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UNIVERSIDAD ALAS PERUANAS FILIAL AREQUIPA

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA Y CIENCIAS DE LA SALUD


ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUMICA
ALUMNO: EMERSON TURPO BALDRRAGO

TRABAJO N

PRCTICA 17: ANLISIS MICROBIOLGICO DE EMBUTIDOS


ENVASADOS AL VACO

I.- INTRODUCCIN
Aunque tericamente todos los alimentos se pueden alterar o suponer algn peligro
por contaminacin, infeccin o formacin de sustancias txicas, son los alimentos de
origen animal los de mayor importancia desde el punto de vista de la higiene
alimentaria. En este grupo estn incluidas las carnes de vacuno, cerdo, aves, ovino y
los derivados crnicos.
Los derivados crnicos, son productos alimenticios preparados total o parcialmente
con carnes, despojos, grasas y subproductos comestibles, procedentes de los
animales de abasto u otras especies. Pueden contener tambin ingredientes de origen
vegetal o animal, as como los condimentos, especias y aditivos, siempre que estn
autorizados, y se ajusten a normas especficas de calidad.
Los derivados crnicos se clasifican en: Productos crnicos crudos adobados,
embutidos crudos curados, productos crnicos tratados por el calor, salazones
crnicas, platos preparados crnicos y otros derivados crnicos. Dentro de este grupo,
uno de los productos de mayor importancia, exactamente por su alta demanda de
consumo, vienen a ser los embutidos.
En alimentacin, se denomina embutido a una pieza, generalmente de carne picada y
condimentada con hierbas aromticas y diferentes especias (pimentn, pimienta, ajos,
romero, tomillo, etc.) que es introducida (embutida) en piel de tripas de cerdo.
El envasado al vaco hace referencia al sistema de envasado en ausencia de aire, el
cual es generalmente til para la supresin de la mayor parte de bacterias nocivas,
incrementndose de esa forma la vida de almacenamiento del producto, puesto que
estas bacterias precisan oxgeno para su crecimiento normal.
Se ha de tener en cuenta no obstante que las esporas no destruidas pueden
permanecer durmientes y pueden ocasionar problemas cuando el envase abre. Por
esta razn se recomienda que los envases al vaco, para su venta minorista, se les
permite un mximo de vida de almacenamiento de 10 das desde la fecha de
envasado.

II.- OBJETIVOS

Realizar el control microbiolgico de embutidos envasados al vaco.

Conocer los mtodos establecidos para el anlisis microbiolgico.

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III.- REVISIN BIBLIOGRFICA


III.1.- Embutidos
Un embutido es una pieza, generalmente de carne picada y condimentada con hierbas
aromticas y diferentes especias (pimentn, pimienta, ajos, romero, tomillo, etc.) que
es introducida (embutida) en piel de tripas de cerdo.
La fabricacin de embutidos depende de muchos factores, por lo que es muy difcil
clasificar estos productos. Price y Schweigert (1976) hacen una divisin de ellos con
base en el tratamiento trmico que reciben. Es as que los embutidos se pueden dividir
en diferentes clases: frescos, secos y semisecos, cocidos, cocidos y ahumados,
ahumados no cocidos y los realizados mediante carne cocida.

Embutidos frescos: Realizados a travs de carne fresca picada, no estn


curadas, llevan condimentos y suelen estar embutidas en tripas. Antes de
consumirse se suelen cocinar. Ej. Las salchichas.

Embutidos secos y semisecos: Estn realizados con carnes curadas, se


fermentan y son desecadas al aire, tambin pueden ahumarse antes de ser
desecadas. Se suelen servir fras. Ej. El salami.

Embutidos cocidos: Pueden estar curados o no, la carne est picada,


condimentada, embutida en las tripas, cocidas y a veces ahumadas.
Normalmente se suelen servir fras. Ej. Mortadela.

Embutidos cocidos y ahumados: Son carnes curadas y picadas,


condimentadas, embutidas en las tripas, ahumadas y cocidas, por lo que no
necesitan ser tratados posteriormente, aunque pueden calentarse antes de ser
servidas. Ej. El salami de Crcega o las salchichas Frankfurt.

III.2.- Envasado al vaco


El envasado al vaco es un sistema de envasado que se realiza en ausencia de aire,
siendo til para la supresin de la mayor parte de bacterias nocivas.
Con carnes frescas (no curadas y no cocidas) la ausencia de oxgeno causa prdidas
del caracterstico color rojo de la carne. El envasado al vaco es por consiguiente
raramente utilizado para envases al por menor, pero es ampliamente utilizado para los
almacenamientos a largo y medio plazo en el comercio.

