UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS-ESPE FACULTAD DE CIENCIAS DE LA VIDA INGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA INFORME DE LABORATORIO

Nombre: Karla Vizuete A. Practica N: 5 Fecha: 22/11/2013

Materia: Microbiologa II Curso/Paralelo: 6to.

1. TEMA: Anlisis de agua: Coliformes totales.

2. INTRODUCCIN: OBJETIVOS: i. Objetivo General: Realizar un anlisis de agua de coliformes totales a partir de muestras recolectadas en la Universidad de las Fuerzas Armadas-ESPE. ii. Objetivos especficos: Determinar el nmero ms probable (MPN) de coliformes presentes en 100ml de muestra de agua. Detectar la presencia de coliformes en las muestras de agua y relacionarla con la seguridad para el consumo humano.

JUSTIFICACIN:

El agua es uno de los elementos bsicos para el desarrollo de la vida humana en el planeta, diariamente consumimos litros de ella para actividades bsicas como el baarse, cocinar alimentos o para saciar la sed. Sin embargo el rpido aumento de la densidad poblacional y el crecimiento industrial hace que el agua segura, aceptable, fsicamente accesible y asequible para uso personal y domstico escasee cada da mas, por esta razn los humanos han tenido que tratar las aguas residuales y convertirlas en agua apta para el consumo humano (PNUD, 2006). Empero, no todos los pases que recurren a este recurso para abastecerse cuentan con la tecnologa necesaria para purificarla totalmente, por lo que las enfermedades transmitidas por el agua por contaminacin fecal son objeto de creciente preocupacin, por esta razn la microbiologa se ha convertido en una herramienta clave para determinar si el agua es apta o no para el consumo humano, esto ocurre gracias a la tcnica de determinacin de

coliformes totales ya que este tipo de microorganismos se asocian con la contaminacin fecal y por lo tanto con bacterias que causan enfermedades entricas como el clera, la fiebre tifoidea y la disentera bacilar (Olivas & Alarcn, 2004; OPS, 1988).

MARCO TERICO:

El agua potable alberga una gran cantidad de bacterias, la mayora de estas no afectan la salud de los seres humanos, sin embargo cuando se confirma que el agua contiene microorganismos como Vibrio cholerae, Salmonella typhi o Shigella dysenteriae se considera que esta no es apta para el consumo humano ya que estos patgenos intestinales son causantes de enfermedades que pueden llegar a ser mortales como la fiebre tifoidea, clera y disentera bacilar (Daz, 2008). La contaminacin del agua por excrementos humanos o animales constituye el mecanismo ms comn para la trasmisin de patgenos entricos a las personas ya sea de forma directa, como beber esta agua, o indirecta, a travs de la preparacin de alimentos. Por esta razn, el principal objetivo de realizar un examen microbiolgico del agua potable es la deteccin de contaminacin fecal (OPS, 1988). Detectar patgenos intestinales en el agua mediante anlisis rutinarios puede ser una tarea difcil o casi imposible, por lo que se desarroll un mtodo indirecto de identificacin de materia fecal, el que se basa en demostrar la existencia de bacterias intestinales no patgenas como Escherichia coli, Enterobacter aerogenes y Sstreptococcus fecalis, este tipo de microorganismos estn siempre presentes en los intestinos y por consecuencia en la heces humanas y animales, pero no se encuentran comnmente en el suelo o en el agua (Olivas & Alarcn, 2004). Los indicadores ms comunes para este tipo de pruebas pertenecen al grupo de las bacterias coliformes (Escherichia, Enterobacter, Citobacter y Klebsiella) que son bacilos Gram negativos aerobios o anaerobios facultativos, no formadores de esporas, la principal caracterstica para identificarlos es su capacidad para fermentar lactosa y producir cido y gas en medios de cultivo solido o liquido despus de 48 horas de incubacin a 35C (Martnez, s.f.). El principal mtodo de identificacin de coliformes en el agua consiste en tres pruebas: Prueba presuntiva: Se basa en la formacin de gas a partir de lactosa, para esta prueba se usa caldo lactosado simple (SL) o doble (DL) con campana de Durham. Estos tubos deben ser inoculados con volmenes de muestra que comnmente son mltiplos o

