Conceptos bsicos en Inmunohematologa

Dr E Muiz-Diaz
Laboratorio de Inmunohematologa
Banc de Sang i Teixits
Barcelona (Espaa)
Inmunohematologa
La IH es la parte de la Hematologa que se ocupa de los
procesos inmunes relacionado con las clulas sanguneas.
Estos procesos estn producidos por anticuerpos (Acs) que
reaccionan con antgenos (Ags) presentes en la membrana
de las clulas sanguneas.
Los Acs son inmunoglobulinas: las de clase IgG e IgM son
las ms habituales.
Los antgenos (Ags) son estructuras de la membrana
(proteinas, glcidos, lpidos, o combinaciones de ellos) con
capacidad inmunognica: capaces de desencadenar una
respuesta inmune.
Inmunohematologa
Los Ags y los Acs son los grandes protagonistas de la IH, y los
estudios inmunohematolgicos realizados para el diagnstico
de los procesos inmunes de la sangre se basan en poner en
evidencia la reaccin Ag-Ac.
Reaccin Ag-Ac
Ags en los
Hemates
Anticuerpos Aglutinacin
Hemlisis
Inmunohematologa. Antgenos.
La parte del Ag que reacciona con el Ac es el determinante antignico
o eptopo.
Cada antgeno est constituido por un nmero variable de eptopos.
Inmunohematologa. Antgenos.
Los Ags presentes en
los hematies son los
Ags eritrocitarios.
Los Ags de las
plaquetas son los Ags
plaquetarios.
Los Ags de los
granulocitos son los
antgenos
granulocitarios.
G
R
U
P
O
S
S
A
N
G
U

N
E
O
S
Los Ags codificados por
un mismo Gen, o por genes
homlogos muy prximos
entre s
Sistema de
grupo sanguneo
Inmunohematologa. Anticuerpos.
Los Acs son proteinas
plasmticas que se producen
en respuesta a un antgeno.
Al realizar un proteinograma
aparecen varias bandas, con
2 grandes fracciones
correspondientes a la
albmina y a las globulinas
(1, 2, 1, 2 y ).
Los Acs se sitan en la
fraccin denominada , y por
su relacin con la inmunidad
se denominan
Inmunoglobulinas (Ig).
Inmunoglobulinas
Las Igs est formadas por 4
cadenas, dos pesadas y dos
ligeras, debido a su peso
molecular, que estn unidas
por puentes disulfuro.
Cada cadena tiene una regin
constante en todas las Igs y
una variable.
Se conocen 5 clases de Igs
(IgG, IgM, IgA, IgD, IgE) que
se diferencian entre s por la
cadena pesada.
Regin Fab
Regin Fc
Inmunoglobulinas
Importancia clnica de los Acs
Los Acs ms importantes en
transfusin e IH son los de
clase IgG e IgM, y muy de
lejos, IgA.
Los Acs de clase IgG son
incompletos porque no son
capaces de aglutinar
espontneamente a los
hematies.
Los Acs de clase IgM son
completos o aglutinantes
porque son capaces de
aglutinar espontneamente a
los hemates.
Clasificacin de los Acs segn su origen
Naturales. Aparecen sin estimulacin detectable.
La mayora son IgM, o bien mezclas de IgG+IgM.
Regulares. Aparecen siempre que se carece del antgeno
correspondiente (ABO).
Irregulares. No siempre aparecen cuando no se posee el
Ag (P1, Le, E...).
Inmunes. Se detectan despus de un estmulo
antignico (transfusin, embarazo...). Son casi
siempre IgG.
Tambin son Acs irregulares.
Clasificacin de los Acs segn el Ag
contra el que van dirigidos
Aloanticuerpos: Dirigidos
contra un Ag extrao no
presente en la persona que lo
produce.
Los Acs dirigidos contra los
Ags eritrocitarios. Anti-Rh(D)
en un indivduo Rh(D-).
Autoanticuerpos: Dirigidos
contra un Ag propio.
Son los responsables de los
procesos autoinmunes.
Procesos en IH que exigen la deteccin de Acs
IH eritrocitaria
Pruebas de compatibilidad transfusionales
Enfermedad hemoltica del RN
Anemia hemoltica autoinmune
IH plaquetaria
Trombocitopenia neonatal aloinmune
Prpura postransfusional
Prpura trombocitopnica autoinmune (PTAI)
IH granulocitaria
Neutropenia neonatal aloinmune
Lesin pulmonar aguda-AT (TRALI)
Neutropenias autoinmunes
Aloanticuerpos
Aloanticuerpos
Aloanticuerpos
Aloanticuerpos
Aloanticuerpos
Aloanticuerpos
Autoanticuerpos
Autoanticuerpos
Autoanticuerpos
Una regla bsica en el diagnstico
inmunohematolgico
La deteccin de un aloanticuerpo en el suero de un
paciente exige, siempre que sea factible, la confirmacin
de la ausencia del correspondiente antgeno.
