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Artigo Convidado 2

Aplicaes T ecnolgicas da Metodologia Cristalogrfica


William B. Fernandes, Hamilton B. Napolitano, Caridad NodaPerez, Felipe T. Martins & Carlito Lariucci
Com o intuito de se conhecer a estrutura molecular e cristalina dos compostos qumicos para posteriores anlises fsico-qumicas e estudos de aplicao, lana-se mo da cristalografia como metodologia cientfica, que permite conhecer a estrutura de qualquer composto qumico cristalino sem nenhuma informao a priori. Esta metodologia est baseada em conceitos como difrao de raios X por materiais cristalinos, simetria, lei de Bragg e transformada de Fourier. O presente trabalho tem como finalidade apresentar as principais etapas do trabalho cristalogrfico, desde a coleta de dados em monocristais, soluo e refinamento da estrutura at as etapas de anlise e validao do modelo cristalogrfico obtido e posterior depsito no banco de dados apropriados. Palavras-chave: estrutura molecular, difrao de raios X, interaes intermoleculares. In order to know the molecular and crystalline structure of chemical compounds for further physical-chemical analysis and application studies, launches hand of crystallography as a scientific methodology that allows knowing the structure of any crystalline chemical compound without any a priori information. This methodology is based on concepts such as X-ray diffraction by crystalline materials, symmetry, Braggs law and Fourier transform. This work aims to present the main steps of crystallographic methodology, since the data collection from a single crystal, solution and refinement of structures until the steps of analysis and validation of crystallographic model, and deposit in appropriate crystallographic database. Keywords: . molecular structure, X-ray diffraction, intermolecular interactions.

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Introduo
O conhecimento do arranjo dos tomos em uma molcula (estrutura molecular) e da posio relativa de todas as molculas em um cristal (estrutura cristalina) para substncias obtidas tanto sinteticamente como isolados de fontes naturais, extremamente til para o entendimento das propriedades qumicas, fsico-qumicas e biolgicas dos compostos para os mais variados ramos da cincia1,2. Na Fsica e na Cincia dos Materiais, fundamental a relao entre propriedades fsicas e a estrutura interna dos slidos; em Qumica as caractersticas estricas de novos compostos ou complexos s podem, em muitos casos, serem conhecidas atravs da determinao de sua estrutura; em Biologia e Bioqumica a atividade funcional de uma biomolcula est intimamente relacionada com sua estrutura tridimensional; em Medicina e Farmacologia a ao de certos frmacos envolve interaes entre frmacoreceptor e a maneira como isto acontece determinada pela estrutura de ambos componentes1,3,4. Com o interesse em conhecer a matria a nvel atmico, torna se necessrio o desenvolvimento de ferramentas que possibilitem a obteno de informaes a este nvel de resoluo. Entretanto, poucas so as metodologias rotineiramente disponveis quando se faz necessrio saber a distribuio espacial relativa dos tomos constituintes de uma dada molcula. Estas metodologias incluem: Difrao de Raios X (DRX) por Monocristais, Difraes de Nutrons, Ressonncia Magntica Nuclear, Espalhamento de Raios X a Baixo ngulo (SAXS), Microscopia Eletrnica, Modelagem Terica e outros. Dentre estas, o mtodo cristalogrfico apresenta-se como o mais adequado devido alta resoluo com que se pode descrever a densidade eletrnica2,5. Este mtodo est baseado no fenmeno da difrao, e fornece o conhecimento da disposio tridimensional dos tomos na estrutura molecular para compostos no estado cristalino quando expostos a radiao X, no necessitando de nenhum conhecimento a respeito do composto a priori3,4. Os dados obtidos atravs de experimentos de difrao de raios X consistem apenas nas intensidades e as posies dos feixes difratados, a partir dos quais se pode obter a amplitude dos fatores de estrutura |F(h)|. Toda informao explcita das fases dos fatores de 20
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estrutura, (h), perdida durante o experimento, o que impossibilita a determinao analtica da estrutura a partir das intensidades medidas. As posies atmicas so determinadas pelos valores mximos da funo de densidade eletrnica (r) (Eq. (1))3,6, onde V o volume da cela unitria e F(h) o fator de estrutura na forma complexa, sendo seu mdulo |F(h)| proporcional intensidade da reflexo medida para direo hkl. A quantidade h.r corresponde ao produto escalar entre o vetor espalhamento no espao recproco h e o vetor posio no espao direto r. (1) Para que essa funo seja conhecida, torna-se necessrio o conhecimento dos fatores de estrutura F(h) (amplitude e fase) de cada reflexo coletada. Nesse sentido, o trabalho de caracterizao estrutural da amostra cristalina a construo da densidade eletrnica a partir das amplitudes e fases dos fatores de estrutura. Uma vez que estas informaes so obtidas, e as posies dos tomos precisamente conhecidas, so calculadas as distncias interatmicas, os ngulos de ligao, ngulos conformacionais, e as caractersticas moleculares de interesse, como por exemplo, a planaridade, estabilidade de um grupo particular de tomos e informaes estreoqumicas e estruturais desejadas7,8. So calculadas ainda as interaes intermoleculares envolvidas no empacotamento molecular do cristal, sendo este, um ramo da cincia conhecido como Qumica Supramolecular9. Frequentemente surgem problemas durante o refinamento de uma estrutura, tais como coleta de cristais geminados (twinning) e problemas de desordem cristalogrfica, e alguns procedimentos e avaliaes no sentido de modelar e resolver estes problemas necessitam ser executados10. Desta forma, o trabalho de elucidao estrutural por cristalografia de raios X em monocristais, um trabalho interativo e multidisciplinar, e envolve as seguintes etapas: coleta, processamento e reduo dos dados; soluo e refinamento da estrutura; validao e anlise do modelo cristalogrfico; depsito no banco de dados apropriados2,3.