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Con las carnes curadas las ventajas del envasado al vaco son:

A causa de que el oxgeno se excluye de los envases, el crecimiento


bacteriano se reduce. El dbil crecimiento microbiano que tiene lugar produce
dixido de carbono que es un veneno para los microorganismos, por lo que
detiene su crecimiento. De esta forma la vida de almacenamiento se prolonga.

La exclusin del oxgeno tambin mejora la estabilidad del color.

El envasado al vaco elimina las prdidas de humedad.

Adems, existen las ventajas ordinarias de los productos correctamente


envasados en unidades convenientes para la exposicin y venta, con un
manejo higinico.

Con carne curada cocida la desventaja que presenta el envasado al vaco es:

En envases transparentes al vaco el color curado es inestable a la luz,


especialmente a la luz ultravioleta. El problema se puede vencer, no obstante,
con la utilizacin de pelculas de envasado con barrera UV.

III.3.- Microorganismos contaminantes

1. Clostridium perfringens

Es una especie bacteriana perteneciente a la familia Bacillaceae. Est


integrada por grmenes de forma bacilar de 4-8 por 0,3-1,5 m. Aparecen
aislados o en cadenas cortas.

El Cl. perfringens es un germen telrico ampliamente distribuido en la


naturaleza (suelo, polvo, sedimento marino, moscas, etc.) que se encuentra en
el intestino de hombres sanos, as como en ganado porcino y bovino, tambin
sanos.

Por otra parte, es un germen patgeno para los animales (enterotoxemias) y


para el hombre (toxiinfecciones alimentarias: Cl. perfringens tipo A, y enteritis
necrtica, Cl. perfringens tipo C).

Para que sea causa de toxiinfeccin alimentaria, debe estar presente en el


alimento en cifras elevadas, superiores a 105 Cl. perfringens por gramo. La
intoxicacin por el tipo A se debe a una enterotoxina que se produce en el
citoplasma de los grmenes en esporulacin. Sus principales caractersticas
bioqumicas son:

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Son capsulados, inmviles, anaerobios estrictos y gram positivos.

Reducen nitratos a nitritos.

Producen SH2.

Fermenta muy rpidamente la lactosa (con produccin de cido y gas),


glucosa, galactosa fructosa, maltosa, manitol, inositol y sacarosa.

Producen leticinasa.

Elaboran toxinas A, B, C, D y E.

2. Salmonella

Se sabe que Salmonella es un gnero bacteriano, perteneciente a la familia


Enterobacteriaceae integrado por grmenes de forma bacilar, no esporulados,
habitualmente mviles mediante flagelos peritricos, aunque existen mutantes
inmviles.

La amplia distribucin de Salmonella spp. en el medio ambiente, aunada a las


prcticas agrcolas utilizadas en la industria crnica, pesquera, de moluscos,
lctea y el reciclaje de la materia prima como alimento para ganado, ha
favorecido la continua permanencia de este patgeno humano en la cadena
alimenticia.

Sus principales caractersticas son:

Bacilos Gram negativos.

Aerobios o anaerobios facultativos.

Fermentan la glucosa con produccin de gas.

No fermentan la lactosa.

Reducen nitratos a nitritos.

Son citocromo-oxidasa negativos.

3. Staphylococcus aureus

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Staphylococcus aureus es una especie bacteriana integrada por formas


cocceas de 0,8-1,0 m de dimetro, que se dividen en ms de un plano, por lo
que se agrupan irregularmente en racimos.

Es una especie muy sensible a la accin del calor y los desinfectantes. Su


presencia o la de sus toxinas en los alimentos es signo evidente de la falta de
higiene. Una caracterstica muy importante de este germen es que sus toxinas
pueden ser causa de intoxicacin cuando se ingiere con los alimentos.

En general, la presencia de un nmero elevado de Staphylococcus aureus en


un alimento refleja higiene defectuosa por mala manipulacin. Si, adems, los
S. aureus aislados son cepas enterotoxignicas, suponen un riesgo para la
salud.

El crecimiento de Staphylococcus aureus en alimentos, tiene gran importancia


por tratarse de un microorganismo capaz de producir una poderosa
enterotoxina, que al ingerirse causa intoxicaciones severas al hombre. Como
se mencion con anterioridad son 5 enterotoxinas: A, B, C, D y E, siendo la A
la ms nociva.

