiento de la molcula con cambios en lo dobles enlaces presentes. Una vez generado un el radical sobre un tomo de carbono en un cido graso, ste reacciona con el O2 para formar un radical peroxilo

Las membranas celulares contienen fosfolpidos que contienen cidos grasos con varios dobles enlaces. Estos cidos grasos poliinsaturados son ms sensibles a la oxidacin que los cidos grasos saturados o los monoinsaturados porque los metilenos (CH2) entre dos dobles ligaduras pueden perder fcilmente un

Toxicidad del oxgeno Coirini

Prof.Dr. Hector

Propagacin: Que implica la formacin de radicales peroxilo (radical de cido graso centrado en oxgeno) por interaccin del radical de cido graso centrado en carbono con oxgeno molecular que contina con la captura por este radical de un hidrgeno de otro resto de cido graso dando dos productos, el primero un hidroxiperxido lipdico (con caractersticas distintas del cido graso inicial) y un nuevo radical centrado en carbono que continuar con la secuencia de reacciones. El radical peroxilo puede obtener un hidrgeno allico proveniente de otro metileno de una cadena de cido graso cercana lo cual propaga la reaccin iniciada por el radical hidroxilo. As la formacin de una ERO puede generar muchos lipoperxidos. Los lipoperxidos se pueden reducir mediante glutatin peroxidasas de fosfolpidos o ser eliminados por la accin de fosfolipasas como la fosfolipasa A2, la cual se ha observado aumentada durante el estrs oxidativo. Por lo tanto a modo de resumen siguientes procesos: Iniciacin: La cual consiste en la remocin de un tomo de hidrgeno de una cadena de cido graso insaturado por accin del radical hidroxilo para formar un radical de cido graso centrado en carbono.
LH + OH L + H2O
. .

L + O2 LOO
.

. .

LOO + LH LOOH + L

(LOO = radical peroxilo, LOOH = hidroxiperxido lipdico) Terminacin: Consiste en la interaccin de radicales peroxilo con radicales centrados en carbono, lo que produce la formacin de hidroxiperxidos lipdicos y lpidos con mayor grado de insaturacin (mayor nmero de dobles enlaces). Tambin es posible la interaccin de radicales centrados en carbono con las defensas antioxidantes del organismo, lo que regenera el

la

lpido original con gasto del antioxidante.


. .

peroxidacin lipdica puede dividirse en los


LOO + L
.

LOOH + LH con una nueva


insaturacin .

L + vitamina E LH + vitamina E
.

L + vitamina E. LH + vitamina E oxidada

La descomposicin de lpidos durante el proceso de peroxidacin lipdica implica la ruptura de la cadena hidrocarbonada del cido graso afectado. Entre los productos de descomposicin se encuentran el malondialdehido y el 4-hidroxi-2nonenal.

(LH= cido graso, L = radical libre centrado en carbono)

Toxicidad del oxgeno Coirini

Prof.Dr. Hector

capaces

de

formar

entrecruzamiento

entre

cadenas polipeptdicas y de esta manera inactivar

Y o o
Malondialdehido

muchos constituyentes celulares, incluyendo membranas y enzimas.

X
O OH

Como una proteccin contra estos compuestos altamente txicos, la clula est dotada de mecanismos detoxificantes. Por

Lipoperxido degradado

ejemplo, el malondialdehido puede ser oxidado en mitocondrials por accin de la enzima aldehido deshidrogenasa.

O CH3 H OH 4-hidroxi-2-nonenal

DAO OXIDATIVO A PROTENAS

Las especies reactivas de oxgeno, actuando en conjunto con metales (hierro, cobre) pueden oxidar protenas. Esta oxidacin puede ser de tipo especfica o no-especifica. Un ejemplo de stas ltimas es la oxidacin por La peroxidacin de las molculas radiaciones que generan un nmero importante de radicales libres, que difunden rpida y fcilmente dentro de la clula reaccionando con distintos grupos funcionales de las protenas. En particular, los restos prolina, histidina, arginina, cistena y metionina de las protenas son particularmente sensibles al dao oxidativo. La oxidacin especfica ocurre en aquellas protenas que tienen sitios de unin a metales (Mg2+ , Ca2+ , Zn2+). Estos metales pueden ser reemplazados por Cu2+ Fe2+, los cuales pueden generar especies reactivas de oxgeno, que atacarn a aminocidos cercanos. Un ejemplo muy caracterstico de este tipo de mecanismo es la oxidacin de la glucosa-6fosfato deshidrogenasa, que es rpidamente

lipdicas invariablemente cambia o daa la estructura molecular del lpido. En caso de ser un lpido de membrana, el aumento de la hidrofilicidad del producto de la peroxidacin altera la estructura de la bicapa y sus funciones. Los principales cidos grasos que sufren peroxidacin en la membrana celular son los cidos linoleico, araquidnico, docosahexaenico. Adems, la peroxidacin de lpidos es una fuente importante de productos txicos para la clula, tales por la como el malondialdehido de los producido descomposicin

hidroperxidos. Por ejemplo el 4-hidroxinonenal, el principal producto de degradacin de la peroxidacin del 1,6 araquidnico es citotxico y mutagnico. Ms an, estos aldehdos son

10

Toxicidad del oxgeno Coirini

Prof.Dr. Hector

inactivada

de

manera

irreversible Fe2+.

por

conduce a la formacin de grupos carbonilo. As, la determinacin de estos grupos funcionales dentro de la clula puede ser un mtodo para

concentraciones muy bajas de H2O2 y

Otro ejemplo de dao a protenas es la oxidacin de la glutamina sintetasa. Esta enzima es oxidada a nivel de histidina y arginina, localizados en el sitio activo, en forma conjunta por el Fe2+ y el perxido de hidrgeno.