A Difrao de Raios X por Cristais


A difrao pode ser definida como o fenmeno de

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perturbao do deslocamento de uma onda devido interao com um obstculo. Mais especificamente, a DRX pode ser entendida como a alterao da direo de propagao, amplitude e fase da radiao eletromagntica cujo comprimento de onda () varia entre 0,1 e 100 como consequncia da interao com centros espalhadores eletrnicos periodicamente arranjados em um cristal. Para que haja DRX por um cristal, raios X espalhados devem estar em fase para interferirem construtivamente e terem suas amplitudes resultantes regidas pelo princpio de superposio de ondas. Para estarem em fase, a diferena de percurso entre os feixes difratados por centros espalhadores deve equivaler a um nmero inteiro n de comprimentos de onda (n). O termo n representa a ordem de difrao, o qual deve ser obrigatoriamente um nmero inteiro. A construo geomtrica que relaciona esta observao com o ngulo de difrao e a distncia d entre os centros espalhadores periodicamente arranjados conhecida como Lei de Bragg e dada por: 2 d sen = n. (2)

Uma vez satisfeita esta condio, o que necessariamente implica que os centros espalhadores e a radiao espalhada possuem grandezas espaciais de magnitude similar, ondas refletidas a partir de centros espalhadores periodicamente ordenados estaro todas em fase e resultaro em feixes difratados. A funo matemtica que descrever tais feixes difratados depender da natureza e estrutura dos centros espalhadores. Portanto, quando difratados, raios X informam quais e como os tomos espalhadores esto periodicamente arranjados no espao, o que permite a determinao da estrutura intramolecular e intermolecular, e tambm as dimenses da cela unitria cristalogrfica. Quando h uma relao de fase definida entre o vetor do campo eltrico incidente Ein de uma radiao eletromagntica e a acelerao causada em um eltron devido interao com esta radiao, qualquer eltron de carga e e massa m acelerado com uma acelerao a: . (3)

princpio do espalhamento Thomson, em que uma onda interage com uma partcula e espalhada com a mesma frequncia e comprimento de onda da radiao incidente. O espalhamento Thomson referenciado tambm como espalhamento coerente e aquele observado no fenmeno de DRX por cristais, embora o espalhamento Compton incoerente tambm ocorra como parte da radiao espalhada de fundo. Entretanto, o espalhamento Compton, caracterizado pela coliso entre duas partculas (fton e eltron) com alterao na frequncia e comprimento de onda da radiao espalhada, no resulta no padro discreto de DRX, pois no h uma relao de fase bem definida neste evento de interao partcula-partcula. A radiao espalhada ser caracterizada por um vetor de campo eltrico Eesp que poder se orientar em qualquer direo no plano normal direo de propagao da radiao eletromagntica. Esta aleatoriedade da direo de Eesp se deve ao fato do feixe incidente tambm no ser polarizado. Considerando que a polarizao parcial p de Eesp uma funo do ngulo de difrao , 0 uma constante eletromagntica fundamental da ordem de 8,854.10-12 F m-1, c a velocidade de propagao da radiao eletromagntica e r a distncia entre o eltron e o ponto de deteco da radiao espalhada, Eesp ser dado por:

(4)

Se definirmos a habilidade de um eltron em espalhar a radiao eletromagntica como o fator de espalhamento eletrnico fe:

(5)

temos uma nova expresso para a amplitude da radiao espalhada Eesp:

(6)

Por sua vez, o eltron acelerado atuar como uma fonte emissora de radiao sob desacelerao. Este o
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Correes devidas polarizao parcial do vetor de campo eltrico da radiao espalhada devem ser realizadas, principalmente quando cristais monocromadores so utilizados para seleo de determinado comprimento
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de onda dos raios X. A polarizao parcial induzida pelo cristal monocromador afetar o espalhamento subsequente pelo cristal em estudo, comprometendo a magnitude da radiao espalhada. Neste caso, o termo referente polarizao p deve ser reescrito como:
+ Kcos2 ( 2)] ___________ p = [1 + Kcos ( 2)] ___________ p = [1
1+K 1+K
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de uma distribuio eletrnica contnua, como aquela de tomos reais, em espalhar a radiao eletromagntica pode ser entendida como: fe (r) d(r), (11)

(7)

onde K razo entre os feixes paralelo e normal superfcie do plano espalhador da radiao na fonte monocromtica. Estes dois feixes so derivados da decomposio do vetor de campo eltrico em dois componentes, um paralelo superfcie do plano espalhador, dependente apenas da densidade eletrnica no plano (feixe ou I||), e outro perpendicular a esta superfcie (feixe ou I), o qual depende tanto da densidade eletrnica no plano quanto do ngulo de difrao . Este ltimo componente responsvel pelo decrscimo da radiao espalhada devido ao fator de polarizao. Sua completa anulao e, consequentemente, a anulao de metade da radiao espalhada decomposta nos dois componentes I|| e I de mesma magnitude ocorre quando 2 = 90. Considerando o ngulo de difrao m do cristal monocromador, uma aproximao muito utilizada para o valor de K :
K = cos (2m).

onde o produto (r) d(r) o nmero mdio de eltrons confinados no elemento de volume d(r). Portanto, (r) pode ser referenciada como a funo de densidade eletrnica de uma distribuio eletrnica. Agora, reescrevendo a equao da radiao espalhada Eesp total relativa radiao incidente Ein para uma distribuio contnua de eltrons em que a habilidade de um centro espalhador em espalhar a radiao ser dada pela equao anterior, e expressando a fase relativa no termo exponencial em funo do vetor de espalhamento k e do centro espalhador r como e i n = e i k r, temos:

(12)

(8)

Agora, a radiao espalhada funo do vetor de espalhamento k, cuja direo de espalhamento dada pelos ndices hkl. Uma vez que a integrao no sobre a varivel r embutida em fe, ns podemos extrair este termo da integral. Em adio, a expresso

Uma vez aplicada correo devida polarizao parcial da radiao espalhada, podemos expressar a radiao espalhada Eesp por um eltron como:

(13)

(9)

Para uma distribuio discreta de n eltrons, a radiao espalhada Eesp total relativa radiao incidente Ein ser dada por:

(10)

onde o termo exponencial se refere relao de fase definida como o nmero ou fraes de comprimentos de onda que separam os eltrons discretamente distribudos no espao. Enquanto a habilidade de um eltron em espalhar a radiao eletromagntica definida como fe, a habilidade 22
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representa a habilidade relativa dos centros espalhadores de uma cela unitria em espalhar radiao eletromagntica quando comparada com a habilidade de um nico eltron. Esta expresso especifica a amplitude da difrao em uma dada direo de espalhamento indexada por hkl. Ento, podemos definir a expresso anterior como o fator de estrutura Fhkl de um mximo de difrao correspondente ao ponto da rede recproca definido pelos integradores hkl. Atravs da substituio da representao vetorial r dos centros espalhadores no termo exponencial por coordenadas fracionrias xyz e vetores cristalogrficos abc, representando o ponto r como: x a + y b + z c, (14)

e o volume dr em funo do volume V da cela unitria como:


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V dx dy dz,

(14)

e, por fim, assumindo a proporcionalidade entre o vetor de espalhamento k e o vetor de rede recproca Ghkl como sendo: k = 2 p Ghkl, (15) onde Ghkl pode ser definido em termos de vetores cristalogrficos da rede recproca a* b* c* como: Ghkl = dhkl-1 = h a* + k b* + l c*, temos o fator de estrutura Fhkl como: (16)

(17)

A integrao sobre a funo de densidade eletrnica atravs das coordenadas da cela unitria deve ser realizada sobre todo o contedo da mesma, o que justifica os limites da integrao indo de zero a um. Desta forma, a funo de densidade eletrnica, outrora representada na forma vetorial por (r), tambm expressa agora como funo das coordenadas fracionrias xyz. Fatores de estrutura Fhkl podem ser expressos em funo de fatores de espalhamento atmico. Considerando que um eltron isolado espalha raios X com uma determinada intensidade definida pelo fator de espalhamento Thomson, um tomo contendo Z eltrons espalharia raios X com intensidade igual ao produto entre Z e a intensidade de um nico eltron isolado, conforme descrito anteriormente. Entretanto, devido s distncias entre os tomos serem da ordem de grandeza do comprimento de onda dos raios X, as ondas que os eltrons espalham interferem umas com as outras, de forma que s haver uma dada intensidade correspondendo a todos os eltrons de um tomo na direo de incidncia dos raios X. Para o espalhamento em outras direes observa-se interferncia parcialmente destrutiva devido ao distanciamento entre os eltrons de um tomo culminar em diferenas de percurso da radiao espalhada. Assim, a amplitude total do feixe espalhado por um tomo, a qual recebe contribuies de todos os seus eltrons, ou seja, proporcional ao nmero
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atmico e dependente dos espaamentos intereletrnicos, decresce com o aumento do ngulo de espalhamento. Esta habilidade de um tomo em espalhar os raios X definida como o fator de espalhamento atmico fj e constitui a amplitude espalhada pela distribuio de eltrons de um tomo normalizada em relao amplitude espalhada por um eltron isolado, sob condies idnticas. Fatores de espalhamento atmico podem assumir como valor mximo Z (nmero atmico do tomo) na ocasio dos eltrons espalharem a radiao em fase, na direo de incidncia do feixe de raios X (2 = 0). Para os feixes espalhados na direo da incidncia, os raios X estaro em fase e a amplitude resultante deriva do principio de sobreposio de ondas. Quando o ngulo de difrao diferente de zero, as trajetrias dos raios espalhados so diferentes e a diferena de fase resulta em interferncia. Considerando uma molcula, a onda total espalhada por todos os tomos dada pela soma vetorial das contribuies individuais de cada tomo. Em prtica, o fator de espalhamento atmico significa a tendncia de um tomo para espalhar a radiao X, a um dado ngulo e certo . Assim, valores tabelados so encontrados para razes de sen/, expressos como o quociente entre a amplitude da onda espalhada por um tomo sobre a amplitude da onda espalhada por um eltron. De maneira similar ao fator de espalhamento atmico, o fator de estrutura um quociente de duas amplitudes: a amplitude da onda espalhada por todos os tomos da cela unitria e a amplitude da onda espalhada por um eltron isolado, onde a magnitude deste fator depende unicamente da posio relativa de todos os tomos na cela unitria e de seus respectivos fatores de espalhamento. Ento, conveniente expressar os fatores de estrutura Fhkl em funo dos valores de fj de cada tomo, o qual embute a funo de densidade eletrnica do tomo em um certo volume determinado pelo seu raio atmico. Ento, a equao anterior reescrita como:

(18)

onde o somatrio deve ser efetuado sobre todos os tomos da cela unitria. Uma vez que os tomos da cela unitria podem estar relacionados por elementos de simetria do grupo espacial, a equao anterior pode ser simplificada. Os fatores de espalhamento atmico devem tambm ser
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corrigidos em funo da temperatura. Em um modelo isotrpico de deslocamento, em que as vibraes trmicas so esfericamente simtricas em todas as direes, o fator de temperatura Tj, de um tomo para qualquer conjunto de planos de rede (hkl) depender do espaamento interplanar e da magnitude de vibrao perpendicular aos planos. Ento, o fator de espalhamento atmico corrigido (fj)T em funo da temperatura ser dado por: eletrnica. Pelo teorema de Fourier, a funo de densidade eletrnica ser a transformada inversa T-1 do padro de DRX, como exemplificado abaixo:

, .

