Centro Universitrio Fundao Santo Andr Faculdade de Filosofia, Cincias e Letras

CURSO: CINCIAS BIOLGICAS

MICROBIOLOGIA Atividades Prticas

4 ANO

NOME:

N:

Profa. Dra. Mrcia Zorello Laporta Profa. Me. Priscila Reina Siliano da Silva 2006

ndice

Normas adotadas no laboratrio de Microbiologia ............................................................................ 2 Atividade 1 Tcnica da Colorao de Gram ................................................................................... 3 Atividade 2 Colorao de Cpsula ................................................................................................ 6 Atividade 3 Colorao de Esporos ................................................................................................ 8 Atividade 4 Colorao de BAAR (Mtodo de Zielh-Neelsen) ............................................................ 10 Atividade 5 Colorao de Espiroqueta........................................................................................... 12 Atividade 6 Preparo de Meios de Cultura ...................................................................................... 15 Atividade 7 Tcnicas de Inoculao.............................................................................................. 19 Atividade 8 Leitura dos Experimentos de Semeadura ..................................................................... 27 Atividade 9 Tcnicas de Semeadura em Placa aps Diluio ........................................................... 31 Atividade 10 Tcnica de Semeadura em Placa Pour-Plate ............................................................... 33 Atividade 11 Isolamento e Identificao de Enterobactrias .......................................................... 35 Atividade 12-A Leitura e Interpretao dos Testes Bioqumicos....................................................... 36 Atividade 12-B Leitura e Interpretao dos Testes Bioqumicos....................................................... 41 Atividade 13 Semeadura em Meio gar Sangue............................................................................. 43 Atividade 14 Tcnica de Semeadura em Anaerobiose..................................................................... 45 Atividade 15 Reduo do Azul de Metileno.................................................................................... 46 Atividade 16 Antibiograma .......................................................................................................... 48 Atividade 17 Ao de Antisspticos sobre Microorganismos ............................................................ 53 Atividade 18 Conjugao bacteriana............................................................................................. 55 Atividade 19 - Preparao para Estudos Microscpicos de Fungos ..................................................... 56 Atividade 20 Microcultivo de Fungos ............................................................................................ 58 Atividade 21 Estudo dos Vrus ..................................................................................................... 61

MICROBIOLOGIA NORMAS ADOTADAS NO LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA As aulas prticas de microbiologia tm como objetivo ensinar ao estudante os princpios e os mtodos utilizados em um laboratrio de microbiologia. Nessas aulas trabalharemos com uma variedade de bactrias, algumas patognicas para o homem. Portanto, essencial seguir as normas de segurana estabelecidas para um laboratrio de microbiologia, a fim de se evitar contaminao dos estudantes, professores e funcionrios. 01. Usar sempre avental. No utiliz-lo fora do laboratrio, caso tenha sido contaminado acidentalmente. 02. Manter cabelos longos sempre presos. 03. Desinfetar a bancada de trabalho no incio e trmino de cada aula prtica. Para essa finalidade, utiliza-se lcool 70%. Com este procedimento, os microrganismos que poderiam contaminar as culturas na rea de trabalho so removidos. 04. Lavar as mos ao entrar e sair do laboratrio e sempre que suspeitar de contaminao. 05. No comer, beber, fumar, aplicar cosmticos, mexer em lentes de contato ou colocar objetos (lpis, dedo etc) na boca. Comer ou fumar so meios eficientes para uma autocontaminao. Se a bancada, equipamentos ou instrumentos tiverem sido contaminados acidentalmente com qualquer microrganismo, comunique imediatamente ao seu professor. 06. Cuidado ao utilizar o bico de gs. Ao acender, verificar se no existem substncias inflamveis por perto. Ao trmino da aula, desligar corretamente o gs. 07. Flambar alas, agulhas e pinas antes e aps o uso. A correta flambagem dos materiais, evita a formao de aerossis. 08. No utilizar pipeta sem a devida proteo de algodo. Isso evita que voc seja contaminado se estiver pipetando uma cultura bacteriana em caldo. 09. No colocar materiais contaminados (pipetas, lminas etc.) sobre a bancada. Estes materiais devem ser colocados em recipientes apropriados que sero dispostos em cada bancada. 10. Seguir as normas de uso dos aparelhos. O microscpio um instrumento de trabalho valioso e deve ser manipulado cuidadosamente. 11. Avisar ao professor em caso de contaminao acidental ou qualquer outro tipo de acidente. 12. Cada aluno responsvel pelo material que receber.

ATIVIDADE 1 TCNICA DA COLORAO DE GRAM INTRODUO A colorao de Gram uma das principais tcnicas utilizadas para a visualizao microscpica da forma e dos arranjos dos diferentes tipos de bactrias. Considerado um mtodo diferencial, permite classificar as bactrias em Gram positivas ou Gram negativas, de acordo com as propriedades tintoriais da clula bacteriana. MATERIAL material retirado da boca iogurte fermento Fleischmann (fermento Sacharomyces biolgico) ou fungo culturas bacterianas corante para o Gram lminas de vidro PROCEDIMENTO a) Preparao dos esfregaos: Para Meios Lquidos (iogurte, fermento em gua, cultura bacteriana em caldo). Com auxlio da ala de platina estril, colocar 2 - 3 alquotas das amostras em meio lquido, numa lmina de vidro. Espalhar bem sobre a superfcie da lmina, fazendo movimentos circulares. Flambar a ala e deixar a lmina secar temperatura ambiente. Para Meios Slidos (culturas bacterianas em placa) Com auxlio da ala de platina, colocar uma gota de soluo salina na superfcie de uma lmina de vidro. Flambar a ala, deixar esfriar e colher crescimento bacteriano. Misturar na gota de soluo salina, fazendo uma suspenso homognea. Flambar a ala e deixar a lmina secar a temperatura ambiente. ala bacteriolgica cotonetes violeta genciana lugol lcool 95 fucsina ou safranina recipiente para a colorao de Gram

cerevisae

Para Material Retirado da Boca Friccionar a superfcie da mucosa oral com um cotonete estril. Fazer um esfregao com o material coletado, na superfcie de uma lmina de vidro, com movimentos circulares. Deixar secar temperatura ambiente. b) Fixao dos Esfregaos Quando estiverem secos, os esfregaos so fixados, passando as lminas 3 vezes pela chama de um bico de gs. Deixar esfriar e corar. c) Colorao de Gram Cobrir o esfregao com soluo de cristal violeta. Aguardar 1 minuto e desprezar o corante no recipiente. Cobrir com lugol, aguardar 1 minuto e desprender o corante no recipiente. Inclinar a lmina, gotejar lcool etlico a 95% at que no haja desprendimento de corante. Lavar a lmina rapidamente em gua corrente.

 Cobrir com fucsina ou safranina. Aguardar 30 segundos e lavar a lmina. Secar com papel toalha sem esfregar a lmina. Observar ao microscpio inicialmente ao menor aumento e depois colocar 1 gota de leo mineral na lmina e focalizar com objetiva de imerso. Desenhar as bactrias observadas considerando o tipo de colorao (Gram + ou -), a forma e o arranjo das clulas. Aps o uso, a objetiva de imerso deve ser limpa com papel absorvente. RESULTADOS Desenhe o que voc observou

iogurte caldo

fermento

cultura bacteriana em

cultura bacteriana em placa Complete a tabela abaixo. Material iogurte

material retirado da boca

Morfologia

Arranjo

Gram

fermento

cultura em caldo

cultura em placa

material da boca

DISCUSSO 1. Complete a tabela seguinte, descrevendo o que ocorre na colorao de Gram. Bact ria Soluo cristal violeta lugol lcool fucsina Gram + Gram -

2. Como voc explica o comportamento das bactrias G + e G - na colorao de Gram?

3. As bactrias do gnero Mycobacterium no se coram pelo mtodo de Gram. Qual seria o motivo?

4. Sabe-se que se ocorrer um aquecimento exagerado no momento da fixao do esfregao, as bactrias G+ passam a se comportar como G-. Por que isso ocorre?

5. Em geral, os corantes no penetram nas clulas vivas. Qual a relao entre esta informao e as etapas que voc seguiu para realizar a colorao de Gram?

6. Quem idealizou o mtodo de Gram? Qual a primeira bactria a ser visualizada com esta tcnica?

ATIVIDADE 2 COLORAO DE CPSULA INTRODUO Certas bactrias Gram + e Gram - produzem cpsula, camada viscosa, externa parede celular. Essa estrutura no constitui carter morfolgico permanente, aparecendo somente sob certas condies de cultura. A cpsula constitui um dos antgenos de superfcie das bactrias e geralmente formada por polissacardeos e mais raramente por protenas. A cpsula pode ser visualizada por colorao negativa onde estruturas que no so coradas, so visualizadas contra um fundo escuro. MATERIAL culturas recentes de bactrias vermelho congo 25 mg/mL cido hidroclordrico 0,15 mol/L-1 fucsina de Ziehl-Neelsen lminas de vidro ala bacteriolgica

PROCEDIMENTO (Mtodo de White modificado) Colocar 1 a 2 gotas de vermelho congo na extremidade de uma lmina de vidro. Misturar uma alada da cultura bacteriana no vermelho congo. Com auxlio de outra lmina de vidro, espalhar a mistura por toda a lmina, formando uma pelcula fina. Aquecer fracamente para secar. Cobrir a lmina que contm a pelcula com cido hidroclordrico. Retirar o excesso do cido, aquecendo rapidamente. Cobrir com fucsina de Ziehl-Neelsen por 10 a 15 segundos. Retirar o excesso de corante e secar delicadamente com papel toalha. Observar ao microscpio. RESULTADO Desenhe o observado e coloque legendas.

