LAPORAN PRAKTIKUM PENGENALAN AGAROSE GEL ELEKTROFORESIS

Ninik Nursanti

Laboratorium Biologi Mulut, Fakultas Kedokteran Gigi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta 25 April 2011

ABSTRACT DNA molecules can be separated by agarose gel electrophoresis which can be prepared with various pore sizes, enables us to separate the two molecules. Many theories have been propounded to explain the electrophoretic migration of DNA in agarose. Molecule DNA move from cathode to anoda. Smaller molecules migrate at a faster rate trough the gel than larger molecules. This experiment aims to make the students understand how to identificated DNA and how to use electrophoresis equipment. The experiments were done by two work . First, the student made agarose gel by mixing agarose powder and aquades, and then put on microwave for a little while. Second, doing elektrophoresis procedure. The result agarose gel that made the student before, have not good consistention and the electrophoresis procedure was not complitely done. The worst result of consistention agarose gel may be caused by the powder agarose gel was expired. If elektrophoresis completely done, the molecules DNA can be visible by autoradiography UV with ethidium bromide, that they moved from cathode to anode. Keywords: DNA, agarose gel, elektrophoresis

PENDAHULUAN DNA merupakan molekul kehidupan atau molekul yang dapat menentukan kehidupan. Kromosom mengandung DNA dan bertanggung jawab terhadap sifat-sifat pewarisan. DNA tersusun dari fosfat, gula, dan basa. Gula yang menyusunnya adalah deoksiribose, Gula dan fosfat merupakan bagian struktur DNA yang tetap, sedangkan basa terdapat empat macam, yaitu basa purin yang terdiri dari adenine dan guanin, serta basa pirimidin yang terdiri dari sitosin dan timin (Hartono dkk., 1998).

Struktur DNA merupakan rangkaian polimer ganda, satu dengan yang lain saling berhadapan, disebut double helix. Sebagai rangka penyangga masing-masing pita helix tersusun dari bahan tetap polimer fosfat-gula-fosfat-gula. Pada posisi nomor 1 cincin gula mengikat basa nitrogen. Basa-basa ini selalu berpasangan antara adenin dengan timin dan antara guanin dengan sitosin. Pasangan tersebut dihubungkan dengan ikatan hidrogen. Seluruh pasangan basa lengkap untuk masing-masing organism disebut genom (Hartono dkk., 1998). Untuk menganalisis dan persiapan memurnikan fragmen-fragmen DNA tertentu dapat digunakan elektroforesis (Old dan Primrose, 1989). Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan atas ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan (Suwono, 2005). Teknik elektroforesis berguna dalam studi tentang protein. Teknik ini dapat diaplikasikan untuk separasi fragmen-fragmen DNA dan RNA dengan ukuran yang berbeda (Klug dkk., 2008). Secara umum, elektroforesis menseparasi molekul dengan cara menyebabkan molekul tersebu bermigrasi di bawah pengaruh aliran listrik. Salah satu material pendukung proses elektroforesis adalah gel. Ada beberapa macam gel yang bisa digunakan, antara lain agarose gel, polyacrylamide gel, serta starch gel. Agarose gel merupakan suatu bahan semi padat berupa polisakarida yang diekstraksi dari rumput laut (Suwono, 2005). Agarose gel dipakai untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA yang ukurannya mempunyai rentang beberapa ratus hingga sekitar 20.000 pasangan basa (Old dan Primrose, 1989). Tujuan praktikum ini adalah untuk memahami proses identifikasi suatu DNA dan mengenal penggunaan alat serta bahan yang berhubungan dengan elektroforesis.

BAHAN DAN CARA Pada praktikum Pengenalan Agarose Gel Elektroforesis, ada dua tahapan kerja, yaitu determinasi konsentrasi DNA, yang terdiri dari proses membuat agarose dan elektroforesis, serta determinasi purifikasi DNA. Untuk membuat agarose gel, bahan yang digunakan adalah gel agarose dan aquades. Sementara itu, alat yang digunakan adalah tabung Erlenmeyer, microwave, dan cetakan gel. Cara pembuatan 2% agarose gel adalah 1 mg agarose gel dimasukkan ke dalam tabung Erlenmeyer yang berisi 5 ml air. Tabung tersebut kemudian dipanaskan dalam microwave sampai hampir mendidih (timbul sedikit letupan air), lalu tabung dikeluarkan dan digoyangkan

