Principios de

Biologa Molecular
Miguel Martnez Trujillo Ernesto Garca Pineda Jess Campos Garca Mara Elena Granados Garca Andrea Faras Escalera

Universidad Michoacana de San Nicols de Hidalgo Secretara de Educacin Pblica-PROMEP

Principios de Biologa Molecular Miguel Martnez Trujillo, Ernesto Garca Pineda, Jess Campos Garca, Mara Elena Granados Garca, Andrea Faras Escalera

Primera edicin, 2006 Morelia, Michoacn, Mxico Derechos reservados conforme a la ley Universidad Michoacana de San Nicols de Hidalgo Secretara de Educacin Pblica-PROMEP ISBN 970-9836-21-8

Impreso en Mxico Printed in Mxico

CONTENIDO
Pgina

1. ESTRUCTURA DEL DNA Y CROMOSOMAS 1.1. Las unidades qumicas del DNA 1.2. El principio transformante 1.3. La estructura del DNA 1.4. Empaquetamiento del DNA 1.5. El cariotipo

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2. SNTESIS DEL DNA Y CICLO CELULAR 2.1 Divisin en procariontes y eucariontes 2.2. Mitosis 2.3. Meiosis 2.4. Replicacin del DNA 2.4.1. Replicacin Semiconservativa 2.4.2. Mecanismo de la replicacin 2.4.3. Orgenes de replicacin y DNA polimerasas 2.5. Regulacin del ciclo celular 3. EXPRESIN GENTICA: SNTESIS DE RNA Y DE PROTENAS 3.1. Un gen una protena 3.2. El dogma central 3.3 Tipos de RNA 3.4. Transcripcin 3.5. Proceso de la transcripcin 3.6. RNA polimerasa bacteriana 3.6.1. La asociacin con el factor sigma cambia la iniciacin de la Transcripcin 3.6.2. Cmo la RNA polimerasa encuentra las secuencias promotoras? 3.6.3. Cmo el factor sigma controla la unin al DNA? 3.6.4. El reconocimiento del promotor depende de una secuencia Conservada 3.6.5. Terminacin de la transcripcin 3.6.5.1. Terminadores intrnsecos 3.6.5.2. Terminadores dependientes de protenas Rho 3.7. RNA polimerasas de eucariontes 3.8. Regiones promotoras de eucariontes 3.9. Factores generales de transcripcin eucariticos 3.10. Procesamiento de RNAs mensajeros de eucariontes 3.11. El cdigo gentico 3

26 28 30 33 37 38 42 43 46 53 53 54 55 57 60 63 65 69 70 73 78 78 82 83 84 85 86 93

3.12. Los ribosomas 3.13. RNA de transferencia (RNAt) 3.14. La traduccin y sntesis de protenas 3.14.1. Complejo de iniciacin en bacterias 3.14.2. Complejo de iniciacin en eucariontes 3.14.3. Alargamiento de las cadenas de protenas 4. REGULACIN DE LA EXPRESIN DE LOS GENES 4.1. Transcripcin y elementos de control gentico 4.2. Regulacin de la expresin gentica en procariontes 4.2.1. Control transcripcional 4.2.2. Control a nivel de la traduccin del RNA mensajero 4.3. Regulacin gentica en eucariontes 4.3.1. Regulacin de la transcripcin a nivel del DNA 4.3.1.1. Protenas activadoras de transcripcin 4.3.1.2. Represores de la transcripcin 4.3.2. Regulacin epigentica 4.3.2.1. Complejos remodeladores dependientes de ATP 4.3.2.2. Variantes de histonas 4.3.2.3. Modificaciones post-traduccionales de histonas 4.3.2.4. Metilacin del DNA 4.3.2.5. Imprinting 4.3.2.6. Silenciamiento de genes inducido por RNA 4.4. El RNA de interferencia 5. MUTACIONES 5.1. Mutaciones puntuales o gnicas 5.2. Efecto de mutaciones en protenas 5.3. Los cambios tautomricos de las bases 5.4. Transiciones y transversiones 5.5. Factores externos 5.6. Mutaciones cromosmicas 5.6.1. Deleciones y duplicaciones de segmentos cromosmicos 5.6.2. Inversiones 5.6.3. Translocaciones 5.6.4. Efectos fenotpicos de los rearreglos cromosomales 5.7. Cambios numricos de cromosomas 5.8. Poliploides 5.8.1. Origen de los poliploides 6. TCNICAS DE DNA RECOMBINANTE 6.1. Corte y ligamiento del DNA 6.2. Electroforesis 6.3. Clonacin de DNA en vectores 6.4. Reaccin en cadena de la polimerasa 6.5. Transformacin gentica de plantas 6.5.1. El sistema de Agrobacterium 6.5.2. El mtodo de biobalstica 6.5.3. Comercializacin y bioseguridad de plantas transgnicas 4

96 97 99 100 102 104 107 107 109 110 114 114 115 116 118 119 121 123 124 126 128 128 129 131 131 133 136 138 138 139 140 140 140 140 141 144 146 149 149 153 156 159 161 161 165 167

6.6. Animales transgnicos 6.6.1. Mtodos de obtencin de animales transgnicos 6.7. Uso de organismos transgnicos para estudiar la funcin de los genes 6.8. Clonacin de individuos 6.9. Clonacin teraputica y clulas madre 6.10. Secuenciacin del DNA 6.10.1. Mtodo enzimtico de terminacin de cadena o mtodo de Sanger 6.10.2. Breve descripcin del mtodo enzimtico de terminacin de cadena 6.10.3. Automatizacin del mtodo de secuenciacin de Sanger 6.11. Transferencia e hibridacin de cidos nucleicos 6.11.1. Tcnicas de Southern y Northern 6.11.2. Microarreglos

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7. GENOMAS 7.1. Los mapas de genomas 7.2. Tamao de los genomas 7.3. Los genomas eucariontes contienen secuencias de DNA repetido y no repetido 7.4. Genomas bacterianos y el genoma mnimo 7.5. El nmero total de genes se conoce para algunos eucariontes 7.6. Las funciones de los genes en los genomas 7.7. Familias de genes 7.8. El genoma humano y la evolucin de especies complejas 7.9. Genes esenciales en eucariontes 7.10. Genomas de organelos 7.10.1. Genomas mitocondriales 7.10.2. Genomas de cloroplastos GLOSARIO BIBLIOGRAFA

197 197 198 202 204 206 209 213 214 217 218 219 222 224 236

Prlogo
El desarrollo de la Biologa Molecular y su incidencia en diferentes reas de la Biologa hace necesario entender los fundamentos de esta disciplina. Sin embargo, existen pocos libros que se adapten tanto en contenidos como en costos a los cursos que se imparten en las carreras de licenciatura. Con el propsito de proporcionar a los estudiantes una forma rpida de familiarizarse con esta rea sin perder la actualidad de los avances que se estn generando, se escribi este libro por profesores que participamos en el Programa Educativo de la carrera de Bilogo de la Universidad Michoacana. Se incluyeron adems de las reas bsicas como la estructura del DNA, su replicacin y expresin, reas nuevas como la epigentica, el RNA de interferencia y la regulacin del ciclo celular. Las tcnicas de investigacin fueron seleccionadas y se describen a una profundidad que permitir a los estudiantes incorporarse a los laboratorios de investigacin con un respaldo slido en los fundamentos de estas metodologas. Con anterioridad hemos confirmado que los estudiantes que han ledo las versiones informales que precedieron a este libro, tuvieron un mejor manejo de los conceptos fundamentales de la Biologa Molecular sin perderse en descripciones que no son adecuadas para el nivel de preparacin que requieren. Esperamos que este libro tambin sirva tambin para profesionistas de otras reas que deseen informarse y consultar aspectos especficos de la Biologa Molecular. Estamos agradecidos con la Universidad Michoacana, la Secretara de Educacin Pblica y el CONACYT por proporcionar parte del financiamiento para que este libro se imprimiera.

Los autores

ESTRUCTURA DEL DNA Y CROMOSOMAS

En las clulas de todo organismo vivo tenemos dos grandes tipos de macromolculas biolgicas en las que reside la informacin gentica y funcional, mediante la cual la clula viva lleva a cabo sus funciones. El primer tipo de macromolculas informacionales son los cidos nucleicos: el DNA y el RNA; el otro tipo de macromolcula informacional son las protenas. Hoy sabemos que el cido desoxirribonucleico (el DNA), es la molcula biolgica en la que reside la informacin gentica en todos los seres vivos y que esta molcula se encuentra formando parte de los cromosomas, que a su vez son estructuras que se localizan en el ncleo de las clulas de animales y vegetales. En las clulas del cuerpo humano hay 23 pares de cromosomas (Figura 1.1).

Figura 1.1. Cromosomas humanos. Se muestran los cromosomas humanos al microscopio ptico (b) y uno de ellos al microscopio electrnico (a). Cada cromosoma humano est formado por una sola molcula de DNA que mide aproximadamente entre dos a seis cm de largo (dependiendo del tamao del cromosoma), la cual est asociada a muchos miles de molculas de protenas, principalmente las llamadas histonas, cuya funcin principal es proporcionarle estructura al cromosoma. En todos y cada uno de nuestros trillones de clulas existen 23 pares de cromosomas (con excepcin de las clulas gametos: espermatozoides y vulos donde hay slo 23 cromosomas); cada juego de 23 cromosomas proviene originalmente de cada uno de nuestros padres. Gracias a los trabajos pioneros de Mendel, a mediados del siglo XIX y de Morgan a principios del siglo pasado, hoy se conoce que en todos los seres 7

vivos los genes son segmentos de la molcula de DNA presente en cada cromosoma y que los genes estn organizados de una manera lineal en los cromosomas, anlogamente al arreglo de los segmentos de una cinta que codifica para canciones en un casete musical, especficos de esta cinta gentica llamada DNA. Es importante recalcar que cada ser vivo tiene un nmero especfico y diferente de cromosomas, con relacin a los dems organismos vivos.

1.1.

Las unidades qumicas del DNA

El DNA fue aislado por Friedrich Miescher en 1869 de esperma de salmn y de pus de heridas abiertas. Dado que la encontr solamente en los ncleos, Miescher denomin a este compuesto nuclena. "Se levantaba en pleno invierno a las 4:00 a.m. y se iba a orillas del Rhin con su ayudante para pescar. Luego, proceda a la extraccin de nuclena en un laboratorio abierto a todos los vientos, donde la temperatura rondaba los 2 C. Una temperatura demasiado elevada habra impedido manipular la nuclena..." A posteriori se le cambi el nombre a cido nucleico y por ltimo a cido desoxirribonucleico (DNA). Robert Feulgen, en 1914, describi un mtodo para revelar por tincin el DNA, basado en la colorante fucsina. Se encontr, utilizando este mtodo, la presencia de DNA en el ncleo de todas las clulas eucariontes, especficamente en los cromosomas. Durante los aos 20, el bioqumico P.A. Levene analiz los componentes del DNA. Encontr que contena cuatro bases nitrogenadas: citosina, timina, adenina, y guanina; el azcar desoxirribosa; y un grupo fosfato. El concluy: 1. que la unidad bsica (nucletido) estaba compuesta de una base pegada a un azcar y que el fosfato tambin estaba pegado al azcar y 2. lamentablemente tambin concluy errneamente que las bases estaban en cantidades iguales y, que un tetranucletido era la unidad repetitiva de la molcula. Sin embargo queda su idea de la estructura del nucletido, el cual es realmente la unidad fundamental (monmero) del cido nucleico (polmero). Los nucletidos estn formados por una base nitrogenada, un grupo fosfato y un azcar; ribosa en caso de RNA y desoxirribosa en el caso de DNA. Las bases nitrogenadas son las que contienen la informacin gentica y los azcares y los fosfatos tienen una funcin estructural formando el esqueleto del polinucletido. En el caso del DNA las bases son dos purinas y dos pirimidinas. Las purinas son A (Adenina) y G (Guanina). Las pirimidinas son T (Timina) y C (Citosina). En el caso del RNA tambin son cuatro bases, dos purinas y dos 8

pirimidinas. Las purinas son A y G y las pirimidinas son C y U (Uracilo) (Figura 1.2).

Figura 1.2. Bases nitrogenadas presentes en los cidos nucleicos, DNA y RNA. Las bases se unen al carbono 1' del azcar y el fosfato en el carbono 5' para formar el nucletido (Figura 1.3).

Figura 1.3. Estructura de un nucletido. Unin de una base nitrogenada, un azcar y un fosfato (izquierda). Cuando los nucletidos estn libres en la clula presentan 3 fosfatos (derecha).

Los nucletidos se unen para formar el polinucletido por uniones fosfodister entre el carbono 5' de un nucletido y el carbono 3' del siguiente (Figura 1.4).

Figura 1.4. Unin de dos nucletidos mediante un enlace fosfodister.

1.2. El principio transformante A comienzos del ao 1900 el estudio de la gentica comienza a dar frutos: la relacin entre el trabajo de Mendel y el de los bilogos celulares result en la teora cromosmica de la herencia; Garrod propuso la relacin entre los "errores innatos del metabolismo" y los genes. La pregunta qued planteada: qu es un gen? . La repuesta la trajo el estudio de una enfermedad infecciosa mortal la neumona. Durante los aos 20s Frederick Griffith estudi las diferencias entre una cepa de la bacteria Streptococcus peumoniae que produca la enfermedad y otra que no la causaba. La cepa que causaba la enfermedad estaba rodeada de una cpsula (tambin se la conoce como cepa S, del ingles smooth, o sea lisa, que es el aspecto de la colonia en las placas de Petri). La otra cepa (la R, de rugosa, que es el aspecto de la colonia en la placa de Petri) no tiene cpsula y tampoco causa neumona. Frederick Griffith (1928) fue capaz de inducir la transformacin de una cepa no patognica Streptococcus pneumoniae. Griffith postul la existencia de un factor de transformacin como responsable de este fenmeno. Griffith inyect las diferentes cepas de la bacteria en ratones. La cepa S mataba a los ratones mientras que la cepa R no lo haca. Luego comprob que la cepa S, muerta por calentamiento, no causaba neumona cuando se la inyectaba. Sin embargo cuando combinaba la cepa S muerta por calentamiento, con la cepa R viva, e inyectaba la mezcla a los ratones (recuerde que ningn componente individual de la mezcla mata a los ratones). Los ratones contraan la neumona y moran! Las bacterias que se aislaban de los 10

ratones muertos posean cpsula y, cuando se las inyectaba, mataban otros ratones. Las hiptesis eran entonces las siguientes: 1. La cepa S, muerta por el calor, fue reanimada o resucit. 2. La cepa R viva fue modificada por algn "factor de transformacin" En los aos 40s Oswald Avery, Colin MacLeod, y Maclyn McCarty revisaron el experimento de Griffith y concluyeron que el factor de transformacin era el DNA. Oswald Avery repitiendo el trabajo de Griffith con el agregado de una enzima que destrua el DNA, demostr que el factor de transformacin era el DNA. Cuando Avery agregaba esta enzima, no observaba la transformacin obtenida por Griffith. El concluy que el material hereditario era DNA y no una protena. Su evidencia era fuerte pero no totalmente concluyente, para esa poca el "candidato principal" para ser el material hereditario eran una protena. La ltima palabra en la cuestin de determinar cul era el material hereditario vino de los trabajos de Max Delbruck y Salvador Luria en la dcada de 1940. Los bacterifagos son un tipo de virus que atacan a las bacterias, Delbruck y Luria trabajaron con virus que atacan a la bacteria del intestino humano Escherichia coli. Los bacterifagos consisten en DNA con una cubierta de protenas. Los bacterifagos infectan una clula inyectndole su DNA. Este DNA viral "desaparece" mientras toma control de la maquinaria de la bacteria que comienza a fabricar nuevos virus. Luego de 25 minutos de haber sido inyectado la clula hospedadora estalla, liberando cientos de nuevos bacterifagos. Como los fagos tienen slo DNA y protenas, eran la herramienta ideal para resolver la naturaleza del material hereditario (Figura 1.5).