Cultura A

Cultura B

DISCUSSO 1. Por que a tcnica denominada colorao negativa?

2. Qual a forma das bactrias em A? E em B?

3. Se eu fizer colorao para cpsula o que posso dizer sobre o Gram da bactria?

ATIVIDADE 3 COLORAO DE ESPOROS INTRODUO Esta colorao baseia-se no grau de afinidade que a estrutura do esporo possui ao corante, comparada com o resto da clula bacteriana, tornando possvel sua diferenciao. O esporo bacteriano uma clula de parede espessa formada no interior de algumas bactrias. muito resistente ao calor, dessecao e a outros agentes qumicos e fsicos; capaz de permanecer em estado latente por longos perodos e, em seguida, germinar, dando origem a uma nova clula vegetativa. O esporo , portanto, mais resistente s condies desfavorveis do meio que a clula vegetativa. A estrutura do esporo constituda de uma primeira camada interna, prximo ao cerne do esporo - a parede do esporo -, composta de peptidoglicano, a qual vai dar origem parede da clula vegetativa, por ocasio da germinao. Envolvendo a parede do esporo fica a crtex, camada espessa, composta de um peptidoglicano existente na parede da clula que o originou. Externamente ao crtex fica a capa do esporo, estrutura rgida composta de protena rica em ligaes de dissulfetos intramoleculares; ela confere resistncia aos agentes qumicos. A camada mais externa recebe o nome de exsporo e consiste numa membrana lipoprotica que contm aminoacares. MATERIAL cultura bacteriana cultura de solo em meio lquido e slido verde malaquita safranina lminas de vidro ala bacteriolgica

PROCEDIMENTO (mtodo de Wirtz-Conklin) fazer um esfregao da cultura bacteriana em lmina e de cultura de solo em outra. secar ao ar. fixar pelo calor. corar a quente durante 6 minutos, com soluo aquosa de verde malaquita: aquecer at a emisso de vapores. lavar suavemente em gua corrente. corar com safranina, por 30 segundos. lavar suavemente em gua corrente. secar ao ar e observar ao microscpio.

RESULTADO Desenhe o observado com legendas.

Cultura bacteriana em caldo

Cultura de solo

DISCUSSO 1. Em qual cor visto o esporo? E a clula vegetativa?

2. Por que a colorao com verde malaquita feita a quente?

3. A clula vegetativa retm o verde malaquita aps a 1 lavagem com gua? E o esporo?

4. Qual a funo da safranina?

10

ATIVIDADE 4 COLORAO DE BACTRIAS LCOOL CIDO RESISTENTES (MTODO DE ZIEHLNEELSEN) INTRODUO Atravs desta colorao, podemos visualizar um grupo restrito de bactrias que possuem sua parede celular constituda de grande concentrao de lipdeos, devido presena de ceras e cidos graxos (cidos miclicos). O mecanismo da colorao de Ziehl-Neelsen est relacionado com a estrutura e a composio da parede celular de um grupo de bactrias. Estas bactrias possuem a parede celular constituda de lipdeos complexos (cidos graxos e ceras); provvel que sejam os responsveis pela propriedade de lcool cido resistncia. Quando os lipdeos so removidos pelo ter, perde-se esta propriedade. Durante a colorao, a fucsina se fixa firmemente a certos lipdeos da parede celular, no sendo removida durante a lavagem com lcool-cido. Essas bactrias ficam, portando, coradas de vermelho. As bactrias que no contm alto teor de lipdeos complexos na sua parede celular no retm a fucsina durante a lavagem de lcool cido; portanto, adquirem a cor do corante de fundo que o azul-de-metileno. MATERIAL BCG (bacilo de Calmette e Guerin) Mycobacterium bovis material retirado da boca fucsina de Ziehl-Neelsen lcool-cido clordrico azul de metileno lminas de vidro ala bacteriolgica cotonete estril

PROCEDIMENTO cobrir esfregao seco e fixado pelo calor com fucsina de Zielh-Neelsen; aquecer em chama at emitir vapores. A partir disto, iniciar a contagem de cinco minutos; lavar a lmina em gua, suavemente; cobrir com lcool-cido clordrico, por um minuto; lavar a lmina com gua: cobrir o esfregao com azul-de-metileno (durante um minuto); lavar a lmina com gua; deixar secar e observar ao microscpio com a objetiva de imerso.

IMPORTANTE O aquecimento no deve ser muito drstico, a ponto de ferver o corante, mas apenas at ligeira emisso de vapores. A colorao de fundo feita para corar bactrias e outras estruturas, descoradas prelo lcool-cido.

11

RESULTADO Desenhe o observado e coloque legendas.

BCG DISCUSSO 1. Complete a tabela abaixo:

Material retirado da boca

Solues em ordem de aplicao 1 - Fucsina de Ziehl 2 - lcool - cido clordrico

3 - azul de metileno

Reao e aspectos da bactria BAAR BNAAR Bactrias coradas em Bactrias coradas em ______ ________ A fucsina no se fixa nos A fucsina se fixa nos lipdeos complexos e no abandona a componentes da parede celular e abandona a clula, que clula, que permanece permanece sem corante no seu _________ interior A clula no afetada e A clula adquire o corante, permanece ___________ tornando-se ___________

2. Por que os BAAR se coram em vermelho e os outros no BAAR se coram em azul?

12

ATIVIDADE 5 COLORAO DE ESPIROQUETA (MTODO DE FONTANA-TRIBONDEAUX) INTRODUO A tcnica utilizada o mtodo de Fontana-Tribondeaux, que no propriamente um processo de colorao, mas, sim, de impregnao pelo nitrato de prata. De fato, estes microorganismos no possuem afinidade pelos corantes comumente empregados, razo pela qual coram-se com muita dificuldade. As espiroquetas so bactrias espiraladas, delgadas e flexveis. As mais finas medem aproximadamente de 0,1 a 0,2 m de dimetro e, assim, no podem ser vistas ao microscpio comum, a no ser em campo escuro ou quando tratadas com sais de prata, que se deposita na superfcie da bactria e as tornam mais espessas. Assim as espiroquetas coram-se em marrom-escuro ou negras sobre um fundo castanhoamarelado. MATERIAL material retirado da boca material retirado do aqurio soluo fixadora lcool absoluto mordente (soluo de tanino) soluo de nitrato de prata amoniacal lminas de vidro cotonete estril

PROCEDIMENTO 1. Colorao de espiroquetas colocar material da boca na lmina e deixar secar ao ar livre ( no fixar pelo calor ); cobrir a lmina com algumas gotas de soluo fixadora e renov-la durante 30 a 60 segundos. cobrir com lcool absoluto e deixar evaporar; cobrir com soluo de tanino (mordente), aquecendo a lmina at a emisso de vapores, durante 30 segundos; lavar em gua corrente / gua destilada; tratar pela soluo de nitrato de prata amoniacal, durante 10 a 15 segundos e em seguida aquecer ligeiramente a lmina, at o desprendimento de vapores, por 30 segundos (a preparao deve adquire a cor marrom); lavar bem em gua destilada; secar com papel-filtro, sem aquecer; examinar com objetiva de imerso.

2. Preparao a fresco Colocar 1 a 2 gotas de gua de aqurio numa lmina e cubra com lamnula. Observar ao microscpio com objetiva de imerso.

13

RESULTADO Desenhar o observado com legendas.

Material da boca

Material retirado de aqurio

DISCUSSO 1. Qual o princpio da colorao para espiroquetas?

2. Qual o objetivo da preparao fresco de espirilos?

3. Aps ter realizado as atividades de colorao das bactrias, monte uma tabela com os seguintes dados: - nome da colorao; - microorganismo utilizado; - corantes utilizados; - tipo de colorao.

14

Para classificar os tipos de colorao, considere as seguintes informaes: 1. Colorao simples: um nico corante aplicado sobre o esfregao fixado, corando toda a clula. 2. Colorao diferencial: utilizada uma combinao de corantes, o que possibilita observar as diferenas qumicas entre os diferentes tipos de bactrias. 3. Colorao estrutural: utilizam corantes que coram apenas uma parte da clula o que permite distingui-la das demais.