(23) (24)

,
onde Tj, dado por:

(19)

,
e Bj assume a grandeza: 8 p2 <u2>,

(20)

A partir do padro de DRX, composto pela amplitude e fase intrnseca dos fatores de estrutura Fhkl difratados em direes de espalhamento discretas e definidas, a funo de densidade eletrnica pode ser ento calculada para cada ponto da cela unitria atravs de suas coordenadas fracionrias por meio da sntese de Fourier dada pela relao:

(21)

onde <u2> representa o deslocamento quadrtico mdio do tomo j. Em cristais moleculares, os tomos esto ligados covalentemente uns aos outros e, portanto, foras atrativas e repulsivas sobre ligaes qumicas distorcem a distribuio da densidade eletrnica de tal forma que um modelo isotrpico de deslocamento atmico deve ser aperfeioado para um modelo anisotrpico de vibrao trmica. Neste modelo, os tomos tm diferentes liberdades de deslocamento em trs direes ortogonais (mutuamente perpendiculares). Ento, neste modelo mais realstico de deslocamento trmico, um nico parmetro trmico isotrpico Bj substitudo por seis parmetros trmicos anisotrpicos Uij, trs deles definindo a forma da representao elipsoidal do tomo j e trs especificando sua orientao. Neste caso, a expresso para o fator de temperatura anisotrpico Tj, ser dada por:

(25)

Como mencionado anteriormente, o padro de DRX discreto e no contnuo, sendo caracterizado por fatores de estrutura Fhkl em posies indexadas. Por esta razo, a integral tripla se degenera dentro de somatrios na equao anterior sobre todos os valores possveis de ndices dos vetores de espalhamento. A intensidade da radiao espalhada uma funo inversamente proporcional ao ngulo de difrao , sendo que, para um dado comprimento de onda da radiao incidente, somente os pontos da rede recproca caracterizados pelo vetor de rede recproca Ghkl cujas magnitudes satisfazem a relao: Ghkl 2 -1, (26)

, (22)
A funo de densidade eletrnica (xyz) varia periodicamente de uma cela unitria a outra atravs do cristal, como consequncia do ordenamento peridico dos tomos no estado cristalino. Devido a esta periodicidade, (xyz) pode ser descrita por uma srie de Fourier tridimensional. Portanto, o padro de DRX a transformada de Fourier T da funo de densidade 24
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podero ser detectados em um experimento de DRX. O termo 2 -1 o raio da esfera limite, a qual representa uma construo geomtrica originada da rotao do cristal sobre a esfera de Ewald. Este valor equivalente ao dimetro da esfera de reflexes ou esfera de Ewald, construo geomtrica que estabelece uma esfera de raio -1 cujos pontos de rede recproca devem atravess-la para satisfazerem a Lei de Bragg e, portanto, ser observado o fenmeno da DRX. A esfera limite restringe o conjunto de pontos da rede recproca que podem atravessar a esfera
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de Ewald. Portanto, todo conjunto de dados de DRX ser sempre finito, e a equao da sntese de Fourier pode ser escrita para os valores limites dos ndices hkl como:

(27)

Experimentalmente, quando um monocristal de um dado composto irradiado com raios X, tipicamente com um l dentro da faixa compreendida entre 0,7 a 2,0 , ele se comporta como uma rede de difrao tridimensional e produz um padro de difrao constitudo de um arranjo tridimensional de intensidades difratadas. As intensidades destas reflexes esto intimamente relacionadas densidade eletrnica dos tomos espalhadores, uma vez que o padro de difrao a transformada de Fourier da densidade eletrnica da estrutura e, inversamente, a densidade eletrnica da estrutura a transformada de Fourier do padro de difrao. Isto pode ser evidenciado atravs da relao anterior. Desta forma, atravs das intensidades e direes das reflexes difratadas possvel determinar a densidade eletrnica da estrutura. Uma vez conhecidos os fatores de estrutura Fhkl, a densidade eletrnica (xyz) pode ser calculada para cada ponto xyz na cela unitria, viabilizando a construo de mapas de densidade eletrnica de uma molcula em um cristal por um procedimento de clculo conhecido como sntese de Fourier. Quando um mapa de densidade eletrnica com resoluo em torno de 1,0 ao longo dos eixos cristalogrficos calculado, os picos de densidade eletrnica podem ser atribudos aos centros espalhadores atmicos e, consequentemente, s suas posies. Todavia, o clculo desses mapas envolve a obteno das fases intrnsecas hkl dos fatores de estrutura, uma vez que:

dados completos e uma multiplicidade observada (MoO) alta que melhor conseguido com a tecnologia do detector bidimensional tipo Charge Coupled Device CCD8,10. A partir da matriz orientao, um programa de coleta de dados iniciado de forma automtica, sendo obtido um conjunto de imagens, em geral pelo mtodo de rotao do cristal que, depois de integradas e processadas, levam a um conjunto de reflexes que fornecem tanto a direo hkl quanto a intensidade de cada feixe difratado8. A partir do padro de distribuio das intensidades obtidas, possvel se determinar os parmetros de rede e a mtrica que possibilitar a obteno dos dados de simetria. O prximo passo a reduo dos dados, uma vez que as intensidades das reflexes que foram medidas por difrao de raios X, esto afetadas por uma srie de fatores que dependem do arranjo experimental utilizado. So obtidos, ento, os mdulos dos fatores de estrutura, |F(h)|, a partir das intensidades observadas experimentalmente, corrigidas pelos diversos fatores que os afetam que executado por programas que aplicam vrias correes como Lorentz, polarizao, absoro, extino primria e secundria, e determina os valores de incerteza padro () para cada reflexo8,10. Assim,os dados obtidos em um experimento de DRX so as intensidades espalhadas Ihkl em direes definidas, as quais podem ser relacionadas apenas amplitude dos fatores de estrutura e, portanto, aos seu mdulos, atravs da relao:

(29)

Fhkl = F e i hkl . hkl

(28)

em que Iin a intensidade do feixe incidente de raios X, a velocidade angular de rotao do cristal, K o fator de escala que converte os mdulos dos fatores de estrutura em valores relativos para grandezas absolutas (definimos o fator de estrutura Fhkl de um mximo de difrao pela equao

COLETA, PROCESSAMENTO E REDUO DOS DADOS A coleta de dados o procedimento de medida das intensidades das ondas difratadas. Depois de um nmero convencional de reflexes, um computador acoplado ao difratmetro calcula os parmetros da melhor cela unitria e da matriz de orientao, baseada em reflexes centradas e indexadas, seguindo a estratgia que d um conjunto de