Figura 1.5. Estructura del bacterifago T2. Este virus tiene DNA como material gentico. La fotografa de la derecha muestra el DNA fuera de la cabeza del fago. 11

En 1952 Alfred D. Hershey y Martha Chase realizaron una serie de experimentos destinados a dilucidar si el DNA o las protenas eran el material hereditario. Marcando el DNA y las protenas con istopos radioactivos el experimento demostrara cual de ellos entraba en la bacteria. Ese sera el material hereditario (factor transformador de Griffith). Dado que el DNA contiene fsforo (P) pero no azufre (S), ellos marcaron el DNA con Fsforo-32 radioactivo. Por otra parte, las protenas no contienen P pero si S, y por lo tanto se marcaron con Azufre-35. Hershey y Chase encontraron que el S-35 queda fuera de la clula mientras que el P-32 se lo encontraba en el interior, indicando que el DNA era el soporte fsico de la herencia (Figuras 1.6 y 1.7).

Figura 1.6. Marcado del DNA del bacterifago T2 con fsforo radioactivo. En los virus descendientes se recupera DNA marcado con fsforo radioactivo, lo que indica que esta molcula es el material hereditario. 12

Figura 1.7. Marcado de las protenas del bacterifago T2 con azufre radioactivo. En los virus descendientes no se recuperan protenas marcadas con azufre radioactivo, lo que indica que esta molcula no es el material hereditario.

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1.3. La estructura del DNA Una vez que se demostr sin ambigedades que el DNA era el material hereditario, faltaba determinar la estructura de la molcula, para as entender la manera en que se guardaba la informacin de los genes y la forma en que se heredaba la informacin de una clula a otra. As, en 1951, el trabajo de Chargaff permiti determinar las cantidades relativas de adenina, timina, guanina y citosina, las cuatro letras del alfabeto gentico de todo ser vivo, y demostrar que en cualquier DNA de cualquier organismo la cantidad molar de adenina es siempre igual a la de timina y tambin que la cantidad de citosina es la misma que de guanina. A esto se le conoci como la regla de Chargaff. Tambin demostr que la relacin de pirimidinas y purinas vara entre las diferentes especies, lo que vislumbr el que la variacin gentica de las especies se deba a esta variacin en la composicin de bases. En la siguiente tabla se muestra la composicin de bases en algunos organismos en los que se cumplen las reglas de Chargaff. Procedencia del DNA Timo de Bovino Esperma de bovino Germen de trigo Saccharomyces Escherichia coli Mycobacterium tuberculosis Virus T5 A 28,2 28,7 27,3 31,3 26,0 15,1 30,3 G 21,5 22,2 22,7 18,7 24,9 34,9 19,5 C 21,2 20,7 21,9 17,1 25,2 35,4 19,5 T 27,8 27,3 27,1 32,9 23,9 14,6 30,8

Muchos cientficos se interesaron en descifrar la estructura del DNA, entre ellos, Francis Crick, James Watson, Rosalind Franklin, y Maurice Wilkins. A finales de la primavera de 1952, la cristalgrafa britnica Rosalind Franklin (1920-1958) obtuvo una fotografa de difraccin de rayos X (Figura 1.8) que revel, de manera inconfundible la estructura helicoidal de la molcula del DNA. Rosalind Franklin falleci en 1958, a los 37 aos, vctima de un cncer en los ovarios. Su invaluable aportacin a este descubrimiento no fue reconocida ni en vida de la cristalgrafa ni de manera pstuma, aunque poco a poco se empieza a conocer su historia.

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Figura 1.8. Rosalind Franklin y la fotografa 51 que revel la estructura helicoidal del DNA. James Watson y Francis Crick (Figura 1.9) eran investigadores tericos que integraron todos los datos disponibles en su intento de desarrollar un modelo de la estructura del DNA. Los datos que se conocan por ese tiempo eran: a) Que el DNA era una molcula grande tambin muy larga y delgada. b) Los datos de las bases proporcionados por Chargaff (A=T y C=G; purinas/pirimidinas=k para una misma especie). c) Los datos de la difraccin de los rayos-x de Franklin y Wilkins (King's College de Londres) que revelaban una estructura helicoidal. d) Los trabajos de Linus Pauling sobre protenas (forma de hlice mantenida por puentes hidrgeno), quin sugiri para el DNA una estructura semejante.

Figura 1.9. James Watson y Francis Crick con el modelo utilizado para explicar la estructura del DNA. 15

El DNA es una doble hlice, con las bases dirigidas hacia el centro, perpendiculares al eje de la molcula (como los peldaos de una escalera de caracol) y las unidades azcar-fosfato a lo largo de los lados de la hlice (como las barandas de una escalera de caracol). Las hebras que la conforman son complementarias (deduccin realizada por Watson y Crick a partir de los datos de Chargaff, A se aparea con T y C con G; el apareamiento se mantiene debido a la accin de los puentes hidrogeno entre ambas bases) (Figura 1.10).

Figura 1.10. Apareamiento entre bases complementarias. El DNA est formado por dos hebras o cadenas complementarias Las dos hebras permanecen unidas entre s a travs de las uniones qumicas dbiles (tipo puente de hidrgeno), que se establecen entre cada dos nucletidos complementarios. Se muestran las uniones tipo puente de hidrgeno que se forman entre los pares de bases complementarios T=A y C = G.

En cada extremo de una doble hlice lineal de DNA, el extremo 3'-OH de una de las hebras es adyacente al extremo 5'-P (fosfato) de la otra. En otras palabras, las dos hebras son antiparalelas, es decir, tienen una orientacin diferente. En el esqueleto azcar-fosfato del DNA los grupos fosfato se conectan al carbono 3 de la molcula de desoxirribosa y al carbono 5 de la siguiente, uniendo azcares sucesivos. La prima () indica la posicin del carbono en un azcar. Por convencin, la secuencia de bases de una hebra sencilla se escribe con el extremo 5'-P a la izquierda (figura 1.11). El DNA es una doble hlice donde las bases de los nucletidos se encuentran orientadas hacia el interior de la doble hlice y los grupos fosfato, y las azcares desoxirribosas, hacia su exterior, formando los esqueletos fosfodister de cada hlice. Los pares de nucletidos se encuentran separados entre s por 3.4 A y en cada diez pares de nucletidos (34 A), se alcanza una vuelta de la hlice (Figura 1.12). En un modelo tridimensional se aprecia que a lo largo de la molcula del DNA se encuentran dos surcos, uno mayor y uno 16

menor, lo cual tiene importancia en la unin de protenas durante la regulacin de la expresin gentica (figura 1.13). En el surco mayor hay mayor posibilidad de grupos qumicos como dadores de puentes de hidrgeno (H) y aceptores de puentes de hidrgeno (O y N), as como grupos metilo. En la figura 1.14 se presentan las cuatro configuraciones posibles de los pares de bases con relacin a los surcos mayores y menores. La secuencia de nucletidos puede crear pequeas distorsiones en la hlice idealizada contribuyendo de esta manera a los procesos de reconocimiento de regiones especficas.

Figura 1.11. Disposicin de las cadenas antiparalelas de nucletidos en el DNA. Las cadenas se mantienen unidas mediante puentes de hidrgeno entre adenina y timina y citosina y guanina. 17

Figura 1.12. Estructura de la molcula del DNA. Se esquematiza la doble hlice mostrando el esqueleto de azcar-fosfato y la proyeccin de las bases nitrogenadas hacia el centro de la molcula.

Figura 1.13. Modelo tridimensional del DNA en los que se destacan el surco mayor y el surco menor. Cada uno de los surcos va girando a lo largo de la molcula sin interrupcin. 18

Figura 1.14. Configuraciones posibles de los pares de bases. El surco mayor en cada caso proporciona mayor nmero de grupos qumicos con los que las protenas pueden interaccionar para regular los procesos moleculares a partir del DNA. Los tomos de hidrgeno unidos a carbono no son capaces de formar puentes de hidrgeno pero si los unidos a oxgeno o nitrgeno. Los grupos metilo forman protuberancias hidrofbicas. El oxgeno y el nitrgeno son formadores potenciales de puentes con el hidrgeno.

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1.4. Empaquetamiento del DNA En los organismos eucariontes el DNA se encuentra asociado a protenas, mientras que en procariontes el DNA se encuentra desnudo y no presenta esta asociacin con protenas para formar empaquetamientos. Las protenas asociadas al DNA se conocen colectivamente con el nombre de histonas. Son polipptidos relativamente cortos cargados positivamente (bsicos) y por lo tanto son atrados por las cargas negativas del DNA. Una de las funciones de esas protenas est relacionada con el empaquetamiento del DNA en la forma del cromosoma: los 2 metros de DNA de la clula humana son empaquetados en 46 cromosomas de un largo combinado de aproximadamente 200 nm. Se conocen cinco tipos de histonas (H2A, H2B, H3, H4 y H1). Con la excepcin de la H1 la mayor parte de las histonas de los eucariontes son muy similares. El nucleosoma es la unidad fundamental de "empaquetamiento" del DNA eucaritico. El "ncleo" del mismo consiste en dos molculas de H2A, H2B, H3, y H4; alrededor de las cuales el DNA se enrolla dos veces y se estabiliza con H1 en la parte externa. (Figura 1.15).

Figura 1.15. Estructura del nucleosoma. La parte central consiste en un octmero de H2A, H2B, H3 y H4, en el cual el DNA se enrolla dndole dos vueltas (izquierda). La histona H1 estabiliza al nucleosoma unindose en la periferia. En la parte derecha se presenta una estructura con la parte frontal del nucleosoma.

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Los nucleosomas se encuentran uno a continuacin de otro formando una hilera que se conoce como fibra de 10 nm, semejando a un collar de perlas (Figura 1.16). El siguiente nivel se conoce como la fibra de 30 nm, que semeja un solenoide o espiral (Figura 1.16), aunque ms recientemente se ha propuesto un modelo conocido como zig-zag. En la interfase de la clula normalmente se encuentra la fibra de 30 nm aunque en regiones transcripcionalmente activas se puede encontrar la fibra de 10 nm.

Figura 1.16. Fibras de 10 y 30 nm. En la parte superior se muestran fotografas al microscopio electrnico de la fibra de 30 nm y de 10 nm. En la parte inferior se esquematiza la fibra de 10 nm y de 30 nm. Los nucleosomas se alinean uno tras otro en la cromatina. El modelo de solenoide de la fibra de 30 nm consiste en una espiral con seis nucleosomas por vuelta. Durante la mitosis los cromosomas replicados se condensan en dominios en bucle de 300 nm utilizando un armazn o esqueleto de protenas no histnicas (Figura 1.17) para as formar el cromosoma que puede ser observado al microscopio ptico compuesto (el cromosoma tiene un ancho de unos 1.400 nm en la metafase).

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Figura 1.17. Estructura del cromosoma. Se muestran los niveles de organizacin y empaquetamiento del DNA para llegar a formar el cromosoma mittico. Partiendo de la parte superior el DNA se asocia a nucleosomas formando la fibra de 11 nm, la cual a su vez forma una espiral de 6 nucleosomas por vuelta para formar la fibra de 30 nm de la interfase, y sta a su vez se pliega en lazos o bucles usando un armazn de protenas no histnicas en la mitosis hasta conformar una estructura de 1400 nm de ancho.

1.5. El cariotipo Se llama cariotipo a la ordenacin de los cromosomas de una especie, en funcin de sus tamaos y formas. Del examen de los cariotipos se deduce que, en condiciones normales, existen grupos de cromosomas iguales, a los que se denomina homlogos. En determinadas especies se halla una pareja de cromosomas que, a pesar de no ser iguales, son considerados homlogos (debido a que se aparean durante la meiosis); son los denominados cromosomas sexuales, pues no aparecen igual en hembras que en machos. En el hombre, por ejemplo, el par nmero 23 puede presentar un cromosoma grande (designado con letra X) o uno ms pequeo (el cromosoma Y); las 22

mujeres poseen en sus clulas dos cromosomas X y los hombres uno X y uno Y. La estructura de los cromosomas replicados y condensados tiene varios aspectos de inters. El centrmero es el punto donde se "anclan" los microtbulos del huso y se observa como un estrechamiento. Con base en la posicin relativa del centrmero los cromosomas pueden clasificarse de la siguiente manera: a) Telocntricos, con el centrmero en un extremo. b) Acrocntricos, uno de sus brazos es muy corto. c) Submetacntricos, brazos de diferente longitud con una relacin aproximada de 2:1. d) Metacntricos, brazos de igual longitud. Para teir los cromosomas y determinar los cariotipos se pueden utilizar colorantes que tien homogneamente a los cromosomas (Figura 1.18). Mediante mediciones cuidadosas es posible determinar las principales caractersticas de un cariotipo. En la siguiente tabla se presentan las mediciones del cariotipo de la planta Vicia dasycarpa:

Figura 1.18. Cromosomas de Vicia dasycarpa. Los 14 cromosomas tienen una tincin homognea mediante el uso de orcena. Fotografa proporcionada por el Bil. Hugo Faras Chagoya.

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CARIOTIPO DE Vicia dasycarpa (Mediciones proporcionadas por el Bil. Hugo Faras Chagoya)
Cromosoma Longitud total (m) Longitud relativa (%) Longitud del brazo corto (m) Longitud del brazo largo (m) Relacin Clasificacin de brazos

1 2 3 4 5 6 7 Total

2.890 13.707 1.195 1.695 1.418 2.778 13.175 1.734 1.044 0.600 2.769 13.133 1.025 1.744 1.700 3.757 17.819 1.074 2.683 2.498 3.317 15.732 0.939 2.378 2.532 3.134 14.864 1.098 2.036 2.765 2.439 11.568 0.854 1.585 1.855 21.084 2n = 14 x=7 nf = 28 fc = 3m + 4sm Constriccin secundaria = 1.003 m cromosoma 2

m m m sm sm sm sm

La tincin homognea de cromosomas no permite diferenciar algunos cromosomas de igual tamao y morfologa, por lo que se han diseado tratamientos que permiten la aparicin de bandas mediante una tincin diferencial a lo largo del cromosoma. Tal es el caso de un tratamiento proteoltico seguido por una tincin con el colorante Giemsa, que genera una serie de bandas G (Figura 1.19).

Figura 1.19. Cariotipo de un hombre. La tincin se realiz con el colorante Giemsa para producir un patrn de bandas G. Los cromosomas estn ordenados en pares, por tamao y posicin del centrmero. 24

El bandeado de los cromosomas ha permitido elaborar una nomenclatura para las bandas, dividiendo primero el cromosoma en brazos p y q y posteriormente en regiones ms pequeas. Esto se ilustra para el siguiente cromosoma hipottico (Figura 1.20).

Figura 1.20. Esquema de bandas G de un cromosoma. El cromosoma puede ser dividido en diferentes regiones de acuerdo a su bandeado. El brazo corto es p y el brazo largo es q. Cada brazo es dividido en regiones mayores que son posteriormente subdivididas para identificar las bandas.