15

ATIVIDADE 6 PREPARO DE MEIOS DE CULTURA INTRODUO Os meios de cultura destinam-se ao cultivo artificial dos microorganismos. Estes meios fornecem os princpios nutritivos indispensveis ao seu crescimento. As exigncias nutritivas esto relacionadas a uma fonte de carbono, de nitrognio, de energia e de sais minerais. Alguns microorganismos tambm necessitam de fatores de crescimento que so substncias que eles no podem sintetizar, tais como vitaminas, aminocidos, etc. Outras condies inerentes ao meio de cultura necessrio ao desenvolvimento so as condies de pH, presso osmtica e grau de umidade. De um modo didtico, podemos classificar os meios de cultura em diversos tipos, mas na prtica vemos que vrios deles se enquadram em mais de um tipo. Lquido: Thioglycollate medium (THIO), Quanto Brain Heart Infusion (BHI) a Consistncia Semi-Slido: Sulfeto Indol Motilidade (SIM) Slido: Manitol Salt gar (MSA), gar Sangue (AS) Enriquecedor: BHI, AS Quanto Meios de Cultura a Diferenciadores: MC, AS funo Manuteno: Nutriente gar (NA) Animados: cultura celular Quanto Natureza Inanimados: Natural: leite Sintticos: MSA Semi-sintticos: AS Seletivos: MSA, Mac Conkey (MC)

Meio Lquido: aquele em que os nutrientes esto dissolvidos em uma soluo aquosa e desprovido de gar (polissacardeo extrado de algas). Meio Semi-Slido: este meio possui na sua composio, alm dos nutrientes, gar em porcentagem de 0,5 a 0,7%. Meio Slido: um meio que possui na sua composio nutrientes e em torno de 15 g de gar. Meio Enriquecedor: aquele que permite o crescimento de microorganismos exigentes que necessitam de fatores de crescimento, mas no inibem o crescimento de outros. Este meio, alm das fontes nutritivas usuais, citadas anteriormente, pode possuir sangue, soro ou extratos teciduais. Meio Seletivo: aquele que contm substncias que inibem o crescimento de certos microrganismos, porm permitem o crescimento de outros. Pode ser adicionado no meio cristal violeta e outros. Meio Diferenciador: este meio possui substncias que evidenciam uma caracterstica que permite identificar um grupo ou uma espcie de microorganismo. Meio de Manuteno: este meio mantm os microorganismos viveis, sem que ocorra uma grande multiplicao que poderia provocar morte celular, devido eliminao de substncias

16

txicas como produtos de metabolismo de microorganismos. Por exemplo, normalmente o meio de manuteno no apresenta glicose porque sua utilizao resulta na eliminao de cidos que podem prejudicar os microorganismos. Meio animado: formado de clulas vivas (animais de laboratrio, tecidos vivos ou ovo embrionrio). Meio inanimado: no possui clulas vivas. O natural aquele que contm substncias provenientes da natureza e o sinttico formado por substncias qumicas preparadas em laboratrio. Semi-sinttico: formado pela unio de componentes naturais e sintticos. (ex.: gar sangue). enorme a quantidade de meios recomendados para o cultivo de microorganismos e a escolha feita pelo laboratorista. Os meios usados devem ser frescos e, a no ser em casos especiais, conter ainda umidade. Ao preparar meios de cultura, deve-se ter em mente alguns fatores que podem interferir em um resultado satisfatrio de crescimento bacteriano, tal como o pH que, geralmente, o do meio final, pronto para inoculao e determinado temperatura ambiente. Outro fator que influencia na preparao a temperatura. Ao preparar um meio de cultura, no podemos manter temperatura ambiente uma soluo no estril por mais de uma hora, devido a dois problemas: possibilidade de evaporao de gua e crescimento microbiano. O meio seria contaminado com metablitos bacterianos e teria sua composio inicial alterada: alguns componentes so utilizados pelas bactrias e os demais, pelo efeito da evaporao, se concentram. As solues no estreis, no podem tambm, ser mantidas em altas temperaturas antes de serem autoclavadas, por exemplo, dentro de autoclave quente, esperando o momento conveniente para iniciar a autoclavao, uma vez que haver quebra de vrios ingredientes do meio. Nesta atividade, voc vai preparar quatro tipos de meios de cultura, a partir de produtos desidratados: gar nutriente, caldo nutriente e gar-gar. MATERIAL POR GRUPO Balana digital 2 tubos de ensaio 13 x 100 mm (para o meio lquido) 2 tubos de ensaio 13 x 100 mm (para o meio semi-slido) 2 tubos de ensaio 16 x 100 mm (para o gar inclinado) 2 placas de Petri esterilizadas 1 pipeta de 5 mL 3 pipetas de 10 mL 2 bqueres de 50 mL (meio lquido e meio semi-slido) 1 balo de vidro (125 mL) ou erlenmeyer de 125 mL algodo em rama para tampes papel alumnio 1 estante para tubos de ensaio sacos plsticos para embalar os meios de cultura em placa 3 esptulas de madeira 1 trip e tela de amianto frasco contendo gar nutriente (em p) frasco contendo caldo nutriente (em p) frasco contendo gar-gar (p) gua destilada

PROCEDIMENTO Preparo do meio lquido Preparar os tampes de algodo para os tubos de ensaio.

17

Calcular a quantidade do caldo nutriente desidratado necessrio para preparar os 2 tubos de ensaio, com 2 mL de meio lquido cada um. Indicar os clculos no espao abaixo.

Pesar o meio, transferir para o bquer, acrescentar a quantidade de gua destilada necessria. Dissolver o meio, aquecendo-o em bico de Bunsen. Distribuir 2 mL do meio dissolvido em cada tubo. Tampar os tubos com os tampes de algodo. Autoclavar a 121C por 15 minutos.

Preparo do Meio Slido em Placa Preparo do Meio Slido em Tubo (gar inclinado) Calcular a quantidade de gar nutriente desidratado suficiente para preparar 2 placas de Petri, considerando que sero colocados 10 mL de meio em cada placa e, suficiente tambm para preparar 2 tubos 16 x 100 mm contendo 4 mL de meio slido (gar inclinado). Deixar os clculos indicados no espao abaixo.

Pesar o meio desidratado e transferir para um erlenmeyer. Acrescentar a quantidade de gua destilada necessria para o preparo do meio slido em placa e em tubo. Aquecer para completa dissoluo. Com uma pipeta, distribuir 4 mL de meio para cada tubo. Tamponar os tubos. Tamponar o erlenmeyer com o meio restante. Autoclavar por 15 minutos a 121 C. Distribuir, aproximadamente 10 mL do meio de cultura esterilizado em cada placa de Petri estril. Este procedimento dever ser realizado prximo chama de um bico de Bunsen para evitar contaminao. Manter as placas na posio horizontal at completa solidificao do meio. Manter os tubos de ensaio com o meio slido em posio inclinada, at completa solidificao do meio.

Preparo do Meio Semi-Slido Calcular a quantidade de caldo nutriente desidratado necessria para preparar 2 tubos de ensaio, contendo 2,5 mL de meio cada. Calcular a quantidade de gar necessria para obter uma concentrao de 0,7% no meio a ser preparado.

18

Deixar os clculos indicados no espao abaixo.

Pesar o caldo nutriente desidratado e o gar e transferir para o bquer. Acrescentar a quantidade de gua destilada necessria para o preparo do meio semi-slido. Aquecer para completa dissoluo. Com uma pipeta, distribuir 2,5 mL do meio em cada tubo. Tampar os tubos com os tampes de algodo. Autoclavar por 15 minutos a 121C. Manter os tubos em posio vertical at a completa solidificao do meio.

Identificao dos Meios Identificar os meios de cultura com o nmero de seu grupo e de sua turma. Armazenamento dos Meios As placas sero acondicionadas em sacos plsticos. Todos os meios sero armazenados em geladeira. DISCUSSO 1. Por que a esterilizao realizada a 121C e no a 100C?

19

ATIVIDADE 7 TCNICAS DE INOCULAO Como descrito, os microorganismos necessitam de um meio de cultura adequado para seu crescimento in vitro. Mas, alm dos componentes presentes no meio, outros fatores interferem no seu desenvolvimento: so fatores ambientais como temperatura e tenso do oxignio. Inoculando um microorganismo em um meio de cultura que possua todos os requisitos nutritivos e fatores ambientais adequados, o microorganismo inicia seu desenvolvimento neste meio, passando pelas diversas fases da curva de crescimento: latncia, logartmica, estacionria. A fase logartmica (exponencial) caracterizada por divises sucessivas (cissiparidade ou binria), podendo originar, em meios slidos, um grupamento de bactrias da mesma espcie, denominado colnia. A colnia bacteriana visualizada sem o auxlio do microscpio, como cada espcie possui um tipo morfolgico colonial diferente, as colnias podem ser analisadas quanto elevao, forma, tamanho, bordas e pigmentao. Denomina-se cultura pura quando observado um nico tipo de colnia no meio, e cultura mista, quando se observam vrios tipos de colnias. Em microbiologia, h vrias tcnicas de inoculao, dependendo do objetivo que se quer atingir. Nessa atividade, voc vai aprender essas tcnicas e para que servem. MATERIAL culturas bacterianas em caldo e em placa. ala de inoculao. agulha (fio) de inoculao. meios de cultura lquido, slido em tubo (gar inclinado), slido em placa, semi-slido, preparados pelos alunos.