hingga gel tercampur. Proses tersebut diulangi beberapa kali hingga seluruh gel larut. Kemudian menuangkan gel secara pelan-pelan ke dalam cetakan dan hindari gelembung-gelembung udara agar tidak terjebak dalam gel. Sisir dinsersikan pada tempatnya, ditunggu hingga larutan gel membeku. Setelah gel mengeras kira-kira 1jam, sisir gel diangkat secara tegak lurus dan perlahan. Bila tidak segera digunakan, gel dibungkus dengan plastik dan disimpan di dalam lemari es dengan suhu 4o C. Untuk proses elektroforesis, bahan yang digunakan adalah sampel DNA, agarose gel 2%, buffer TBE yang terdiri dari 10 mM Tris HCl pH 8,0 dan 1 mM EDTA, serta gel loading buffer yang terdiri dari 0,25% bromphenol blue, 0,25 5-xylene cyanol FF, dan 40% w/v sukrosa dalam air. Cara kerjanya adalah sebagai berikut. Sampel DNA sebanyak 8 l diambil dengan mikropipet dan diletakkan di atas parafilm. Kemudian ditambahkan 2 l larutan gel loading buffer yang mengandung bromphenol blue. Campuran tersebu diaspirasi dengan mikropipet sebanyak 3-4 kali, lalu dimasukkan ke dalam sumuran agarose gel 2% yang telah terendam oleh buffer TBE. Elektroforesis dilakukan tegangan listrik 110 volt dan arus listrik 88 mA. Pergerakan pita DNA diamati. Setelah pita DNA berada di bagian bawah maka elektroforesis dinyatakan selesai. Waktu yang dibutuhkan untuk proses tersebut dicatat. Selanjutnya jika sampel berupa hasil produk PCR, maka dapat dilanjutkan langkah berikutnya (namun langkah ini tidak dilakukan dalam praktikum). Gel diangkat dan diletakkan dalam suatu tempat plastik yang berisi TBE buffer dan 0,5 g/mL ethidium bromide, lalu diletakkan di atas shaker selama 20-30 menit. Larutan tesebut dibuang kemudian gel diletakkan pada tempat semula, selanjutnya dialiri dengan air mengalir secara perlahan selama 20-30 menit, proses ini dinamakan destaining. Gel diangkat lalu dilakukan pemotretan dengan alat khusus di bawah sinar ultraviolet.

HASIL PENGAMATAN

sumuran DNA sebelum elektroforesis

sumuran DNA setelah elektroforesis

hasil sumuran DNA dilihat dengan sinar UV

PEMBAHASAN Sifat pelarutan dari serbuk agarose di dalam pelarut akan menentukan hasil agarose gel. Serbuk agarose harus larut seluruhnya di dalam pelarut untuk mendapatkan agarose gel yang baik. Menurut Suwono (2005), untuk melarutkan serbuk agarose di dalam pelarut, dapat dibantu dengan pemanasan, misalnya menggunakan microwave oven. Selain sifat pelarutannya, keadaan dari serbuk agarose itu sendiri juga dapat mempengaruhi hasil akhir agarose gel. Serbuk agarose yang sudah melewati tanggal kadaluwarsa kemungkinan mengalami perubahan secara kimiawi yang akan dapat mempengaruhi hasil agarose gel. Konsentrasi agarose yang ditentukan oleh jumlah serbuk agarose dalam pelarutnya. Konsentrasi agarose yang tinggi digunakan untuk separasi DNA kecil, sedangkan konsentrasi agarose yang rendah digunakan untuk separasi DNA besar (Anonim, 2000).