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2. SNTESIS DEL DNA Y CICLO CELULAR

Los ciclos en la naturaleza son ubicuos y el ciclo celular est coordinado por seales externas e internas, en este caso seales qumicas. La transicin de cada una de las fases del ciclo, requiere la integracin de seales qumicas especficas, lo que requiere de respuestas especficas a estas seales. Si las seales son incorrectamente detectadas o si las clulas no estn preparadas para responder apropiadamente, las clulas se podran transformar en cancerosas. Para el crecimiento de cualquier organismo, ya sea que se trate de un organismo unicelular o multicelular, deben ocurrir tres cosas: 1) la masa celular debe aumentar; 2) debe haber una duplicacin del material gentico; y 3) debe haber un proceso de divisin que asegure que cada clula hija reciba un complemento igual e idntico de material gentico para asegurar la perpetuacin de la lnea celular. En clulas eucariontes, esto ocurre en una progresin ordenada de eventos que tienen lugar durante el lapso de vida de una clula o ciclo celular. La vida es un continuo desde una generacin a la siguiente y debe haber una renovacin o retorno al estado inicial para que los procesos ocurran una vez ms. Se puede decir que cualquier clula dada tiene una vida, lo mismo que cualquier organismo dado. La vida de una clula comienza con su formacin por divisin celular de una clula madre y termina con la formacin de una clula hija o con su muerte. Los estados a travs de los cuales una clula pasa de una divisin a la siguiente constituyen el ciclo celular. En clulas eucariontes el ciclo celular se divide en dos fases principales basadas sobre las actividades celulares fcilmente visibles con un microscopio de luz: la fase M (de mitosis) y la interfase. La interfase se divide en fase G1, fase S y fase G2 (figura 2.1). La fase M incluye el proceso de mitosis o divisin celular mittica, que fue descrita en 1879 por Walter Flemming. La fase M consiste de dos procesos interrelacionados: 1) mitosis, es la divisin del ncleo, el trmino (mitos- hilo o hebra, se refiere a la aparicin de cromosomas, que son parecidos a hilos); y 2) citocinesis, son los cambios citoplsmicos que incluyen la propia divisin celular. La figura 2.1 ilustra este proceso.

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Figura 2.1. Etapas del ciclo celular. El diagrama indica los estados a travs de los cuales una clula pasa de una divisin a la siguiente. El ciclo celular puede ser dividido en dos estados: la fase M y la interfase. La fase M incluye los estados sucesivos de mitosis y citocinesis. La interfase est dividida en G1, S y G2, siendo la fase S, el perodo equivalente a la sntesis de DNA. Durante la interfase el evento inicial es el crecimiento e incremento en la masa celular. Esta etapa es llamada fase G1. Para una clula de mamfero que normalmente toma 24 horas en completar su ciclo celular, la fase G1 durara aproximadamente 10 horas, en donde la actividad metablica est asociada con el crecimiento y la preparacin para la replicacin del DNA. Enseguida de G1 ocurre la replicacin del DNA. Esta es la etapa de sntesis o fase S, la cual tarda aproximadamente nueve horas. Durante la fase de sntesis, el material gentico de cada uno de los cromosomas es replicado, de tal manera que cada 27

cromosoma consiste ahora de dos cromtidas hermanas. Despus de la replicacin del DNA, la clula entra en otra fase de crecimiento llamada fase G2, esta fase dura aproximadamente cuatro horas, en las que la clula se prepara para la divisin o fase M, que es la parte final del ciclo. El proceso es virtualmente similar en clulas vegetales con respecto a clulas animales, con ligeras variaciones. Mientras que en vegetales la fase M tarda tan slo de 30 a 60 minutos, la interfase puede extenderse por horas, das, semanas o ms, dependiendo del tipo de clula y de las condiciones. Se ha observado que de las clulas de un tejido o de un cultivo celular, slo un pequeo porcentaje de stas se encuentra en mitosis, lo cual indica que las clulas pasan la mayor parte del tiempo en interfase.

2.1. Divisin en procariontes y eucariontes Las clulas procariticas y eucariticas difieren marcadamente en la manera de coordinar la sntesis de DNA y la subsiguiente separacin durante la divisin celular. La divisin celular en procariontes es un proceso relativamente sencillo, que refleja la simplicidad relativa de las clulas mismas. Primero se replica el DNA, luego se divide el citoplasma, de manera que se asegura la distribucin igual de DNA replicado entre las clulas hijas (figura 2.2). El genoma de una clula procarionte contiene aproximadamente 4 X 106 pares de bases, aproximadamente 1.4 mm en longitud. Si las bacterias en crecimiento son expuestas a timidina radiactiva, casi cada clula est marcada, indicando que cada organismo est sintetizando DNA. As que la mayor parte del tiempo que una bacteria usa para dividirse, lo gasta en sintetizar DNA. Las clulas eucariontes se dividen por dos procesos: mitosis y meiosis. La divisin mittica, que ocurre en virtualmente todas las clulas eucariontes, es el proceso por el cual las clulas se reproducen ellas mismas para el crecimiento de organismos multicelulares. La caracterstica de la divisin mittica es que las clulas hijas son idnticas entre s y a la clula madre. La clula madre y las clulas hijas son diploides (2n): hay dos copias de cada cromosoma. Por otra parte, la divisin meitica, es la base de la reproduccin sexual en las plantas y animales superiores. Esto ocurre durante la formacin de gametos en animales y la formacin de esporas en plantas y hongos. La clula parental es diploide (2n), pero las clulas hijas (gametos o esporas) son haploides (n), esto es, cada gameto o espora tiene uno de cada par cromosmico (figura 2.3).

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Figura 2.2. Replicacin del DNA y divisin celular en una clula procarionte. El DNA en clulas procariontes est unido a la membrana celular y permanece unido durante la divisin celular. (a) El cromosoma circular, el cual ha comenzado la replicacin, est unido a la membrana plasmtica. (b) Cuando la replicacin del DNA est completa, el nuevo cromosoma tiene un punto de unin a la membrana. Una membrana nueva y una pared celular nueva se forman en la parte media a lo largo de la clula. (c) Conforme ms membrana y ms pared celular se forman, parte de este crecimiento proporciona un septo para dividir a la clula. (d) La divisin est completa; el nuevo cromosoma est unido a la membrana plasmtica de cada clula hija.

Figura 2.3. Diferencias biolgicas conceptuales entre mitosis y meiosis. La dotacin cromosmica bsica se presenta mediante la letra n; 2n significa la dotacin cromosmica diploide; 2c la cantidad de DNA tras la mitosis, en el perodo G1, previo a la replicacin.

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2.2. Mitosis En clulas animales, el primer indicio de que una mitosis est prxima se observa en el citoplasma de la clula en interfase. El centrosoma es el centro organizador de microtbulos en la clula, por lo que son los responsables de la formacin del huso en los polos de la clula en divisin. Los microtbulos radian desde el centrosoma, organizan y coordinan el movimiento de los cromosomas durante la mitosis (figura 2.4). El centrosoma es duplicado por la clula durante la interfase, de tal manera que cada clula hija eventualmente recibe uno. En la mayora de las clulas animales, el centrosoma tiene un par de centrolos localizados en el centro de ste, y su replicacin tambin antecede a la divisin. Conforme comienza la divisin, el centrosoma se divide en dos, y los microtbulos radian hacia afuera formando un ster (figura 2. 4)

Figura 2.4. El huso mittico de clulas animales. Cada polo del huso contiene un par de centrolos rodeados por material pericentriolar amorfo en el cual, los microtbulos son nucleados. Los microtbulos se unen a los cromosomas en la regin del centrmero en la placa del cinetocoro y de esa manera pueden alinearlos en el centro de la clula y despus separarlos hacia los polos. La mitosis es un proceso continuo, sin embargo para propsitos de su estudio se le divide en diferentes fases: profase, metafase, anafase y telofase, las cuales son definidas por la estructura y el comportamiento de los cromosomas (figuras 2.5 y 2.6). Profase. Esta fase se puede dividir en profase temprana y profase tarda. En la profase temprana, los dos centrosomas se separan y se mueven hacia los polos opuestos de la clula formando rieles para el movimiento de 30

los cromosomas. Los cromosomas, los cuales fueron replicados durante la fase S del ciclo, estn sumamente alargados. Ellos comienzan a condensarse a travs de un sper enrollamiento, y ahora aparecen como entidades discretas.

Figura 2.5. Esquema de las etapas de mitosis.

Figura 2.5. Etapas de la mitosis. 31

Figura 2.6. Mitosis en Allium cepa. A profase temprana. B Profase avanzada. C-D Metafase. E-F Anafase. G Telofase. En D y F el DNA tiene fluorescencia azul y los microtbulos fluorescencia verde. En la profase tarda, los cromosomas estn sumamente condensados, las dos cromtidas de cada cromosoma se encuentran unidos al nivel del centrmero. Los cinetocoros se acomplejan al centrmero y funcionan como los sitios a los cuales los microtbulos se unen y guan el movimiento de los cromosomas. Los centrosomas se han movido hacia los polos de la clula. Una red de microtbulos continuos se extiende alrededor de la membrana nuclear e interconecta los polos. La membrana nuclear y el nucleolo, que es la estructura donde se ensamblan los ribosomas, se fragmentan y dispersan en el citoplasma. Los microtbulos invaden la regin nuclear hasta unirse a cada cromtida por medio del cinetocoro en la regin del centrmero. En la metafase el par de cromtidas hermanas condensadas toman posicin en el centro de la clula, o placa ecuatorial, entre los dos polos. Estrictamente, son realmente los centrmeros los que se disponen en el plano ecuatorial, de modo que los cromosomas quedan divididos por un plano que deja una cromtida a un lado y la otra al otro lado (figura 2.6). Las cromtidas de la metafase estn sumamente enrolladas y definidas. Los brazos de las cromtidas hermanas se extienden desde la regin del centrmero, pero las 32

cromtidas se mantienen unidas por el centrmero hasta el comienzo de la siguiente fase. La anafase comienza cuando los centrmeros se separan y las cromtidas hermanas se separan y se mueven hacia los polos opuestos de la clula. El movimiento es el resultado del acortamiento de los microtbulos. Despus de la separacin anafsica, cada una de las cromtidas tiene su propio centrmero, y se considera ahora, un cromosoma. En la anafase los cromosomas se alargan un poco por relajacin del intenso enrollamiento metafsico y se mueven a los respectivos polos del huso. La mitosis asegura que cada clula hija tenga la misma informacin gentica que la clula madre.

2.3. Meiosis En 1883 van Beneden describi el proceso de meiosis (del griego que significa disminucin), o divisin celular meitica, donde el nmero diploide de cromosomas (2n) es reducido a la mitad hacia el estado haploide (n) durante la formacin de los gametos, Los cromosomas materno y paterno son azarosamente distribuidos hacia el ncleo hijo durante la meiosis. La meiosis es un proceso largo en el cual el material cromosmico se replica una vez y la clula se divide dos veces, reduciendo as el nmero de cromosomas a la mitad. En las clulas diploides pre-meiticas cada uno de los cromosomas tiene un compaero homlogo. Para cada par de cromosomas homlogos, uno de ellos lo aporta el esperma (cromosoma paterno) y el otro lo aporta el huevo (cromosoma materno). Al final de la meiosis cada clula tiene un cromosoma del par homlogo, ya sea el materno o el paterno, siendo as haploide. La meiosis tiene dos divisiones sucesivas. La primera, divisin de reduccin (meiosis I), es la ms compleja. Durante esta divisin, el par de cromosomas homlogos, segregan y se mueven a diferentes ncleos. En la interfase, durante el perodo S, la clula germinal que va a sufrir la meiosis ha duplicado su DNA como en cualquier interfase premeitica, sin embargo algo ocurre en el perodo G2 que dirige la clula hacia la meiosis en vez de hacia la mitosis. La profase es muy larga y durante ella los cromosomas homlogos se aparean ntimamente a la par que se acortan, intercambindose material gentico. La primera etapa de la meiosis, contiene una larga y compleja profase I formada de cinco subfases secuenciales (figuras 2.7 y 2.8). La primera es llamada leptoteno, en la cual los cromosomas aparecen como objetos nucleares igual a hilos. La tercera subfase de la profase I es llamada paquiteno. En este momento los cromosomas pueden ser vistos como estructuras replicadas, esto es, como se ven bajo el microscopio de luz, cada cromosoma consiste de dos cromtidas. Los cromosomas continan acortndose y condensndose durante el paquiteno. Las cromtidas no hermanas en cada par de cromosoma homlogo, intercambian segmentos de material gentico entre ellas, en un proceso de recombinacin gentica llamado 33

entrecruzamiento. La evidencia visual del entrecruzamiento, son estructuras en forma de X llamadas quiasmas.

Figura 2.7. Esquema de la evolucin de los cromosomas homlogos en la meiosis. Para simplificar, se representan nicamente tres pares: A, B y C. En el ejemplo, entre los cromosomas A se establecen dos quiasmas, ambos a un mismo lado del centrmero. Entre los cromosomas B hay dos quiasmas, uno a cada lado del centrmero. Entre los cromosomas C hay un solo quiasma.

Figura 2.8. Meiosis en testculo de Chortipus jucundus (insecto ortptero). A: Preloptoteno: B: Cigoteno. C: Paquiteno. D: Diploteno. E: Diacinesis. F: Anafase. 34

Con ayuda de un microscopio electrnico, una estructura igual a una escalera llamada el complejo sinaptonemal se puede observar entre cromosomas homlogos en sinapsis, uniendo aparentemente cromtidas no hermanas en toda su longitud para facilitar el entrecruzamiento. El espacio en la mitad de la escalera contiene lazos de DNA proveniente de cada cromosoma, y es probable que el entrecruzamiento ocurra entre estos lazos de DNA, coordinados por ndulos de enzimas recombinantes (figura 2.9). I

Figura 2.9. Esquema tridimensional de un complejo sinaptonmico. En ste se ha formado un ndulo de recombinacin para el intercambio entre cromtidas de cromosomas homlogos. Durante la cuarta subfase de la profase I, el diploteno, los cromosomas homlogos parecen repelerse uno de otro o desinapsarse. Sin embargo, los miembros de un par permanecen unidos en el sitio donde est ocurriendo el quiasma referido anteriormente. En muchos animales, este estado de diploteno es extremadamente prolongado. En hembras humanas, por ejemplo el estado diploteno de la profase I es completado en el ovario durante la vida fetal. Aproximadamente 400000 huevos inmaduros (oocitos) alcanzan este estado, y entonces la divisin celular se detiene. Los huevos permanecen en este estado suspendido hasta el inicio de la pubertad. Despus de la pubertad y al inicio del ciclo menstrual, un huevo al mes contina la meiosis en la trompa de Falopio. Algunos huevos permanecen en este estado meitico suspendido por varias dcadas. Durante la ltima subfase de la profase I, la diacinesis, los pares de cromosomas aumentan de grosor y se mueven hacia el centro del ncleo. El 35

nucleolo y la membrana nuclear se dispersan y los microtbulos que emanan de los centrosomas se unen al cinetocoro. En este momento termina la profase I. En la metafase I los pares cromosmicos estn altamente condensados y ordenados en lados opuestos de la placa ecuatorial. Los microtbulos estn pegados al cinetocoro en la regin centromrica. Los quiasmas se han movido hacia las terminales de cada par de cromosomas. Durante la anafase I los miembros de un par de cromosomas homlogos se mueven hacia polos opuestos. Los centrmeros an no se han dividido; siendo as que cada cromosoma consiste de dos cromtidas (figura 2.10). La telofase I ocurre cuando los cromosomas alcanzan los polos opuestos de la clula. La envoltura nuclear puede o no formarse durante esta fase. El estado entre las dos divisiones meiticas es llamado intercinesis y generalmente es de corta duracin. Las clulas se caracterizan por ser haploides debido a que ellas contienen slo un miembro de cada par de cromosomas homlogos. Aunque las clulas son haploides, stas contienen dos veces la cantidad de DNA que un gameto haploide, debido a que cada cromosoma est representado por un par de cromtidas unidas. Durante la segunda divisin meitica, la divisin ecuatorial (meiosis II) los centrmeros se escinden y las cromtidas hermanas se separan (figura 2.10).

Figura 2.10. Esquema de la evolucin de los cromosomas homlogos en la meiosis. Para simplificar, se representan nicamente tres pares: A, B y C.