IMPORTANTE As seguintes normas devem ser seguidas nas inoculaes dos meios de cultura: a) o fio e a ala de platina devem sempre ser flambados antes e depois de qualquer inoculao, ou seja, devem ser aquecidos ao rubro no cone interno da chama do bico de Bunsen. Para a coleta de material, devem ser esfriados na parte interna do recipiente com meio de cultura: b) os recipientes (tubos de ensaio, placas de Petri, etc.) com meio de cultura devem sempre ser abertos prximos ao bico de Bunsen: c) a boca dos tubos de ensaio deve ser aquecida aps a retirada e antes da colocao da tampa. A tampa nunca deve ser colocada sobre o balco, sendo retirada e mantida segura pelo dedo mnimo da mo direita durante a inoculao. PROCEDIMENTO Identifique todos os meios semeados. Utilize as letras constantes das figuras.

20

1. Tcnica de semeadura em meios lquidos Inocular as culturas bacterianas em caldo e em placa em um meio lquido, com auxlio da ala de platina.

21

2. Tcnica de semeadura em meio slido inclinado Inocular a cultura bacteriana em caldo em um meio inclinado fazendo estrias na superfcie do gar, utilizando a ala de platina.

C - Caldo -----> ala ------> gar inclinado

D - placa ------> gar inclinado

22

3. Tcnica da semeadura em meio semi-slido (picagem profunda) Inocular a cultura de bactrias em caldo em um meio semi-slido utilizando o fio: a inoculao dever ter a profundidade de 2/3 do meio e no dever ser mais do que uma nica picada.

E
fio

4. Tcnica de semeadura em meio slido em placa (tcnica de esgotamento) A tcnica do esgotamento em placa consiste em depor sobre um ponto da superfcie do meio uma alquota do material e depois espalh-lo em dois ou trs setores, por meio de ala de platina, sem recarreg-la, de maneira a obter quantidades progressivamente menores do material. Temos que obter rarefao suficiente do material, de modo a formar colnias perfeitamente isoladas.

23

Esta tcnica de semeadura esquematizada a seguir:

O sucesso da semeadura est em: a) grande nmero de estrias; b) no perfurar o meio; c) no voltar a ala sobre a estria d) pegar pequena quantidade de material para semear. Inocular as culturas bacterianas em caldo e em placa, em placas com gar nutriente.

24

IMPORTANTE: SEMPRE DEIXE O MATERIAL PRXIMO CHAMA PARA EVITAR CONTAMINAO EXTERNO.

25

26

DISCUSSO 1. Qual a funo dos meios de cultura?

2. Quais so as exigncias bsicas de um microorganismo?

3. Quanto consistncia, como esto classificados os meios de cultura?

4. O que um meio seletivo?

5. Como se classifica um meio constitudo por clulas vivas?

6. Aps preparar um meio de cultura, adequado deix-lo dentro de uma autoclave aquecida, antes da autoclavao?

7. Alm dos nutrientes presentes no meio de cultura que outros fatores podem interferir no crescimento bacteriano?

27

8. O que voc entende por de crescimento bacteriano?

9. Observe o seguinte grfico:

3 4
n de bactrias

Tem po

Grfico 1 Curva de crescimento bacteriano num meio de cultura Um aluno quer estudar a produo de uma enzima por uma bactria. Utilizou para isso uma cultura bacteriana na fase de crescimento 4. Voc concorda? Justifique.

10. Utilizando um cotonete estril, um aluno recolheu bactrias da garganta de outro aluno. Qual das tcnicas de semeadura apresentadas, seria adequada para obteno de uma cultura pura?

11. Quais as vantagens de se usar meios slido, lquido e semi-slido?

12. A partir do crescimento no meio semi-slido, como poderamos proceder para identificar a bactria?

28

ATIVIDADE 8 LEITURA DOS EXPERIMENTOS DE SEMEADURA MATERIAL Meios semeados na aula anterior Ala bacteriolgica Lupas

PROCEDIMENTO MEIO LQUIDO Para realizar a leitura dos resultados desta tcnica devem-se observar os seguintes itens: a) Quantidade de crescimento: pode ser escassa, moderada ou abundante. b) Distribuio de crescimento no meio de cultura: pode ter crescimento uniformemente distribudo (nitidamente turvo); crescimento confinado superfcie do meio como uma espuma ou filme (pelcula); ou crescimento acumulado como sedimento que pode ser granuloso ou viscoso. c) Odor: pode ser ptrido, aromtico, ou desprezvel. Registrar os resultados no quadro abaixo: A Cultura bacteriana em meio lquido para meio lquido Bactria a b c B Cultura bacteriana em placa para meio lquido Bactria a b c item item

C - MEIO GAR INCLINADO Para avaliar a leitura dos resultados desta tcnica deve-se observar os seguintes itens: a) Quantidade: pode ser descrita como escassa, moderada ou abundante.

29

b) Margem ou bordos do crescimento: pode ser descrita como uniforme ou ntida, ou mostrando vrias irregularidades. c) Consistncia da massa de crescimento: pode ser butrica ou de consistncia semelhante de manteiga, facilmente removvel com a ala de platina: viscosa ou mucide; seca ou quebradia. d) Cromognese ou pigmentao: pode ser opaca, translcida ou com pigmento.

Bactria a b c d

item

D - MEIO SEMI-SLIDO O modo de se observar um resultado quando utiliza-se esta tcnica o seguinte: Resultado positivo: h crescimento por todo o meio de cultura, semelhante a um "pinheiro invertido". Resultado negativo: h crescimento somente no local da inoculao. Registrar o resultado no quadro abaixo: Bactria Resultado

Interpretao: O meio de cultura utilizado foi o mesmo do item anterior (AN), sendo que o objetivo foi o de verificar a locomoo das bactrias; para tal, foi colocada uma quantidade menor de gar (7,5 g por 1000 mL de gua).

30

MEIO DE CULTURA SLIDO EM PLACA (TCNICA DE ESGOTAMENTO) RESULTADO Quando h desenvolvimento de colnias isoladas na superfcie do meio, considera-se o isolamento correto. Neste mtodo verificam-se as caractersticas de colnias quanto aos seguintes aspectos: a) tamanho: o tamanho das colnias varia desde dimenses muito pequenas (puntiformes), com apenas uma frao de milmetros de dimetro, at colnias muito grandes, com 5 a 10 mm de dimetro. Outras bactrias, como, por exemplo Proteus sp espalham-se sobre toda a superfcie do gar. b) borda: a periferia das colnias bacterianas pode formar muitos desenhos diferentes, dependendo da espcie. Pode ser inteira, ondulada, lobulada, denticulada ou franjada. c) elevao: as colnias podem ser achatadas, espraiadas, convexas (baixa e alta), umbilicada, centro saliente. d) cromognese ou pigmentao: opaca, translcida ou com pigmento. e) forma: as colnias podem ser circulares, irregulares ou rizides. f) consistncia da massa de crescimento: pode ser butrica ou de consistncia semelhante da manteiga, facilmente removvel com a ala de inoculao: viscosa ou mucide; seca ou quebradia. Anotar seus resultados no quadro abaixo: E Cultura de caldo para placa Bactria Caractersticas das colnias Isoladas ou no a b c d e f

31

F Cultura de placa para placa Bactria Caractersticas das colnias Isoladas ou no a b c d e f

32

ATIVIDADE 9 TCNICAS DE SEMEADURA EM PLACA APS DILUIO INTRODUO Em diversos estudos microbiolgicos necessria a determinao do nmero de bactrias vivas presentes em uma amostra. Nessa atividade voc vai aprender a calcular o nmero de bactrias em uma amostra previamente diluda. MATERIAL Caldos com cultura de Escherichia coli 2 placas com gar nutriente 6 tubos contendo 9 mL de salina estril 1 pipeta (0,1 mL) estril 2 alas de Drigalski estreis

PROCEDIMENTO Diluir a cultura em caldo de E. coli: passar 0,1 mL da cultura no 1 tubo com salina, misturar bem; transferir 0,1 mL da suspenso do tubo 1 para o tubo 2 e assim sucessivamente at o tubo 6. Colocar 0,1 mL de cada diluio feita sobre as 2 placas com gar nutriente e espalhar por toda a superfcie, com da ala de Drigalski. Incubar a 37 C, por 18-24 h. RESULTADO Desenhe o observado em cada uma das placas. DILUIO 1 2

Conte o nmero de colnias: escolha a placa mais adequada para a contagem. Nmero total de colnias da cultura em caldo: _______________ Deixe os clculos indicados.

33

DISCUSSO 1. Faa uma pesquisa sobre a) padres microbiolgicos de balneabilidade. b) como se determina uma infeco urinria. c) como se classifica, microbiologicamente, leites do tipo A, B e C. 2. Relacione o que voc aprendeu na atividade realizada no laboratrio e as pesquisas realizadas em 1.

34

ATIVIDADE 10 TCNICA DE SEMEADURA EM PLACA POUR-PLATE INTRODUO A tcnica da semeadura em placa pour-plate pode ser realizada com o objetivo de se obter colnias isoladas (estudo qualitativo) ou para realizar a contagem de colnias em placa (estudo quantitativo).