evaluar el dao a protenas. Otra consecuencia de la oxidacin de protenas es la ruptura de la cadena peptdica o en entrecruzamiento de cadenas. Por otro lado, se ha determinado que las protenas oxidadas son ms fcilmente

degradadas por proteasas La oxidacin de algunos restos

aminocidos como arginina, lisina o prolina,

Me++

Fe++

Fe++

H 2O 2

Se ha demostrado un aumento de parmetros que indican dao oxidativo a protenas (aumento de C=O, inactivacin de glutamino sintetasa o glucosa-6-fosfato-

considerablemente con el estrs oxidativo. En muchas clulas se generan modificaciones en las bases del ADN cuando se les aade H2O2. Esto se debe en gran parte a los metales de transicin, fundamentalmente al Fe2+, que se encuentran unidos al ADN y que en presencia del H2O2 generan el radical OH que modifica las bases del mismo. El OH puede atacar tanto las purinas como las pirimidinas, as como la desoxiribosa y adems generar rupturas en el ADN. La reaccin de radicales libres con los azcares del ADN puede traer como consecuencia la fragmentacin del azcar, la prdida de una base con parte de este residuo hidrocarbonado y el corte de la cadena (ver esquema).
. .

PROT EA SA S

Aminocidos

deshidrogenasa, actividad de proteasas, etc) en un nmero considerable normal, restriccin de patologas: de

Envejecimiento Alzheimer,

enfermedad

calrica-proteica, reumatoidea,

isquemia-reperfusin, cataratas, etc.

artritis

DAO OXIDATIVO A CIDOS NUCLICOS

En el ADN ocurre, a una tasa baja pero continua, la prdida de bases, la desaminacin de la citosina en uracilo y de la 5metilcitosina en timidina y la ruptura de una o las dos hebras del ADN. Estas alteraciones se incrementan

11

Toxicidad del oxgeno Coirini

Prof.Dr. Hector

R O
-O

3'

R O O
-O

3'

Cuando hay rupturas en el ADN se activan las polimerasas de poli-ADPribosa (PARP) que
O

P O

P O

unen residuos de ADPribosa formando cadenas


H C H C C H

H2C

BASE Radicales Libres

CH2 - COO-

BASE

ramificadas, unidas a residuos de glutamato de la propia PARP y de algunas protenas que estn asociadas con el ADN. El sustrato de la poliADP-ribosilacin es el NAD+ celular que se consume rpidamente. La glicohidrolasa de la poli-ADP-ribosa despolimeriza simultneamente el polmero por lo que la reaccin slo dura unos cuantos minutos. Muchas protenas nucleares se unen a los polmeros de ADP-ribosa de dichas protenas lo cual modifica su actividad. Se piensa que esta reaccin facilita la accin de los mecanismos de reparacin de las rupturas en el ADN. Hay mecanismos de reparacin especficos que sustituyen las bases mal apareadas, oxidadas, desaminadas o que aaden la base faltante y otros que degradan un tramo de nucletidos en una hebra alrededor de la regin alterada y luego una polimerasa de ADN y una ligasa de ADN reparan el tramo. En el hombre se conocen varias enfermedades, como el xeroderma pigmentoso, la ataxia telangectasia y el sndrome de Bloom, en las cuales estn afectados algunos de estos mecanismos de reparacin del ADN.

O
-O

OO
-O

O O

P O R'

P O

5'

R'

5'

En condiciones de estrs oxidativo las protenas que normalmente estn unidas al ADN pueden generar uniones covalentes con l, por ejemplo, una unin entre una tirosina y una timina. Asimismo, los lipoperxidos pueden reaccionar con el ADN y modificarlo. El ADN de las mitocondrias y del cloroplasto tambin se modifican. De hecho, el ADN mitocondrial de los animales generalmente presenta un mayor nmero de modificaciones que el ADN nuclear. Los cambios en las bases nitrogenadas pueden generar mutaciones cuando se duplica el ADN. Por ejemplo, la 8hidroxiguanina puede hacer puentes de hidrgeno con una adenina en vez de con una citosina y la 8hidroxiadenina con una guanina en vez de con una timina.

Ejemplos de algunas de las lesiones causadas por las especies reactivas de oxgeno a las bases

12

Toxicidad del oxgeno Coirini

Prof.Dr. Hector

O HN O N H CH3 N

NH2 N HN H2N

O N

N H

N H

T imina

Adenina

Guanina

Especies React ivas

de

Oxgeno
O

O HN O N CH3 OH OH H HN

NH2

H N NH

O C H H2N HN

H N O

N H

Timina

glicol

formamido

pirimidina

8 - oxoguanina

El avance en la qumica de los radicales El ataque sobre las bases conduce a una alteracin de la misma, como puede verse en el esquema. Puede llegar a observarse rotura de simple y doble cadena. Timina y citosina son las bases ms susceptibles al dao por .OH, seguido por adenina y guanina. La susceptibilidad del ADN al dao oxidativo depende adems, de la complejidad de la molcula. Por ejemplo, el libres indica que no hay sustancia biolgica que est exenta del ataque de estos compuestos. Por lo tanto, no resulta sorprendente el hecho que la glucosa y otros monosacridos relacionados pueden sufrir oxidacin en condiciones determinadas. Se ha demostrado que la glucosa puede servir como un atrapador de radicales .OH, siendo as oxidada. Tambin se ha descripto que el manitol y deoxiazcares reaccionan fcilmente con radicales libres. El cido hialurnico, principal ADN doble hlice es menos susceptible a la injuria oxidativa que el ADN aislado. Se sabe que las explosiones atmicas estn acompaadas por la emisin de radiaciones ionizantes, las que provocan la formacin en los tejidos de grandes cantidades de radicales libres. Estos compuestos, por lo tanto, pueden daar al ADN.
DAO OXIDATIVO EN LOS CARBONO HIDRATOS DE

proteoglicano del fluido

que

mantiene en

la las

viscosidad

sinovial

articulaciones, es un glicosaminoglicano que contiene unidades repetidas de glucurnico y Nacetil-glucosamina. Se ha descripto, que luego de una exposicin a radicales libres, como puede ocurrir en un proceso inflamatorio, el cido hialurnico se fragmenta, y en consecuencia hay una desestabilizacin del tejido conectivo y una prdida de la viscosidad del fluido sinovial. Aquellos carbohidratos con una estructura de hidroxi-aldehido pueden enolizarse en la

13

Toxicidad del oxgeno Coirini

Prof.Dr. Hector

presencia de iones para transformarse en cetoaldehdos. fisiolgicas Algunos para monosacridos formar simples
SISTEMAS PRIMARIOS DE DEFENSA

sufren fcilmente autooxidacin bajo condiciones compuestos decarbonilicos y perxido de hidrogeno. La importancia de la autooxidacin de la glucosa y compuestos relacionados se centra en el hecho que estas molculas activadas pueden interaccionar con otras molculas, formando nuevas estructuras. Un ejemplo de este caso podra ser la glicosilacin no especfica de protenas.