La intercinesis es seguida por la profase II, mucho ms simple que su predecesora. Si la envoltura nuclear se form en la telofase I, sta se rompe de nuevo. En la metafase II los cromosomas se vuelven a compactar y se alinean 36

en la placa metafsica. Los cinetocoros de las cromtidas hermanas de la metafase II se orientan de cara a cada polo, y se unen a grupos opuestos de fibras del huso. Los centrmeros se dividen en la metafase II y las cromtidas formadas, ahora cromosomas hijas, se mueven hacia los polos opuestos en la anafase II. Cuando los cromosomas han alcanzado los polos opuestos y detienen su movimiento, en la telofase II, se forma la membrana nuclear alrededor de cada grupo de cromosomas haploides, y contina la citocinesis. El resultado de las divisiones meiticas I y II es de cuatro clulas haploides que contienen un miembro de cada uno del par de cromosomas homlogos. Las consecuencias genticas de la Meiosis se pueden resumir de la siguiente manera: a) Reduccin del nmero de cromosomas a la mitad de una clula diploide al formar clulas haploides. En el humano la clula diploide tiene 46 cromosomas y las haploides slo 23 cromosomas. Esta reduccin a la mitad es la que permite que el fenmeno siguiente de la fecundacin mantenga el nmero de cromosomas de la especie. b) Recombinacin de informacin gentica heredada del padre y la madre: el apareamiento de los cromosomas homlogos y consecuente entrecruzamiento permite que se intercambie la informacin. La consecuencia de este fenmeno es que ningn hijo heredar un cromosoma ntegro de uno de sus abuelos. c) Segregacin al azar de cromosomas maternos y paternos: la separacin de los cromosomas paternos y maternos recombinados, durante la anafase I y II, se realiza completamente al azar, por lo que contribuyen al aumento de la diversidad gentica. En el ser humano, con 23 pares de cromosomas homlogos, la posibilidad de recombinacin es 223 (8388608 combinaciones). Este nmero es sin tener en cuenta las mltiples combinaciones dadas por la recombinacin de cromosomas durante el entrecruzamiento.

2.4. Replicacin del DNA La replicacin del DNA ocurre en el perodo del ciclo celular llamado fase S. La estructura del DNA propuesta por Watson y Crick en 1953, estuvo acompaada por una propuesta para su auto-replicacin. Las dos cadenas de la doble hlice permanecen unidas por puentes de hidrgeno entre las bases. Individualmente, estas uniones de hidrgeno son dbiles, pudindose romper fcilmente. Watson y Crick imaginaron que la replicacin ocurra por la separacin gradual de las cadenas de la doble hlice, muy parecida a la separacin de las dos mitades de una cremallera. Debido a que las dos cadenas son complementarias una de otra, cada cadena contiene la informacin requerida para la formacin de la otra cadena. As, una vez que las cadenas se han separado, cada una acta como molde para dirigir el ensamble 37

de nucletidos requeridos para la formacin de la cadena complementaria y el restablecimiento del estado de la doble cadena (figura 2.11).

2.4.1. Replicacin Semiconservativa La propuesta de Watson y Crick produjo ciertas predicciones concernientes al comportamiento del DNA durante la replicacin. De acuerdo a esta propuesta, cada una de las cadenas hijas debera estar compuesta de una cadena completa proveniente del duplex parental y una cadena recin sintetizada. La replicacin de este tipo, se dice que es semiconservativa debido a que cada duplex hija contiene una cadena que proviene de la estructura parental (figura 2.12).

Figura 2.11. Replicacin de una molcula de DNA doble helicoidal, de acuerdo a la propuesta original de Watson-Crick. Durante la replicacin, la doble hlice se desenrolla y cada una de las cadenas parentales sirve como molde para la sntesis de una nueva cadena complementaria. 38

Figura 2.12. Replicacin semiconservativa. En ausencia de informacin sobre los mecanismos responsables para la replicacin, se consideraron adems otros dos tipos posibles de replicacin: la conservativa y la dispersiva. Para decidir entre estas tres posibilidades fue necesario distinguir entre el DNA recin sintetizado del DNA original. En 1958, Matthew Messelson y Franklin Stahl realizaron estudios sobre bacterias, usando istopos de nitrgeno (15N) pesado y (14N) ligero, para distinguir entre las cadenas parentales y las nuevamente sintetizadas. Estos investigadores crecieron bacterias por muchas generaciones en un medio conteniendo cloruro de amonio, con el istopo 15N, como la nica fuente de nitrgeno. Consecuentemente, las bases conteniendo nitrgeno en el DNA de stas clulas, contenan slo el istopo de nitrgeno pesado. Los cultivos de bacterias pesadas fueron lavados e incubados en medio nuevo conteniendo compuestos con 14N, y las muestras fueron tomadas a intervalos crecientes sobre un perodo de varias generaciones. El DNA fue extrado a partir de muestras de bacterias y sujetas a centrifugacin en un gradiente de densidad. En este procedimiento, el DNA es mezclado con una solucin concentrada de cloruro de cesio y centrifugado hasta que molculas de DNA de doble cadena alcanzan el equilibrio de acuerdo a su densidad (figura 2.13).

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Figura 2.13. Experimento que demuestra que la replicacin del DNA en bacterias es semiconservativa. Se muestran los resultados esperados de cada uno de los tres posibles esquemas de replicacin. El tubo de la izquierda indica la posicin del DNA parental y las posiciones a las cuales podran encontrarse los fragmentos ligeros, hbridos o pesados de DNA. 40

En el experimento de Messelson y Stahl la densidad de una molcula de DNA est directamente relacionada al porcentaje de tomos de 15N y 14N que sta contiene. Si la replicacin es semiconservativa, uno podra esperar que la densidad de las molculas de DNA podran disminuir gradualmente durante el cultivo en el medio conteniendo 14N. La densidad podra disminuir conforme las cadenas ligeras fueran sintetizadas en asociacin con las cadenas pesadas. Despus de una generacin, todas las molculas de DNA podran ser hbridos 15 N-14N y su densidad flotante sera intermedia entre el DNA totalmente pesado y el DNA totalmente ligero. Conforme la replicacin contina ms all de la primera generacin, las cadenas podran contener slo istopos ligeros y dos tipos de DNA duplex podran aparecer en los gradientes: aquellos conteniendo hbridos 15N-14N y aquellos conteniendo slo 14N. Conforme el tiempo de crecimiento en el medio ligero contina, un porcentaje cada vez mayor de molculas de DNA presentes, podran ser ligeras (figura 2.14).

Figura 2.14. Resultados experimentales obtenidos por Messelson y Stahl. La aparicin de una banda hbrida y la desaparicin de una banda pesada despus de una generacin eliminan la hiptesis de la replicacin conservativa y demuestra que la replicacin es semiconservativa. La subsiguiente aparicin de dos bandas, una ligera y una hbrida, elimina el esquema dispersivo. 41

Sin embargo, conforme la replicacin contina semiconservativamente las cadenas parentales pesadas originales, podran estar presentes e intactas en las molculas hbridas de DNA que ocuparan un porcentaje cada vez menor del DNA total. Los resultados de los experimentos en gradientes de densidad obtenidos por Messelson y Stahl indican que la replicacin ocurre de manera semiconservativa.

2.4.2. Mecanismo de la replicacin Para que se replique el doble helicoidal de DNA se separan las dos cadenas, abrindose en un extremo y formando una horquilla de replicacin. Para conseguir abrir la hlice existen dos protenas: la enzima DNA helicasa, que abre la hlice, y las protenas desestabilizadoras de la hlice o protenas de unin a DNA de una sola cadena, que ponen recta la hlice y la mantienen abierta. La enzima DNA polimerasa sintetiza las cadenas complementarias de cada una de las dos cadenas originales, y cada una de estas cadenas se va enlazando con su copia formndose dos dobles hlices (figura 2.15).

Figura 2.15. Horquilla de replicacin del DNA. La DNA helicasa permite la separacin de las dos cadenas de DNA y posteriormente unas protenas desestabilizadoras de la hlice permiten que ambas cadenas permanezcan separadas para que sean copiadas. Mientras la cadena de arriba (cadena conductora o lder que comienza en 3 y termina en 5) es copiada de un modo continuo (en direccin 5 3) por la DNA polimerasa, la de abajo (cadena retrasada que comienza en 5 y termina en 3) es copiada de un modo discontinuo: en fragmentos pequeos en direccin 5 3 (fragmentos de Okazaki) que se unen por la enzima DNA ligasa. Para iniciar la replicacin de cada fragmento de DNA se necesita un RNA cebador que es sintetizado por la RNA primasa. 42

Para que se inicie la copia del DNA, hace falta un RNA especfico de corta longitud (10 bases), denominado RNA cebador, que permite que empiece a actuar la DNA polimerasa. El RNA cebador es generado por una enzima denominada RNA primasa, esta enzima se une directamente a la DNA helicasa, formando una unidad denominada primosoma, que se va desplazando con la cadena en formacin.

2.4.3. Orgenes de replicacin y DNA polimerasas Arthur Kornberg descubri en 1955, en E.coli, una enzima capaz de catalizar la replicacin del DNA (una replicasa). Esta enzima polimeriza una cadena de DNA complementaria a otra existente (molde), creando la molcula de doble cadena que exige la replicacin semiconservativa. La DNA polimerasa-DNA dependiente de Kornberg, ahora llamada polimerasa I, alarga una cadena de polinucletidos aadiendo un nucletido al oxidrilo 3 de la ltima ribosa ya presente en la cadena. El nuevo nucletido, inicialmente un trifosfato, pierde su pirofosfato (PPi) terminal al unirse a la cadena. El pirofosfato es luego roto por una pirofosfatasa haciendo que la reaccin total sea favorable termodinmicamente. (figura 2.16).

Figura 2.16. Crecimiento de las cadenas del DNA. La adicin de nucletidos al DNA ocurre en el extremo 3. Los precursores son nucletidos trifosfatados y en la reaccin el fosfato interior queda unido al azcar eliminndose dos fosfatos.

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Para aadir un nucletido de guanina a la cadena, por ejemplo, se necesitan dos pasos: (1) (2) (polinucletido)n + GTP (polinucletido)n+1 + PPi PPi 2Pi

Los cambios de energa libre del estado estndar de dos pasos son cerca de 0.5 Kcal/mol y 8 Kcal/mol, respectivamente. Considerando los pasos en su conjunto, la reaccin total es favorable. Los nuclesidos entrantes son seleccionados por su capacidad para formar pares de bases por las reglas de Watson-Crick con el molde. Las DNA polimerasas pueden adicionar slo un nucletido donado por un nuclesido trifosfato al grupo 3OH libre de polinucletido apareado, de tal manera que las cadenas de DNA son extendidas solamente en la direccin 5 3. Los experimentos de John Cairns con autoradiogramas de cromosomas de E. coli revelaron la presencia de ojos o burbujas llamadas estructuras (debido a su parecido a la letra Griega theta), lo cual indica que el DNA duplex se replica por la separacin progresiva de las dos cadenas parentales acompaada por la sntesis de sus cadenas complementarias para producir dos cadenas duplex hijas replicadas semiconservativamente. Un punto de bifurcacin en un ojo de replicacin en el cual ocurre la sntesis de DNA es llamado horquilla de replicacin (figura 2.17). Una burbuja de replicacin puede contener una o dos horquillas de replicacin (replicacin unidireccional o bidireccional). Las imgenes de baja resolucin proporcionados por autoradiogramas sugieren que las dos cadenas antiparalelas de DNA son simultneamente replicadas en una horquilla de replicacin. Si todas las DNA polimerasas conocidas slo alargan cadenas en direccin 5 3, cmo entonces copian la cadena parental que se extiende en direccin 5 3?. Se supuso en forma inicial, que otra polimerasa, no descubierta, catalizaba en el sentido 3 5, pero todas las tentativas de identificar dicha enzima fracasaron. Las evidencias de la unin del DNA a la membrana celular condujeron a los cientficos a buscar las enzimas en la fraccin de membranas del desecho celular (fraccin que hasta entonces haba sido rutinariamente descartada), descubriendo all una segunda replicasa, llamada polimerasa II. No obstante, la actividad de la polimerasa II es similar en ndole a la de la replicasa anterior, dado que cataliza la adicin de nucletidos slo al extremo 3 de una cadena preexistente. A una tercera polimerasa (polimerasa III) que cataliza el crecimiento en direccin 5 3, se le ha asignado ahora el papel de replicasa principal; las polimerasas I y II estaran dedicadas en su mayor grado (pero no en forma exclusiva) a la reparacin ms que a la replicacin del DNA.

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Figura 2.17. Replicones durante la replicacin del DNA. As como en una hebra la replicacin es continua, en la otra se van produciendo fragmentos de Okazaki que se unen por la DNA ligasa. Los nmeros 1, 2, 3, 4, y 5 indican el orden de formacin de los fragmentos. El replicn de la derecha indicara un estado ms avanzado que el de la izquierda. Replicones en el que va cambiando la direccin de la replicacin, representados en dos estados sucesivos de la replicacin (1 y 2). 1. En cada replicn, la replicacin ser continua en una mitad y discontinua en la otra. 2. Estado ms avanzado de la replicacin de la figura anterior, mostrando como los replicones tienden a juntarse, dando por terminada la replicacin del DNA. Para explicar la replicacin del DNA hay que considerar tres problemas: (a) Cmo se puede iniciar y mantener una rotacin de alta velocidad de una molcula muy larga; (b) Qu mecanismo puede ser responsable de alargar la cadena que crece en la direccin 3 5 ; y (c) Cmo se inicia la sntesis de DNA si las replicasas slo pueden replicar cadenas preexistentes.

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Hay varios modelos para explicar satisfactoriamente la replicacin del DNA. Los modelos dependen de otro par de nucleasas, una de las cuales es capaz de provocar rupturas de una sola cadena (una endonucleasa o nickasa), en tanto que la otra, una DNA ligasa, las repara. Estas rupturas producidas temporalmente y reparadas por delante del punto de replicacin, permiten que el DNA se desenrolle rotando en torno de las uniones P O P de la cadena adyacente, sin necesidad de retorcer la molcula entera. (Figura 2.15) Si un cultivo de E. coli es marcado con un pulso de 30 segundos con timidina tritiada [3H], el DNA nuevamente sintetizado tiene un coeficiente de sedimentacin en lcali de 7S a 11S. Estos fragmentos llamados fragmentos de Okazaki, consisten de 1000 a 2000 nucletidos (100 a 200 nucletidos en eucariontes). Sin embargo, si despus de 30 segundos de pulso con timidina [3H], E. coli es transferida a un medio sin marcar (experimento de pulso y caza), el DNA marcado radiactivamente resultante sedimenta a una velocidad que aumenta con el tiempo en que las clulas han crecido en el medio sin marcar. Los fragmentos de Okazaki deben ser incorporados a una molcula de DNA ms larga, como se muestra en la figura 2.15.

2.5. Regulacin del ciclo celular La regulacin del ciclo celular ocurre de diferentes formas. Algunas clulas se dividen rpidamente, otras como las clulas nerviosas pierden la capacidad de dividirse una vez que llegan a la madurez. Algunas, como las clulas hepticas, conservan, aunque no la utilizan, su capacidad de divisin. Las clulas del hgado se dividen si se remueve parte del hgado y su divisin contina hasta que el hgado retorna a su tamao normal. Factores ambientales tales como cambios en la temperatura y el pH y disminucin de los niveles de nutrientes llevan a la disminucin de la velocidad de divisin celular. Basados en las investigaciones realizadas en huevos de anfibios los investigadores imaginaron la existencia de un "reloj central bioqumico" u oscilador que "instruye" a los ncleos acerca de las funciones a cumplir para controlar las fases de la divisin. Los modelos de estudio para conocer el ciclo celular han sido las levaduras Saccharomyces cerevisiae y Saccharomyces pombe y los oocitos de la rana Xenopus laevis (Figura 2.18).