MATERIAL

Escherichia coli cultivada em caldo nutriente 6 tubos de ensaio contendo 0,9 mL de salina estril 1 placa de Petri estril 20 mL de meio de cultura (gar nutriente) fundido pipeta estril (0,1 mL)

PROCEDIMENTO Transferir 0,1 mL da cultura em caldo de E. coli para o tubo 1. Agitar o tubo 1 e transferir 0,1 mL dessa suspenso para o tubo 2. Agitar o tubo 2 e transferir 0,1 mL dessa suspenso para o tubo 3, e assim sucessivamente at o tubo 6. Transferir 0,1 mL do tubo 6 para a placa de Petri estril.. Colocar 20 mL de gar nutriente fundido sobre o fundo da placa, realizando movimentos rotatrios, em forma de 8, para a perfeita mistura da cultura com o gar nutriente (no muito quente para no matar as bactrias). Esperar solidificar, inverter a placa e incubar a 37o C, por 18-24 h. Proceder contagem de colnias (a placa deve ter 30 a 300 colnias no mximo, para ser possvel a contagem). Calcular o nmero de unidades formadoras de colnias / mL. RESULTADO (deixar os clculos indicados no espao abaixo)

DISCUSSO 1. Faa uma pesquisa sobre bactrias heterotrficas, explicando a) O que so essas bactrias. b) Como podem ser utilizadas como padro de higiene.

35

2. Relacione o que voc aprendeu na atividade realizada no laboratrio e a utilizao de bactrias heterotrficas.

36

ATIVIDADE 11 ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE ENTEROBACTRIAS A PARTIR DE MATERIAL FECAL INTRODUO A maioria dos estudos de bactrias geralmente envolve uma etapa de isolamento da bactria e sua identificao. A etapa de isolamento exige a obteno de colnias bacterianas, de forma isolada, pois a partir de uma delas, ser feita a identificao. A etapa de identificao geralmente envolve o cultivo da bactria, a partir da colnia isolada, em meios de cultura cujos componentes reagem com substncias produzidas pela bactria, de modo a permitir a distino das propriedades bioqumicas do microorganismo estudado e sua identificao. MATERIAL 1 1 1 1 1 1 1 meio de transporte Cary Blair placa com gar Mac Conkey tubo com meio EPM tubo com meio MILi tubo com meio Citrato de Simmons ala de inoculao fio de inoculao

PROCEDIMENTO

1. COLETA DO MATERIAL

As fezes devero ser mantidas em meio de transporte Cary Blair, conforme as instrues do professor, at o momento da semeadura.

2. ISOLAMENTO

Utilizando uma ala de inoculao, semear as fezes em uma placa de gar Mac Conkey, de modo a obter colnias isoladas. Incubar a 36-37oC, por 24 horas.

3. SEMEADURA NOS TESTES BIOQUMICOS Escolher uma colnia crescida no Mac Conkey e semear, nos seguintes meios de cultura A. EPM - semear com fio de inoculao, picando o meio e semeando em estria na superfcie. Anote a cor inicial do meio de cultura: _________________________________ B. MILi - semear com fio de inoculao, picando apenas uma vez o meio de cultura. Anote a cor inicial: __________________________ Este meio de cultura transparente ou opaco? _________________ C. CITRATO DE SIMMONS - semear com ala de inoculao a superfcie do meio. Anote a cor inicial: _________________________

37

ATIVIDADE 12 - A LEITURA E INTERPRETAO DOS TESTES BIOQUMICOS 1. MEIO MAC CONCKEY O meio MC seletivo para bactrias Gram negativas porque possui sais biliares e cristal violeta, que impedem o crescimento das bactrias gram positivas. O meio tambm diferencial devido presena de lactose na sua composio, que diferencia as bactrias fermentadoras da lactose das que no fermentam este acar. O meio possui como indicador de pH o vermelho neutro, que em meio cido rosa e em pH alcalino incolor. Quando as bactrias fermentam a lactose, liberam cido e suas colnias se tornam rseas. Quando no fermentam o acar, as colnias so incolores. RESULTADO Crescimento Conkey Cor da colnia Fermentao da lactose 2. Provas Bioqumicas Enterokit B O ENTEROKIT B consiste dos meios EPM, MILi e Citrato de Simmons. O meio EPM contm os testes de fermentao e produo de gs em glicose, produo H2S, hidrlise da uria e desaminao do triptofano. O meio MILi contm os testes de motilidade, indol e descarboxilao de lisina. O Citrato de Simmons oferece o teste de utilizao do citrato como nica fonte carbono. Os trs meios totalizam 8 testes que somados ao da fermentao da lactose na placa isolamento, permitem identificar com fidelidade a grande maioria das enterobactrias isoladas espcimes clnicos. 2.1 Meio EPM O meio EPM permite investigar: . fermentao da glicose; . produo de: gs, H2S, urease, L-Triptofano Desaminase (LTD). A. Fermentao da glicose Bactrias que fermentam glicose produzem cidos que acidificam a base do meio, tornando-a amarela pela viragem do indicador azul de bromotimol (pH cido = amarelo, pH neutro = verde, pH alcalino = azul). A superfcie do meio, que contm O2, torna-se alcalina (azul), devido a degradao aerbica da glicose e a utilizao de peptonas, que resulta na liberao de amnia. Quando a bactria no fermenta glicose, a cor da base do meio permanece inalterada (verde). B. Produo de gs A formao de gs, a partir da fermentao da glicose, verificada pela formao de bolhas, ou rachaduras, na base do meio. de de de de em Mac

38

C. Produo de H2S Bactrias que possuem a enzima tiossulfato redutase reagem com o tiossulfato de sdio, produzindo H2S, que um gs incolor. Combinando-se com compostos que contm ferro, ou chumbo, o H2S d origem ao sulfeto correspondente, que tem cor preta.
Tiossulfato de sodio Tiossulfato redutase H2 S (gas incolor)

H2S + ons Fe sulfeto de ferro (precipitado preto). D. Produo de urease A urease cataliza a hidrlise da uria em amnia e CO2, o que torna o meio alcalino. Portanto, no EPM, quando a reao positiva, a base do meio torna-se azul, ou azul-esverdeada (reao fraca). H 2N H 2N uria C = O + 2 HOH urease

CO2 + H2O + 2 NH3

E. Produo de L-triptofano desaminase (LTD) A desaminao oxidativa do L-triptofano catalisada pela L-triptofano desaminase resulta na formao de cetocido que, em presena de ferro provoca o desenvolvimento de cor verdegarrafa na superfcie do meio. A. Cor do EPM base superfcie

fermentao da glicose B. Presena de bolhas ou rachaduras Produo de gs C. Presena de precipitado preto Produo de H2S D. Cor da base do meio. Produo de urease E. Cor da superfcie do meio Produo de LTD 2.2. Meio MILi Permite investigar: . motilidade . produo de: indol, lisina descarboxilase. A. Motilidade

39

As bactrias mveis (que possuem flagelos), quando inoculadas em meio sem-slido, se movimentam, turvando total ou parcialmente o meio. As imveis s crescem no local onde foram inoculadas. B. Produo de lisina descarboxilase A descarboxilao da lisina resulta na formao de amina (cadaverina) que torna o meio alcalino.
L lisina L - lisina descarboxilase cadaverina + CO 2

A enzima formada apenas quando a bactria cultivada em meio cido, na presena do substrato. O indicador de pH do MILi o bromocresol prpura, que em pH cido vira a cor do meio para amarelo, e em pH neutro, ou alcalino, para roxo. O MILi, alm de outros componentes, contm lisina e glicose. Quando a lisina no descarboxilada, o meio torna-se cido (amarelo), devido a fermentao da glicose. Quando a lisina descarboxilada, o meio torna-se alcalino, passando de amarelo para roxo. Reao positiva: O meio adquire cor roxa discreta ou acentuada. Reao negativa: O meio adquire cor amarela ntida, nos seus 2/3 inferiores. C. Produo de indol A enzima triptofanase, produzida por certas bactrias, cataliza a degradao do triptofano, o que resulta na produo de indol. L-triptofano triptofanase Indol + cido pirvico + amnia. O indol pode ser detectado pela adio de 3 a 4 gotas de uma soluo de p-dimetilaminobenzaldedo Reativo de Kovacs) na superfcie do meio. O desenvolvimento de um anel de cor rosa, ou vermelha, indica presena de indol. Quando a reao negativa, o anel conserva a cor do reativo. Nota: S colocar o reativo de Kovacs aps a leitura dos testes de motilidade e lisina.

A. Modo de Motilidade B. Cor do meio Produo descarboxilase

crescimento

da

lisina

C. Formao do anel cor de rosa Produo de Indol 2.3. Meio de Citrato de Simmons Permite determinar se uma bactria capaz de utilizar citrato como nica fonte de carbono para o seu metabolismo. O meio tambm contm sais inorgnicos de amnio. Um microrganismo que utiliza o citrato, como nica fonte de carbono, tambm utiliza os sais de amnio como nica fonte de nitrognio. A utilizao dos sais de amnio resulta na formao de amnia (NH3), que provoca alcalinizao do meio. O meio contm como indicador do pH o azul de bromotimol (pH alcalino = azul; pH neutro = verde, pH cido = amarelo).