La cantidad de Staphylococcus aureus necesaria para producir suficiente


toxina (1.0 microgramo), para causar intoxicacin, es de 10 6 UFC/g de
alimento, sin embargo Jablonski et al, comentan que el FDA, establece que
una cantidad de Staphylococcus aureus patgeno, en el que se encuentren
105 UFC/g de alimento, provoca intoxicaciones y que un nivel basal de
aproximadamente un nanogramo de toxina estafilocccica por gramo de
alimento, es suficiente para causar sntomas asociados con la intoxicacin
antes mencionada.

Sus principales caractersticas son:

Cocos gram positivos.

Disposicin sola, en pares o racimos.

No son mviles, ni esporulados.

Su metabolismo es oxidativo/fermentativo.

Catalasa positivo.

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III.- MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS

III.1.- MATERIALES

Tubos de ensayo.

Placas Petri descartables.

Piceta.

Probetas de 100 mL.

Matraces de 250 mL.

Mechero Bunsen.

Trpode y malla de asbesto.

Cucharilla metlica.

Recipiente estril.

Bagueta.

Bistur estril.

Asa de Koll.

Asa de Digralsky.

Gradilla metlica.

Gasa estril.

Jeringas estriles de 1, 10 y 20 mL.

Papel kraft.

Algodn estril.

Pabilo.

III.2.- REACTIVOS

Agua destilada.

Agar Salmonella-Shigella.

Agar Manitol Salado.

Agar Triptona-Sulfito-Neomicina (TSN).

Caldo peptonado.

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Caldo selenito-cistina.

Cloruro de sodio al 0.9%.

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III.3.- EQUIPOS

Autoclave.

Estufa.

Balanza electrnica.

IV.- PROCEDIMIENTO

Fuente: NTS N 071- MINSA/DIGESA-V.01.

4.1.- DILUCIONES DECIMALES


A. Fundamento: Tiene por objeto efectuar diluciones progresivas de una muestra
sometida a anlisis, para poder realizar recuentos microbianos posteriores.

B. Tcnica

Pesar aspticamente 10 g de la muestra analtica.

La cifra de pesado obtenido se debe multiplicar por 9 para calcular el


volumen del diluyente, por lo cual se le aadirn 90 mL de Suero fisiolgico.

Proceder a homogeneizar y/o triturar la muestra con el diluyente, lo que


constituir la suspensin madre y primera dilucin de la serie (1:10).

A un tubo que contenga 9 mL de Suero fisiolgico, se transfiere 1 mL de la


suspensin madre. Mezclar 30 segundos en un agitador (dilucin 10-2).

De la mezcla anterior, incorporar 1 mL a otro tubo que contenga 9 mL de


Suero fisiolgico. Mezclar 30 segundos en un agitador (dilucin 10-3).

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4.2.- AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE SALMONELLA


A. Fundamento:
La tcnica para la deteccin de Salmonella en alimentos, describe un esquema
general que consiste de 5 pasos bsicos:

Preenriquecimiento, es el paso en donde la muestra es enriquecida en un


medio nutritivo no selectivo, que permite restaurar las clulas de Salmonella
daadas, logrando de esta manera una condicin fisiolgica estable.

Enriquecimiento selectivo, se logra a partir de un medio de cultivo que


conjunte dos condiciones, por un lado debe incrementar las poblaciones de
Salmonella y por otro inhibir otros microorganismos presentes en la
muestra.

Seleccin en medios slidos, este punto se deriva directamente del


anterior y se utilizan medios selectivos, que restringen el crecimiento de
otros gneros diferentes a Salmonella y que permitan el reconocimiento
visual caracterstico de colonias sospechosas.

Identificacin bioqumica, este paso permite la identificacin genrica de


los cultivos de Salmonella y la eliminacin de cultivos sospechosos falsos.

Serotipificacin, es una tcnica inmunolgica (antgeno-anticuerpo) que


permite la identificacin especfica de un microorganismo.

B. Tcnica:
Preenriquecimiento en medio lquido no selectivo
-

Pesar aspticamente y en un envase estril 25 g del producto a


analizar.

Aadir 225 mL de agua peptonada para obtener una solucin 1:10.

Mezclar bien e incubar a 37C durante 16-20 horas.

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Enriquecimiento en medio lquido selectivo


-

Tomar 10 mL del cultivo previo en agua peptonada y aadirlo sobre 100


mL de caldo selenito-cistina.

Incubar a 37C durante 18-24 horas.

