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Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento

Comunicado 16 Tcnico
Extrao e Fracionamento Quantitativo de Substncias Hmicas do Solo: um Procedimento Simplificado de Baixo Custo

ISSN 1517-5685 Rio de Janeiro, RJ Outubro, 2003

Foto:Vincius M Benites

Vinicius M. Benites 1 Beta Madari 2 Pedro Luiz O. de A. Machado2

Introduo
A presena de substncias hmicas (SH) no meio ambiente h muito tempo vem sendo observada (Berzelius, 1839; Kononova, 1958; Orlov, 1985; Frimmel & Christman, 1988). A definio de SH no simples e reflete bem a complexidade do material orgnico. SH podem ser definidas como uma srie de polmeros amorfos de colorao amarelomarrom a preta, de peso molecular relativamente alto e formados por reaes de snteses secundrias, biticas e abiticas (Stevenson, 1994). Entretanto, como exposto por MacCarthy (2001), devido ao aspecto vago desta e de outras definies de SH, comum definir tambm estes materiais operacionalmente em termos de procedimentos laboratoriais usados para extra-los de solos, sedimentos e guas. O procedimento clssico de extrao do solo resulta em trs fraes principais: cidos hmicos (AH), cidos flvicos (AF) e huminas. Estas fraes so definidas operacionalmente em relao s suas solubilidades em meio aquoso em funo do pH da soluo extratora (Tombcz & Meleg, 1990). Solues alcalinas, normalmente NaOH 0,1 mol L-1, extraem os cidos hmicos e os cidos flvicos do solo deixando a humina ligada fase mineral. A acidificao
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do extrato alcalino, de colorao preta, resulta na coagulao da frao dos cidos hmicos (precipitado preto ou amarronzado), enquanto a frao dos cidos flvicos permanece solvel (soluo amarela amarronzada) (Foto 1). Embora este esquema de separao parea bastante arbitrrio, consegue-se um certo grau de segregao de materiais polimricos com diferentes propriedades qumicas (McBride, 1994). Nenhuma destas fraes isoladas representa compostos individuais de composio especfica, mas sim uma mistura de compostos heterogneos com comportamento qumico similar. A Tabela 1 sumaria algumas das propriedades qumicas mostrando que a seqncia cidos flvicos - cidos hmicos - humina representa um contnuo crescente de propriedades qumicas, com certa similaridade com a lignina (um polmero aromtico complexo) (McBride, 1994). O termo hmus freqentemente usado como sinnimo de SH, mas h casos em que hmus inclui, por falta de definio correta da nomenclatura, SH e substncias nohmicas como cidos orgnicos de baixo peso molecular (ex. cido ctrico, cido malnico etc), compostos produtos da decomposio da matria orgnica (protenas, lipdeos etc.) e

Pesquisador, DS, Embrapa Solos, Rua Jardim Botnico 1024 - CEP 22.460.000 - Rio de Janeiro/RJ, E-mail:vinicius@cnps.embrapa.br. Pesquisador, PhD, Embrapa Solos, Rua Jardim Botnico 1024 - CEP 22.460.000 - Rio de Janeiro/RJ, E-mail:beata@cnps.embrapa.br,pedro@cnps.embrapa.br.