40

Reao positiva: crescimento bacteriano na superfcie do meio e desenvolvimento de cor azul (pH alcalino). Reao negativa: ausncia de crescimento e a cor do meio permanece inalterada (verde). Crescimento Cor do meio Utilizao de citrato Aps leitura de todos os testes consultar a tabela 1 para identificar a bactria. Identificao da bactria: ____________________________

41

TABELA 1 - IDENTIFICAO DE ALGUMAS ENTEROBACTRIAS PELOS TESTES DOS MEIOS EPM, MILi e CITRATO Lactose (Mac Conkey) + Va + + V DISCUSSO 1. Seria adequado semear o iogurte no meio de Mac Conkey? Justifique. 2. Seria adequado utilizar essa srie bioqumica para identificar estafilococos? Justifique. Gs + V + + + + + EPM H2S Urease + + + + + + + + + MILi LTD Mot. Lisina + + + + + + + + + + + + V + + + Indol + + V + V + + + + + + + V V Citrato Enterobactri a

E. coli
EIEC,outros,

E. coli

Enterobacter

Klebsiella pneumoniae
Shigella, EIEC Salmonella

Citrobacter freundii
Serratia

Providencia rettgeri Yersinia enterocolitica Proteus mirabilis Proteus vulgaris

42

ATIVIDADE 12 - B LEITURA E INTERPRETAO DOS TESTES BIOQUMICOS Amostra: ______________________________ 1. Meio Mac Conkey Crescimento Conkey Cor da colnia Fermentao da lactose 2. Meio EPM A. Cor do EPM base superfcie em Mac

fermentao da glicose B. Presena de bolhas ou rachaduras Produo de gs C. Presena de precipitado preto Produo de H2S D. Cor da base do meio. Produo de urease E. Cor da superfcie do meio Produo de LTD 3. Meio MILi A. Modo de Motilidade B. Cor do meio Produo da lisina descarboxilase C. Formao do anel cor de rosa Produo de Indol crescimento

43

4. Meio Citrato de Simmons Crescimento Cor do meio Utilizao de citrato

IDENTIFICAO DA BACTRIA: ________________________________

44

ATIVIDADE 13 SEMEADURA EM MEIO GAR SANGUE (AS) INTRODUO O gar sangue classificado como meio enriquecedor porque rico em nutrientes. tambm diferenciador porque indicar se a bactria produz ou no uma protena denominada hemolisina. Essa protena hemolisa as hemcias presentes no meio. Assim, a bactria que produz hemolisina, forma uma colnia com um halo transparente em seu redor. A hemlise pode ser total (halo bem transparente: -hemlise) ou parcial (halo esverdeado: alfa hemlise). Se a bactria no produzir hemolisina, a colnia no forma o halo ao seu redor (gama hemlise). MATERIAL 2 cotonetes estreis 1 tubo com salina estril 1 placa com meio gar sangue 1 frasco conta-gotas com gua oxigenada palitos de dente lminas de vidro material para colorao de Gram

PROCEDIMENTO Dividir a placa ao meio, utilizando caneta para retroprojetor. Coletar, com auxlio de um cotonete, material de mucosa bucal ou nasal. Semear, por esgotamento, numa das metades da placa. Umedecer o outro cotonete em salina e coletar material da superfcie da pele. Semear, por esgotamento a outra metade da placa. Incubar a placa a 370 C por 18-24 h. Observar na placa se h formao de halos de hemlise.

Teste da Catalase Com auxlio de um palito, transferir a colnia a ser testada para uma lmina, contendo 1 gota de gua oxigenada. Observar o desprendimento de bolhas. Colorao de Gram Realizar a colorao de Gram nas colnias testadas (ver pg. 3). DISCUSSO 1. Comparando o meio gar sangue com o meio Mac Conkey, podemos afirmar que o primeiro seletivo? Justifique.

2. Por que o meio gar sangue considerado diferenciador?

3. H possibilidade de identificar as bactrias isoladas neste experimento?

45

RESULTADOS Completar a tabela com as caractersticas gerais das colnias. Colnias (*) Tipo de hemlise Teste da catalase Gram Morfologia

(*) anotar caractersticas como cor, tamanho etc

46

ATIVIDADE 14 TCNICA DE SEMEADURA EM ANAEROBIOSE INTRODUO As bactrias apresentam diferenas a sua necessidade de O2, sendo classificadas em: 1. aerbicas estritas: no crescem na ausncia de O2. 2. microaerfila: crescem melhor em uma atmosfera com baixo teor de O2. 3. anaerbicas estritas: crescem somente na ausncia de O2. 4. anaerbicas facultativas: crescem tanto na presena quanto na ausncia de O2. Nessa atividade voc vai conhecer um mtodo para se cultivar bactrias. MATERIAL 1 1 1 1 cotonete estril placa contendo gar chocolate jarra de plstico com tampa vela

PROCEDIMENTO Com auxlio do cotonete, coletar material da mucosa nasal ou faringe. Semear, por esgotamento, na placa com gar chocolate. Colocar a placa dentro da jarra, colocar a vela acesa em cima da placa e fechar a jarra. Incubar a 37C, por 18-24 h.

LEITURA Observar a placa para visualizar colnias. Fazer colorao de Gram. Desenhar o observado.

RESULTADOS 1. Descrever o aspecto geral das colnias encontradas. 2. Desenhar o observado na colorao de Gram. Morfologia: ____________________ Gram: ____________________________

DISCUSSO 1. Pesquisar bactrias que crescem, preferencialmente, no ambiente estudado nesta prtica. 2. Relacionar o uso de vela, como feito nesta prtica, com o uso de gua oxigenada ao se trabalhar com bactrias anaerbicas estritas.

47

ATIVIDADE 15 REDUO DO AZUL DE METILENO INTRODUO O azul de metileno age como aceptor de hidrognio, descolorindo-se. A rapidez da descolorao indica a taxa de oxidao. Se o azul de metileno for colocado em contato com o ar ou o oxignio, ser reoxidado, reaparecendo a colorao azul.

CH 3 CH 3

CH 3 S N Azul de Metileno Colorido N CH 3 + 2 H Cl

CH 3 CH 3

S N H

CH 3 CH 3 + HCl Cl

Azul de Metileno Incolor

MATERIAL Azul de metileno 0,005% (conserva-se em geladeira por 1 semana) 4 tubos de ensaio estreis 4 pipetas de 10 mL estreis amostras de leite (tipo A, B, C, longa vida)

PROCEDIMENTO Agitar a amostra de leite. Colocar em um tubo estril 10 mL de cada amostra de leite. Acrescentar 1 mL de azul de metileno. Misturar bem. Incubar a 37C.

Anotar a cor inicial: ___________________

48

Observar as amostras depois de 10 min, 15 min, 30 min, 1 hora, 2 horas, 3 horas. Anotar a cor na tabela abaixo. Leitura 30 min 1 hora

10 min Amostra Leite A Leite B Leite C Longa vida n de bactrias

15 min

2 horas

3 horas

INTERPRETAO menos de 15 minutos: excessivamente contaminado 15 a 60 minutos: fortemente contaminado 1 - 3 horas: ligeiramente contaminado mais de 3 horas: satisfatrio

Na contagem, os resultados so os seguintes: menos de 2 h 30 min: + de 2.000.000 de germes 2 h 30 min a 4 h 30 min: + de 200.000 germes mais de 4 h 30 min: - de 200.00 germes. DISCUSSO 1. De que modo a mudana de cor indica multiplicao bacteriana?

2. As amostras de leite analisadas so adequadas ao consumo?

49

ATIVIDADE 16 ANTIBIOGRAMA INTRODUO O antibiograma uma prova de sensibilidade aos antimicrobianos utilizada para alguns grupos de bactrias, principalmente para os que adquirem resistncia facilmente, como Enterobactrias, Pseudomonas, Staphylococcus, etc. O tratamento eficaz de uma infeco por essas bactrias implica na realizao do antibiograma da bactria isolada, a partir do material clnico. Nesta atividade vamos realizar antibiogramas de culturas de Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Cada grupo trabalhar com uma amostra diferente. MATERIAL 1 placa com gar Meller-Hinton 2 cotonetes estreis 1 tubo contendo salina estril 1 pina 1 frasco com lcool discos de antibiograma culturas em caldo de Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Escala de Mac Farland - padro de turvao: intensidade de multiplicao - frmula nefelomtrica de Mac Farland - Cloreto de brio em cido sulfrico - Sulfato de brio (precipitado) PROCEDIMENTO 1. Embeber o cotonete na cultura bacteriana e diluir salina at obter turvao similar aquela do padro da escala de Mac Farland (108 bactrias/mL). 2. Embeber o mesmo cotonete na cultura diluda em salina, retirar o excesso comprimindo-o contra a parede interna do tubo e fazer uma semeadura uniforme em toda a superfcie da placa de Mller-Hinton em trs direes, conforme esquema abaixo.

