Escolar Documentos
Profissional Documentos
Cultura Documentos
OBJETIVO.
Determinar indirectamente el contenido de protenas totales en una muestra desconocida.
II. FUNDAMENTO
El mtodo de micro-kjeldahl es una simplificacin hecha por HACH en el proceso
Kjeldahl tradicional. Realizando el mismo anlisis en un tiempo corto y con pequeas
muestras.
Se funda en la transformacin del nitrgeno presente en las protenas a nitrgeno
inorgnico. Para ello se siguen tres etapas claramente diferenciadas
1. En la primera, se digiere el material por accin del cido sulfrico en presencia de
oxidantes fuertes (peroxido de hidrgeno), de esta manera todo el carbono presente se
libera como CO2 y nitrgeno como NH3, luego este se combina con el exceso de
cido sulfrico para dar sulfato de amonio.
2. En la segunda se destila el amonio, previamente liberado por la accin de un lcali
fuerte Na(OH), el amoniaco liberado se recibe en una solucin de cido dbil en
presencia de colorante indicador.
3. En la tercera se titula la solucin con un cido fuerte cuantificando el nitrgeno
presente.
Luego se aplica la relacin siguiente:
%N = ml.N.fc.meq.100
peso de muestra
donde: ml.N.fc.meq = peso de nitrgeno en la muestra
ml = gasto de cido sulfrico en la titulacin (ml)
N. normalidad del cido
Fc. Factor de correccin del cido
meq.= peso del miliequivalente del nitrgeno
Suponiendo que la muestra solo contiene protenas simples con 16% de N, el
porcentaje de protenas ser:
Protena = 6.25xN
III. PROCEDIMIENTO
El proceso de determinacin se hace en tres etapas:
DIGESTIN.
Escriba las ecuaciones de las reacciones de cada una de las etapas durante el proceso
de determinacin del nitrgeno
Indique que tipo de enlaces de una protena se rompen durante la etapa de digestin
V. OBSERVACIONES
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________
VI. CONCLUSIONES
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_________________________________________________
VII. BIBLIOGRAFA
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
___________________________________________________________
PRCTICA 2
CONCENTRACIN DE EXTRACTOS PROTEICOS POR
DILISIS
I.
OBJETIVO
Aumentar la concentracin de las protenas en un extracto o solucin que las contenga.
II. FUNDAMENTO
La dilisis es una tcnica que separa las molculas de acuerdo a su tamao usando
membranas semipermeables que contienen poros de dimensiones menores que las
macromolculas que se deseen separar como las protenas, los poros permiten la difusin
de las molculas de solventes, sales y otras molculas pequeas, pero bloquean el paso de
protenas por su gran tamao.
Se usan membranas de celofn (acetato de celulosa), nitrocelulosa, colodin, u otras de
naturaleza semipermeable.
Los mecanismos de transporte son: osmosis, y difusin por diferencia de concentracin.
III. MATERIALES Y EQUIPOS
01 pliego de papel celofn.
1Kg de azcar.
Solucin de extracto proteico al 0.5%.
Pipeta de 10 ml.
Vaso de precipitados.
Piceta.
IV. MTODO
Preparar una bolsa con el papel celofn, de modo que no se presenten fugas al llenarla
con una solucin.
Preparar en el vaso de precipitados 50 ml de una solucin de protena al 0.5%.
Comprobar la concentracin de protena con el espectrofotmetro a 280 nm.
Llenar la bolsa de celofn con 50 ml de solucin proteica, usando para tal fin la pipeta
de 10 ml., y sellar luego la bolsa de modo que no presente fugas.
Preparar un tazn con azcar, y colocar all la bolsa de celofn conteniendo la
solucin proteica.
Untar toda la bolsa de celofn, con el azcar, cubrindola por completo.
Esperar 15 a 30 min y retirar la bolsa del azcar, observando los cambios ocurridos.
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
________________________________________
VIII. BIBLIOGRAFA
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_______________________________________________________
PRCTICA 3
DETERMINACIN ESPECTROFOTOMTRICA DE PROTENAS
I.
II.