submltiplos de 1ml. Debe controlarse la formacin de gas a las 24 y 48 horas, si a las 48 horas no existe formacin de gas la prueba es negativa. Adems en esta prueba se puede obtener el nmero ms probable de coliformes presentes en 100ml de agua. Prueba confirmatoria: Para esta prueba se utilizan medios que permiten el desarrollo selectivo de coliformes inhibiendo el desarrollo de otros microorganismos que no son de inters como el Endo agar o el medio EMB. Si las colonias que se desarrollaron en EMB son de colores metlicos o con centros negros la prueba confirmatoria es positiva. Prueba completa: A partir de las colonias sembradas en EMB que presenten caractersticas tpicas de coliformes se vuelve a inocular tubos de fermentacin en caldo lactosado con campana de Durham y en agar inclinado, si se confirma la produccin de gas a partir de lactosa y que estas bacterias son Gram negativas no formadoras de esporas se puede afirmar con certeza que la presencia de coliformes en la muestra ( bid.).

HIPTESIS:

La muestra AL es apta para el consumo humano mientras que la muestra AL no lo es. . 3. MATERIALES Y MTODOS:

Se recolect las muestras de agua en la Universidad de las Fuerzas Armadas-ESPE, ubicada en la ciudad de Sangolqu, Pichincha-Ecuador, la primera muestra fue de agua corriente de la ESPE, se la etiquet bajo las letras AL y la segunda del agua de la pileta decorativa del edificio administrativo de la universidad (AS), en ambos casos las muestras fueron recogidas en recipientes estriles evitando la contaminacin proveniente del operador. Se llev las muestras al Laboratorio de Microbiologa y se realiz la prueba presuntiva inoculando 9 tubos con campana de Durham (la prueba se realiz para las dos muestras recolectadas), tres tubos con caldo SL con 1ml de muestra, tres tubos con caldo SL con 0,1ml y 3 tubos con caldo DL con 10ml de muestra, se evalu la presencia de gas en las campanas de Durham a las 48 horas, con los tubos que mostraron presencia de gas se continu con la prueba confirmatoria, se sembr el caldo lactosado sobre agar EMB, despus de 24 horas de incubacin de observ que las colonias presenten las caractersticas tpicas de coliformes; se sembr estas colonias en medio SIM y MRVP y en caldo lactosado.

4. RESULTADOS Y OBSERVACIONES: Despus de 48 horas de incubacin, los resultados de la prueba presuntiva fueron los siguientes:
Tabla 1. Resumen de resultados de la Prueba Presuntiva de ambas muestras.

Nmero de Muestra Caldo Volumen inoculado tubos con presencia de gas SL AS SL DL SL AL SL DL 1ml 0,1ml 10ml 1ml 0,1ml 10ml 0 0 2 0 0 0

Se utiliz la informacin mostrada en el Anexo1 para determinar que existen 9 bacterias coliformes por cada 100ml de agua AS y tambin que no existen coliformes en la muestra AL. A continuacin se muestran los resultados de la prueba confirmatoria.

Se observ colonias con centros obscuros y de color verde metlico, caractersticas propias de coliformes.

Imagen 1. Siembra de AS en agar EMB.

Las colonias presentaron centros obscuros pero no coloraciones metlicas lo cual descarta la presencia de coliformes en la muestra.

Imagen 2. Siembra de AL en agar EMB.

Los resultados de la prueba completa fueron:

Tabla 2. Resumen de resultados de la Prueba Completa de la muestra AS.

PRUEBA Motilidad Indol Rojo de Metilo VP

RESULTADO + + + -

Imagen 3. Muestras de AS. Tubo A: prueba VP negativa. Tubo B: prueba MR positiva. Tubo C: prueba de Indol positiva.