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a qual nos permite concluir que tais fatores de estrutura Fhkl so grandezas relativas, normalizadas em relao ao produto Ein fe, ento, para levar Fhkl para um valor absoluto devemos multiplic-lo tanto por Ein (Iin = Ein2)
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quanto por fe, termo este embutido no fator de escala K (K = fe2 N2, onde N o nmero total de celas unitrias contidas dentro do volume Vcrist do cristal)), Lhkl o fator de Lorentz que corrige as diferentes oportunidades temporais e geomtricas que diferentes pontos da rede recproca tm para difratar em funo da interseco com a esfera de Ewald (Lhkl = 1/sen 2), phkl o fator de polarizao discutido anteriormente, Ahkl o termo que corrige o efeito da absoro dos raios X e assume a forma de e-x, onde o coeficiente de absoro linear do cristal e x trajetria total cursada pelos feixes incidente e espalhado, ehkl corrige os efeitos de extino primria (reflexes mltiplas por planos de Bragg fortemente espalhadores dos raios X) e secundria (decrscimo da radiao incidente dentro do interior do cristal devido difrao por planos mais externos) e funo do nmero de planos perfeitamente paralelos dentro do cristal, entre outras variveis. Por fim, o quadrado do mdulo presente na equao que corrige as intensidades dos mximos de difrao de raios X considera o fator de estrutura j corrigido em funo da temperatura, em que: no pacote de programas de resoluo e anlises cristalogrficas WinGX15. Alm dos Mtodos Diretos, que amplamente utilizado na soluo do problema da fase para pequenas molculas sendo tambm um mtodo promissor para a cristalografia de protenas, existe outro mtodo amplamente utilizado na determinao da posio de tomos pesados na cela unitria, conhecido como Mtodo de Patterson16,17. Este mtodo pode ser muito efetivo na localizao do ponto de partida para a soluo da estrutura, fornecendo informaes sobre distncias interatmicas a partir das quais possvel, eventualmente derivar as posies dos tomos sem que seja preciso informao acerca das fases. A soluo de Patterson geralmente contm somente a sub-estrutura enquanto que os Mtodos Diretos frequentemente do as posies de quase todos os tomos no hidrogenides, no entanto o Mtodo de Parterson mais rpido e os tomos remanescentes so encontrados geralmente na sntese Fourier diferena aps alguns ciclos de refinamento3,6,16. Algumas estruturas que no podem ser resolvidas com os Mtodos Diretos convencionais so resolvidas rapidamente com programas baseados nos algortimos de espao dual, como por exemplo, a implementao dos programas Shake and Bake ou SHELXD18. A escolha do melhor destes mtodos vai depender do problema individual (tamanho da estrutura, presena de tomos pesados, presena de espalhamento anmalo, resoluo mxima, e outros)10. O que se obtm da resoluo so os mapas de densidade eletrnica que so calculados utilizando o melhor conjunto de fases como indicados pelas figuras de mrito. Estes mapas resultam da sntese de Fourier usando como coeficientes da srie, os fatores de estrutura normalizados E(h). Os mximos num mapa de E devem corresponder as posies atmicas, mas, por causa dos erros sistemticos nas fases, podem existir picos residuais onde no existem tomos, ou faltar picos onde deveria ter devido a presena de algum tomo. O programa SHELXS-9713 faz uma lista de picos, colocando-os em forma decrescente. Em seguida o operador deve tentar resolver a estrutura da molcula a partir deste mapa, atravs de critrios estreo-qumicos para identificao de fragmentos moleculares. Em alguns casos, boa parte das molculas pode ser visualizada, porm, o mais comum achar alguns picos e ento usar,
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Na prtica, o processamento das intensidades experimentais de DRX feito usando programas como o HKL Denzo-Scalepack11. Alm dos fatores fsicos e geomtricos descritos anteriormente, este programa inclui outros parmetros refinveis no clculo do fator de escala geral das reflexes coletadas usando difratmetros com geometria Kappa12. SOLUO E REFINAMENTO DA ESTRUTURA A etapa de soluo da estrutura est associada obteno da fase (h) de cada reflexo medida, de forma que seja possvel a construo dos mapas de densidade eletrnica (r). Ainda que no exista uma soluo geral para o problema da fase, foram descobertas certas relaes matemticas entre fatores de estrutura a partir das quais certo conjunto de fases pode ser encontrado diretamente, os conhecidos Mtodos Diretos3,8. O uso destas relaes e outras levaram aos mais sofisticados cdigos de resoluo de estruturas, como sejam os desenvolvidos por George Sheldrick (SHELXS-97)13 e por Altomare e colaboradores (SIR-92)14 presentes 26
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por exemplo, uma sntese Fourier Diferena que uma sntese de Fourier na qual se utilizam como coeficientes a diferena entre os mdulos dos fatores de estrutura observados |F(h)|obs e calculados |F(h)|cal conforme a Eq. (32), sendo cal as fases calculadas a partir do modelo, e k um fator de escala6,8.
= ( r ) 1 (k F(h) obs F(h) cal ) exp(ical ) exp(2ih.r ) , V h

(32)

este mtodo feita a diferena entre a densidade eletrnica observada (r)obs e a densidade eletrnica ) (r ) obs (r )cal . A calculada (r)cal , em que (r = partir da Eq. (32) pode ser construdo um mapa de densidade eletrnica do qual podem ser observados novos picos que podem ser atribudos a tomos leves que no haviam sido includos no modelo inicial. Para estruturas contendo um ou mais tomos bem mais pesados em relao aos outros mais leves, os picos correspondentes a estes tomos mais leves ficam confundidos com as flutuaes de fundo, aparecendo somente os picos correspondentes aos tomos pesados, conforme apresentado na Figura 1. Na diferena das densidades eletrnicas estas flutuaes anulam-se, pois so praticamente as mesmas em ambos e, portanto possvel localizar outros tomos. Em certos casos favorveis possvel localizar, mediante esta sntese, a posio dos tomos de hidrognio6,8. As posies atmicas da estrutura molecular inicial, obtidas da primeira soluo, no so resultado direto do experimento de difrao, mas uma interpretao da funo densidade eletrnica calculada a partir da medida das intensidades e dos ngulos de fase de alguma forma determinados inicialmente. Novas fases (h) mais acuradas podem ser calculadas para as posies atmicas, que permitem uma redeterminao da funo de densidade eletrnica (r) com uma preciso maior. Novos tomos podem ser introduzidos e algumas vezes, precisam ser removidos do modelo para o melhor ajuste da funo (r). Quando o modelo atmico est completo, os tomos podem ser descritos como elipsides (refinamento anisotrpico) e as posies de tomos de hidrognio podem ser determinadas ou calculadas geometricamente6,10. Todas as etapas desde a obteno do modelo inicial at a obteno do modelo acurado chamado de refinamento. Proporcionalmente as intensidades coletadas, se
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obtm os fatores estrutura denominados observados |F(h)|obs. Baseado em transformadas de Fourier, um conjunto completo de fatores de estrutura denominados calculado |F(h)|cal obtido a partir do modelo atmico. O refinamento o procedimento de minimizao da discordncia entre os mdulos dos fatores de estrutura observados |F(h)|obs e calculado |F(h)|cal, realizando pequenas modificaes nos parmetros atmicos (portanto das fases (h) calculadas) determinados para a estrutura aproximada3,6,19. O princpio utilizado o dos Mnimos Quadrados10 em que a soma dos erros ao quadrado minimizada atravs da funo M dada pela Eq. (33), onde w o peso atribudo a cada reflexo, inversamente proporcional ao desvio padro h que est associado medida da reflexo h. As intensidades calculadas so ento comparadas com as intensidades medidas, e o melhor modelo aquele que minimiza M.