OBJETIVO
Determinar la concentracin de una solucin de protenas mediante la reaccin de
Biuret y el espectrofotmetro
FUNDAMENTO:
La presencia de protenas en una mezcla se puede determinar mediante la reaccin del
Biuret. El reactivo Biuret contiene CuSO4 en solucin alcalina. La reaccin se basa en
la formacin de un compuesto de color violeta, debido a la formacin de un complejo
de coordinacin entre los iones Cu (+2) y los pares de electrones no compartidos del
nitrgeno que forma parte de los enlaces peptdicos.
III.
MATERIALES Y EQUIPO
Espectrofotmetro
Gradilla para tubos de ensayo
Tubos de ensayo
Vasos de precipitado
Probetas, Pipetas
Materiales: extracto de levadura, reactivo biuret
IV.
PROCEDIMIENTO
Realizacin de una curva patrn: Como se desconoce el coeficiente de extincin molar
() de las protenas coloreadas con el reactivo biuret, se proceder a construir una curva
patrn, midiendo la absorbancia de soluciones con concentraciones conocidas de
protena, para sobre ella interpolar el valor de Abs de la solucin problema y determinar
su concentracin grficamente y tambin por regresin lineal.Para ello se dispone de uns
solucin de 10 mg/ml de protena ( extracto de levadura) a partir de ella se realizan
diluciones conocidas aplicando la frmula:
Ci x Vi = Cf x Vf
Donde:
Ci = concentracin de la solucin madre inicial
Vi = volumen a tomar de la solucin madre inicial
Cf= concentracin final de la solucin a preparar
Vf= volumen total final de la solucin a preparar
En 8 tubos de ensayo se preparan, a partir de la solucin madre (Ci=10 mg/ml) las
soluciones de la tabla.
Conc
Fnal.Sol.a
preparar
Tubo
Blanco
1
2
3
4
5
6
7
8
Muestra
Volumen Volumen
agua
Rx.Biuret
Volumen Abs
Final
570nm
Mg/ml
Volumen
Sol.
Madre
inicial
ml
ml
ml
ml
0,0
4,0
0,5
3,5
1,0
3,0
1,5
2,5
2,0
2,0
2,5
1,5
3,0
1,0
3,5
0,5
4,0
0,0
4,0
0,0
V.
CUESTIONARIO
5.1 Cul es la concentracin de protenas de la muestra?
5.2
5.3
5.4
VI.
OBSERVACIONES
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_____________
VII.
CONCLUSIONES
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
________________________________________
VIII. BIBLIOGRAFA
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_______________________________________________________
PRCTICA 4
SEPARACIN EN CAPA FINA DE UNA MEZCLA DE AMINOCIDOS
I.
OBJETIVO:
Aplicar la tcnica de cromatografa en capa fina para la identificacin de aminocidos
presentes en una muestra biolgica.
: Slido/lquido
- Fase mvil
: liquido/gas
El soporte poroso est adherido a la base, est pegado gracias a la presencia de SO4Ca
que ayuda a pagar el soporte.
En las leyendas de las placas de slica se encuentran como:
El ZnS bajo luz UV la placa de silica gel se torna verde y si hay alguna marcha de la
migracin de muestra o estndares esta marcha ya no es verde sino violeta.
III. PROCEDIMIENTO:
Primer Proceso: Sembrado de la muestra
Se siembra los estndares y la muestra con un capilar bastante fino.
Tener precaucin de que en el sembrado se intenta tener una mancha entre 1 y
2 mm de dimetro.
La distancia entre las siembras puede ser no menor de 6-7mm
aproximadamente.
Segundo Proceso: Elusin
Una vez sembrada la muestra se procede a la fase mvil con la ayuda de un
solvente de elusin.
Para ello se coloca dentro de una cmara de elusin
Destapar la cmara y retirar con cuidado la placa de vidrio. - Secar la placa con ayuda
de una secadora de cabello.
Con la ayuda de un spray aplicar Ninhidrina 0.1% en butanol sobre la placa. Secar la
placa con una secadora.