Por ej. Una gestante portadora de anti-D debe ser Rh(D-).
1. Investigaremos la presencia de anticuerpos en su suero
Suero problema + hematies de grupo conocido Rh(D+ y D-)
2. Comprobaremos la ausencia del Ag en la gestante
Ac conocido (anti-RhD) + hemates de la gestante
La reaccin Ag-Ac es la base del
diagnstico inmunohematolgico
Los resultados posibles de
la reaccin Ag-Ac pueden
ser:
Aglutinacin
Hemlisis.
Las tcnicas empleadas
para poner en evidencia
estos fenmenos son
fundamentalmente las
tcnicas serolgicas.
Hemlisis
Aglutinacin
Tcnicas serolgicas: Aglutinacin
Es el agregado de hemates que se forma cuando las
molculas de Ac se unen a los determinantes antignicos
(Ags) de mltiples clulas adyacentes.
Algunas molculas son capaces de unirse a los Ags y de interaccionar con
otras molculas induciendo la aglutinacin final (IgM).
Otras molculas slo se unen a su antgeno pero no son capaces de hacerlo
con sus vecinas y de producir la aglutinacin (IgG).
Tcnicas serolgicas: Aglutinacin
La aglutinacin es un
proceso qumico reversible
que se produce en dos
fases:
Fase de Sensibilizacin: unin del
Ac con el Ag.
Fase de Aglutinacin: formacin
de puentes entre las clulas
sensibilizadas hasta constituir la
red que conduce a la aglutinacin.
Son muchos los factores que
inciden en estas dos fases y
que podemos manipular para
aumentar, o disminuir, la
aglutinacin.
Factores que afectan a la fase de
Sensibilizacin
1. Temperatura.
2. pH.
3. Tiempo de incubacin.
4. Tipo de anticuerpo: clase de Ig.
5. Proporcin de Ag y Ac.
6. Constante de afinidad del anticuerpo.
1. Temperatura
Los Acs IgG reaccionan de
forma ptima a 37C
(calientes).
Los Acs IgM reaccionan de
forma ptima a 4C o a TA.
(fros).
2. pH
El pH ptimo para la reaccin
est entre 6.9 y 7.2.
Algunos Acs necesitan de un
medio cido para actuar.
3. Tiempo de incubacin
El estado de equilibrio sin
potenciadores es de 15 a 60
min.
4. Tipo de Anticuerpo
IgM: aglutinante en solucin
salina.
IgG: no aglutinante. Habr
que potenciar la aglutinacin.
5. Proporcin de Ag y Anticuerpo
Tiene que haber una relacin
entre el nmero de molculas
de Ac y el de lugares
antignicos.
6. Constante de afinidad del Ac
A mayor afinidad del Ac mayor
es la velocidad de asociacin y
ms lenta la disociacin.
Factores que afectan a la fase de
Aglutinacin
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
CARGA POSITIVA:
CATIONES DEL MEDIO
HEMATIE
CARGA NEGATIVA:
SIALOGLICOPROTEINAS
DE LA MEMBRANA
1. Intensidad inica del
medio (Potencial Z).
El potencial Z es la
diferencia de potencial entre
el hemate cargado
negativamente y la nube de
cargas positivas del medio.
Es el responsable de la
fuerza de repulsin de los
hemates.
2. Tipo de Ac
Los IgM siempre aglutinan.
Los IgG raramente (segn la
localizacin del eptopo del Ag).
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
nube de
iones Ig G
Ausencia de
aglutinacin
Ig M
Aglutinacin
35 nm
25 nm
14 nm
anticuerpo
incompleto
anticuerpo
completo
Potenciadores de la reaccin Ag-Ac
Souciones de baja fuerza inica (LISS)
- Aceleran la fase de sensibilizacin al disminuir la carga negativa.
- Suele requerir una sustancia no inica para evitar la hemlisis (Glicina).
Albmina
- Reduce la repulsin entre clulas (potencial Z) favoreciendo la aglutinacin.
- Hace posible que Acs IgG sean capaces de unir hemates adyacentes.
Enzimas
- Bromelina, ficina, papaina,tripsina, pronasa y neurominidasa.
- Reducen la carga negativa. Hacen aglutinantes a los Acs IgG.
- Mejoran el acceso a los lugares antignicos.