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Figura 2.18. Modelos de estudio del ciclo celular. Levaduras Saccharomyces cerevisiae (izquierda) y Saccharomyces pombe (medio) y oocito de Xenopus laevis. Las levaduras al ser organismos eucariontes unicelulares han permitido estudiar el ciclo celular mediante mutaciones que detienen a estos organismos en ciertas etapas del ciclo. Los huevos de rana por su gran tamao (5 mm) permiten inyectar compuestos y extractos que modifican las etapas de divisin celular en el huevo. La progresin del ciclo celular es controlada en cuatro puntos de control: uno en la fase G1 tarda, antes de la sntesis de DNA; un segundo en la transicin G2/M; y el tercero y cuarto durante la mitosis. Estos puntos de control garantizan que los eventos claves de ciclo celular, como son la replicacin y la divisin mittica, sean realizados de manera precisa. La progresin a travs de estos puntos de control es mediada por la activacin secuencial de complejos heterodimricos de protenas cinasas conocidos como cinasas dependientes de ciclinas (CDKs). Estos complejos CDKs constan de una subunidad de cinasa cataltica o CDK, y una reguladora denominada ciclina. Las ciclinas reciben su nombre debido a su patrn de expresin transcripcional en forma peridica a lo largo del ciclo celular, a diferencia de las cinasas cuya expresin se mantiene constante a travs del mismo. Las protenas CDKs monomricas fosforilan residuos de serina y treonina en protenas blanco y tienen por s mismas una baja actividad de cinasa, por lo que su activacin completa requiere de la unin con las ciclinas. Cada CDK puede asociarse con distintas ciclinas determinando de esta manera qu protena ser fosforilada por el complejo, a partir del cambio conformacional que produzca la interaccin CDK/ciclina. Todas las ciclinas comparten una regin altamente conservada de aproximadamente 100 aminocidos, denominada caja de ciclinas, requerida para su interaccin con la subunidad cataltica de la CDK. De manera similar, las CDKs contienen una secuencia conservada de 16 aminocidos fundamental para su unin con las ciclinas. Adems de su unin, los complejos CDK/ciclina son regulados a diferentes niveles. El primer nivel de regulacin es la transcripcin de sus genes, e involucra factores transcripcionales especficos 47

del ciclo celular, as como la actividad per se de los complejos CDK/ciclina. Una vez expresadas las ciclinas y cinasas, su actividad se regula a nivel traduccional o de sntesis de protenas, y postraduccional mediante su fosforilacin, hasta ser degradadas rpidamente por el proteosoma en fases especficas del ciclo celular. La localizacin celular es otra manera de regular la funcin de las ciclinas y cinasas, ya que algunas requieren ser transportadas del citoplasma al ncleo para ser completamente activas. El proteosoma es un complejo de proteasas que se encuentra altamente conservado tanto en estructura como en funcin en arqueas, bacterias y eucariontes. En clulas eucariontes el proteosoma 20S tiene una estructura en forma de barril y el sitio activo de sus mltiples subunidades catalticas se encuentra orientado frente a la cavidad central. Este sitio denominado centro del proteosoma, se asocia tpicamente con uno o dos complejos de la fraccin 19S o cap para formar un complejo ms grande llamado proteosoma 26S. El complejo 19S contiene varias subunidades de ATPasas que estn involucradas en el desdoblamiento de las protenas blanco. El complejo 19S contiene tambin por lo menos 11 subunidades no-ATPasas, las cuales participan en la regulacin y el reconocimiento del blanco. Una de estas subunidades se une a la ubiquitina, que funciona como una seal universal para el marcaje de protenas que sern degradadas por el proteosoma. Sin embargo, la degradacin proteosomal no se encuentra dirigida exclusivamente hacia protenas ubiquitinadas, otros sustratos incluyen: protenas no plegadas o que han perdido su plegamiento, antgenos y protenas marcadas por otros mecanismos como fosforilacin. La va de degradacin por el proteosoma de las protenas marcadas por ubiquitinacin se presenta en la figura 2.19. Existen diferentes clases de ciclinas, que se agrupan en dos grandes conjuntos de acuerdo a su fase de accin: las ciclinas G1, con un patrn de expresin circunscrito a las fases G1 y S, y las ciclinas mitticas presentes en las fases G2 y M. En cada organismo, la complejidad de la familia de genes de ciclina es enorme. En la levadura Saccharomyces cerevisiae existen cinco ciclinas G1, tres que promueven la fase G1 y se denominan CLN1 CLN2 y CLN3 y dos ms reguladoras de la fase S llamadas CLB5 y CLB6; posee tambin cuatro ciclinas mitticas, CLB1, CLB2, CLB3 y CLB4. Todas estas ciclinas forman complejos con una nica CDK denominada cinasa maestra o CDC28 (Cdc2, en Schizosacharomyces pombe).

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E2 E1
SH ATP

E3 E2
S Protena blanco

E2 E3

E1
Ubi

S Ubi

E2

E3

Protena blanco marcada para su dregradacin por el proteosoma

Figura 2.19. Va de degradacin proteoltica mediante la va de ubiquitina. La degradacin de protenas por el proteosoma mediante la va de ubiquitina implica tres enzimas E1, E2 y E3. La enzima E1 utiliza ATP para forma un enlace tiol-ster de alta energa con una glicina del C-terminal de la ubiquitina (ubi). La ubiquitina es posteriormente trasferida a un residuo de cisteina de la enzima E2 y una vez ocurrido esto, se une a la enzima E3 para la transferencia de ubiquitina hacia la protena blanco asociada a la E3. Despus de varios ciclos de ubiquitinacin la protena contiene una cadena de ubiquitina que es reconocida por el proteosoma para su degradacin.

En mamferos, se han identificado hasta ahora ocho familias diferentes de ciclinas. Las ciclinas G1 comprenden la familia de ciclinas A, C, D, E, H y K que se dimerizan con las cinasas CDK2, CDK8, CDK4/6, CDK2/4, CDK7 y CDK9, respectivamente. En el grupo de las ciclinas mitticas se encuentran la familia de ciclinas B que se unen a CDK1 y la ciclina F, para la cual no se ha identificado la subunidad cataltica de unin. Finalmente, en plantas se han localizado cinco familias de ciclinas tanto G1 como mitticas homlogas a las ciclinas A, D, E, B y H de animales, que se unen a cinco cinasas diferentes denominadas con la letra A a la E. La destruccin especfica de las ciclinas mitticas (ciclinas A y B) permite la inactivacin de los complejos CDK/ciclina, como es el caso del MPF (Factor promotor de la maduracin). Dicho mecanismo depende de una secuencia de nueve aminocidos localizada en el extremo N-terminal de la protena denominado caja de destruccin (de destruction box o D box), la cual se encuentra altamente conservada entre las distintas ciclinas mitticas y funciona como blanco para la protelisis mediada por la ubiquitina. Los tiempos de degradacin difieren entre las ciclinas: las ciclinas de tipo A son degradadas durante la metafase mientras que las ciclinas de tipo B son destruidas a partir del inicio de la anafase. En la figura 2.20 se ilustra de manera general la participacin de los diferentes reguladores del ciclo celular. 49

Figura 2.20. Modelo general de la regulacin del ciclo celular eucarionte. Las cinasas asociadas a ciclinas son complejos que fosforilan protenas diversas, lo que hace que se pueda dar la transicin entre una etapa y otra. Los complejos APC y SCF permiten la degradacin de protenas, para que de esa manera el ciclo tambin proceda en una sola direccin.

En clulas animales, la progresin a travs del punto de restriccin G1/S es mediada por la va Rb/E2F (Fig 2.21). La protena Rb (pRB) es una fosfoprotena nuclear de 105 a 110 kDa que es forforilada por los complejos de CDK2/ciclinaD y E en mltiples residuos de serina/treonina y funciona como supresor de tumores en estado hipofosforilado o activo. La protena Rb hipofosforilada atrapa al factor transcripcional E2F y por lo tanto inhibe la transcripcin de los genes regulados por E2F. Se ha reportado que el E2F activa la transcripcin de varios genes cuyos productos son importantes para la entrada a la fase S as como para la replicacin. El factor E2F puede activar la transcripcin de estos genes slo si se encuentra en estado libre, ya que su unin a Rb lo inactiva (Figura 2.21). La mayora de los elementos claves en la va de Rb/E2F se encuentran conservados a travs de la evolucin de los 50

organismos multicelulares. En distintas especies de plantas se han aislado protenas relacionadas con Rb (RBRs), E2F y activadores transcripcionales de la familia DP.

CycE

CDK2

CycD

CDK4,6

M CycE CDK2 G2 G1 CycD CDK4,6

p21 p27 INK4

RB S E2F Activo P P P RB P P E2F Inactivo P

Figura 2.21. Regulacin de la transicin G1/S en mamferos. Una vez formados los complejos CDK4,6/ciclina D y CDK2/ciclina E se inicia la hiperfosforilacin de la protena Rb, permitiendo la liberacin del factor transcripcional E2F y por tanto la activacin transcripcional de los genes requeridos para llevar a cabo la fase S. Ambos complejos cinasa/ciclina pueden ser inhibidos por la unin secuencial de molculas de p27, p21 o INK4 lo cual mantiene a las clulas en la fase G1. Las cromtidas hermanas durante la metafase se encuentran unidas mediante la protena cohesina. Para que la anafase tenga lugar, se requiere que dicha protena sea degradada por una proteasa (separasa), de manera que las cromtidas puedan migrar hacia polos opuestos del huso. En metafase, la separasa se encuentra inhibida por la unin de la protena securina. Mediante la va de ubiquitina, mediada por el APC (complejo promotor de la anafase), la securina es marcada para su protelisis liberando a la separasa que inicia la degradacin de cohesina y por tanto la progresin a la anafase. (Figura 2.22).

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Ubi APC securina separasa securina proteosoma

cohesina separasa

Degradacin de cohesina

Cdc25C

Inicio de la anafase

Figura 2.22. Funcin del APC en la separacin de las cromtidas hermanas durante la metafase-anafase.

Un importante regulador del ciclo celular lo constituye una protena denominada p53, la cual por un lado ejerce un control de tipo negativo frenando la divisin a nivel de G1. Esta protena es sintetizada por la propia clula en respuesta a la aparicin de alteraciones del DNA, se origina en el gen p53 perteneciente a la categora de genes supresores de tumores. La p53 hace que se expresen otros genes de protenas reguladoras como los p21 y p16 que bloquean la actividad de las cinasas. Las clulas, al no replicar su DNA se estabilizan en la fase G1. Si el DNA replicado tiene un dao peligroso para las clulas hijas, la protena p53 se encarga de la muerte celular o apoptosis (muerte celular programada).

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3. EXPRESIN GENTICA: SNTESIS DE RNA Y DE PROTENAS

3.1. Un gen una protena Durante los aos 1930s a pesar de los grandes avances los genetistas tenan muchas preguntas sin respuestas: Qu eran exactamente los genes? Cmo trabajaban? Qu produce un nico fenotipo asociado con un alelo especfico? Las respuestas de la fsica, la qumica y los estudios de los microorganismos y diversas enfermedades dieron origen a lo que hoy se conoce como Biologa Molecular. Las reacciones bioqumicas estn controladas por enzimas. Las enzimas, estn a menudo involucradas en cadenas de reacciones conocidas como vas. La prdida de actividad de una enzima puede inactivar todo el ciclo. Archibald Garrod, en 1902, fue el primero en sugerir, la relacin entre enfermedad y metabolismo a travs de su estudio de la alcaptonuria, enfermedad en que el individuo elimina por la orina una gran cantidad de cido homogenstico que le da un color oscuro caracterstico ("alcapto"). El razon que en los individuos sanos el cido homogenstico se deba metabolizar a otros productos, razn por la cual no apareca en orina. Sospech la existencia de un bloqueo en la va metablica y propuso que esa condicin era debido a "un error innato del metabolismo". Tambin descubri que la alcaptonuria se heredaba como un factor mendeliano recesivo. Dado que las reacciones qumicas que ocurren en el cuerpo estn mediadas por enzimas, y dado que las enzimas son protenas, deba existir una relacin entre genes y protenas. En 1941 Beadle y su colaborador Edward L. Tatum decidieron examinar, etapa por etapa, las reacciones qumicas en una va metablica. Ellos usaron un hongo, la Neurospora crassa, como organismo experimental. Tiene como ventajas un ciclo de vida corto y el hecho de crecer fcilmente en laboratorio. Dado que es haploide en la mayor parte de su ciclo vital, las mutaciones se expresan inmediatamente. Los mapeos previos realizados a los cromosomas del organismo facilitaron su trabajo. La Neurospora puede desarrollarse en un medio mnimo, y su nutricin puede ser estudiada por su capacidad para metabolizar azcares u otros productos, que los cientficos pueden agregar o sacar de la mezcla utilizada para su crecimiento. Tambin es capaz de sintetizar todos los aminocidos que necesita para su crecimiento, por lo tanto las mutaciones en una va biosinttica pueden demostrase fcilmente. Las mutaciones en Neurospora son inducidas por rayosX y luego, las esporas mutadas se colocan en un medio enriquecido con todos los aminocidos. A estos cultivos se los compara con medio en el que existe slo uno de los 20 aminocidos. Si una espora no puede sintetizar un aminocido, por ejemplo prolina, slo crecer en el medio al cual se le haya agregado prolina.

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La biosntesis de aminocidos (los ladrillos que forman las protenas) es un complejo proceso con muchas reacciones qumicas mediadas por enzimas que si mutan, tornndose inactivas, detendrn la va biosinttica y por lo tanto el crecimiento. Beadle y Tatum propusieron la hiptesis "un gen una enzima" y, dado que un gen codifica para la produccin de una protena. "Un gen una enzima" ha sido modificado a "un gen un polipptido" dado que muchas protenas (como la hemoglobina) estn formadas por ms de un polipptido. Posteriormente, gracias al trabajo pionero de Crick, Brenner, Niremberg y Ochoa entre otros, fue posible describir los mecanismos generales celulares involucrados en la decodificacin de la informacin gentica por la clula para dar lugar a la sntesis de protenas, mediante la propuesta y comprobacin de los mecanismos de transcripcin del DNA en RNA mensajero y traduccin de este RNA en protena.

3.2. El dogma central El primer paso en la sntesis de protenas, a partir de la informacin presente en los genes a nivel del DNA, es la sntesis o formacin de una molcula de RNA, especfica para cada gene, usando para ello como molde un segmento (un gene) de una de las dos cadenas del DNA y posteriormente esta molcula de RNA es traducida para formar protenas. A este flujo de informacin se le conoce como el Dogma Central (figura 3.1).

Figura 3.1. El dogma central de la biologa molecular indica el flujo de la informacin gentica. En el DNA se encuentran los genes, en todas las clulas de los organismos vivos. A partir de la informacin localizada en esta molcula de doble hlice, una clula sintetiza todas sus protenas. Esto se lleva a cabo mediante dos mecanismos: la transcripcin, que es la sntesis de molculas de RNA usando regiones especficas o genes del DNA como templado o molde, y la traduccin, que es la sntesis de protenas a travs de la lectura de las molculas del RNA mensajero en los ribosomas. Adems el DNA, como ya se ha mencionado, tiene la funcin de autoreplicarse. 54

3.3 Tipos de RNA El RNA juega un papel central en la expresin de genes. ste fue inicialmente caracterizado como un intermediario en la sntesis de protenas, pero a partir de entonces se han descubierto muchas otras funciones relacionadas con un papel estructural o funcional a otros niveles de la expresin de genes. Existen tres clases de RNA que estn directamente relacionados con la produccin de protenas (Figura 3.2): 1) RNA mensajero (RNAm): son molculas intermediarias que llevan una copia del mensaje codificado en una secuencia de DNA que posteriomente ser traducido a protena. 2) RNA de transferencia (RNAt): son pequeas molculas de RNAs que son usadas para proveer de los aminocidos correspondientes a cada uno de los codones contenidos en el RNAm. 3) RNA ribosomal (RNAr): stos constituyen parte de los componentes de los ribosomas, complejos de ribonucleoprotenas formados de muchas protenas y RNAs, los cuales constituyen el aparato de la polimerizacin de aminocidos hacia la produccin de una cadena polipeptdica (sntesis proteica). El papel que juega el RNA en cada unos de estos casos es distinto. Para el RNAm, su secuencia es la principal caracterstica: cada triplete de nucletidos dentro de una regin codificante del RNAm representa un aminocido de la correspondiente protena codificada. Sin embargo, la estructura del RNAm, en particular la secuencia encontrada en cualquiera de los extremos de la regin codificante puede jugar un papel primordial en controlar su actividad y por lo tanto en la cantidad de protena que ser producida a partir de ste. En el RNAt, se pueden notar dos de los trminos ms comunes que gobiernan el uso del RNA: su estructura tridimensional es importante, as como la capacidad de interaccionar de sus bases nitrogenadas (par de bases) con otras molculas de RNA (RNAm). La estructura tridimensional del RNAt es reconocida por una enzima que lleva a cabo la unin de ste a un aminocido especfico para producir el aminoacil-RNAt, que es reconocido como la estructura acarreadora que es usada para la sntesis de protenas. La especificidad con que un aminoacil-RNAt es usado en la sntesis proteica est controlada por el apareamiento o complementariedad de las pares de bases, cuando una secuencia corta como lo es un triplete (el anticodn) se aparea con los nucletidos del triplete del RNAm (codn) representando por consiguiente a un aminocido.