Extrao e Fracionamento Quantitativo de Substncias Hmicas do Solo

de materiais hmicos e no hmicos (Rice & MacCarthy, 1990) e como tal poderia ser melhor descrita como um material que contm SH do que uma substncia hmica propriamente dita. Apesar de apresentar baixa reatividade, so responsveis por mecanismos de agregao de partculas e na maioria dos solos tropicais representa a maior parte do carbono humificado do solo. O estudo de substncias hmicas no solo desenvolveu-se bastante nas ltimas trs dcadas, graas ao desenvolvimento de novas metodologias e equipamentos (Hatcher et al ., 2001). Atravs de reunies bianuais, o Encontro Brasileiro de Substncias Hmicas vem oferecendo grande contribuio na oferta e organizao da informao sobre as SH no solo e nas guas, sua estrutura e transformao no meio ambiente. Contudo, um dos fatores que tem dificultado maior estudo de substncias hmicas em solos tropicais a falta de organizao e apresentao detalhada de metodologias para a extrao, fracionamento e, especialmente a quantificao das fraes hmicas. A Sociedade Internacional de Substncias Hmicas (IHSS) recomenda um mtodo para a extrao das substncias hmicas de material de solo e posterior fracionamento em cidos hmicos, flvicos e humina, baseado na solubilidade diferencial destas fraes em meio alcalino e cido (Swift, 1996; Machado, 1999). Contudo, este mtodo laborioso e deve ser empregado quando se pretende extrair substncias hmicas com alto grau de pureza para fins de caracterizao. A sugesto que aqui se apresenta o resultado de uma adaptao desta metodologia de extrao e fracionamento, visando a quantificao das fraes hmicas por meio de procedimento simplificado e de fcil execuo. O procedimento foi testado em vrias classes de solos do Brasil e os resultados so considerados satisfatrios para o emprego como anlise de rotina (Benites et al., 2000). As informaes geradas pela adoo desta metodologia podem ser teis em trabalhos de classificao de solos, como indicadores do efeito do manejo ou para estudos de dinmica de carbono no solo (Swift, 2001), fornecendo uma informao complementar ao teor de carbono orgnico total do solo.

Foto 1. Tubos de centrfuga com a frao cido flvico (A) como sobrenadante e a frao cido hmico (B) como precipitado.

produtos metablicos da atividade microbiana freqentemente associados s substncias hmicas (Stevenson, 1994). Tabela 1. Algumas propriedades qumicas importantes das diferentes fraes hmicas.
cidos flvicos Peso molecular (D) C (%) O (%) N (%) Capacidade de troca catinica ( cmol(- ) kg-1 ) 640-5.000 42-47 45-50 2,0-4,1 ~1.400 cidos hmicos 10.000-100.000 51-62 31-36 3,6-5,5 ~500 Humina* >100.000 >62 <30 >5 <500

* Valores da frao humina so aproximados, dada a dificuldade em se eliminar a fase mineral para a anlise elementar. Fonte: McBride, 1994; Schnitzer & Khan, 1978.

Os cidos hmicos e flvicos representam a poro solvel em meio alcalino, de maior reatividade e conseqentemente de maior polaridade. Os cidos flvicos so os compostos hmicos de maior solubilidade por apresentarem maior polaridade e menor tamanho molecular. Estes compostos so os principais responsveis por mecanismos de transporte de ctions dentro do solo, por meio de complexos organo-metlicos, o que caracteriza o processo de queluviao (Duchaufour, 1982). Os cidos hmicos so os compostos hmicos mais estudados e apresentam pouca solubilidade nas condies de acidez normalmente encontradas em solos. Estes compostos so responsveis pela maior parte da CTC de origem orgnica em camadas superficiais de solos. A humina consiste em um aglomerado

Materiais e Equipamentos Necessrios


Para o fracionamento
- Centrfuga refrigerada de alta rotao com rotor para tubos de 50 mL e FCR superior a 5.000 g; - Sistema de filtragem a vcuo com suporte para filtros 47mm de dimetro ou maior; - Bomba de vcuo;

Extrao e Fracionamento Quantitativo de Substncias Hmicas do Solo

- Filtros de membrana em ster de celulose, 0,45 m de poro e 47 mm de dimetro, lisa (ex. Millipore HAWP04700); - Bales volumtricos de 50 mL; - Balana com preciso de 0,0001 g; - Potencimetro; - Tubos de centrfuga de 50 mL com tampa; - Soluo de Hidrxido de Sdio (NaOH 0,1 mol L-1); e - Soluo de cido Sulfrico (H2SO4 20% (v/v)).