Antioxidantes Son sustancias que reaccionan con radicales libres transformndolos en especies no radicales y convirtindose en radicales del antioxidante, que por su estructura qumica suelen ser muy estables y no propagan la reaccin. Muchas veces se regeneran por accin enzimtica, volviendo a adquirir su capacidad antioxidante. Entre ellos se encuentran: 1- Vitamina E: La vitamina E es el antioxidante ms ampliamente distribuido en la naturaleza, ya que se lo encuentra tanto en el reino animal como vegetal. El trmino genrico vitamina E se refiere al menos a 8 ismeros estructurales del tocoferol. Entre estos, el alfa-tocoferol es el ms conocido dado que presenta la ms potente actividad antioxidante. Debido a su propiedad lipoflica, la vitamina E acta fundamentalmente en un entorno lipdico, por ejemplo en las lipoprotenas plasmticas (forma parte de las LDL) y en las membranas. Altas concentraciones de tocoferol se encuentran en determinados tejidos como por ejemplo glndula adrenal, corazn, testculos e hgado. En el interior de la clula, la vitamina E est asociada a las membranas mitocondriales y del retculo endoplsmico. Por lo tanto, la accin antioxidante de esta vitamina es altamente efectiva para proteger a las membranas de la lipoperoxidacin lipdica reaccionando con radicales hidroxilo y peroxilo.

SISTEMAS DE DEFENSA CONTRA EL DAO OXIDATIVO

An normales, la incesantemente

bajo

condiciones o

fisiolgicas celular est por

homeostasis atacada

desafiada

estresores provenientes del medio interno o externo. Para defenderse de estos estresores, la clula ha desarrollado mecanismos de proteccin. La principal amenaza a la homeostasis celular en los organismos aerbicos deriva del metabolismo del oxgeno, que genera especies reactivas que producen dao a las diversas estructuras (protenas, lpidos y ADN), an en condiciones fisiolgicas. Evolutivamente, se han desarrollado sistemas de defensa que son mecanismos que tienden a neutralizar el efecto oxidativo del oxgeno y sus metabolitos y que generalmente se denominan sistemas antioxidantes. Estos sistemas de defensa se clasifican en primarios y secundarios, de acuerdo a sus funciones de prevencin y reparacin del dao producido, respectivamente.

14

Toxicidad del oxgeno Coirini

Prof.Dr. Hector

2- Vitamina C: En contraste a la vitamina E, la vitamina C o cido ascrbico es hidroflico y funciona mejor en un ambiente acuoso. Como agente reductor y antioxidante, la vitamina C reacciona con O2-. y
.OH

La semiquinona puede transformarse nuevamente en quinona por la cadena de transporte de electrones.

varios puede

hidroperxidos vitamina E.

lipdicos.

Adems

regenerar la propiedad antioxidante de la

La vitamina E y la vitamina C puede actuar en conjunto. Ej:


LOO. + vitamina E LOOH + vitamina E.

3- Vitamina A: Durante mucho tiempo los carotenoides han sido considerados antioxidantes debido a su capacidad de atrapar radicales libres. Protege a los lpidos contra la peroxidacin inducida principalmente por la xantino oxidasa.

vit E. + ascorbato semi-dehidro-ascorbato + vitamina E

La vitamina C est ampliamente distribuida en tejidos de mamferos y se encuentra presente en cantidades relativamente elevadas en glndulas adrenales e hipfisis. En menor concentracin, se la encuentra en hgado, bazo, pncreas y cerebro. 4En la mitocondria es posible que la vitamina E sea regenerada por reaccin con la ubiquinona
vitamina E. + CoQH2 vitamina E + CoQH.

Glutation: El tripptido glutation (GSH)

(gamma glutamil-cisteinil-glicina) es el tiol de bajo peso molecular ms abundante en casi todas las clulas de mamferos. La concentracin intracelular varia entre 0,5 mM y 5 mM pero en ciertas ocasiones puede alcanzar una concentracin de l0 mM. El glutation reducido se caracteriza por su grupo tiol (-SH) muy reactivo

15

Toxicidad del oxgeno Coirini

Prof.Dr. Hector

y su enlace gamma glutamilo que lo hace resistente al ataque por peptidasas. Sus propiedades fsico-qumicas le permiten servir como nuclefilo y como reductor interactuando con numerosos compuestos electroflicos y oxidantes tales como O2 H2O2 y .OH. El glutation contribuye a mantener reducido los grupos sulfhidrilos de protenas y es una defensa contra la accin de las especies Dada la gran actividad de biliverdina reductasa en la mayora de los tejidos, prcticamente no se encuentra biliverdina, sino bilirrubina. Siempre se consider a la bilirrubina como un producto de desecho, cuya acumulacin en ciertas regiones cerebrales puede producir transtornos graves en el recin nacido (kemicterus), dado que el sistema de conjugacin de la bilirrubina es inmaduro. Por ello la mayor parte de la bilirrubina se elimina del organismo, sin embargo pequeas cantidades quedan en el organismo. Recientemente se ha comprobado que reactivas del oxgeno teniendo un rol de importancia en una variedad de procesos de detoxificacin. Adems es capaz de regenerar la vitamina E a su forma activa
L. + vitamina E LH + vitamina E. vitamina E. + GSH vitamina E + GS. 2GS. GSSG GSSG + NADPH + H+ 2 GSH + NADP+
-

hemo + O2 + NADPH + H+ Fe3+ + CO + NADP+ + biliverdina

(hemo-oxigenasa)
biliverdina + NADPH + H+ bilirrubina + NADP+

(biliverdina reductasa)

esas

pequeas

cantidades

de

bilirrubina,

constituyen una defensa muy efectiva contra las EROs. En el cerebro, la bilirrubina resulta un agente protector contra la lipoperoxidacin desencadenada por el H2O2. Durante la reaccin con el agente oxidante, la bilirrubina se oxida a biliverdina, pero teniendo en cuenta la alta actividad de la biliverdina reductasa, se vuelve a transformar de en bilirrubina desencadenado inmediatamente, por grandes permitiendo de esta manera controlar el proceso