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Figura 3.2. Tres tipos de RNA requeridos para la expresin gentica. Con el RNAr, se puede hacer notar otro tipo de funcin, el papel estructural de la molcula de RNA proveyendo del marco de trabajo con el que las protenas ribosomales forman un complejo ribonucleo-proteico. Y adems, ste participa directamente en la funcin que realiza el ribosoma. Una de las funciones cruciales de los ribosomas es la capacidad de catalizar la formacin de un enlace peptdico por el que un aminocido es incorporado en una protena. Esta actividad reside en una de las molculas de RNAr contenida en el ribosoma. Aunque la funcin del RNAm como molcula codificante es nica, el RNAt y RNAr son ejemplo de la amplia variedad de funciones que poseen los RNAs de la clase no codificante en la expresin gentica.

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3.4. Transcripcin El RNA es una molcula qumicamente muy parecida a una de las hebras del DNA ya que tambin est formado por cadenas lineales de nucletidos, por lo que la informacin gentica contenida en el DNA, es decir, el orden de desoxirribonucletidos de una de las hlices del DNA, de uno o varios genes, se transfiere uno a uno, a una secuencia de ribonucletidos complementaria en el proceso de la sntesis del RNA. Este proceso de transcripcin o sntesis del RNA es un proceso enzimtico mediado por la enzima RNA polimerasa, que siempre ocurre, al igual que la replicacin del DNA, en la direccin 5' a 3', y normalmente slo una de las dos cadenas del DNA es transcrita en una molcula de RNA (figura 3.3).

Figura 3.3. Proceso de transcripcin. Las molculas de RNA son transcritas o producidas por la enzima RNA polimerasa a partir de regiones especficas de material gentico (que contienen uno o varios genes), utilizando como molde una de las dos cadenas del DNA. Las molculas de RNA son polmeros lineales de centenares de cuatro tipos diferentes de nucletidos: A, G, C y U, en donde la diferencia primaria con el DNA es que el uracilo (U) es utilizado en lugar de la timina (T), durante su sntesis. Todas las molculas de RNA, que son intermediarios en la sntesis de las protenas, son exportadas del ncleo en el caso de las clulas eucariontes, y luego en el citoplasma celular son ledas y su informacin es utilizada para sintetizar protenas. Cada molcula de RNA mensajero es recipiente de la informacin para sintetizar una o varias protenas especficas. La transcripcin involucra la sntesis de una cadena de RNA representando una de las cadenas del DNA dplex. Esta cadena tiene por caracterstica que es idntica en secuencia con una de las cadenas del DNA, la cual es llamada la cadena codificante o con sentido. La cadena de RNA complementaria con la cadena del DNA que sirve como molde para su sntesis se le conoce como cadena templado o sin sentido. (Figura 3.4). 57

Figura 3.4. La funcin de la RNA polimerasa es copiar una cadena de DNA dplex en una de RNA.

La sntesis del RNA es catalizada por la enzima conocida como RNA polimerasa, la cual generalmente es un complejo multiproteico. La transcripcin comienza cuando la RNA polimerasa se une a una regin especial, conocida como promotor, usualmente localizado al inicio del gen. El promotor se encuentra cercano al punto de inicio de la sntesis del RNA, llamado punto de inicio o inicio de la transcripcin. A partir de este punto, la RNA polimerasa se mueve a lo largo del templado, sintetizando el RNA, hasta localizarse en una secuencia terminadora de la transcripcin llamada terminador. Esta accin se define como unidad de la transcripcin, la cual comprende desde el promotor hasta el terminador. Secuencias encontradas anteriores al punto de inicio son descritas como secuencias corriente arriba a ste; las encontradas despus del punto de inicio se denominan secuencia corriente abajo. Las secuencias son convencionalmente escritas de tal manera que la transcripcin procede en la direccin de izquierda (corriente arriba) a derecha (corriente abajo). Lo anterior conlleva a que usualmente la molcula de RNAm se escribe o representa en direccin 5' 3'. Respecto a las secuencias de DNA, generalmente slo es escrita la cadena codificante, la cual tiene la misma secuencia que el RNA. Las posiciones de las bases son numeradas en ambas direcciones a partir del punto de inicio, que es asignado con el valor +1; los nmeros son incrementados corriente abajo con valores positivos y corriente arriba con valores negativos (para este caso no es asignado el nmero cero) (Figura 3.5). 58

Figura 3.5. Una unidad de transcripcin es producida como un solo RNA. El producto inmediato de la transcripcin es llamado transcrito primario, el cual deber contener un RNA extendido desde el promotor hasta el terminador. El transcrito primario generalmente es inestable, en procariontes por ejemplo, el RNAm es rpidamente degradado; en eucariontes, el RNAm inmaduro es modificado en los extremos y/o sometido a ruptura-ligacin (edicin) para obtener el RNAm maduro. La transcripcin es la primera etapa en la expresin gentica y la principal en que sta puede ser controlada. Existen protenas reguladoras, las cuales van a determinar cuando un gen en particular ser transcrito por la RNA polimerasa. Esta etapa inicial de regulacin consiste en tomar la decisin si un gen es o no transcrito, de tal manera que la expresin gentica para muchos genes es controlada a este nivel, aunque para muchos otros existen etapas subsecuentes que controlan los niveles de expresin.

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En la transcripcin dos eventos importantes contemplan el hecho de cmo la RNA polimerasa es capaz de encontrar los promotores en el DNA y cmo las protenas reguladoras interaccionan con la RNA polimerasa para activar o reprimir etapas especficas en la iniciacin, elongacin o terminacin de la transcripcin, y de esta manera controlar el nivel de expresin gentica.

3.5. Proceso de la transcripcin La sntesis de RNA tiene lugar dentro de la burbuja de la transcripcin, en donde el DNA es transitoriamente separado en sus cadenas simples y la cadena templado del DNA es usada para la sntesis directa de la cadena de RNA. La cadena de RNA es sintetizada en direccin del extremo 5' hacia el extremo 3'. El grupo OH del extremo 3' del ltimo nucletido adicionado a la cadena reacciona con el extremo 5' trifosfato del nucletido entrante. El nucletido entrante pierde dos grupos fosfato, mientras que el fosfato interior es usado en la formacin del enlace fosfodister de la cadena nucleotdica. La velocidad de reaccin a este nivel es de aproximadamente 40 nucletidos/segundo a 37 oC (para la RNA polimerasa bacteriana); esta velocidad es similar a la velocidad de traduccin (15 aminocidos/segundo), pero mucho ms baja que la velocidad de la replicacin del DNA (800 pares de bases/segundo). La estructura de la burbuja de la transcripcin con la RNA polimerasa es mostrada en la figuras 3.6. La RNA polimerasa se mueve a lo largo del DNA templado (tambin conocido como DNA molde), mediante un evento de desenrollamiento de la doble hlice del DNA por la parte frontal de la burbuja y un evento de enrollamiento del DNA por la parte trasera. Las dimensiones de la burbuja de la transcripcin contemplan de 12 a 14 pb, pero el largo de la regin hbrida RNA-DNA dentro de sta es ms corta. El proceso de la transcripcin puede ser dividido en tres etapas; iniciacin, elongacin y terminacin (Figura 3.7). Iniciacin: el reconocimiento del templado comienza con la unin de la RNA polimerasa a la regin denominada promotor constituida por una cadena de DNA dplex para formar lo que se conoce como complejo cerrado. Una vez ocurrido, las cadenas del DNA son separadas para dar lugar a la formacin del complejo abierto que constituye la disponibilidad de la cadena templado o molde de DNA para la interaccin por apareamiento de bases con los ribonucletidos, necesaria para la sntesis del RNA. La burbuja de la transcripcin es creada por un desenrollamiento local que comienza en el sitio de unin de la RNA polimerasa.

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Figura 3.6. La transcripcin es realizada en la burbuja, en donde el RNA es sintetizado durante el desplazamiento de la RNA polimerasa.

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Figura 3.7. Etapas de la transcripcin. La transcripcin involucra diferentes tipos de interacciones entre la RNA polimerasa y el DNA. La enzima se une al promotor y forma la burbuja de la transcripcin separando las cadenas del DNA, la enzima permanece estacionaria durante la iniciacin, se desplaza a lo largo del DNA durante la elongacin sintetizando el RNA y se disocia en el sitio de la terminacin liberando al RNA. 62

La iniciacin se describe como la sntesis de los primeros nucletidos unidos por la RNA polimerasa. Las enzima permanece anclada al promotor mientras sta sintetiza un RNA de aproximadamente 9 nucletidos. La fase de iniciacin es caracterizada por la ocurrencia de eventos abortivos en los que la enzima hace transcritos de RNA cortos, liberando stos y entonces comenzando nuevamente la sntesis del RNA. La fase de iniciacin termina cuando la enzima procede a extender la cadena de RNA y se desplaza del promotor, dando comienzo a la etapa de elongacin. Elongacin: durante la fase de elongacin la RNA polimerasa se mueve a lo largo del DNA y extiende el crecimiento de la cadena de RNA. Cuando la enzima se desplaza, sta va desenrollando la hlice del DNA para exponer un nuevo segmento de templado en cadena sencilla. Los nucletidos son unidos covalentemente en el extremo 3' de la cadena de RNA en crecimiento, formando un hbrido RNA-DNA en la regin desenrollada. Pasando la regin de desenrollamiento el DNA nuevamente es enrollado para restablecer su estructura y la cadena de RNA emerge como una cadena sencilla. La elongacin involucra el movimiento de la burbuja de la transcripcin debida a la disrupcin de la estructura del DNA, en la que la cadena templado de la regin de desenrollamiento es apareada con la cadena del RNA naciente en el punto de crecimiento. Terminacin: la etapa de terminacin de la transcripcin involucra el reconocimiento de un punto o regin en el que ya no es posible adicionar ms bases a la cadena de RNA. La secuencia o regin del DNA requerido para estas reacciones es definida como terminador. Para terminar la transcripcin la formacin de enlaces fosfo-dister debe cesar y el complejo de la transcripcin se desintegrar. Cuando la ltima base es adicionada a la cadena de RNA, la burbuja de la transcripcin colapsa y el hbrido RNA-DNA es desintegrado, entonces el DNA adquiere su estado dplex y la enzima y el RNA son liberados.

3.6. RNA polimerasa bacteriana La ms estudiada de las RNA polimerasas es la de la eubacteria Escherichia coli. Al parecer slo un tipo de RNA polimerasa es responsable de la sntesis de todo el RNAm, RNAt y RNAr en una eubacteria. Alrededor de 7000 molculas de RNA polimerasa son encontradas en una clula de E. coli, de las cuales probablemente 2000-5000 estn sintetizando RNA en cualquier tiempo, dependiendo de las condiciones de crecimiento. La enzima completa o tambin conocida como holoenzima en E. coli tiene una masa molecular de aproximadamente 465 kDa. El ncleo de la enzima est constituido por cuatro subunidades proteicas, dos subunidades , una y una ', as como una adicional y variable denominada subunidad sigma () (Figura 3.8).

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Figura 3.8. La RNA polimerasa. En eubacterias est formada por cuatro tipos de subunidades; , y las cuales tienen tamaos constantes en las diferentes especies bacterianas, sin embargo la subunidad es el componente variable. Las subunidades y ' codificadas por los genes rpoB y rpoC, respectivamente, unidas constituyen el centro cataltico, en la subunidad se entrecruzan el templado de DNA, el producto de RNA y los ribonucletidos; mutaciones en los genes rpoB y rpoC afectan la transcripcin totalmente. La subunidad es requerida para el ensamblaje del ncleo de la enzima, as como para la afinidad por el promotor y la interaccin de la RNA polimerasa con algunos factores reguladores. La subunidad est implicada especficamente con el reconocimiento del promotor. La holoenzima (2') puede ser separada en dos componentes, el ncleo de la enzima (2 ') y el factor sigma (). Slo la holoenzima puede iniciar la transcripcin. El factor sigma garantiza que la RNA polimerasa bacteriana se una de manera estable al DNA slo en la regin del promotor. El factor sigma usualmente es liberado cuando la cadena de RNA contiene 8-9 bases, dejando al ncleo de la RNA polimerasa proseguir a la etapa de elongacin. El ncleo de la RNA polimerasa se une usualmente a cualquier regin del DNA con una constante de disociacin muy baja (aproximadamente 60 min), por lo que ste no distingue entre los promotores y otras secuencias de DNA. Cuando el factor sigma se une al ncleo de la enzima y forma la holoenzima ste introduce cambios estructurales que influyen en la afinidad de 64

la RNA polimerasa por el DNA, reduciendo drsticamente la capacidad de unin a sitios del DNA. Estos cambios provocan que la constante de disociacin disminuya alrededor de 1000 veces, provocando que el tiempo promedio de interaccin RNA polimerasa-DNA disminuya a <1 segundo. Esto trae como consecuencia un rpido desplazamiento de la holoenzima en la bsqueda de una nueva regin del DNA hasta encontrar la regin del promotor correcto (Figura 3.9).

Figura 3.9. El ncleo de la RNA polimerasa se une indiscriminadamente a cualquier regin en el DNA. El factor sigma reduce la afinidad por la unin independiente de la secuencia de reconocimiento y confiere la especificidad para el promotor.

3.6.1. La asociacin con el factor sigma cambia la iniciacin de la transcripcin Podemos ahora describir los estados de la trascripcin en trminos de las interacciones entre las diferentes formas de la RNA polimerasa y el templado de DNA. La iniciacin se puede resumir en la figura 3.10 65

a) La holoenzima-promotor reaccionan formando el complejo binario cerrado. Cerrado porque el DNA permanece como cadena dplex. Debido a que la formacin del complejo cerrado es reversible, ste usualmente es descrito como una constante de equilibrio (KB). Por lo tanto un amplio rango de valores de constante de equilibrio formar el complejo cerrado. b) El complejo cerrado es convertido a un complejo abierto, por la separacin (apertura) de un regin corta del DNA donde ocurre la unin de la enzima. Para promotores fuertes la conversin en un complejo binario abierto es irreversible, tal reaccin es descrita por la constante de proporcionalidad (K2). Esta reaccin es rpida y el factor sigma est involucrado en la reaccin de apertura del DNA. c) La siguiente etapa es la incorporacin de los primeros 2 nucletidos, donde un enlace fosfodister es formado entre stos. Esto genera un complejo ternario que contiene RNA, DNA y la enzima. La formacin del complejo ternario es descrita como una constante Ki; sta es ms rpida que la constante K2. Ms nucletidos pueden ser adicionados sin existir movimiento de la enzima para generar una cadena de RNA que puede ir arriba de 9 bases. Despus de que cada base es adicionada, hay cierta probabilidad de que la enzima sea liberada de la cadena. Esto representar una iniciacin abortiva de la RNA polimerasa. Un ciclo de iniciacin abortiva usualmente ocurre para generar una serie de oligonucletidos muy cortos. d) Cuando la iniciacin sucede, el factor sigma ya no es tan necesario y entonces la enzima realiza la transicin hacia la elongacin, llevada a cabo por el complejo ternario constituido por el ncleo de la RNA polimerasa, el DNA y el RNA naciente. Cuando la holoenzima de la RNA polimerasa inicialmente est unida al DNA, esta cubre alrededor de 75-80 pb, extendindose desde el nucletido -55 al +20. Las dimensiones de la RNA polimerasa (160 A0) podran cubrir aproximadamente 80 pb de DNA en forma extendida. Sin embargo, cuando la RNA polimerasa pasa a la etapa de elongacin sta pierde la regin que va desde del nucletido -55 al -35, teniendo slo aproximadamente 60 pb como la regin de interaccin con el DNA (Figura 3.11).