Molculas cargadas positivamente
- Son polmeros que aportan un exceso de carga positiva: polybrene, sulfato de
protamina, poli-L-Lisina, que pueden producir una aglutinacin espontnea.
- Pueden dar falsos positivos.
PEG
- Es un polmero soluble que potencia la reaccin Ag-Ac eliminando el agua que hay
alrededor de los hemates.
- til para la deteccin de Acs de clase IgG.
El test de la antiglobulina (Test de Coombs)
En 1945 Coombs, Mourant y Race disearon una tcnica
para poner en evidencia a los Acs que no eran capaces de
aglutinar directamente a los hematies (IgG).
1. La base es la utilizacin de un suero anti-Inmunoglobulina
humana o, anti-C, (suero antiglobulina) que acta como un
puente de enlace entre los Acs que se han fijado.
2. Originalmente se emple para demostrar anticuerpos Rh(D)
incompletos o no aglutinantes (IgG) en el suero.
3. Posteriormente, para detectar la sensibilizacin in vivo de
hemates por anticuerpos, o factores del C, (autoanticuerpos)
en pacientes afectos de Anemia hemoltica autoinmune.
Es el test ms importante en Inmunohematologa
Inyeccin
plasma humano o de
Igs especficas
Suero de Coombs:
anticuerpos contra las
fracciones Fc de las Igs humanas
Antiglobulina Poliespecifica / Polivalente: Anti-Igs (mayorit. IgG) + C3d
Antiglobulina Monoespecifica: Anti IgG, anti IgM, anti IgA, anti C3d
Cmo se obtiene la antiglobulina humana?
Aplicaciones de la tcnica de la antiglobulina
Prueba directa
AHAI: autoacs.
Hemlisis inducida por
frmacos.
EHRN: RN con CD+.
Reacciones aloinmunes:
- Ac fijado a hemates
transfundidos.
Prueba indirecta
Tipificacin:
-Ac conocido y Ag desconocido.
Deteccin e identificacin
de Acs:
-Ac desconocido y Ag
conocido.
Pruebas cruzadas.
TEST DE LA ANTIGLOBULINA HUMANA
Test directo:
Indicaciones:
Anemia hemoltica autoinmune
Enfermedad hemoltica del recin nacido
Hemlisis por frmacos
Reacci hemoltica post-transfusional
TEST DE LA ANTIGLOBULINA HUMANA
Test indirecto:
suero
paciente
hematies
reactivo
hematies
sensibilizados
anticuerpos
anti-IgG y/o C
aglutinacin
Indicaciones:
Deteccin e identificacin de anticuerpos anti-eritrocitarios
Pruebas de compatibilidad pre-transfusional
Tipificacin de antgenos eritrocitarios que no son visualizados
por aglutinacin directa
Sensibilizacin: reaccin Ag-Ac
El suero antiglobulina se une al fragmento Fc de los Acs IgG
El suero antiglobulina acta como puente entre los Acs IgG
favoreciendo la aglutinacin
Aglutinacin final
Comparacin entre el Coombs Directo
e Indirecto
La prueba exige una incubacin previa
(suero+hemates) antes de aadir la
antiglobulina humana.
Los hemates son examinados
directamente con la antiglobulina
humana.
La tcnica requiere 2 pasos. La tcnica requiere 1 paso.
La sensibilizacin de los hemates
se ha provocado al incubar el suero
en estudio con los mismos.
La sensibilizacin se ha producido
espontneamente en el organismo del
paciente.
Detecta Acs (IgG) y/o C fijados
a los hemates, procedentes del
suero en estudio.
Detecta Acs (IgG) y/o C
directamente fijados a los
hemates en estudio.
Coombs Indirecto Coombs Directo
Mtodos para observar la Aglutinacin
La tcnica en tubo Es la tcnica estndar
Ventajas
Se pueden aadir aditivos
Permite la manipulacin
Es visible la hemlisis
Desventajas
La aglutinacin es inestable
Requiere experiencia en la
manipulacin y lectura cuidadosa 4+ 4+ 3+ 2+ 1+ 0
Mtodos para observar la Aglutinacin
Aglutinacin en columna / tarjeta La columna contiene gel, microesferas...
Utilizan aditivos (LISS) para potenciar la reaccin Ag-Ac y reducir el tiempo
de incubacin.
La reaccin es semipermanente y puede evaluarse horas-das despus.
Ventajas
Entrenamiento mnimo y poca
manipulacin.
Se requieren pocos reactivos.