Identificacin
Luego proceder a identificar las manchas existentes que debern corresponder a
aminocidos para ello se debern hacer los clculos de los Rf de los estndares y luego
los Rf correspondientes a las manchas de las muestras.
Rx. Ninhidrina es la reaccin que identifica aminocidos a travs de una coloracin azul
violeta.
V. CUESTIONARIO:
5.1.
5.2.
5.3.
5.5.
5.6.
5.7.
Indicar tipos de solventes de elusin para la fase mvil tanto para silica y almina.
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
___________________________________________________
5.8.
5.9.
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
_____________________________________________
VI. OBSERVACIONES
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
______________
VII. CONCLUSIONES
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
____________________________________________
VIII. BIBLIOGRAFA
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
________________________________________________________
PRCTICA 5
REACCIONES DE IDENTIFICACIN DE CARBOHIDRATOS
OBJETIVOS:
Reconocer los principios inmediatos de los carbohidratos.
Diferenciar experimentalmente monosacridos, disacridos y polisacridos.
Familiarizarse con la clasificacin de los hidratos de carbono en reductores y no reductores.
Estudiar las propiedades del almidn.
II. FUNDAMENTO TERICO:
Se denominan carbohidratos o glucsidos los derivados aldehdicos cetnicos, reales o potenciales de
alcoholes polivalentes o sus productos de condensacin segn la cantidad de glucsidos o azcares sencillos
que se obtengan por hidrlisis de los policarbohidratos.
Se les clasifica como:
Polisacridos (celulosa, almidn)
Trisacridos (rafinosa)
Disacridos (sacarosa, lactosa, maltosa), y
Monosacridos
Los monosacridos por el grupo carbonilco pueden ser aldosas o cetosas por el. nmero de tomos de
oxigeno, pueden ser hexoaas (glucosa, galactona, manosa, fructosa), pentosa (arabinosa, xilosa, ribosa,
lixosa), terrosas (treosa y eritrosa).
Los carbohidratos poseen algunas propiedades de las funciones carbonilo y oxhidrilo y, adems, algunas
especficas. Todos son ptimamente activos. Por el calor y la accin de cidos fuertes se deshidratan, dando
en algunos casos derivados del furfural.
Los hidratos de carbono ms abundantes de la bisfera estn constituidos por el almidn y celulosa que son
polmeros de glucosa presentes en plantas.
El almidn est distribuido ampliamente en las plantas que lo almacenan en granos y en tubrculos como
reserva alimenticia para el momento de la germinacin. Todos los tipos de almidn producen un color azul
con el yodo, lo cual sirve de indicador cualitativo sensible, tanto para ensayar el yodo como el almidn.
La hidrlisis del almidn catalizada por cidos lo convierte en varias clases de dextrinas, en maltosa y por
ltimo en D (+) glucosa.
El ensayo con yodo se utiliza para seguir la marcha de la hidrlisis puesto que la coloracin va cambiando de
azul a rojo a medida que decrece el peso molecular del compuesto orgnico.
Los grupos funcionales existentes en el almidn y en la celulosa son los grupos hidroxilo y acetal. Estos
polisacridos tienen diferente configuracin, siendo el almidn un glucsido y la celulosa un f -glucsido.
Tambin difieren en el tamao teniendo la celulosa un peso molecular medio mucho mayor que el del
almidn.
III. MATERIALES Y REACTIVOS
Reactivo Molisch
Tubos de ensayo
Reactivo Fehling
Pipetas
Reactivo Tollens
Bao de agua hirviente
Reactivo Seliwanoff
Pinzas
Reactivo Barfoed
Bao hirviente
Sol. glucosa 1%
Vaso de precipitados
Sol. fructuosa 1%
Luna de reloj
Sol. sacarosa 1
Sol. lactosa 1%
Sol. almidn 1%
Sol. sacarosa 5%
Sol. HCl 10%
Sol. NaOH 10%
Sol. yodo - yodurado
IV. PROCEDIMIENTO:
Reacciones genricas de los carbohidratos
Reaccin de Molisch
En 6 tubos de ensayo ponga respectivamente 1 ml. de una solucin de glucosa al 1%, 1 ml. de solucin
de fructuosa o levulosa al 1%, 1 ml. de una solucin de sacarosa al 1%, 1 ml. de una solucin de lactosa
I.