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Figura 3.10. La RNA polimerasa pasa por varias etapas previas a la elongacin. Un complejo binario cerrado es convertido a un complejo abierto y despus a un complejo ternario. 67

Figura 3.11. El largo de la regin de unin del DNA por la RNA polimerasa cambia conforme cambia del estado de iniciacin al de elongacin. 68

3.6.2. Cmo la RNA polimerasa encuentra las secuencias promotoras? Este fenmeno puede ser explicado en acuerdo a lo ocurrido en la difusin, en donde la RNA polimerasa probablemente se une al azar a sitios en el DNA cambindose entonces hacia otras secuencias tan rpidamente hasta encontrar un promotor. En primera instancia para explicar lo anterior, hay que tomar en cuenta que existe un exceso de ncleos de la RNA polimerasa como complejos cerrados perdidos y en consecuencia hay muy pocas molculas de RNA polimerasa libres. Adems existe una suficiente cantidad de factores sigma de cerca de una tercera parte de la cantidad de polimerasas para existir como holoenzimas, y ellas estar distribuidas entre los complejos cerrados perdidos en los sitios no especficos y complejos binarios (cerrados) en los promotores. Alrededor de la mitad de la RNA polimerasa consiste de ncleos de enzima enfocada a la transcripcin. La RNA polimerasa encuentra a los promotores dentro del contexto del genoma, suponiendo que un promotor es reducido a aproximadamente 60 pb, cmo entonces sta distinguir esta pequea regin de una tan grande como 4 X 106 pb que constituyen el genoma de E. coli, por ejemplo. La figura 3.12 ilustra el modelo ms simple de reconocimiento del promotor, en donde la RNA polimerasa se mueve por difusin al azar. La holoenzima es muy rpidamente asociada con, y disociada de, sitios blanco, continuando esta etapa hasta encontrar una secuencia correspondiente a un promotor. Entonces el reconocimiento de la secuencia especfica permitira una ligera interaccin necesaria para que ocurra la formacin del complejo binario abierto. El movimiento de un sitio a otro por la RNA polimerasa est limitado por la velocidad de difusin en el medio, la cual es aproximadamente de <108 M-1 seg-1 por una secuencia blanco de 60 pb. Si este valor se aplicara in vivo, el tiempo requerido de ciclos sucesivos de asociacin y disociacin para encontrar los sitios blanco de unin a promotor sera tan grande que se requerira una gran cantidad de RNA polimerasas para encontrar el promotor. La RNA polimerasa puede por lo tanto usar algunos otros mecanismos para encontrar los sitios de unin. La figura 3.13 presenta que el proceso podra ser aumentado en velocidad si el blanco inicial para la RNA polimerasa es el genoma completo, no slo para una secuencia promotora especfica, mediante el incremento del tamao del blanco, la constante de difusin por el DNA es correspondientemente incrementada y por lo tanto no sera limitante. Si esta idea es correcta, la RNA polimerasa libre se une al DNA y entonces permanece en contacto con ste. Posteriormente la enzima posicionada en un determinado sitio se intercambia hacia otra regin del DNA muy rpidamente, continuando este intercambio hasta que un promotor es encontrado. En este momento la enzima forma un complejo estable que facilitar la etapa de iniciacin de la transcripcin. Otra idea supone que la enzima se desliza a lo largo del DNA mediante un desplazamiento uni-dimensional al azar, quedndose inmvil slo hasta que sta encuentra a un promotor. Sin embargo, no existen an evidencias de que la RNA polimerasa pueda funcionar de esta manera. 69

3.6.3. Cmo el Factor Sigma controla la unin al DNA? La iniciacin requiere una unin momentnea de la RNA polimerasa con la regin denominada promotor, existiendo una asociacin reversible entre el factor sigma y el ncleo de la RNA polimerasa. El factor sigma se liberar una vez que la iniciacin ocurre o por cambios en su asociacin con la enzima. Debido a que existen pocas molculas de factor sigma en una clula respecto al nmero de molculas de ncleo de la RNA polimerasa, la utilizacin del ncleo de la enzima requiere que el factor sigma sea reciclado eficientemente. Esto ocurre inmediatamente despus de la iniciacin en alrededor de un tercio de los casos; presumiblemente el factor sigma y el ncleo se disocian en algn otro punto posterior para el resto de complejos. Este evento slo ocurre en la etapa de iniciacin, cuando la etapa abortiva ha concluido y la sntesis del RNA ha sido iniciada. Cuando el factor sigma es liberado del ncleo de la RNA polimerasa, ste inmediatamente estar disponible para ser usado por otro ncleo de la enzima y as iniciar un nuevo ciclo de transcripcin. El ncleo de la enzima posee una alta afinidad intrnseca por el DNA, que es incrementada por la presencia del RNA naciente. Sin embargo, esta afinidad por los sitios inespecficos es tan grande que permite a la enzima distinguir eficientemente los promotores de otras secuencias. Adems de que el factor sigma favorece la estabilizacin del complejo ternario en el sitio del promotor, ste dirige la reaccin irreversiblemente hacia la formacin del complejo abierto. El factor sigma posee dominios que reconocen los promotores en el DNA. Como un polipptido independiente, el factor sigma no se une al DNA, pero cuando forma la holoenzima forma un complejo con fuerte capacidad de unin en donde sigma contacta el DNA en la regin 5 al punto de inicio de la transcripcin. Estas diferencias son debidas a un cambio en la conformacin del factor sigma cuando ste se une a la enzima. La regin N terminal del factor sigma libre suprime la actividad de unin de ste al DNA, sin embargo cuando el factor sigma se une al ncleo de la enzima, esta inhibicin es liberada y entonces ste es capaz de unirse especficamente a la secuencia del promotor (Figura 3.13).

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Figura 3.12. Modelos de la unin de la RNA polimerasa al DNA.

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Figura 3.13. Interaccin de la RNA polimerasa con el DNA y las regiones promotoras de la transcripcin.

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3.6.4. El reconocimiento del promotor depende de una secuencia conservada Un promotor es definido por la presencia de secuencias cortas conservadas en una localizacin especfica del DNA. Los promotores estn constituidos tpicamente por tres componentes: una secuencia -35, una -10 y un punto de inicio de la transcripcin. La informacin para que el promotor funcione es proporcionada directamente por la secuencia del DNA: esta estructura es la seal, siendo un clsico ejemplo de un sitio que acta en cis. La enzima RNA polimerasa reconoce al promotor mediante un sitio activo capaz de distinguir la estructura qumica de una secuencia de base en el DNA, en particular de la doble hlice. En bacterias existen 4 a 5 secuencias conservadas que funcionaran como promotores, los cuales constan del inicio de la transcripcin, la regin -10 de 6 pb y la regin -35 de 6 pb y una determinada separacin entre estas regiones. El punto de inicio es usualmente (>90% de la veces) una purina comnmente intermedia a la secuencia CAT, aunque la conservacin de este triplete no es una seal obligatoria. La regin de inicio se encontrar a no ms de 6-8 pb de la regin de reconocimiento -10. El centro del hexmero generalmente est a 10 pb arriba del punto de inicio; sin embargo existe una variacin en la distancia que va entre -9 y -18 pb. La secuencia consenso (conservada en promotores conocidos) es TATAAT, pudiendo resumirse en los siguientes porcentajes: T80 A95 T45 A60 A50 T96 Donde los nmeros denotan el porcentaje de ocurrencia de las bases encontradas en los promotores bacterianos dependientes del factor sigma D. La otra secuencia conservada es el hexmero situado en la regin -35 situado arriba del punto de inicio. La secuencia consenso para esta regin es TTGACA; la cual se resume en: T82 T84 G78 A65 C54 A45 La separacin existente entre las secuencias -10 y -35 usualmente est entre 16-18 pb en el 90% de los promotores de este tipo, existiendo excepciones que contemplan distancias menores a 15 pb o mayores de 20 pb. Aunque la secuencia es importante en el reconocimiento del promotor, la distancia de separacin de las secuencias consenso son crticas para el plegamiento de los dos sitios en la regin de interaccin dada por la geometra de la RNA polimerasa. Algunos promotores contienen una regin rica en A-T localizada ms arriba de las anteriores, denominada elemento superior (UP element), el cual interacciona con la subunidad alfa de la RNA polimerasa el 73

cual generalmente funciona como un potenciador que favorece la iniciacin de la transcripcin. (Figura 3.14).

Figura 3.14. Promotores bacterianos. La regin de los promotores en los organismos procariontes es un fragmento de aproximadamente veinticinco pares de nucletidos que contiene dos conjuntos denominados regiones de -10 y -35. La sntesis de RNAm inicia en bacterias en la posicin +1, es decir, 10 pares de nucletidos despus de la regin -10. Cuando ocurren mutaciones en las regiones -10 o -35, la enzima RNA polimerasa ya no es capaz de reconocer con la misma eficiencia esta regin del promotor; en esos casos puede cancelarse la sntesis de RNAm. La ocurrencia de mutacin en la regin promotora puede causar diferencias en el funcionamiento del promotor; por ejemplo (Figura 3.15): Mutaciones en esta regin usualmente pueden afectar la eficiencia del promotor, mientras que mutaciones arriba de estas regiones pueden tener efecto contrario. Mutaciones dentro de la regin -35 usualmente afectan la unin inicial de la RNA polimerasa. Mutaciones en la secuencia -10 usualmente afectan la reaccin de separacin de las cadenas del DNA, que convierten el complejo cerrado en el complejo abierto.

Estos resultados sugieren el modelo de la figura 3.16. La funcin de la secuencia -35 es proveer la seal para el reconocimiento por la RNA 74

polimerasa, mientras que la secuencia -10 permite la conversin del complejo cerrado al abierto. El factor general responsable de la trascripcin de muchos genes que se expresan en condiciones normales es el factor sigma 70 (70). Los factores sigma alternativos S, 32, E y 54 son activados en respuesta a cambios ambientales; 28 es usado para la expresin de genes relacionados con la biosntesis de flagelos durante el crecimiento normal, pero sus niveles de expresin responden a cambios en el medio ambiente. De manera general, todos los factores sigma excepto 54 son de la misma familia de protenas y poseen funciones similares. El gen rpoH es un regulador necesario para el encendido de la respuesta a calor (heat shock); su producto, 32 funciona como un factor sigma alternativo que causa la transcripcin de los genes relacionados con la respuesta a calor. La respuesta a calor es acompaada con un incremento en la cantidad de 32 cuando la temperatura incrementa y un decremento cuando el cambio de temperatura es revertido. Los factores 32 y 70 pueden competir por la disponibilidad del ncleo de la RNA polimerasa durante la respuesta a calor, de tal manera que la expresin de genes depender del balance entre stos. El factor S es inducido cuando la bacteria hace su transicin hacia la fase estacionaria de crecimiento, as como bajo otras condiciones de estrs. Otro factor sigma que es usado bajo condiciones de privacin de nitrgeno es 54, el cual es activado cuando el amonio est ausente en el medio. En estas condiciones, los genes correspondientes son encendidos para permitir la utilizacin de fuentes alternas de nitrgeno. Cada factor sigma causa que la RNA polimerasa inicie la transcripcin en un determinado promotor. Por anlisis de secuencia de estos promotores se describen las secuencias conservadas caractersticas de cada uno de estos promotores, reconocidos por los distintos factores sigma (Figuras 3.17 y 3.18). En resumen, los factores transcripcionales o factores sigma son los responsables de la unin y/o reconocimiento de la RNA polimerasa con la regin del promotor. Una vez unida la RNA polimerasa e iniciada la trascripcin el factor sigma modifica su estructura y entonces se libera de la regin de unin con el DNA y favorece la formacin del complejo abierto para llevar a cabo la trascripcin.

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Figura 3.15. Puntos de interaccin de la RNA polimerasa en la regin del promotor de la transcripcin. Modificaciones que pueden o no alterar la interaccin RNA polimerasa-promotor (arriba). Puntos de interaccin de las subunidades y de la RNA polimerasa sobre el DNA y RNA (abajo).

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Figura 3.16. La funcin de la secuencia -35 es proveer la seal para el reconocimiento por la RNA polimerasa, mientras que la secuencia -10 permite la conversin del complejo cerrado al abierto.

Figura 3.17. La sustitucin de los factores sigma puede controlar la iniciacin de la transcripcin. 77

Figura 3.18. Caractersticas de las regiones promotoras reconocidas por los factores sigma comnmente encontrados en procariontes.

3.6.5. Terminacin de la transcripcin Una vez que la RNA polimerasa ha comenzado la transcripcin, la enzima se mueve a lo largo del DNA templado, sintetizando el RNA, esto hasta encontrarse con una secuencia de terminacin o tambin conocido como terminador de la transcripcin. En este punto la enzima detiene la adicin de nucletidos a la cadena creciente de RNA, libera el producto sintetizado y se disocia del DNA templado. La terminacin requiere que todos los puentes de hidrgeno formados entre el hibrido DNA-RNA sean destruidos, para despus formarse nuevamente la cadena dplex de DNA. En bacterias o en fagos se han identificado secuencias que son necesitadas para la reaccin de terminacin (in vitro o in vivo). Las secuencias de terminacin de procariontes no presentan semejanzas o similitud entre ellas. En E. coli los terminadores son distinguidos de acuerdo a si la RNA polimerasa requiere algn factor adicional para realizar la terminacin in vitro: 1. El ncleo de la polimerasa puede terminar en ciertos sitios en la ausencia de cualesquier factor. Estos sitios son llamados terminadores intrnsecos. 2. Los terminadores dependientes de Rho son definidos por la necesidad de adicionar la protena Rho a la reaccin in vitro; Adems en condiciones in vivo las mutaciones en el gen que codifica para esta protena, afectan la terminacin de la transcripcin.

3.6.5.1. Terminadores intrnsecos Los terminadores intrnsecos tienen dos caractersticas principales; la formacin de una estructura secundaria tipo asa y una regin rica en residuos de uracilo (U) cercanas a la regin de terminacin de la estructura. El asa 78

usualmente contiene regiones ricas en G-C (guanina-citosina) cercanas a la base del brazo del asa. La distancia tpica entre el asa y la regin rica en U es de 7 a 9 bases (Figura 3.19).

Figura 3.19. Terminadores intrnsecos. Este tipo de terminadores constan de una secuencia palindrmica que comprende entre 7 y 20 pares de bases, formando una horquilla. Dos regiones son importantes, una rica en GuaninaCitosina (G-C) y la otra en Uracilos (U). Cuando se forma una estructura de terminacin la RNA polimerasa se detiene en el asa o terminador formado en el RNA y la regin rica en uracilos desestabiliza el hibrido DNA-RNA, favoreciendo el desacoplamiento del complejo ternario abierto. Una vez ocurrido lo anterior, la RNA polimerasa, el RNA y el DNA son liberados y en consecuencia la transcripcin finaliza (Figura 3.20).