Aislamiento diferencial
-

A partir del cultivo obtenido en el caldo selenito-cistina sembrar en


estras, por duplicado y sin recargar el asa en la segunda placa sobre la
superficie de Agar Salmonella Shigella (SSA).

Incubar en estufa a 37C todas las placas sembradas, durante 24-48


horas.

Aislar como mnimo dos colonias con aspecto tpico de Salmonella del
Agar SS.

Sembrar cada colonia en agar hierro triple azcar (TSI), con asa de
cultivo, y sin recargar el asa, sembrar, por picadura en el medio agar
lisina hierro (LIA).

Incubar los tubos de TSI a 37C durante 24 horas y los de agar LIA a
37C durante 48 horas.

PROCEDIMIENTO PARA EL ANLISIS DE SALMONELLA EN ALIMENTOS

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IV.3.- RECUENTO EN PLACA DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS

A. Fundamento
Esta tcnica para la deteccin de Staphylococcus aureus, se fundamenta en
los siguientes pasos:

Aislamiento selectivo, se utiliza un medio selectivo slido, el cual


inhibe el desarrollo de gneros diferentes al Staphylococcus, pero
adems permite reconocer el desarrollo caracterstico del
microorganismo buscado.

Recuperacin de la cepa, este paso permite restaurar las clulas


daadas de Staphylococcus aureus.

Identificacin bioqumica, en este punto se identifica el gnero y


especie de Staphylococcus aureus enterotoxignico.

B. Tcnica
-

A partir de la serie de diluciones decimales (10 -1, 10-2 y 10-3) y por duplicado
se siembra 0.1 mL de cada dilucin sobre la superficie bien seca de agar
Manitol Saldado contenido en placas de Petri.

Diseminar con asa de Digralsky estril (siembra por agotamiento en placa).

Incubar en estufa a 37C durante 48 horas.

Seleccionar para el recuento las placas que contengan entre 20-200


colonias tpicas. Una vez contadas estas colonias, la cifra obtenida se
multiplica por el factor de dilucin de la placa, lo que da como resultado el
recuento total de S. aureus en 0.1 g del producto analizado. Esta cifra
multiplicada por 10, expresa el recuento total de S. aureus por gramo o
mililitro de muestra.

PROCEDIMIENTO PARA EL ANLISIS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EN


ALIMENTOS

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4.4.- RECUENTO DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

A. Fundamento:

Se fundamenta en los agentes inhibidores (Sulfito, Polimixina B y Neomicina)


que le dan carcter selectivo al medio de cultivo, adems de la temperatura de
cultivo (46C) a la que solo Cl. perfringens puede crecer.

B. Tcnica

A partir de las diluciones decimales, y por duplicado, se siembra 1 mL de


las distintas diluciones en tubos de ensayo con tapn a rosca, estriles.

Inmediatamente se vierten en cada tuvo, 15 mL de agar triptona-sulfitoneomicina (TSN), licuado y atemperado a 45C-50C.

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Una vez solidificado el agar, se vierten sobre su superficie unos 3 mL de


parafina lquida estril.

Incubar a 46C durante 24 horas. Esta temperatura es selectiva para el


aislamiento de Cl. perfringens.

El recuento de Cl. perfringens se obtiene contando el nmero de colonias


tpicas crecidas en el tubo y multiplicando por su factor de dilucin; se
obtiene as el nmero de colonias por gramo o mililitro del alimento en
estudio.

V.- RESULTADOS
Tabla No.1.- Caractersticas de la muestra
Muestra

Salchichn

Consistencia

Slida

Color

Rosceo

Envasado

Al vaco

Tabla No.2.- Resultados del control microbiolgico


Microorganismo
Salmonella sp.
Staphylococcus aureus
Clostridium perfringens

Resultado
Ausencia en 25 g
4 x 103 UFC/g
Ausencia

VI.- RECOMENDACIONES

Antes de empezar con el anlisis microbiolgico asegurarse que el rea de


trabajo se encuentre limpia y desinfectada.

En el sembrado por superficie con el asa de Digralsky, extender bien la


dilucin.

VII.- CONCLUSIONES

Primera: A travs del anlisis microbiolgico realizado a una muestra de


salchichn envasado al vaco, se determin una concentracin de 4 x 10 3
UFC/g para Staphylococcus aureus, la misma que segn la Norma Tcnica
Sanitaria N-071 establecida por la Direccin General de Salud Ambiental
(DIGESA) no se encontrara dentro de los parmetros establecidos por la
norma anteriormente mencionada.