Figura 1. O fator estrutura F(h) de fase (h) e suas componentes devido a tomos leves Fp(h) e pesados Fl(h).

= M

w
h

F ( h) 2 F ( h) 2 obs cal

(33)

O refinamento um processo interativo na construo do modelo cristalogrfico, guiado pela convergncia e pela consistncia qumica do modelo obtido2,10. Um dos programas mais utilizados para o refinamento de pequenas molculas o SHELXL13, cuja rotina est baseada no esquema da Figura 2. Para utilizar o SHELXL somente dois arquivos de entrada (input) so necessrios: o arquivo de instruo name.ins que contm os dados do cristal, as instrues de refinamento e as coordenadas dos tomos; e o arquivo com os dados de reflexo name.hkl que contm as coordenadas das reflexes medidas no espao recproco hkl e as intensidades F2 com suas incertezas associadas
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(F2). Todos os arquivos aqui citados esto no formato de arquivos de texto do tipo ASCII. Aps alguns ciclos de refinamento com o SHELXL, so gerados dois arquivos principais. Um arquivo name.res com as novas coordenadas fracionrias e parmetros de deslocamento atmicos obtidos, juntamente com os ndices estatsticos utilizados na validao do modelo. O outro arquivo obtido o name.lst que contm informaes mais detalhadas do refinamento. Novos parmetros podem ser includos ou ajustados no arquivo name.res, que poder ser salvo na extenso name.ins, recomeando todo o ciclo at a obteno do modelo esperado10,13. ocasionada pela existncia de mais de uma molcula na unidade assimtrica, a ocorrncia de geminao ou ainda de desordem. Molculas desordenadas possuem fragmentos que apresentam duas ou mais orientaes, ou seja, dois ou mais conjuntos de coordenadas para cada tomo. Um indicativo de estrutura desordenada so valores muito altos os chamados parmetros de deslocamento anisotrpico, Uanis. Os principais tipos de desordem so: substitucional e posicional, esta ltima podendo ser dinmica ou esttica. Na desordem substitucional, um mesmo stio em duas celas unitrias, ocupado por dois tipos diferentes de tomos. Na desordem posicional, um tomo ocupa dois ou mais stios, podendo ser em uma mesma cela unitria (desordem dinmica) ou em duas ou mais celas unitrias diferentes (desordem esttica). Na desordem esttica a mdia do contedo da cela unitria obtida medindo todo o espao sobre diferentes celas unitrias. A desordem dinmica pode ser distinguida da desordem esttica realizando a coleta de dados em duas temperaturas distintas, visto que a vibrao trmica diminui quando a temperatura se reduz. Um caso especial de desordem, chamado mess, ocorre quando grandes vazios ou cavidades no interstcio molecular so preenchidos por molculas do solvente, orientadas de maneira randmica, que no contribuem no padro de difrao j que seu espalhamento difuso. A introduo de desordem no modelo aumenta consideravelmente o nmero de parmetros a serem refinados. Portanto a fim de melhorar o refinamento pode-se utilizar restraints e constraints3,10,18. Constraints so equaes que relacionam ou atribuem valores numricos fixos a dois ou mais parmetros reduzindo o nmero de parmetros independentes a serem refinados. Restraints so ferramentas que permitem ao cristalgrafo introduzir informaes qumicas e fsicas provenientes de outras fontes que no o experimento de difrao de raios X, no processo de refinamento. Os restraints so utilizados a fim de assegurar que certos parmetros geomtricos e de deslocamento trmico estejam dentro da normalidade, restringindo distncias, ngulos de ligao e ngulos torsionais a certos valores. Estruturas desordenadas so freqentemente tratadas e modeladas utilizando os softwares SHELXL-9713 e PLATON20, ambos integrantes do pacote WinGX15.
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Figura 2. Organizao da rotina de refinamento de estrutura utilizando o SHELXL.