5- Bilirrubina: Es el principal producto del catabolismo del hemo. Como se ver mas adelante (Metabolismo del Hemo), la bilirrubina se produce por accin de la hemo-oxigenasa, que transforma el hemo en monxido de carbono, Fe3+ y biliverdina, la cual por accin de la biliverdina reductasa, es convertida en bilirrubina

oxidacin

cantidades de EROs a pesar de que la bilirrubina se encuentra en concentraciones muy bajas.


bilirrubina + agente oxidante biliverdina + agente oxidante inactivado

16

Toxicidad del oxgeno Coirini

Prof.Dr. Hector

biliverdina + NADPH + H+ bilirrubina + NADP


+

actualmente se ha reconocido su capacidad como antioxidante, ya que se ha demostrado que capta


.OH. El mecanismo de accin no est an

6- Melatonina: Este compuesto es la principal hormona sintetizada por la glndula pineal

totalmente preservando

aclarado, el debido

se a

cree la

que

acta de

ascorbato

plasmtico, formacin

probablemente

complejos con metales de transicin como hierro y cobre. Otros investigadores han propuesto que el cido rico activa la sntesis de prostaglandinas iniciada por el araquidnico. Sistemas enzimticos que intervienen en el metabolismo de las EROs 1- Superxido dismutasa (SOD): La superxido Adems de cumplir funciones dismutasa es una metalo-enzima que cataliza la dismutacin del radical superxico (O2-.)
O2-. + O2-. H2O2 + O2

relacionada con los ritmos circadianos, se ha demostrado que la melatonina tiene propiedades antioxidantes, que se ejercen a dos niveles: En primer lugar acta como atrapador de radicales libres en forma directa permitiendo la regeneracin de la vitamina E. En segundo lugar, se comprob que la melatonina es capaz de inducir en el cerebro a una de las enzimas que metabolizan EROs la glutation peroxidasa (ver mas adelante). Tambin la melatonina presenta la capacidad de aumentar la produccin de NADPH por activacin de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. Recordemos que el NADPH es cofactor en la generacin de bilirrubina a partir de biliverdina y en la reduccin del glutation. Adems, la melatonina inhibe la produccin de otro radical libre de importancia biolgica, el xido ntrico (NO). 7- cido rico: Tradicionalmente, el cido rico se lo considera un producto del metabolismo de degradacin de purinas. Sin embargo

Se conocen tres clases distintas de enzimas intracelulares las cuales dependen del ion metlico que asociado: Cu/Zn SOD; Mn SOD y Fe SOD. La mayor actividad se localiza en la mitocondria (Mn SOD, tetrmero) y en el citoplasma (Cu/Zn SOD, dmero). La actividad de SOD presenta diferencias entre los diferentes tejidos. La mayor actividad se encuentra en hgado, glndula adrenal, rin y bazo. 2- Catalasa: Esta enzima cataliza la conversin de perxido de hidrgeno en agua
2 H2O2 2 H2O + O2

El hgado, rin y glbulos rojos poseen altas concentraciones de catalasa. Esta enzima se encuentra predominantemente en peroxisomas, pequeas organelas que adems contienen

17

Toxicidad del oxgeno Coirini

Prof.Dr. Hector

oxidasas que producen perxido de hidrgeno. Existe una rara alteracin gentica denominada acatalasemia, caracterizada por el dficit casi completo de la enzima catalasa. La sintomatologa es casi nula, indicando que presumiblemente otros mecanismos de defensa compensan la falta de esta enzima. 3- Glutation Peroxidasa: Esta enzima cataliza la reduccin del perxido de hidrgeno y de hidroperxidos orgnicos, utilizando al gutatin como agente reductor.
2 GSH + H2O2 GSSG + 2 H2O 2 GSH + LOOH GSSH + H2O + LOH

La enzima esta localizada tanto en citoplasma como en la mitocondria. Hay dos tipos de glutation dependiente especificidad peroxidasa: de de dependiente Poseen La y no selenio. sustrato. diferente peroxidasa

dependiente de selenio es citoslica y tiene una baja capacidad para la reduccin de H2O2. La enzima independiente de selenio utiliza hidroperxidos orgnicos preferentemente.

Esquema que resume las defensas enzimticas contra la injuria por radicales libres:

Superxido Di smu t asa

Fe2+ H2O2

Fe3+ .OH 2 GSH NADP+


Gl u t a t i o n Red uc t asa

2 O2-. 2 H+ O2

Ca t alasa

Glut at ion Peroxidasa

2 H2O + O2

GSSG

NADPH

SISTEMAS SECUNDARIOS DE DEFENSA

han demostrado que la peroxidacin de los lpidos de membrana puede estimular la actividad lipoltica de la fosfolipasa A2 e igualmente, los lpidos peroxidados son los sustratos preferidos de la fosfolipasa A2. Esto tiene una gran importancia fisiolgica, ya que representa un mecanismo eficaz en la reparacin del dao a membranas 2Enzimas Proteolticas: Varias enzimas

1-

Enzimas Lipolticas:

Las clulas estn

equipadas con varias enzimas responsables para la reconstruccin de los constituyentes de membranas daados o alterados. Se ha sugerido la eliminacin mediada por fosfolipasas de los cidos grasos de los lpidos de membrana pueden ser un medio efectivo para mantener la integridad de membrana y al mismo tiempo proveer un medio para regular el recambio ('turn-over') de los lpidos de membrana. Algunos investigadores

proteolticas pueden actuar como mecanismos de defensa contra el dao oxidativo, al degradar

18

Toxicidad del oxgeno Coirini

Prof.Dr. Hector

protenas oxidadas alteradas. Este proceso puede es de gran importancia en el envejecimiento, donde la acumulacin de protenas daadas puede no ser ventajoso para el organismo. La estrategia celular para combatir la injuria oxidativa a protenas por enzimas proteoliticas sera anlogo al descripto para lpidos y otros constituyentes, es decir cumplir una funcin dual de proteccin y reparacin. 3- Enzimas reparadoras del ADN: Las clulas poseen mecanismos para reconocer y reparar defectos generados por las alteraciones de bases nitrogenadas del ADN, que actan durante los procesos de replicacin o bien luego de daos generados por factores fsicos o de agentes oxidantes. Entre las enzimas involucradas existen endonucleasas, ADN polimerasas beta y epsilon, ADN ligasas y fosfatasas que eliminan las secuencias defectuosas remplazndolas por secuencias correctas. 4- Sustancias exgenas atrapadores de radicales libres Existen sustancias que atrapan radicales libres (en ingls: 'scavengers'). Entre ellas se encuentran sustancias vegetales del grupo de los flavonoides o de los antocianos. Estos compuestos estn presentes, por ejemplo, en el vino tinto produciendo un efecto protector contra los radicales libres. Estudios realizados en Francia determinaron que el vino Cabenet Sauvignon que la y el y vino el tinto tienen una concentracin elevada de flavonoides; mientras grapa vino blanco poseen concentraciones muy bajas de los mismos. En resumen, las defensas primarias estn formadas por antioxidantes y enzimas captadoras de radicales libres que disminuyen marcadamente

los niveles de radicales libres. Sin embargo, en ciertas circunstancias algn dao celular puede ocurrir, entonces las defensas secundarias, eliminan entonces, las molculas daadas o bien las reparan.
ESPECIES REACTIVAS DE OXGENO Y SU RELACIN CON PATOLOGAS

Cual es el rol exacto que cumplen las especies reactivas de oxgeno en diversas patologas? En primer lugar, algunas enfermedades pueden ser causadas por un estrs oxidativo. Por ejemplo, la radiacin ionizante genera .OH por ruptura de molculas de agua. Muchas de las consecuencias biolgicas de la exposicin a un exceso de radiacin pueden deberse a dao causado por los radicales libres sobre el ADN, lpidos y protenas. Los signos producidos por una deficiencia dietaria crnica en selenio (ej. la enfermedad de Keshan) o en tocoferoles (alteraciones neurolgicas observada en pacientes con defectos en la absorcin intestinal) pueden estar mediadas por el estrs oxidativo (recordar que el selenio es un componente esencial de la glutation peroxidasa). En el infante prematuro, la exposicin de la retina incompletamente vascularizada a altas concentraciones de oxgeno, pueden llevar a la retinopata del prematuro, que en los casos ms severos conduce a la ceguera
Produccin de especies reactivas de oxgeno como eventos secundarios en patologas

El dao tisular causado por diversas enfermedades, trauma, toxinas u otras causas, conduce usualmente a un aumento en la

19

Toxicidad del oxgeno Coirini

Prof.Dr. Hector

formacin de "mediadores de la injuria" como son las prostaglandinas, leucotrienos,

antioxidantes que atraviesen la barrera hematoenceflica es de gran valor en estos casos. El hierro se acumula en la sustancia nigra y otras zonas del cerebro en pacientes que padecen Parkinson, y se ha especulado que la formacin de radicales libres por reacciones dependientes de hierro podran ser importantes en esta patologa. En pacientes con dao heptico fulminante se ha demostrado un aumento de la disponibilidad de hierro y cobre presentes en plasma. Una deficiencia en la enzima glucosa-6fosfato deshidrogenasa, afecta a los eritrocitos. Esta enzima que forma parte de la va de las

interleukinas, interferones y factores de necrosis tumoral. Dentro de este listado de "mediadores de injuria" podramos incluir a las EROs. En la mayora de las patologas el estrs oxidativo es un efecto secundario. Por ejemplo, los neutrfilos activados producen anin superxido, perxido de hidrgeno y cido hipocloroso para destruir los agentes patgenos. Sin embargo, si

comienzan a activarse un gran nmero de fagocitos en un rea localizada, puede llegar a producirse dao tisular. Otro ejemplo seria el caso de un paciente con artritis reumatoidea, en el cual en el fluido sinovial de la rodilla se observan grandes cantidades de neutrfilos activados. Otro ejemplo se presenta cuando por daos mecnicos, qumicos o isqumicos se produce la ruptura de la clula con la consecuente liberacin de su contenido al entorno. Este contenido puede incluir metales de transicin como el hierro. Algunas reas del cerebro humano son ricas en hierro, pero el lquido cefaloraqudeo no tiene capacidad para captar este hierro, ya que su contenido en transferrina es muy bajo. Entonces si hay dao cerebral producido por medios mecnicos (trauma) o por deprivacin del oxgeno (infarto), puede haber liberacin de hierro, el cual a su vez contribuye a acelerar el dao, por un aumento en la formacin de radicales libres catalizada por este metal. Es por ello que, la administracin teraputica de

pentosas-fosfato, genera NADPH, el cual es utilizado por la glutation reductasa para generar glutation reducido. Cuando los niveles de NADPH se encuentran disminuidos por dficit de glucosa-6fosfato deshidrogenasa, la glutation peroxidasa carece de un sustrato necesario para prevenir la acumulacin de lpidos peroxidados. Como consecuencia de esto las membranas del eritrocito se vuelven ms frgiles y la vida media de estas clulas disminuye, causando anemia. Por otro lado, en esas condiciones el hierro presente en la hemoglobina, tiende a mantenerse en forma oxidada, provocando un aumento en metahemoglobina, que no transporta oxgeno, lo que exacerba el cuadro. La produce injuria tisular con frecuentemente la consecuente

hemorragias

liberacin de hemoglobina por lisis de los eritrocitos. La exposicin de hemoglobina a