Procedimento
Extrao e Fracionamento
- Pesar uma amostra de solo (TFSA) que contenha aproximadamente 30 mg de carbono orgnico total; - Transferir para tubo de centrfuga de 50 mL com tampa e adicionar 20 mL de NaOH 0,1mol L-1; - Agitar manualmente e deixar em repouso (Foto 2); - Centrifugar a 5.000 g por 30 min (Foto 3); por 24 h

Para a determinao do teor de carbono nas fraes


- Bloco digestor com, no mnimo, 40 posies; - Bureta automtica (ou titulador); - Pipetas de 1 e 5 mL (ou pipeta automtica regulvel de 15 mL); - Dispensador de 5 mL; - Frascos Erlenmeyer de 125 mL; - Tubos de digesto com dedos para refluxo (ou bolinhas de gude); - Soluo de Dicromato de Potssio (K2Cr2O7) 0,167 mol L : Dissolver 49,04 g de K Cr2O7 (pr-seco em estufa a 2 105C e conservado em dessecador) em gua e diluir a soluo para o volume de 1.000 mL;
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Foto 2. Tubos de centrfuga de 50 mL com solo e soluo NaOH 0,1 mol L-1, em repouso aps agitao manual.

- Soluo de Dicromato de Potssio (K2Cr2O7) 0,042 mol L -1: Dissolver 12,26 g de K Cr2O7 (pr-seco em estufa a 2 105C e conservado em dessecador) em gua e diluir a soluo para o volume de 1.000 mL; - Indicador de Ferroin 0,025 M: Dissolver 1,465 g de ortofenantrolina monohidrata e 0,985 g de sulfato ferroso amoniacal (Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O) em gua. Completar o volume para 100 mL; - cido sulfrico p.a. (H2SO4 cc., no mnimo 96%); Soluo de sulfato ferroso amoniacal (Fe(NH4)2 (SO4)2.6H2O) 0,250 mol L-1: Dissolver 98,04 g de SFA em 500 mL de gua previamente misturada a 15 mL de H2SO4, resfriar a soluo e diluir ao volume de 1.000 mL. Soluo de sulfato ferroso amoniacal (Fe(NH4)2 (SO4)2.6H2O) 0,0125 mol L-1: Dissolver 4,902 g de SFA em 500 mL de gua previamente misturada a 15 mL de H2SO4, resfriar a soluo e diluir ao volume de 1.000 mL 3.
Foto 3. Tubos de centrfuga com destaque do precipitado (solo + humina) aps centrifugao a 5.000 g.

- Recolher cuidadosamente o sobrenadante em copo de plstico descartvel de 50 mL e reservar4 (Foto 4); - Adicionar mais 20 mL de NaOH 0,1 mol L -1 a cada amostra e agitar manualmente at o desprendimento e ressuspenso do precipitado; - Deixar em repouso por 1 h;
4 O sobrenadante deve ser recolhido imediatamente aps a centrifugao,

3 Este reagente deve ser mantido sob refrigerao e protegido do sol. A

evitando, assim,

a ressuspenso do precipitado. A transferncia do

normalidade desta soluo deve ser corrigida a cada anlise usando o branco sem aquecimento, como descrito a seguir.

sobrenadante deve ser feita com cuidado evitando o desprendimento de material do fundo do tubo de centrfuga.

Extrao e Fracionamento Quantitativo de Substncias Hmicas do Solo

Foto 4. Transferncia quantitativa do extrato alcalino do tubo de centrfuga para os copos plsticos.

Foto 6. Filtragem a vcuo do extrato acidificado para separao das fraes cido hmico e flvico.