Esperava-se que com a evoluo da informtica e dos equipamentos de coleta de dados fossem criadas estratgias automatizadas de refinamento de estruturas, mas um nmero crescente de estruturas tem requerido a interveno e a percepo humana. Se o refinamento de uma estrutura no converge de um jeito normal, algumas possveis aes podem ser executadas. Problemas durante o refinamento aparecem quando os fatores R crescem incontrolavelmente, e os parmetros de deslocamento atmicos assumem valores absurdos, ou mudanas de parmetros fazem a estrutura irreconhecvel. Nos ltimos estgios isto pode significar a extino de alguns parmetros ou ainda que algum parmetro de deslocamento se torne significativamente negativo. Excluso de tomos vlidos geralmente menos prejudicial do que a incluso de falsos, e em qualquer caso, os tomos vlidos reaparecem em mapas posteriores6,10,18. A estrutura cristalogrfica a mdia espacial de todas as molculas sobre o volume de um cristal em um determinado momento. Em muitos casos, partes da molcula so encontradas em mais de uma orientao cristalogrfica. Essa situao pode ser 28
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VALIDAO, ANLISE DO MODELO E DEPSITO NO BANCO DE DADOS CRISTALOGRFICO Por ser a cristalografia uma metodologia estrutural, ocorre durante as etapas de determinao estrutural, uma srie de erros que interferem na validade do resultado obtido. A anlise destes possveis erros feita durante a etapa de validao que ir avaliar a exatido e a preciso desses resultados sendo de grande importncia para a qualidade e confiabilidade das estruturas resolvidas. Outra preocupao est associada qualidade da anlise, e depende, entre outros fatores, da qualidade do cristal, da coleta de dados, da experincia do cristalgrafo e dos programas utilizados. Os critrios analisados so: coerncia qumica na estrutura, o conjunto dos dados, a preciso nas distancias e ngulos de ligao, a qualidade dos ndices estatsticos, a vibrao trmica dos tomos, as interaes intermoleculares, a desordem no cristal e a completeza do espao tridimensional cristalino. ndices estatsticos so utilizados para avaliar a diferena entre o conjunto de dados tericos |F(h)|cal, gerado para o modelo construdo, e o conjunto de dados experimentais |F(h)|obs medido a partir do cristal que contm o erro randmico2,3. Uma avaliao estatstica fazendo uso dos conjuntos |F(h)|obs e |F(h)|cal pode ser feita com Figuras de Mrito, que so ndices estatsticos que indicam a qualidade de uma estrutura cristalogrfica, sempre obtidos pela comparao entre os fatores de estrutura medidos experimentalmente e aqueles calculados teoricamente. O grau com que a distribuio das diferenas entre os conjuntos |F(h)|obs e |F(h)|cal se ajusta aos valores esperados, afetados pelos erros randmicos, pode ser avaliado atravs do teste do X2 (chi-quadrado)3,21, dado pela expresso do Goodness of Fit (Goof) ou simplesmente S (para o SHELXL-97),
2 2 Goof = w F ( h) obs F ( h) cal

tem significado fsico. A unidade seu valor ideal10. O grau de preciso do modelo cristalogrfico construdo e a estrutura real pode ser avaliado pelos ndices de discordncia (residual factors), calculado a partir do quantitativo total desviado entre os conjuntos |F(h)|obs e |F(h)|cal, dado pela Eq. (35).
= R

F ( h) obs F ( h) cal / F ( h) obs

(35)

Para uma estrutura confivel, o valor de R deve estar entre 0,02 e 0,06 aps o refinamento. Elevados ao quadrado todos os fatores de estrutura associados, os correspondentes s reflexes mais intensas tm um peso maior em relao aos correspondentes s reflexes fracas, sendo obtida assim a Eq. (36) com os ndices de discordncia ponderados Rw ou wR2.
2 2 = Rw w F ( h) obs F ( h) cal

) / w ( F (h) )
2 2 obs

2 1/ 2

(36)

) / m n
2

1/ 2

(34)

onde m corresponde ao nmero de observaes e n ao nmero de parmetros independentes refinados (G ou fator de escala, posies atmicas, parmetros de ocupao e outros) utilizados no refinamento pelo mtodos dos Mnimos Quadrados. Goof > 5 indica algum problema com um dos conjuntos |F(h)|obs ou |F(h)|cal e Goof, significativamente menor do que a unidade sugere que o modelo melhor do que os dados e, portanto, no
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Finalizado o trabalho de construo do modelo estrutural, todas as informaes cristalogrficas podem ser armazenadas num arquivo texto comum, respeitando o padro Crystallographic Information File (CIF), adotado em 1991 pela International Union of crystallography (IUCr). Esse formato de arquivo armazena cada informao cristalogrfica atravs de um cdigo para o item no formato ASCII. O senso qumico de uma estrutura cristalina deve ser prioritrio sobre todos os mtodos estatsticos2,10,18. Obtido o modelo cristalogrfico validado e com sentido qumico, so realizadas anlises da geometria molecular (distncias e ngulos entre tomos, e ngulos diedrais), alm de estudos supramoleculares analisando como as molculas se organizam no cristal (estrutura cristalina), em decorrncia das interaes intermoleculares. Estas interaes so mais fracas do que as ligaes intramoleculares (interaes entre tomos em uma mesma molcula que podem ser inica, covalente ou metlica). As interaes intermoleculares incluem interaes eletrostticas fortes (entre ons ou entre ons dipolo), foras de Van der Waals e dentre estas as foras de disperso (foras de London), ligaes de hidrognio, interaes hidrofbicas e outras interaes envolvendo sistemas deslocalizados ou anis aromticos9,22.
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Com exceo das interaes eletrostticas fortes, as ligaes de hidrognio so as interaes de maior energia (460 kj/mol) em cristais moleculares afetando a maneira com que as molculas so empacotadas9. A ligao de hidrognio por si s a mais relevante interao intermolecular na natureza, sendo o principal fator na determinao da estrutura da gua, enovelamento de protenas e emparelhamento das bases no DNA. Esta interao consiste em um tomo de hidrognio que fica entre dois tomos eletronegativos, e um par de eltrons isolados, especificamente nitrognio (N), oxignio (O) ou halognios (F, Cl, Br). As ligaes de hidrognio so altamente direcionais e a energia eletrosttica geralmente o termo de maior contribuio para a sua estabilidade. As ligaes de hidrognio chamadas clssicas incluem os sistemas O-H...O, N-H...O e O-H...N. As chamadas no clssicas so: C-H...O, O-H..., e C-H.... Enquanto que as liagaes de hidrognio O-H...O, N-H...O vem sendo estudadas por dcadas, o mesmo no pode ser dito para as interaes no clssicas como C-H...O, O-H..., que somente a algum tempo vem ganhando aceitao de ser uma genuna ligao de hidrognio23,24. As ligaes C-H...O fazem contribuies energeticamente favorveis para a estabilidade do empacotamento das molculas. Para a identificao destas interaes necessrio a utilizao de critrios tais como distncia doador D / aceptor A e o ngulo D-H...A. A distncia D...A um dos atributos importantes para determinar a existncia deste tipo de ligao e deve ser menor que a soma dos raios de Van der Walls do tomo doador e do tomo aceptor. Assim, para uma ligao de hidrognio entre tomos de carbono e oxignio, se o raio de Van der Walls do tomo de oxignio 1,40 e do tomo de carbono ligado ao hidrognio de 1,84 , ento a distncia C...O deve ser menor que 3,25 para ter uma interao deste tipo. A distncia D/A uma condio necessria, mas no suficiente, pois como mencionado estas interaes so direcionais de forma que o ngulo ao redor do tomo de hidrognio deve ser o mais linear possvel9. Nestas interaes a variao do ngulo aceita est entre 100 e 180. As ligaes de hidrognio so classificadas de acordo com sua topografia como intramolecular, intermolecular ou bifurcada, e de acordo com sua energia, como fraca, moderada e forte. Alm das ligaes de hidrognio intramoleculares, embora menos comum e muitas vezes mais fraca do que as ligaes de hidrognio intermoleculares, tambm podem exercer um impacto 30
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considervel sobre as propriedades moleculares. Elas incluem a estabilidade relativa dos ismeros estruturais, a distribuio de cargas nas molculas, a reatividade e outros. Em uma tpica ligao de hidrognio D-HA o tomo de hidrognio ligado covalentemente a um tomo eletronegativo D, e no-covalentemente a um tomo eletronegativo A. Por causa de sua longa srie de interaes, as ligaes de hidrognio tambm so encontradas entre um doador e dois aceptores, ou entre um aceptor e dois doadores. O primeiro tipo normalmente conhecido como bifurcada9,24. As interaes C-H... so outro tipo de ligaes de hidrognio no clssicas que so frequentemente encontradas no arranjo supramolecular de protenas e pequenas molculas orgnicas contendo eltrons deslocalizados ou anis aromticos. Em uma anlise das interaes C-H... em estruturas depositadas no Protein Data Bank (PDB) foi observado que a maioria delas apresentava uma distncia d (mostrada na Figura 3A) de 3,6 entre o tomo doador e o centro de massa da ligao ou centro de massa de um anel aromtico Cg (centride) sendo observado ainda que para incluir 96% de todos os dados encontrados essa distncia deveria ser ampliada a 4,5 23,24. Como no caso das outras interaes envolvendo tomos de hidrognio, o ngulo C-H...Cg importante e o valor mnimo aceito 120. Ultimamente, vem ganhando ateno e destaque outro tipo interao que ocorre em sistemas aromticos: o empilhamento - tambm conhecido como -stacking (Figura 3B e 3C). Por definio, as interaes - so contatos hidrofbicos que ocorrem entre dois sistemas deslocalizados. De acordo com estudos sobre a natureza das interaes -, ressalta-se que a energia de interao entre as molculas resulta do somatrio de vrias energias que podem ser observadas na Eq. (37)25