20

Toxicidad del oxgeno Coirini

Prof.Dr. Hector

niveles altos de perxido de hidrgeno causa la degradacin del grupo hemo con liberacin de iones hierro. Como recordaran, el hierro puede catalizar la formacin de otras EROs capaces de estimular la peroxidacin de los lpidos de membranas. Afortunadamente, existen defensas contra estos procesos dadas por protenas plasmticas (haptoglobina) ligadoras y de de hemo hemoglobina (hemopexinas),

acepta que un aumento en los niveles plasmticos de lipoprotenas de baja densidad (LDL) y un aumento en los niveles de colesterol causan un aumento en los depsitos grasos en la pared arterial, formando la lesin primaria aterognica. En este mecanismo, la modificacin oxidativa de LDL juega un rol fundamental. Las LDL oxidadas son captadas por monocitos y macrfagos, los cuales son transformados en clulas espumosas. Por otro lado, las LDL oxidadas daan al de los la ntima de la arteria, por contribuyendo derivados proceso la aterognico

adems la accin de compuestos antioxidantes el cido ascrbico usualmente inhibe la

peroxidacin acelerada por hemoprotenas en presencia de limitadas concentraciones de

disrupcin del endotelio. Muchos productos lipoperoxidacin, hidroxiperxidos, participando en 4el fundamentalmente efecto citotxico

perxido de hidrgeno, debido a que el ascorbato acta como un sustrato alternativo para la oxidacin y temporariamente protege a otras molculas. Muchos infantes prematuros presentan distrs respiratorio, lo cual se debe a la falta de maduracin pulmonar con la consecuente incapacidad de sntesis de surfactante pulmolar (este ltimo impide la correcta reduccin de la tensin superficial dentro del alvolo pulmonar, que previene el colapso durante la espiracin). La hipoxia que se genera por esta situacin, causa acidosis que debe ser corregida, siendo el tratamiento empleado, la administracin de aire enriquecido en oxgeno. Sin embargo, un exceso de oxgeno provoca alteraciones pulmonares y en la retina. Desde hace algunos aos, se ha tratado de explicar las causas de la ateroesclerosis basndose en la hiptesis de la modificacin oxidativa de las lipoprotenas. Actualmente se

hidroxinonenal y malondialdehido, ejercen su entrecruzamineto de protenas estructurales y en la modificacin de molculas de ADN que llevan a la mutagnesis. Tambin se ha demostrado que la LDL oxidada estimula en las clulas endoteliales la produccin de prostaglandinas, que son compuestos que promueven la agregacin plaquetaria con la consiguiente exacerbacin de la alteracin vascular. La anoxia (falta de oxgeno en los tejidos) provoca la formacin de cantidades importantes de anin superxido. En principio, se podra pensar, que en los tejidos privados de oxgeno no deberan formarse radicales libres. Lo que sucede es que estos compuestos se forman en el momento en que el tejido recibe nuevamente oxgeno (reperfusin). La enzima responsable de dicho proceso parecera ser la xantino deshidrogenasa. En condiciones normales esta

21

Toxicidad del oxgeno Coirini

Prof.Dr. Hector

enzima deshidrogena la xantina para formar cido rico mediante la siguiente reaccin
xantina + H2O + NAD+ cido rico + NADH + H+

estos compuestos son importantes en una patologa en particular, es necesario demostrar que: - Las especies reactivas de oxgeno son

Pero en condiciones de anoxia tisular, la xantino deshidrogenasa es transformada, probablemente por accin de proteasas en una enzima con actividad de xantino oxidasa, catalizando la reaccin:
xantina + H2O + O2 cido rico + 2 O2

formadas en el lugar de la injuria - El tiempo de su formacin es tal, que estas especies podran participar de algn modo en la patologa (correlacin temporal). - La eliminacin de las especies

-.

+ 2 H+

reactivas de oxgeno o la prevencin de su formacin tiene efectos beneficiosos

La transformacin de la enzima no es reversible, de modo que cuando el oxgeno vuelve al tejido, se forman grandes cantidades de anin

- La aplicacin directa de las especies reactivas de oxgeno en concentraciones equivalentes a las encontradas in vivo, reproduce el dao celular. Como puede entenderse, estas demostraciones no son muy fciles de realizar en todos los casos.

superxido que estara involucrado en el dao oxidativo.


ATP AMP Adenosina Inosina Hipoxantina O2
XANTINA OXIDASA

XIDO NTRICO

El xido ntrico (NO) es una molcula


Acido Urico + O2

compuesta slo por dos tomos, uno de nitrgeno y otro de oxgeno, lo que determina un nmero total de 15 electrones. Al tener un nmero impar de electrones, uno de ellos, ubicado en el orbital ms externo, est desapareado. y esto es justamente lo que le da su carcter de radical libre. Sin embargo, este compuesto es relativamente estable y tiene una vida media de 1-60 segundos. El NO es una molcula no polar y por lo tanto es soluble en medio hidrfobo. Esta propiedad le permite difundir fcilmente a travs

En la mayora de las patologas las especies reactivas de oxgeno son producidas en mayor cantidad a consecuencia de la injuria tisular, por lo tanto es lgico preguntarse: Las especies reactivas de oxgeno Aportan una contribucin significativa al

desarrollo de la patologa o su formacin tiene poca o ninguna consecuencia? La respuesta probablemente sea

de las membranas biolgicas y as cumplir un rol de mensajero intercelular. En los ltimos aos se

diferente para cada patologa. Para afirmar que

22

Toxicidad del oxgeno Coirini

Prof.Dr. Hector

ha avanzado de manera significativa en el conocimiento de la bioqumica del NO y su participacin en un nmero importante de procesos. As, actualmente se considera que el NO es un importante regulador de los sistemas nervioso, inmune y cardiovascular. Adems de su funcin como mediador de las funciones normales, el NO est involucrado en el shock sptico, hipertensin, infarto y enfermedades neurodegenerativas.