3. Deixar a placa secar e aplicar os discos de antimicrobianos com uma pina, que deve ser sempre flambada. conveniente marcar com a caneta na base da placa de Petri os locais onde os discos sero colocados. Pression-los levemente com a pina aps a aplicao.

50

4. As placas sero incubadas a 370 C por 16-20 h e lidas na prxima aula. LEITURA DO ANTIBIOGRAMA 5. Medir o dimetro dos halos de inibio com o auxlio de uma rgua, anotar os dados e interpretar os resultados utilizando a tabela anexa. RESULTADOS 1. Resultados do seu grupo Bactria utilizada: Bactria Antimicrobiano Dimetro do halo Interpretao (R - I S)

_____________ __

_____________ __

_____________ __

2. Resultados da classe Amostra Modelo de Resistncia

51

52

DISCUSSO 1. possvel encontrar amostras da mesma espcie com padres de sensibilidade diferentes? 2. Uma pessoa est com uma infeco urinria. Foi identificada a bactria Pseudomonas sp. De acordo com os resultados obtidos, qual(is) antibitico(s) no deveria(m) ser utilizado(s)? Justifique.

53

TABELA I Tabela para interpretao de halos de inibio (*) antibacterianos para organismos Gram positivos e negativos Conc. Zona de Inibio em mm Antibacterianos Discos Cdigo (a) (a) Moder. Resistente intermediri sensvel Sensvel o Amicacina (b) Ampicilina (c) - p/ Gram negativos entricos - p/ Staphylococcus (d) - p/ Haemophilus sp (e) - p/ enterococos (f,g) p/ estreptococos no enterococos (f,g) Carbenicilina - p/ Enterobactrias (d) - p/ Pseudomonas Cefazolina (h) Cefotaxima (h) Cefoxitina (h) Cefalotina (h) Cefoperazona (h) Ceftazidima (h) Cefuroxima (h) Cloranfenicol Clindamicina (j) Doxiciclina (l) Eritromicina Estreptomicina Gentamicina (b) Minociclina (l) Nalidixico. Ac (i) Netilmicina (b) Nitrofurantoina(i) Oxaciclina - p/ Staphyloccocus (m) - p/ pneumococus penicilina sensvel (e) Penicilina G - p/ Staphylococcus (d) - p/ N. gonorrhoeas - p/ enterococos (f,g) - outros Gram positivos (f,g) Sulfonamidas (i,n) Tetraciclina (l) Trimetoprima (i,n) Sulfametoxazil / Trimetoprima Tobramicina (b) Vancomicina 30 g 10 10 10 10 10 g g g g g AMI AMP AMP AMP AMP AMP 14 11 28 19 16 21 15 - 16 12 - 13 17 (g) 22 - 29 17 14 29 20 30

100 g 100 g 30 g 30 g 30 g 30 g 75 g 30 g 30 g 30 g 2 g 30 g 15 g 10 g 10 g 30 g 30 g 30 g 300 g 1g 1g

CAR CAR CFZ CTX CFO CFL CPZ CTZ CRX CLO CLI DOX ERI EST GEN MIN NAL NET NIT OXA OXA

17 13 14 14 14 14 15 14 14 12 14 12 13 11 12 14 13 12 14 10 19

18 - 22 14 - 16 15 - 17 15 - 17 15 - 17 16 - 20 15 - 17 15 - 17 13 - 17 15 - 16 13 - 15 14 - 17 12 - 14 13 - 14 15 - 18 14 - 18 13 - 14 15 - 18 11 - 12 -

15 - 22 -

23 17 18 23 18 18 18 18 18 18 17 16 18 15 15 19 19 15 17

13 20

10 10 10 10

UI UI UI UI

PEN PEN PEN PEN SUL TET TRI SUT TOB VAN

28 19 14 19 13 15 11 11 13 10

16 18 15 15 14 11

15 (g) 20 - 27 -

29 20 28 17 19 16 16 15 12

300 g 30 g 5 g 25 g 10 g 30 g

12 14 10 10 12 9

(*) Adaptado do NCCLS - (a, b, c,....) ver bula Cefar

54

TABELA COMPLEMENTAR II Tabela padro para interpretao de halos de inibio de antibacterianos no tabulados em I Conc. Zona de Inibio em mm Antibacterianos Discos Cdigo (a) (a) Moder. Resistente intermediri sensvel o Amoxacilina Bacitracina Cefalexina Cefaloridina Cefadroxil Cefapirina Cefradina Ceftriaxona Ciprofloxacina Cotrimazina Sulfadiazina + Trimetoprima Dicloxacilina Fosfomicina Lincomicina Neomicina Norfloxacina (**) Pefloxacina (**) Pipemidico, Ac. (**) Polimixina - B Rifamicina - B Rifampicina (**) - p/ N. meningitidis - p/ outros organismos Rifampicina / Trimetoprima (**) Sisomicina Tianfenicol 10 g 10 UI 30 g 30 g 30 g 30 g 30 g 30 g 5 g 25 g 1 g 20 g 2 g 30 g 10 g 5 g 20 g 300 UI 30 g 5 g 30 g 35 g 10 g 30 g AMO BAC CEF CFA CFD CFP CFI CRO CIP SZT DIC FOS LIN NEO NOR PEF PIP POL RFM RIF RIF RIT SIS TIA 8 14 14 14 14 14 13 15 10 11 14 12 12 16 13 8 33 24 11 11 14 12 segue Ampicilina 9 - 12 15 - 17 15 - 17 15 - 17 15 - 17 15 - 17 14 - 17 16 - 20 11 - 15 segue Oxacilina 12 - 17 15 - 16 13 - 16 13 - 16 17 - 21 14 - 18 9 - 11 -

Sensvel

13 18 18 18 18 18 18 21

16 18 17 17 17 22 19 12 34 25 19 15 18 18

12 12 15 13

18 14 17 17

REFERNCIAS: 1 - Bauer, A. W.; Kirby, W. M. M.; Sherris, J. C. and Turck, M. - Antibiotic susceptibilly testing by standardized single disc method. Amer. J. Clin. Poth. 45: 493 - 6. 1966. 2 - Federal Register. col. 37, n 191, September 30. 1972. 3 - NCCLS (National Commithes for Clinical Laboratory Standards). Oct. 1983. Performance Standard for Antimicrobic Disc Susceptibility Test. Vol. 3. n 14. 4 - Ximenes, J. Importncia da padronizao da prova de sensibilidade bacteriana (Antibiograma). A Folha Mdica vol. 66. n 3, p. 113 - 116. 1973. (**) Limites fornecidos pelo laboratrio detentor do antibacteriano.

55

ATIVIDADE 17 AO DE ANTISSPTICOS SOBRE MICROORGANISMOS INTRODUO Antissepsia consiste na inativao ou reduo dos microorganismos presentes no organismo humano ou de outros animais. Para ser eficiente, o agente antissptico deve afetar diretamente o microorganismo. Nessa atividade, voc vai investigar a ao de diversos agentes qumicos sobre microorganismos pertencentes microbiota humana. MATERIAL 1 placa de gar sangue 3 placas de gar nutriente 1 recipiente com cepacol 1 frasco com mertiolate 12 cotonetes estreis 1 frasco com salina estril iodopovidina (iodo ativo a 10%) 1 sabo em barra PROCEDIMENTO 1. Ao de detergentes (cloreto de cetil peridnio-cepacol) Dividir a placa de gar sangue em 3 partes e marc-las: t0, t1 e t2. Friccionar um cotonete estril na mucosa da bochecha e semear em t0, em zigue-zague. Bochechar com soluo de cepacol, diludo 1:2 em gua, durante 1 minuto. Aguardar 3 minutos, repetir a coleta de material e semear em t1. Repetir o procedimento anterior e semear em t2. Incubar a placa a 370 C por 18/24 horas. 2. Ao do mertiolate Dividir a placa de gar nutriente em 2 partes e marc-las: com M, sem M. Passar mertiolate cuidadosamente na palma de uma das mos. Esperar secar. Umedecer um cotonete estril e friccionar na palma da mo, onde foi utilizado o mertiolate. Semear em zigue-zague, na metade da placa marcada com M. Umedecer outro cotonete estril na salina estril e friccionar na palma da mo onde no foi utilizado o mertiolate. Semear na metade da placa marcada sem M. Incubar a 370 C por 18/24 horas. 3. Ao da soluo de iodo ativo Dividir a placa de gar nutriente em 2 partes e marc-las: com I, sem I. Passar iodo cuidadosamente na palma de uma das mos. Esperar secar. Umedecer um cotonete estril e friccionar na palma da mo, onde foi utilizado o mertiolate. Semear em zigue-zague, na metade da placa marcada com I. Umedecer outro cotonete estril na salina estril e friccionar na palma da mo onde no foi utilizado o mertiolate. Semear na metade da placa marcada sem I. Incubar a 370 C por 18/24 horas. 4. Ao de sabo em barra Dividir a placa de gar nutriente em 2 partes e marc-las: com S, sem S. Lavar uma das mos com sabo e enxugar com toalha de papel.