V.
al 1%, 1 ml. de una solucin de almidn al 1% y en el ltimo 1 ml. de agua (testigo). A cada una
agrguele 2 gotas
de reactivo de Molisch; inclinando el tubo, deje resbalar por las paredes 2 ml. de cido sulfrico
concentrado.
Observe el color violceo del anillo formado en la interfase entre los dos lquidos. Anote aquellas
soluciones que den positiva la prueba.
Reacciones Especficas
Reacciones de Fehling
En 5 tubos de ensayo mezclar en cada uno 0.5 ml. de solucin A de Fehling con 0.5 ml. de la solucin
B de Fehling, agrgueles 1 ml. de la solucin de los carbohidratos utilizados en el experimento anterior.
Introducir los tubos en un bao hirviente, observe si hay cambios de color, formacin de precipitados.
Reaccin de Tollens
En 5 tubos de ensayo colocar a cada uno 1. ml. de Reactivo de Tollens recientemente preparado,
aadir a cada uno 2 ml. de las soluciones de carbohidratos utilizados anteriormente.
Introducir los tubos en un bao hirviente, observe si hay formacin de espejo de plata y cuales
carbohidratos dan negativa esta reaccin.
Realice una comparacin de estos resultados con los de la prueba de Fehling.
Reaccin de Seliwanoff
En 5 tubos de ensayo coloque 1 ml. del reactivo Seliwanoff, luego aada 3 gotas de solucin de los
carbohidratos utilizados anteriormente, luego lleve los tubos a bao hirviente. Anote el tiempo en que
se colorea cadaa tubo y el color adquirido.
Reaccin de Barfoed
En 5 tubos de ensayo coloque 1 ml. del reactivo Bartoed luego aada 1 ml. de solucin de los
carbohidratos utilizados anteriormente, luego llevar los tubos a bao hirviente y observar la formacin
de un precipitado de color rojo ladrillo, lo que indicar la presencia de monosacridos.
Los disacridos tambin precipitan xido cuproso, pero muy lentamente.
Hidrlisis de la Sacarosa
En 3 tubos de ensayo coloque 5 ml. de solucin de sacarosa al 5%, llvelos a bao hirviente y a cada
tubo aada volmenes iguales de agua para el primer tubo, cido clorhdrico al 10% en el segundo
tubo, e hidrxido sdico acuoso al 10% en el tercero.
Calentar los tubos durante cinco minutos y ensaye a continuacin la reaccin de una porcin de cada
mezcla con la solucin de Fehling. Qu conclusiones deduce?
Ensayo del Almidn frente al Iodo
En un tubo de ensayo coloque 6 ml de solucin de almidn al 1%, aada una gota de solucin de Iodo
- lodurada, observe el color de la solucin. Luego caliente la solucin coloreada a ebullicin y observe
el efecto, observe tambin qu efecto produce el enfriamiento de la solucin.
Hidrlisis del Almidn
En un vaso de precipitados coloque 50 ml de solucin de almidn al 1%, aada 1 ml de cido
dorhdrico concentrado. Hierva la solucin y retire muestras de Y ml. a intervalos prximos, ensayando
su reaccin frente al iodo. Anote el color en los diferentes ensayos.
Cuando la solucin ya no produzca coloracin con el iodo, neutralcela y ensaye la reaccin de una
muestra frente al Fehling. Formule estructuralmente los productos finales de la hidrlisis del almidn
(un disacrido y un monosacrido).
CUESTIONARIO:
5.1. Indique la composicin de los reactivos utilizados en la prctica (R. Molish, R. Seliwanoff, R Barfoed,
R Fehling).
5.2. Elabore un diagrama de flujos del proceso de produccin de la glucosa a nivel industrial.
5.3. A qu se debe la coloracin azul del iodo sobre las muestras de almidn?
5.4. Cmo se utiliza el ensayo del iodo para seguir la hidrlisis del almidn?