FUNCIONES NTRICO

BIOLGICAS

DEL

XIDO

En el endotelio vascular, el NO participa como factor de relajacin. Una serie de mediadores (bradiquinina, ATP, acetilcolina e ionforos del calcio) estimulan la sntesis de NO a nivel del endotelio, el cual difunde a travs de las membranas hasta llegar a las clulas del msculo liso subendotelial, donde activa la guanilato ciclasa, que a su vez incrementa los

El NO es sintetizado enzimticamente por una grupo de enzimas llamadas NO-sintasas (NOS), ampliamente distribuidas en tejidos de mamferos. Todas las NOS son dimricas, con un peso molecular de 130 - 150 kDa por monmero, poseen en su sitio activo flavina y hemo, as como un sitio de unin para el complejo calciocalmodulina. Muchas de las NOS requieren la presencia de tetrahidrobiopterina como cofactor para su accin. El NO se sintetiza por la siguiente reaccin:
L-arginina + O2 + NADPH + H+ NO + citrulina + NADP+

niveles de GMPc. El GMPc participa en la activacin de las bombas de calcio que acumulan el mismo en el sarcoplasma, por lo que el calcio citoplasmtico disminuye y el msculo se relaja. De esta manera el NO estara cumpliendo un rol de mensajero intercelular. El NO difundido al espacio intravascular es rpidamente eliminado por la oxihemoglobina eritrocitaria. El NO cumple un rol fisiolgico en el sistema nervioso. Uno de los neurotransmisores excitatorios de numerosas neuronas del sistema nervioso central es el glutamato. Mediante la unin del glutamato a receptores NMDA (Nmetil-D-aspartato, agonista selectivo de este tipo de receptor) se produce la apertura de canales

Las NOS fueron clasificadas en un principo de acuerdo a su localizacin en: endotelial (eNOS), macrofgica (mNOS iNOS) y neuronal (nNOS). Las eNOS y la nNOS son variedades constitutivas de la NOS, y su actividad se regula por activacin calciocalmodulina dependiente. En cambio, la mNOS es inducible por determinados compuestos tales como citoquinas y endotoxina.

para calcio. Este in penetra en la neurona postsinptica, y se une a calmodulina, activando la NOS neuronal, con la consecuente produccin de NO, que seria un intermediario ms en la transmisin del estmulo. El NO tambin puede participar como molcula efectora citotxica sobre bacterias, virus y clulas tumorales a nivel los de macrfagos y neutrfilos del sistema inmune.

23

Toxicidad del oxgeno Coirini

Prof.Dr. Hector

El NO ejerce sus acciones biolgicas a travs de reacciones con diferentes compuestos, uno de ellos son las metaloproteinas. Como principal rol vimos anteriormente es el su la En cambio la desoxihemoglobina sufre otro tipo de reaccin, generando nitrosil hemoglobina, que produce un complejo estable:
hemoglobina Fe2+ + NO hemoglobina Fe2+ - NO

fisiolgico

mediante

interaccin con la guanilato ciclasa (que es una hemo-protena) pero el NO tambin se une a otras hemo-protenas, como por ejemplo

El NO puede reaccionar tambin con grupos sulfhidrilos de protenas conduciendo a la formacin de nitrosotioles (RSNO), lo cual produce una alteracin en la estructura de la misma, con una posible prdida en su actividad o funcin. El NO puede oxidarse en presencia de oxgeno molecular a dixido de nitrgeno (NO2) que tambin es un radical libre muy reactivo. Este NO2 es transformado a compuestos mas estables y menos reactivos como nitrato (NO3- ) y nitrito (NO2-).

citocromo oxidasa mitocondrial, citocromo P-450 microsomal y a protenas que contienen hierro como la aconitasa del ciclo de Krebs. Debido a su interaccin con metaloprotenas el NO que difunde al espacio intravascular luego de la

relajacin de la musculatura lisa de los vasos sanguneos (vasodilatacin) puede ser eliminado mediante su unin con oxihemoglobina

formando metahemoglobina y nitrito mediante la siguiente reaccin:


hemoglobina Fe2+- O2 + NO
NO3 + hemoglobina Fe3+

NO. NO2.

N2O3 H2O

2 NO2-

1/2 NO + O2

H2O NO2. N2O4 NO 3 - + NO2-

La reaccin del NO con el radical superxido conduce a la formacin del anin peroxinitrito (ONOO-) que es una especie no radical. Sin embargo, es un compuesto poco estable, que rpidamente se transforma en nitrato. El peroxinitrito es una especie altamente reactiva

oxidante capaz de reaccionar con sulfhidrilos, metaloprotenas, lpidos, azcares y ADN. El NO reacciona con radicales orgnicos con gran velocidad, entre ellos puede interactuar con el radical peroxilo (LOO.) que se forma en la peroxidacin de membranas. En este caso el

24

Toxicidad del oxgeno Coirini

Prof.Dr. Hector

mecanismo resulta ser beneficioso, ya que detiene la etapa de propagacin de la

MTODOS DE DETERMINACIN ESPECIES REACTIVAS DE OXGENO

DE

peroxidacin de lpidos por un mecanismo de dismutacin.


PARTICIPACIN PATOLGICOS DE NO EN PROCESOS

Mediante tcnicas de laboratorio es posible determinar la produccin de EROs, ya sea en una forma directa o bien indirectamente evaluando los efectos producidos por estos agentes sobre las diferentes biomolculas.