56

Umedecer um cotonete estril em salina e friccionar na palma da mo lavada. Semear em zigue-zague, na metade da placa marcada com S. Umedecer outro cotonete estril na salina estril e friccionar na palma da mo no lavada. Semear na metade da placa marcada sem S. Incubar a 370 C por 18/24 horas.

RESULTADOS Complete as tabelas com os resultados obtidos.

GAR SANGUE Sem cepacol (t0) Com cepacol (t1) Com cepacol (t2)

GAR NUTRIENTE Com mertiolate Sem mertiolate

Com sabo

Sem sabo

QUESTES 1. Os antisspticos utilizados so eficientes? Justifique. 2. Suponha que a partir dos resultados obtidos, voc quisesse comparar a eficincia dos antisspticos testados. Como voc poderia fazer? 3. Observe as colnias crescidas no gar sangue. Alguma produziu hemolisina? Justifique. 4. Faa o teste da catalase com as colnias crescidas em gar sangue. Quais os resultados obtidos? OBS.: TESTE DA CATALASE Coloque 1 gota de gua oxigenada (H2O2) na superfcie de uma lmina de vidro. Com auxlio de um palito, retire material da colnia escolhida e misture com a gua oxigenada. Observe se ocorreu a formao de bolhas, o que corresponde resultado positivo: a bactria em questo produz a enzima catalase. 5. Faa a colorao de Gram para uma colnia catalase +. Qual o resultado?

57

ATIVIDADE 18 CONJUGAO BACTERIANA INTRODUO H vrias maneiras pelas quais as bactrias adquirem material gentico de outras bactrias. A conjugao um desses processos, e envolve troca de material gentico entre duas clulas bacterianas ntegras e em contato clula-clula. Nessa atividade voc vai investigar um processo de conjugao bacteriana que envolve a aquisio de marcas de resistncia a antibiticos. MATERIAL 1 mL de caldo nutriente 3 placas de gar MacConkey contendo cido nalidxico (50 g/mL) e ampicilina (50 g/mL) 1 placa com gar nutriente 1 ala bacteriolgica 2 amostras bacterianas cultivadas em meio lquido, apresentando as seguintes caractersticas: Marcas de Resistncia cromossmica plasmidiais s A (E. coli J53 (pR1)) lac + Et, Clo, Ap* B (E. coli MA 3456) lac NaI *Et = estreptomicina, Clo = cloranfenicol, Ap = ampicilina PROCEDIMENTO: 1. Em um tubo de ensaio adicionar: - 1 mL de crescimento em caldo nutriente da amostra A - 1 mL de crescimento em caldo nutriente da amostra B - 1 mL de meio nutriente. - Incubar a 37C durante 1 hora no mnimo. 2. Semear as placas contendo meio seletivo MacConkey + NaI50 + Ap50 as amostras A, B e a mistura M. 3. Semear com ala bacteriolgica, as mesmas culturas em meio no seletivo. Incubar as placas por 16-18 horas. Amostra Fermentao de lactose

RESULTADOS Descreva o que ocorreu nas placas contendo gar MacConkey e gar nutriente. DISCUSSO 1. Como voc interpreta os resultados obtidos? 2. Por que voc semeou as amostras em gar nutriente?

58

ATIVIDADE 19 PREPARAO PARA ESTUDOS MICROSCPICOS DE FUNGOS COLORAO COM LACTOFENOL AZUL-ALGODO INTRODUO O mtodo com lactofenol azul-algodo usado para preparar exame microscpico de colnias de fungos. uma tcnica que tem a finalidade de visualizar o miclio vegetativo e reprodutor de um fungo filamentoso, como tambm as caractersticas da clula vegetativa e reproduo por brotamento de leveduras. MATERIAL Culturas de fungos diversos 1 frasco conta-gotas com Lactofenol azul-algodo Lminas e lamnulas Alas de platina

PROCEDIMENTO a) Colocar uma gota de lactofenol azul-algodo sobre a lmina. b) Retirar pequeno fragmento da cultura de bolor ou uma alquota da cultura de levedura, com auxlio de uma ala de platina estril. c) Colocar o fragmento da cultura sobre a gota de lactofenol ou a alquota de levedura. d) Cobrir com lamnula e examinar ao microscpio na objetiva de 10 e 40 vezes. RESULTADO Visualizar e esquematizar os fungos observados ao microscpio.

Fungo:

Fungo:

Fungo:

Fungo:

59

DISCUSSO 1. Os fungos observados tm a mesma morfologia? Explique. 2. H alguma classificao dos fungos baseada na morfologia? Exemplifique. 3. Um aluno escreveu que os esporos de fungos tm a mesma funo daqueles encontrados nas bactrias. Voc concorda? Justifique.

60

ATIVIDADE 20 MICROCULTIVO DE FUNGOS INTRODUO Este mtodo possibilita a obteno de estruturas em boas condies para o estudo morfolgico detalhado.

1 ETAPA: Preparo do microcultivo

MATERIAL 1 Placa de microcultivo esterilizada, montadas conforme o esquema, com o seguinte material 1 placa de Petri 1 pedao de papel filtro 1 basto de vidro em U 1 lmina de vidro 1 lamnula de vidro placas com gar Sabouraud com culturas de fungos diversos placa de Petri pequena com gar Sabouraud estril 1 pina estril 1 ala de platina 1 tubo de ensaio com 5 mL de gua destilada estril

PROCEDIMENTO Com a pina, coletar um quadrado de aproximadamente 1 cm de lado, de gar Sabouraud estril e colocar sobre a lmina da placa de microcultivo. Com auxlio da ala de platina, coletar uma alquota da cultura de fungo e semear num dos lados do quadrado de gar Sabouraud (veja letra g do esquema). Repetir, semeando no lado oposto.

61

Cobrir o gar semeado com lamnula. Colocar 5 mL de gua destilada na placa de Petri, embebendo o papel filtro. Colocar as placas de microcultivo dentro de um recipiente com tampa. Incubar a 370 C, durante o perodo necessrio (aproximadamente 1 semana). Incubar a temperatura ambiente, por 12 horas e, a seguir a 370C por 48 horas.

2 ETAPA - COLORAO DO MICROCULTIVO

MATERIAL 1 placa de microcultivo crescida 1 lmina de vidro 1 lamnula de vidro 1 pina 1 frasco com formol a 10% 1 frasco conta-gotas com lactofenol azul algodo recipiente com desinfetante para desprezar o gar Sabouraud crescido. 1 frasco de esmalte para unhas incolor. papel filtro PROCEDIMENTO Aps as colnias estarem crescidas, acrescentar 10 mL de formol a 10% na placa de microcultivo. Aguardar 24 horas: todos os fungos estaro mortos. Numa lmina de vidro limpa, colocar 1 gota de lactofenol azul algodo. Com cuidado e utilizando a pina, retirar a lamnula da placa de microcultivo e deposit-la, com a face onde cresceram as colnias de fungos, sobre a gota de lactofenol azul algodo. Com a pina, retirar o quadrado de gar Sabouraud da placa de microcultivo e desprez-lo no recipiente com desinfetante. Colocar 1 gota de lactofenol azul algodo sobre a lmina de vidro onde estava o quadrado de gar Sabouraud. Cobrir com lamnula. Temos, ento, duas lminas com as colnias crescidas. Com auxlio do papel filtro, secar o excesso de corante das bordas das lamnulas, dessas duas lminas, procure no mover as lamnulas. Aps as bordas estarem secas, passar o esmalte cuidadosamente nas bordas das lamnulas. Esperar secar e passar novamente o esmalte. Observar ao microscpio e desenhar o observado. RESULTADOS Desenhe os fungos observados com legendas.

62

DISCUSSO 1. 2. 3. 4. Classifique os fungos observados de acordo com sua morfologia. Por que foi utilizado papel filtro embebido em gua? Por que o cultivo foi mantido em recipiente fechado, durante o perodo de incubao? De acordo com os resultados obtidos nos diversos experimentos, o que voc pode dizer a respeito da velocidade de crescimento de bactrias e fungos? Justifique.

63

ATIVIDADE 21 ESTUDO DE VRUS INTRODUO Os vrus podem ser estudados, indiretamente, pelos efeitos que causam s clulas hospedeiras. Nesta atividade, voc vai investigar a ao de vrus parasitas de bactrias. MATERIAL Cultura de E. coli 1 placa de Petri com gar nutriente 1 ala de Drigalski estril 1 recipiente com lcool 1 pipeta de 1 mL estril 1 cotonete estril

PROCEDIMENTO Embeber o cotonete na cultura de E. coli, retirar o excesso e semear na placa de gar nutriente. Esperar secar. Colocar sobre essa semeadura 0,5 mL de esgoto, com auxlio de uma pipeta estril. Espalhar com ala de Drigalski. Esperar secar. Incubar a 37C por 24 horas. Observar cuidadosamente a placa, verificando a ocorrncia de falhas no crescimento bacteriano. RESULTADO Nmero de falhas observado: _______________________

DISCUSSO 1. Como voc explica a formao dessas falhas? 2. Por que foi utilizado esgoto? 3. A que se relaciona o nmero de falhas encontrado?

64