ETotal= Eeletrosttico + Einduo + Edisperso + Erepulso .

(37)

A maior contribuio sobre a geometria dessas interaes devido aos efeitos eletrostticos, decorrentes do quanto deslocado estar o sistema de anis e quais so os anis interagentes25. Como pode ser observado na equao, tambm existem outros fatores que contribuem energeticamente. Ressalta-se que pelas informaes
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cristalogrficas no se pode ter acesso a essas energias, mas a distncia que separa as molculas pode ser um parmetro que fornea uma idia do quo forte a interao.

Figura 3. Geometria das interaes entre anis aromticos. (A) interao vrtice-face ou forma T. (B) Empilhamento face a face deslocada. (C) Empilhamento face a face.

trabalho de caracterizao de compostos cristalinos, permitindo o entendimento da relao entre a estrutura e as propriedades fsico-qumicos dos compostos. Atravs dessa metodologia podem-se determinar as posies relativas de todos os tomos que constituem a molcula (estrutura molecular) e a posio relativa de todas as molculas que constituem a cela unitria e o cristal (estrutura cristalina). Pode-se, portanto, estabelecer os ngulos e as distncias interatmicas da estrutura cristalina, bem como as interaes intermoleculares (Van der Waals, dipolo-dipolo, ligao de hidrognio, entre outras interaes no-covalentes). Em casos complexos, assim como estruturas com desordem, pseudo-simetria ou geminao, o conhecimento cristalogrfico, habilidades de refinamento e experincia so de vital importncia para obter estruturas cristalinas de alta qualidade.

Uma das distncias que podem ser utilizadas para identificar uma interao - distncia interplanar, ou seja, a distncia entre dois planos que so formados por sistemas aromticos. Como pode ser observado na 4B, as molculas no se arranjam de maneira alinhada uma sobre a outra, pois isto resultaria em uma repulso entre eltrons . Assim as molculas esto ligeiramente deslocadas, sendo que este deslocamento apresenta um ngulo aproximado de 20. Com isto, outro parmetro a distncia entre centrides Cg, comumente utilizado para estudar as interaes -. O fato deste no ser um contato perpendicular implica que sua distncia sempre seja maior do que a encontrada por um contato interplanar9. Geralmente as distncias Cg...Cg apresentam um intervalo de 3,4 a 3,8 . Porm esta faixa de distncias intecentrides pode assumir limiter inferiores e superiores diferentes destes valores9,25. Aps toda a etapa de validao e anlise de dados, o modelo cristalogrfico no formato CIF, pode ser depositado no banco de dados apropriado. Para pequenas molculas geralmente se utiliza o Cambridge Structural Database CSD mantido pelo Cambridge Crystallographic Data Centre (CCDC). O Protein Data Bank (PDB) utilizado para protenas e macromolculas biolgicas.

Agradecimentos Referncias

Os autores agradecem CAPES pelo apoio financeiro.

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Consideraes finais

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Cincias Exatas e Tecnolgicas, UEG, Caixa Postal 459, CEP 75001970, Anpolis, GO. Instituto de Qumica, UFG, Caixa Postal 131, CEP 74001-970, Goinia, GO. Instituto de Fsica, UFG, Caixa Postal 131, CEP 74001-970, Goinia, GO. *e-mail: william.fernandes@ueg.br

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