- Centrifugar novamente a 5.000 g por 30 min; - Recolher o sobrenadante junto ao previamente reservado (extrato alcalino - pH 13,0); - Reservar o precipitado. - Ajustar o pH do extrato alcalino5 para pH 1,0 ( 0,1), pela adio de gotas de soluo de H 2SO4 20%, dentro do copo plstico de 50 mL (Foto 5); - Decantar por 18 h; - Filtrar o precipitado em filtro de membrana de 0,45 m sob vcuo (Foto 6); - Recolher o filtrado e aferir o volume para 50 mL usando H2O destilada (frao cidos flvicos); e
-1 - Adicionar NaOH 0,1 mol L sobre o precipitado at a 6 lavagem completa do filtro e aferir seu volume para 50 mL usando H2O destilada (frao cidos hmicos) (Foto 7).

Determinao do teor de orgnico total nas fraes


Humina

carbono

- Transferir quantitativamente (sem perdas de material) o precipitado dos tubos de centrfuga de 50 mL para tubos de digesto, utilizando o mnimo de lquido possvel 7 (10 ml); - Secar em estufa aquecida a 65oC (at a secagem completa); - Adicionar 5 mL de K2Cr2O7 0,1667 mol L-1 e 10 mL de H2SO4 concentrado a cada amostra e em quatro tubos vazios (brancos); - Levar os tubos com as amostras e dois dos quatro brancos ao bloco digestor pr-aquecido a 150oC e deixar por 30 minutos, sob exausto; - Transferir quantitativamente o contedo dos tubos de digesto para frascos Erlemeyer de 125 mL (amostras + dois brancos aquecidos + dois brancos sem aquecimento); - Adicionar 3 gotas de indicador FERROIN; - Titular com sulfato ferroso amoniacal 0,25 mol L-1 sob agitao;

5 A acidificao do extrato alcalino deve ser feita o mais rapidamente possvel

evitando a oxidao dos cidos hmicos e flvicos, que normalmente ocorre em meio alcalino. 6 Este procedimento pode ser feito com a bomba de vcuo ligada, o que facilita a operao. O filtro pode ser reutilizado em at 10 amostras dependendo do teor de argila no solo. 7 Usar um volume mnimo de gua na transferncia para evitar que a secagem demore muito tempo. Este trabalho exige um pouco de prtica, especialmente em solos muito argilosos. Aconselha-se a utilizao de um arame de ao para soltar o material do fundo, com cuidado para no arranhar o tubo.

Foto 5. Acidificao do extrato alcalino a pH 1,0 pela adio de soluo H2SO4 20%.

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Clculo: X = (V baq -Vam) N SFAcorr x 12/4 x 1/peso da amostra (g) sendo: X - mg C na forma de humina ( mg de Chumina g-1 solo)

- Levar os tubos com as amostras e dois dos quatro brancos ao bloco digestor pr-aquecido a 150oC e deixar por 30min, dentro de capela - Transferir quantitativamente o contedo dos tubos de digesto para frascos Erlemeyer de 125 mL (amostras + dois brancos aquecidos + dois brancos sem aquecimento) - Adicionar 3 gotas de indicador FERROIN - Titular com sulfato ferroso amoniacal 0,0125 mol L-1 sob agitao. Clculo: X = (Vbaq-Vam)NSFAcorr x 12/4 x 50/alquota (mL) x 1/peso da amostra (g) X - mg C na forma de cido hmico (ou flvico) por grama de solo Vbaq - Volume (mL) de SFA consumido na titulao do branco aquecido Vam - Volume (mL) de SFA consumido na titulao da amostra NSFAcorr - Normalidade do SFA corrigida pela equao: NSFAcorr = Volume de dicromato x Normalidade do dicromato Volume de SFA consumido na titulao do branco sem aquecimento

Vbaq - Volume (mL) de Sulfato Ferroso Amoniacal (SFA) consumido na titulao do branco aquecido Vam - Volume (mL) de SFA consumido na titulao da amostra NSFAcorr - Normalidade do SFA corrigida pela equao:

NSFAcorr = Volume de dicromato x Normalidade do dicromato Volume de SFA consumido na titulao do branco sem aquecimento

Foto 7. Bales volumtricos de 50 mL com as fraes cido flvico (FAF) e cido hmico (FAH).