La sobreproduccin de NO resulta ser txico para la clula. Dicha toxicidad puede basarse en una sobrestimulacin de la guanilato ciclasa, como se observa en la sepsis con hipotensin refractaria, donde una vasodilatacin persistente genera la cada sostenida de la presin arterial en la periferia. Por otro lado, se ha demostrado que un exceso de NO conduce a una inhibicin de la respiracin celular, debido a que este compuesto compite por el sitio de fijacin del oxgeno a nivel de la oxidasa terminal de la cadena de transporte de electrones. Esta

Para el caso de la determinacin directa existen ensayos especficos para cada tipo de agente. Por ejemplo, es posible determinar los niveles de perxido de hidrgeno por la capacidad de ste, de oxidar al cido p-hidroxifenilactico

(sustancia dadora de hidrgeno) en presencia de la peroxidasa de rbano, produciendo un producto fluorescente relativamente estable, cuya fluorescencia puede ser determinada. Los

radicales libres, hidroxilo, aquellos centrados en carbono, ascorbilo, ubisemiquinona y el xido ntrico, presentan concentraciones bajas y una vida media muy corta, por lo que para su determinacin es necesario generar una especie mas estable. Para ellos se utilizan agentes especficos denominados sustancias atrapadoras, cuya funcin es generar una sustancia con una vida media mas prolongada y con una

inhibicin conduce a una disminucin en los niveles de ATP y una alteracin de la homeostasis del calcio. El peroxinitrilo tambin puede tener acciones txicas. Este compuesto puede inactivar los componentes de la cadena respiratoria, a enzimas con grupos sulfhidrilos como la gliceraldehido fosfato deshidrogenasa, o a enzimas con centros ferro-sulfurados como la aconitasa. A su vez, el peroxinitrilo puede reaccionar con los restos tirosinas de ciertas protenas que son sustratos de quinasas y de este modo alterar el mecanismo de transduccin de seales, crecimiento y diferenciacin celular.

concentracin mayor. La presencia de esta especie se determina aplicando un campo magntico externo a la muestra que la contiene. El campo magntico genera la alineacin de los electrones no apareados con este campo y los cambios de energa producidos por esta

alineacin pueden ser determinados mediante un detector, generndose una curva de energa caracterstica. En todos los casos se utilizan

25

Toxicidad del oxgeno Coirini

Prof.Dr. Hector

muestras patrn con el radical a determinar a fin de comparar las curvas de cambios energticos producidos. La tcnica utilizada se denomina resonancia paramagntica electrnica o EPR. Para el caso del radical superxido se determina su presencia por espectrofotometra, produciendo la reaccin de este radical con un reactivo indicador (por ej. citocromo c, adrenalina, formazan) que va a generar un compuesto coloreado. El grado de peroxidacin lipdica puede determinarse por quimioluminiscencia, dado que las especies excitadas formadas durante la reaccin en cadena (entre ellos el oxgeno singulete) vuelve a su correspondiente estado fundamental liberando energa en forma de fotones (luz). En resumen las EROs pueden ser determinadas en forma directa mediante tcnicas de fluorescencia, resonancia paramagntica

(HPLC)

por

espectrofotometra.

El

malondialdehido, producto de la descomposicin de los lpidos peroxidados, reacciona con el cido tiobarbitrico dando un compuesto coloreado que puede cuantificarse por espectrofotometra. En cuanto a las protenas, la

modificacin por oxidacin, genera grupos carbonilo, que pueden ser determinados.

Tambin pueden determinarse la desaparicin de grupos sulfhidrilos, que son altamente

susceptibles de ser oxidados a puentes disulfuros. La formacin de ditirosinas puede dar un ndice del entrecruzamiento intramolecular de dos cadenas peptdicas. La fragmentacin de

protenas, puede ser evaluado por tcnicas de western blot, mientras que la formacin de agregados proteicos, por unin de zonas

hidrofbicas, pueden ser monitoreadas por tcnicas electroforticas. Otro ndice de accin sobre protenas activas es la determinacin de la prdida total o parcial de actividad enzimtica. Con respecto al ADN puede

electrnica, espectrofotometra y quimioluminiscencia. Otra forma de evaluar la presencia de EROs en un sistema biolgico es evaluar el dao producido sobre las biomolculas. As para el caso de los lpidos, se puede determinar el consumo de oxgeno utilizando un electrodo sensible a dicho gas, en suspensiones de niitocondrias, microsomas, ncleos, etc., dando una medida del avance en el proceso de peroxidacin. Tambin puede determinarse la cantidad de dienos conjugados mediante

determinarse la cantidad de bases modificadas, especialmente la formacin de 8-hidroxi-2'deoxiguanosina. Alternativamente se puede

evaluar el grado de fragmentacin del ADN por medio de electroforesis en geles de agarosa.

EVALUACIN DE DEFENSAS ANTIOXIDANTES

espectrofotometra en el rango de luz ultravioleta (longitud de onda de 230nm). Los Una forma alternativa de evaluar el estrs oxidativo es estudiar las condiciones de los sistemas de defensas antioxidantes Los

hidroperxidos lipdicos pueden determinarse mediante cromatografa lquida de alta presin

26

Toxicidad del oxgeno Coirini

Prof.Dr. Hector

procedimietos a seguir para la evaluacin de stos son: a) La determinacin de la actividad de enzimas tales como la superoxido dismutasa (SOD), catalasa , glutation peroxidasa (GP) por tcnicas espectrofotomtricas b) Determinacin de los niveles de antioxidantes hidrosolubles como la vitamina C y cido rico, que se miden por tcnicas que utilizan

cromatografa liquida de alta presin (HPLC) o bien el glutation se determina por tcnicas espectrofotomtricas c) Determinacin de compuestos antioxidantes liposolubles como la vitamina E, carotenoides, ubiquinoles, que pueden medirse por HPLC. La mayora de las determinaciones en los laboratorios, se efectan en lquidos biolgicos, como sangre tota, suero, plasma, orina, lquido sinovial, lquido cefalorraqudeo, saliva, exudado pleural y plasma seminal. Tambin pueden utilizarse clulas (eritrocitos, clulas de la serie blanca, espermatozoides) e incluso material proveniente de biopsias y necrosis.

27