Agarose gel dipilih untuk elektroforesis karena memiliki beberapa kelebihan, antara lain tidak toksik, mudah dan cepat dicetak, baik untuk menseparasi molekul DNA yang besar, dan relative kuat. Namun di sisi lain, agarose gel mempunyai kekurangan, yaitu elektroendosmosis, mahal, dan kurang baik untuk menseparasi sampel yang berat molekulnya rendah (Tietz, 1998). Untuk membuat sumuran pada cetakan agarose gel dipakai sisir yang dapat terbuat dari Perspex (Suwono, 2005) atau Plexiglas (Tietz, 1998). Sebelum gel mendingin dan memadat, sisir tersebut ditancapkan pada salah satu ujung gel yang masih cair. Jika sisir terlambat ditancapkan ketika gel sudah mulai memadat, nantinya malah akan merusak gel dan sumuran tidak dapat tercetak dengan baik. Selain cetakan agarose gel, hasil praktikum ini juga menunjukkan tampaknya pergerakan/migrasi sampel DNA pada proses elektroforesis. Sebelum proses elektroforesis, sampel DNA berada di kutub negatif. Beberapa waktu kemudian setelah proses elektroforesis berlangsung, sampel DNA tampak berjalan menjauhi kutub negatif menuju ke kutub positif. Hal ini sesuai teori menurut Suwono (2005), molekul DNA bermuatan negatif. Ketika listrik dialirkan, DNA bergerak ke arah kutub positif. Didukung pula teori menurut Old dan Primrose (1989), yaitu didalam medan listrik molekul DNA bergerak melalui gel pada kecepatan yang berbeda, tergantung ukurannya. Molekul DNA yang kecil dapat dengan mudah melewati gel dan karenanya bergerak lebih cepat dibandingkan molekul yang lebih besar. Untuk melihat pergerakan molekul DNA dengan jelas dapat dilakukan dengan merendam agarose gel dalam ethidium bromida kemudian gel disinari dengan ultraviolet dari bawah. Pitapita akan tampak sebagai pencitraan dari molekul-molekul DNA yang bergerak sepanjang gel setelah dielektroforesis (Suwono, 2005). Namun, pada saat proses tersebut, pita-pita DNA tidak terlihat jelas terpisah-pisah berdasarkan ukuran molekul. Agarose gel dalam bentuk bubuk dan larut dalam air atau buffer pada suhu kamar. Tapi larut dalam air mendidih. Ketika mulai dingin, mengalami proses yang dikenal sebagai proses polimerisasi. Polimer crosslink gula satu sama lain sehingga menjadi bentuk "gel" atau semi padat. Hasil dari sumuran DNA yang kabur kemungkinan disebabkan oleh kurang sempurnanya proses polimerisasi dari agarose gel yang digunakan. (Anonim, 2009)

KESIMPULAN Proses elektroforesis terjadi pergerakan DNA yang memiliki muatan negatif, dan saat berada dalam aliran listrik, akan bermigrasi melalui gel menuju kutub positif. setelah dilakukan proses elektroforesis, dilakukan pencitraan dibawah sinar UV. Tetapi hasilnya yang diperoleh kabur, hal ini kemungkinan disebabkan dari polimerisasi agarose gel yang kurang sempurna.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2000. Agarose Gel Electrophoresis of DNA. Online (http: www.vivo.colostate.edu). Diakses 25/03/10. Anonim. 2009. Exsperiment 2: Gel Electrophoresis Of DNA. University of Illinois. Chicago. Online (http://www.life.illinois.edu/molbio/geldigest/electro.html). Diakses 25/03/10. Goodenough U. 1988. Genetika. Erlangga. Jakarta. Hartono, Suryadi E, Siswosudarmo R, Romi MM. 1998. Buku Pegangan Kuliah Genetika Kedokteran. Yogyakarta. Klug WS, Cummings MR, Charlotte AS, Palladino MA. 2008. Concepts of Genetics. Pearson. San Fransisco. Old RW dan Primrose SB. 1989. Prinsip-Prinsip Manipulasi Gen. Blackwell Scientific Publications. Oxford. Suwono T. 2005. Biologi Molekuler. Erlangga. Jakarta. Tietz D. 1998. Nucleid Acid Electrophoresis. Springer.

PENGENALAN AGAROSE GEL ELEKTROFORESIS LABORATORIUM BIOLOGI MULUT

Disusun Oleh: Ninik Nursanti 08/264637/KG/8258 Kelompok A2

Laporan ini disusun sebagai salah satu prasyarat mata kuliah Biologi Mulut 3

FAKULTAS KEDOKTERAN GIGI UNIVERSITAS GADJAH MADA YOGYAKARTA 2011