Foto 8 . Copos plsticos com as fraes cido hmico ( esquerda) e as fraes cido flvico correspondentes ( direita).

cidos hmicos e flvicos (Foto 8)


- Transferir uma alquota de 5mL da soluo de cido hmico ou flvico para tubos de digesto 8, utilizando uma pipeta automtica (a alquota pode ser diluda em gua nas amostras mais concentradas sem se esquecer de considerar nos clculos) - Adicionar 1mL de K2Cr2O7 0,042 mol L-1 e 5mL de H2SO4 concentrado a cada amostra e em quatro tubos contendo 5mL de H2O destilada (brancos)
8 No caso de amostras muito concentradas (pode ser estimado pela colorao

do extrato) utilizar alquotas menores (ex. 2mL) completando-se o volume para 5mL com gua destilada.

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Comentrios Gerais
Neste mtodo, ao contrrio do que se faz no procedimento usado para extrao de substncias hmicas para fins analticos, no so eliminados os compostos orgnicos de baixo peso molecular (COBPM) e nem a matria orgnica leve (MOL). Desta forma, estas formas orgnicas estaro contidas em um das trs fraes hmicas determinadas e isto pode limitar o mtodo para solos onde no haja quantidade muito grande de uma destas formas (ex. Organossolos so ricos em MOL). A MOL normalmente considerada como humina, em virtude de sua insolubilidade em solvente alcalino. Os COBPM so co-extrados com os cido flvicos e, por isso, a utilizao do termo frao cidos flvicos utilizada para mostrar que o carbono determinado nesta frao no exclusivamente formado por substncias hmicas (Malcolm, 1990). Da mesma forma, como no feita a purificao dos cidos hmicos, esta frao denominada frao cidos hmicos, por conter compostos no humificado co-extrados. O mtodo tem sido aplicado a uma srie de amostras de diferentes classes de solos (Benites et al., 2000). Os resultados demonstram que a tcnica razoavelmente replicvel, sendo encontrados coeficientes de variao mdio de 15%. Cuidados especiais devem ser tomados na determinao do carbono nas fraes (ex. homogeneidade no aquecimento dos tubos de digesto) evitando maiores coeficientes de variao. O somatrio das fraes apresenta variaes entre 90 e 105% do teor de carbono orgnico total. Normalmente, em trabalhos de pesquisa cientfica, so efetuadas trs repeties de extrao e apenas uma nica determinao de carbono em cada frao por repetio suficiente. A metodologia aqui descrita permite a anlise de 36 amostras por semana com um nico operador. A partir dos resultados obtidos (teores de carbono na forma de frao cidos flvicos, frao cidos hmicos e humina) podem ser derivadas algumas variveis como teores percentuais em relao ao carbono orgnico total e as relaes entre fraes: Relao AH/AF - a relao entre os teores de carbono na forma de cidos hmicos e cidos flvicos que indica a mobilidade do carbono no solo. Em geral os solos mais arenosos apresentam maiores relaes AH/AF indicando a perda seletiva da frao mais solvel (FAF). Relao EA/HUM - a relao entre o extrato alcalino (cidos flvicos mais cido hmicos) e a humina. Este ndice indica iluviao de matria orgnica e nos horizontes espdicos so encontrados as maiores relaes EA/HUM (Benites et al., 2001) enquanto em horizontes superficiais as relaes EA/HUM so em geral menores que 1.

Referncias Bibliogrficas
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Comunicado Tcnico, 16
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Expediente

Supervisor editorial: Jacqueline Silva Rezende Mattos Reviso de texto: Andr Luiz da Silva Lopes Tratamento das ilustraes: Jacqueline S. R. Mattos Editorao eletrnica: Jacqueline S. Rezende Mattos

1 a edio 1 a impresso (2003): 300 exemplares