5. DISCUSIN: Roldn y Ramrez (2008) mencionan que la muestra de agua debe ser tomada a una profundidad de 20cm y evitar los remansos y la cercana de las orillas, adems que la recoleccin debe hacerse en envases previamente esterilizados y la muestra debe procesarse antes de las 24 horas, el ensayo realizado se cumpli con estos requerimientos en la toma de muestras y se proces tres horas despus de la recoleccin. Por otro lado, Olivas y Alarcn (2004) afirman que en la prueba presunta si despus de la incubacin se observa fermentacin y presencia de gas en cualquiera de los tubos (al menos uno), se presume que existen coliformes en la muestra de agua, en la prueba presuntiva para la muestra AS se observ la presencia de gas en dos tubos con caldo doble lactosa inoculado con 10ml de muestra por lo que se presumi que haban coliformes en el agua, en la prueba presuntiva de la muestra AL no se observ gas en ninguno de los tubos con campana de Durham por lo que se asumi que no existen coliformes en dicha agua. Para comprobar la ausencia de coliformes en la muestra AL se sembr en agar con eosina y azul de metileno (EMB) y se obtuvo colonias con centros negros pero de mismo color del medio, no con colores metlicos, se repiti la siembra obtenindose los mismos resultados, por esta razn se confirm que la muestra no contiene microorganismos fermentadores de lactosa (coliformes) ya que no se evidencio las caractersticas tpicas de las colonias de coliformes en este medio, estas se encuentran descritas en el manual de uso del agar EMB publicado por la Laboratorios Britania en el 2010. Comparando con la misma bibliografa, las colonias obtenidas de la siembra de la muestra AS en agar EMB si presentaron las caractersticas de bacterias Gram negativas con colonias de color verde metlico, estos confirmaron la existencia de bacterias fermentadoras de lactosa por lo que se continu con la prueba completa para diferenciar entre Escherichia coli y Enterobacter aerogenes. Un estudio de la Universidad de Zulia afirma que, bajo las condiciones de siembra e incubacin apropiadas, E. coli es positivo para las pruebas de Indol y Rojo Metilo pero negativo para Voges-Prokauer, mientras que E. aerogenes es negativa para Indol y Rojo Metilo y positiva para Voges-Prokauer, comparando con los resultados del ensayo se concluy que la muestra AS contiene Escherichia coli.

CONCLUSIONES:

El agua corriente de la ESPE (AL) es apta para el consumo humano. El agua de la pileta de la ESPE (AS) no es apta para el consumo humano. El NMP de coliformes en 100ml de la muestra AS es de 9 bacterias. El agua obtenida de la pileta de la ESPE presenta contaminacin fecal ya que se evidenci la presencia de E. coli en la muestra AS.

6. BIBLIOGRAFA: Daz, C. (2008). Calidad microbiolgica del agua. Colombia: Universidad Nacional de Colombia. Olivas, E., Alarcn, R. (2004). Manual de prcticas de Microbiologa bsica y Microbiologa de alimentos: Programa de nutricin. Mxico: Universidad Autnoma de Jurez. Organizacin Panamericana de la salud (OPS). (1988). Guas para la calidad del agua potable. Vol 3. Control de la calidad del agua potable en sistemas de abastecimiento para pequeas comunidades. Disponible en el URL: http://hdr.undp.org/en/media/03-Chapter%202_ES.pdf [Consulta: 18 de Noviembre de 2013] Programa de las Naciones Unidas para el desarrollo (PNUD). (2006). Informe sobre Desarrollo Humano 2006. Ms all de la escasez: Poder, pobreza y la crisis mundial del agua. Mxico: Mundi-Prensa. Roldn, G. & Ramrez, J. (2008). Fundamentos de la limnologa neotropical. Segunda edicin. Espaa: Universidad de Antioquia. (s.n.). (2010). Levine E.M.B. Agar (con Eosina y Azul de Metileno). Laboratorios Britania. Disponible en el URL: http://www.britanialab.com/productos/231_hoja_tecnica_es.pdf [Consulta: 19 de Noviembre de 2013] (s.n.). (2003). Microbiologa de la lecha II. Universidad de Zulia. Venezuela. Disponible en el URL: http://www.revistavirtualpro.com/files/ti22_200512.pdf [Consulta: 19 de Noviembre de 2013]
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7. ANEXO: Anexo1. ndice del NMP y lmite confiable de 95% para varias combinaciones de resultados positivos y negativos para la prueba de tubos mltiples. Tomado de http://www.upemor.edu.mx/labo/tarchivos/archivos/HEAL/practica_7.pdf