Desventajas
Requiren equipamiento
Muy sensibles
Equipamiento en la tcnica de
aglutinacin en columna
Prinicipio de la aglutinacin en Gel
Ejemplo de tipificacin de unos hematies Kell+
y de unos hemates Kell- con anti-K
Hemates K+
Hemates K-
Hemates K+
Hemates K-
Ejemplo de tipificacin de unos hematies Kell+
y de unos hemates Kell- con anti-K
Hemates K+
Hemates K-
Ejemplo de tipificacin de unos hematies Kell+
y de unos hemates Kell- con anti-K
Hemates K+
Hemates K-
Ejemplo de tipificacin de unos hematies Kell+
y de unos hemates Kell- con anti-K
Hemates K+
Hemates K-
Ejemplo de tipificacin de unos hematies Kell+
y de unos hemates Kell- con anti-K
Hemates K+
Hemates K-
Ejemplo de tipificacin de unos hematies Kell+
y de unos hemates Kell- con anti-K
Hemates K+
Hemates K-
Ejemplo de tipificacin de unos hematies Kell+
y de unos hemates Kell- con anti-K
Hemates K+
Hemates K-
Ejemplo de tipificacin de unos hematies Kell+
y de unos hemates Kell- con anti-K
8 88 8 Se utilizan microplacas
de plstico con 96 pocillos.
8 88 8 Permite automatizacin.
8 88 8 Muy til para grandes
series.
Tcnica en fase slida en microplacas
Mtodos para observar la Aglutinacin
Tcnica en Fase Slida (Microplaca)
Hemates o estromas
eritrocitarios de composicin
antignica conocida, fijados en los
pocillos de una
microplaca.
Se aade el suero a estudiar y se
incuba; posteriormente
se lava la placa para eliminar el
exceso de anticuerpo.
El anticuerpo fijado se detecta
aadiendo un reactivo de
antiglobulina conjugado en enzima
o con hemates
sensibilizados recubiertos con
antiglobulina.
Ventajas:
- Sensibilidad parecida al PEG
- Larga caducidad
- Lectura de resultados automatizable.
Desventajas:
- La fase de lavado de las microplacas es delicado.
- Se puede automatizar, pero encarece los costes.
- No es prctica para muestras aisladas.
- Ideal para series largas de muestras.
Tcnica en Fase Slida (Microplaca)
El Complemento
Es un sistema de 25-30 proteinas sricas y de la membrana que
actan en cascada para producir diversos efectos biolgicos,
entre ellos la lisis de los hemates.
Se encuentran en estado inactivo o de proenzimas, y tras su
activacin se convierten en enzimas activos.
La activacin se produce:
por va clsica: reaccin Ag-Ac
por va alternativa: bacterias, virus, proteinas o carbohidratos ajenos.
Nueve componentes estn numerados de C1 a C9.
Activacin completa del Complemento
C1qrs rompe C4 y C2 en 2 fragmentos: C4a y C4b y C2a y C2b.
C4b y C2a se unen para formar la C3 covertasa que rompe C3 en C3a y C3b.
C3 convertasa se une a C3b para formar la C5 convertasa que rompe C5 en dos
fragmentos, etc.
El complejo de proteinas de ataque lo forman el grupo de C5 a C9 que acaban
produciendo agujeros en la misma y la hemlisis subsiguiente.
Activacin incompleta del
Complemento (C3d)
Jka
Macrfago
Fc de Igs
Hemate
Receptor macrofgico para el receptor Fc
Jk
a Jka
C1q
C1r
Ca
++
C1s
Ca ++
C4b
C2a
C3b
Receptor macrofgico para C3b
Macrfago
Hematie
Reaccin transfusional
Reaccin
retardada
Reaccin
inmediata
Habitualmente extravascular
Anti-Jka y anti-Jkb
Intravascular / Extravascular
anti-A y anti-B
IgG
IgM
Activacin completa del C
Activacin incompleta del C
Tcnicas moleculares. Aplicaciones
1. En pacientes transfundidos o con Coombs directo positivo
podemos determinar el genotipo. (Ej. Hemoglobinopatas).
2. Definir las variantes RhD y confirmar el carcter positivo o
negativo de la muestra.
3. Confirmar el grupo ABO en las discordancias srico-hemticas.
4. Buscar donantes con determinados genotipos (Ej. Dombrock)
cuando no se dispone de antisueros.
5. Determinar la zigosidad exacta de clulas de Panel (Ej. Fy(a+b-)
puede ser Fy
a
/Fy
a
, Fy
a
/Fy, Fy
a
/Fy
x
.
6. Anlisis del genotipo fetal: RhD, Rhc, K. Permite aplicar un
programa profilctico racional.
La tcnica ms comn es la PCR: PCR-ASRA, PCR-ASP, Discriminacin
allica con tecnologa Taqman.
http://booksmedcos.org
Gracias por su atencin
Barcelona vista desde el Parque Gell