Segunda: Se logr aprender la metodologa a seguir para la realizacin de los


diferentes ensayos microbiolgicos.

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VIII.- BIBLIOGRAFA
-

Pascual M.A, Caldern V. Microbiologa alimentaria: metodologa analtica para


alimentos y bebidas.

Norma Legal El Peruano. Criterios Microbiolgicos de Calidad Sanitaria e


inocuidad para los alimentos y Bebidas de consumo humano. Resolucin
Ministerial N0568-2003-RE. Lima, 26 de junio del 2003.

Hernndez A. Microbiologa Industrial. EUNED.

M.D. Ranken. Manual de industrias de la carne.1 Ed: 2003.

IX.- CUESTIONARIO

1. Cules son las pruebas bioqumicas utilizadas para identificar C.


perfringens?

Para la identificacin bioqumica de C. perfringens se realizan las siguientes


Pruebas bioqumicas:

Fermentacin de azcares: glucosa, lactosa, ramnosa, manitol.

Hidrlisis de: almidn, gelatina, esculina, casena, DNA, lecitina.

Produccin de: hidrgeno sulfurado, indol, gas.

2. Cmo se consigue un medio anaerobio para la incubacin de las


bacterias anaerobias?

Como los anaerobios estrictos varan en su sensibilidad al oxgeno,


existen diferentes mtodos para disminuir la cantidad de oxgeno en los
cultivos; algunos sencillos y otros mucho ms complejos.

Botellas, tubos o matraces completamente llenos con el medio de


cultivo y los tapones apropiados, proporcionan condiciones anaerbicas
suficientemente buenas para el crecimiento de muchos anaerobios.

Tambin es posible aadir algn compuesto qumico que reacciona con


el oxgeno del aire y la reduce hasta H2O. Un buen ejemplo de esto es
el tioglicolato, comnmente utilizado para ensayar el requerimiento de

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oxgeno de un microorganismo. Despus de que el tioglicolato


reaccione con el oxgeno del tubo, el oxgeno puede penetrar solamente
en la parte superior, donde el medio contacta con el aire.
-

Para quitar todas las trazas de oxgeno para el cultivo de anaerobios


puede utilizarse una jarra de anaerobios. El aire de la jarra de
sustituye por una mezcla de hidrgeno y anhdrido carbnico y, en
presencia de un catalizador, se consumen las trazas de oxgeno que
todava quedan, esto proporciona condiciones totalmente anaerobias
para el crecimiento de anaerobios estrictos.

3. Describa el fundamento del caldo selenito cistina y el agar TSN

Caldo Selenito Cistina

La peptona aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo


bacteriano.

La lactosa es el hidrato de carbono fermentable.

El selenito de sodio inhibe flora Gram positiva y la mayora de la flora


entrica excepto Salmonella spp.

La l-cistina es el agente reductor y fue propuesta por la FDA para el


aislamiento de Salmonella en productos alimenticios incrementando la
recuperacin por reduccin de la toxicidad del selenito.

Agar TSN
-

Esta bacteria es tolerante a la Neomicina y a la Polimixina, las cuales


tienen la capacidad de inhibir el crecimiento de la flora secundaria.
Concretamente es la Neomicina la que inhibe al Clostridium
bifermentans pues es un antibitico de la familia de los
Aminoglucsidos.

La condicin ptima de temperatura para Clostridium perfringens son


46C aumentando as el carcter selectivo debido a las condiciones de
la incubacin.

Tambin est capacitado para producir Hidrgeno Sulfuro por lo que


tiene lugar la precipitacin del Hierro (II) Sulfuro negro alrededor de las
colonias.

X.- ANEXOS

Anexo N1.- Nueva Formulacin del Agar TSN


Peptona de casena
Extracto de levadura

15.0 g
10.0 g

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Sulfito sdico
Sulfato ferroso
Gentamicina
Agar
Agua destilada

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1.0 g
0.5 g
0.5 mL
20 g
1.000 mL

Nota: Como se observa en el Anexo N1, algunos elementos de la composicin original del
agar TSN fueron sustituidos, en esto se incluye al Citrato de hierro que fue sustituido por el
sulfato ferroso y a los antibiticos Polimixina B y neomicina, que fueron sustituidos por la
gentamicina. Cabe aclarar que se recurri a esta nueva formulacin por no tener acceso al agar
TSN, sin embargo, el medio de cultivo obtenido cumpli con las mismas caractersticas.

Anexo N2.- Recuento de Staphylococcus aureus sobre Agar Baird Parker

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