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Figura 3.20. La terminacin de la transcripcin ocurre cuando se forma la estructura del terminador, liberando la RNA polimerasa, el RNA transcrito y el DNA. Un terminador de transcripcin que ha sido ampliamente estudiado es el

tI, que se encuentra en el genoma del fago lambda. Este virus se reproduce en
E. coli y bacterias relacionadas. Mediante estudios de eliminaciones de la regin del terminador, tanto del extremo 5 como 3 han permitido determinar la importancia tanto de la regin de uridinas como de la estructura del tallo de RNA. Adems, se ha determinado que regiones hacia el extremo 5 de la estructura de horquilla tambin tienen una influencia en la terminacin de la transcripcin, posiblemente por la formacin de estructuras secundarias alternativas. En la figura 3.21 se resumen las eliminaciones generadas y los porcentajes de terminacin relativos que se obtienen mediante un ensayo de transcritos. 80

Figura 3.21. Eliminaciones en la regin del terminador tI y eficiencias de terminacin. Las flechas que se encuentran sobre la secuencia del DNA muestran el sitio donde terminan las eliminaciones 5, mientras que las flechas que estn debajo de la secuencia del DNA indican los extremos de las eliminaciones 3. En la figura superior las eliminaciones se ubican con relacin a la prediccin de la estructura secundaria que forma la horquilla en el RNA. Los asteriscos indican los diferentes sitios de la terminacin de los transcritos. La eficiencia de terminacin de la transcripcin se determin por anlisis de transcritos y se indica en porcentaje entre parntesis. 81

3.6.5.2. Terminadores dependientes de protenas Rho El factor Rho es una protena esencial en E. coli, su funcin se relaciona solamente con la terminacin de la transcripcin en genes especficos o dependientes de este tipo de terminadores (cerca de la mitad de los genes en E. coli son terminadores Rho-dependientes. El factor Rho es un hexmero de subunidades idnticas de 275 kDa de masa molecular. La subunidad posee un dominio de unin al RNA y uno para la hidrlisis de ATP, lo que lo hace un miembro de las helicasas dependientes de ATP. La secuencia que reconoce el factor Rho es de 50-90 bases, encontrada en direccin arriba del sitio de terminacin. Se caracteriza por unirse a una regin del RNA rica en citosinas (C) y pobre en residuos de guanina (G). Los factores Rho actan de manera progresiva sobre la cadena de RNA, siendo la actividad de helicasa clave en su funcin, para la cual la energa es proporcionada por la hidrlisis del ATP. El sitio de unin inicial para el factor se encuentra aproximadamente a 70 nucletidos de la regin arriba del sitio donde se localiza el terminador. El factor Rho se une al RNA y entonces usa su actividad de ATPasa para proporcionar la energa necesaria para desplazarse a lo largo del RNA hasta encontrar la regin donde se forma el hibrido DNA-RNA. El mecanismo de cmo el factor Rho captura a la RNA polimerasa sugiere que ste simplemente se mueve a lo largo del transcrito de RNA ms rpidamente que la RNA polimerasa sobre el DNA templado. La enzima en consecuencia se detiene (pausa) cuando sta reconoce un terminador y la terminacin ocurre si el factor Rho se adiciona a este evento. El pausado de la RNA polimerasa es por lo tanto importante en los terminadores dependientes de Rho. Esta habilidad sugiere que Rho puede directamente tener acceso al hibrido DNA-RNA localizado en la burbuja de la transcripcin y causar su desdoblamiento. An se desconoce si esta accin es suficiente para liberar el transcrito o si el factor Rho tambin interacta con la RNA polimerasa para favorecer la liberacin del RNA (Figura 3.22).

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Figura 3.22. El factor de terminacin Rho persigue a la RNA polimerasa a lo largo del RNA y puede causar la terminacin cuando ste captura a la enzima que se encuentra detenida en un terminador dependiente de Rho.

3.7. RNA polimerasas de eucariontes La transcripcin del DNA se lleva a cabo por RNA polimerasas. Mientras que slo una enzima es responsable de este trabajo en eubacterias y arqueas, los eucariontes tienen tres RNA polimerasas que comparten la tarea de transcribir los genes nucleares: a) La RNA polimerasa I es la responsable de sintetizar la mayor parte de los precursores del RNA ribosomal (18S, 5.8S y 28S); b) La RNA polimerasa II sintetiza el RNA mensajero y la mayora de los 83

RNA nucleares pequeos (snRNA); c) La RNA polimerasa III sintetiza una variedad de otros RNAs incluyendo RNAt, 5S RNAr y U6 snRNA. Todas las RNA polimerasas son complejos de protenas, con dos subunidades grandes y un arreglo complejo de pequeos componentes cuyos tamaos varan de 10 a 90 kDa. Existe una fuerte conservacin filogentica de las dos subunidades grandes y parece ser que las polimerasas I, II y III han evolucionado de una RNA polimerasa procaritica. Las subunidades B220 y C160 de las polimerasas II y III, respectivamente, son ms similares entre s con respecto a la subunidad grande A190 de la polimerasa I, lo que sugiere que las polimerasas II y III tienen un precursor comn ms cercano.

3.8. Regiones promotoras de eucariontes Los promotores de genes nucleares reconocidos por la RNA polimerasa II contienen combinaciones de secuencias de DNA, las cuales incluyen a) elementos ncleo o basales del promotor y b) elementos proximales del promotor. Existen elementos que se encuentran ms alejados del promotor y que influencian su actividad, pero no se consideran propiamente parte del promotor y se les conoce como enhancers o potenciadores. El ncleo del promotor es definido generalmente como la combinacin mnima de secuencias de DNA (tpicamente alrededor de 40 bases) que son suficientes para la iniciacin precisa de la transcripcin por parte de la RNA polimerasa II y los factores basales. Los elementos ncleo del promotor mejor caracterizados son el elemento o caja TATA, localizado entre 25 y 30 bases hacia atrs (5) del sitio de inicio de la transcripcin, con una secuencia consenso TATAa/tAa/t y el elemento iniciador (INR), centrado en el sitio de inicio de la transcripcin y rico en pirimidinas, aunque su secuencia precisa es variable (YYANa/tYY). La caja TATA est presente en la mayora de los promotores y puede combinarse con el elemento iniciador. En otros promotores en que no hay caja TATA el elemento iniciador generalmente est presente, aunque puede faltar. Con base en estas secuencias los promotores pueden ser TATA+Inr+ (con caja TATA y con elemento iniciador), TATA+Inr- (con caja TATA y sin elemento iniciador), TATA-Inr+ (sin caja y con elemento iniciador), TATA-Inr- (sin caja TATA y sin elemento iniciador). Los promotores con caja TATA presentan elementos iniciadores dbiles, ya que la eliminacin de la caja TATA ocasiona la prdida de la actividad del promotor y en estos casos el elemento iniciador tiene la funcin de precisar el sitio correcto de inicio del transcrito. Los promotores sin caja TATA tienen elementos iniciadores fuertes y permiten por s solos el inicio de la transcripcin. Aquellos genes que no tienen una buena secuencia TATA o un elemento iniciador son frecuentemente expresados ineficientemente, probablemente debido a que el reclutamiento de la RNA polimerasa es dbil. Otro elemento presente en el ncleo del promotor es el DPE (downstream promoter element) o elemento que se encuentra hacia abajo del ncleo del promotor y que se ha reportado en algunos promotores de Drosophila y humanos, con una secuencia consenso a/gGa/tCGTG ubicada 30 nucletidos hacia abajo (3) del sitio de 84

inicio de transcripcin. Sin embargo, en un estudio de 205 promotores de Drosophila se encontr que existe una mayor flexibilidad en la secuencia DPE y que es tan comn como la caja TATA. Se ha descrito un nuevo elemento presente en la regin ncleo del promotor, BRE (elemento reconocido por el factor TFIIB), con la secuencia consenso G/C-G/C-G/A-CGCC, el cual probablemente juega un papel en determinar la fuerza del promotor. En la figura 3.23 se esquematizan los principales elementos de secuencia (cis) reconocidos por la RNA polimerasa II.

Figura 3.23. Elementos cis reconocidos por la RNA polimerasa II y los factores generales de transcripcin en eucariontes.

3.9. Factores generales de transcripcin eucariticos No es posible iniciar la transcripcin in vitro cuando se utiliza slo la RNA polimerasa II purificada y en este caso es necesario adicionar componentes proteicos aislados de extractos celulares crudos. Este hecho demuestra que se requieren factores de transcripcin, definidos como cualquier protena que es necesaria para la iniciacin de la transcripcin, pero que no es parte propiamente de la RNA polimerasa. El estudio de la transcripcin in vitro ha 85

permitido encontrar los componentes mnimos necesarios para este proceso, que corresponde a la transcripcin basal. Los factores necesarios adicionales a la RNA polimerasa se han definido como factores generales de transcripcin (TAFs) y se han nombrado de acuerdo al orden en que fueron aislados: TIFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF y TFIIH. Los factores y el proceso de iniciacin de la transcripcin han sido descritos por Orphanides et al., (1996) como sigue: a) Reconocimiento de los elementos del ncleo del promotor por el factor TFIID; b) Reconocimiento del complejo TFIID-promotor por TFIIB; c) Reclutamiento de la RNA polimerasa y el factor TFIIF; d) Unin de TFIIE y TFIIH para completar el complejo de preiniciacin; e) Formacin de un complejo de iniciacin abierto, por la separacin de cadenas del DNA; f) Sntesis del primer enlace fosfodister en el transcrito naciente de RNAm; g) Liberacin de los contactos de la RNA polimerasa II y aclaramiento del promotor y h) Alargamiento del transcrito de RNA. TFIIA puede unirse al complejo en cualquier etapa despus de la unin de TFIID, estabilizando el complejo de iniciacin. Las figuras 3.24 y 3.25 ilustran el ensamblaje de la RNA polimerasa II y los factores generales de transcripcin a la regin promotora, as como el inicio de la transcripcin.

3.10. Procesamiento de RNAs mensajeros de eucariontes En el caso de los procariontes que no tienen membrana nuclear, las molculas de RNA que se transcriben de los genes, son inmediatamente traducidas por los ribosomas para sintetizar las protenas, sin embargo, en el caso de los eucariontes que s tienen membrana nuclear, los RNA transcritos a partir de los genes, deben ser transportados del ncleo al citoplasma, a travs de esta membrana. Adems, es importante sealar que a diferencia de las bacterias, los genes de los eucariontes contienen generalmente las estructuras llamadas intrones. Estas estructuras, que son tambin DNA, estn interrumpiendo las regiones del gene que codifican para la protena y que son llamadas exones. Como resultado de esta situacin al sintetizarse RNA a partir de un gene durante el proceso de transcripcin, la molcula de RNA resultante incluye tanto las regiones de los intrones como la de los exones. Hoy sabemos que las molculas de RNA que llevan intrones y exones, resultantes del proceso de transcripcin que se lleva a cabo en los ncleos de las clulas de los eucariontes, deben ser procesadas para dar lugar a las molculas de los RNA mensajeros maduras, ms pequeas, que son exportadas del ncleo de la clula al citoplasma, donde son luego traducidas en protenas (Figura 3.26).

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Figura 3.24. Orden de ensamblaje de los factores generales de transcripcin y la RNA polimerasa II en el promotor tpico de Adenovirus ML. El reconocimiento del promotor se lleva a cabo por la unin de TBP a la caja TATA. TBP funciona como parte del complejo TFIID y el resto del factor representa a los TAFs. TBP unido al DNA recluta a TFIIA y TFIIB, el cual proporciona una plataforma para que la polimerasa II unida al factor TFIIF se incorpore al complejo. TFIIE y TFIIH son reclutados al final mediante interacciones con la RNA polimerasa II. 87

Figura 3.25. Proceso de inicio de la transcripcin por la RNA polimerasa II en eucariontes.

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Figura 3.26. Diferencias en el flujo de la informacin gentica entre eucariontes y procariontes.

Luego que en el ncleo de la clula eucariota se transcribe un RNA, el RNA transcrito es extensamente modificado antes de ser exportado al citoplasma. Se le agrega 7-metilguanina (una base inusual) al extremo 5' del mRNA, formando lo que se conoce como cap o caperuza; y esto resulta esencial para el pegado del mRNA al ribosoma. Una cola de adeninas (tanto como 200 nucletidos conocido como poli-A) se agrega al extremo 3' del mRNA luego de la transcripcin. La funcin de esta "cola" de poli A es importante tanto en la estabilidad del RNA mensajero como en la interaccin con los ribosomas en la sntesis de protenas (Figura 3.27, 3.28, 3.29). Las modificaciones de un RNA mensajero se muestran en la figura 3.30 para el caso del gen de ovoalbmina.

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Figura 3.27. Modificacin del transcrito en los extremos 5 y 3 para formar un RNAm maduro.

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Figura 3.28. Mecanismo de edicin de mensajeros en eucariontes y modificacin postranscripcional. El procesamiento depende de secuencias consenso que limitan los bordes de exones e intrones, as como una secuencia en el intrn. Estas secuencias son reconocidas por complejos de RNA y protenas (U1, U2, U4, U5, U6) que en conjunto conforman lo que se conoce como el spliceosoma. En el proceso el intrn forma una estructura de lazo (lariat), que posteriormente se desprende y es degradado por la clula. 91

Figura 3.29. Mecanismo molecular de eliminacin de los intrones. 92

Figura 3.30. Procesamiento del RNA mensajero del gen de ovoalbmina de gallina. Las regiones con letras representan los intrones y los nmeros a los exones.

3.11. El cdigo gentico Las protenas son el otro tipo de molculas biolgicas informacionales que tenemos en nuestro organismo y ellas tienen la informacin que les permite realizar la mayor parte de las funciones y los trabajos celulares. El DNA es una molcula, que es el resultado de polimerizar (unir en forma de collar), varios millones de los cuatro diferentes nucletidos (A, G, C y T); las protenas tambin son polmeros biolgicos que estn constituidos por decenas o centenas de veinte tipos diferentes de monmeros llamados aminocidos. Por esta razn, no puede haber correspondencia de un aminocido por cada uno de los nucletidos que integran los genes y la consecuencia es que cada uno de los muchos aminocidos que integran una protena debe estar codificado por un grupo de nucletidos.

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El cdigo gentico fue descifrado por Marshall Nirenberg y Heinrich Matthaei (de los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos), 10 aos despus que Watson y Crick descifraran el misterio de la estructura del DNA. Nirenberg descubri que el RNAm, independientemente del organismo de donde proviene, puede iniciar la sntesis proteica cuando se lo mezcla con el contenido del extracto de Escherichia coli. Adicionando poli-U (un RNAm sinttico) a cada uno de 20 tubos de ensayo (cada uno de los cuales tena un aminocido diferente) Nirenberg y Matthaei determinaron que el triplete UUU, el nico posible en el poli-U, codificaba para el aminocido fenilalanina (Figura 3.31). Asimismo un RNAm artificial compuesto por bases A y C alternando, codifica alternativamente para histidina y treonina. (Figura 3.31). Gradualmente se fue confeccionando una lista completa del cdigo gentico, a lo cual contribuyeron Francis Crick y Severo Ochoa.

Figura 3.31. Sntesis in Vitro de polipptidos a partir de RNAs sintticos.

Al descifrar el cdigo gentico se comprob, de facto, que cada aminocido est codificado por un grupo de tres nucletidos, al que se le denomina triplete o codn. Se determin tambin que en varios casos, ms de un triplete codifica para un mismo aminocido y que algunos tripletes codifican para seales de terminacin o iniciacin para la sntesis proteica. Este cdigo gentico es universal ya que es el mismo para todos los seres vivos y se muestra en la figura 3.32. 94

Este cdigo es el que permite a la clula de cualquier organismo traducir en protenas la informacin gentica almacenada en los genes que se localizan en el DNA, mediante la lectura, en bloques de tres nucletidos de la informacin gentica presente en el RNA mensajero. Las protenas son polmeros o grandes collares biolgicos de decenas o centenas de aminocidos, en las cuales cada aminocido (o cuenta del collar) es un monmero. Son veinte diferentes aminocidos con los que cuenta la clula para integrar las ms de cien mil protenas del cuerpo humano. Se puede hacer una analoga entre letras del alfabeto que seran los aminocidos, y las palabras que seran las protenas; el orden de las letras es responsable del significado de las palabras, de la misma manera que el orden de los aminocidos en la protena es responsable de su significado o funcin biolgica. Cada uno de los veinte diferentes aminocidos est codificado al menos por un codn al nivel del RNA mensajero (figura 3.33).

Figura 3.32. El cdigo gentico. Establece la relacin de grupos de 3 bases en el DNA (o RNA) con el aminocido correspondiente para el cual codifica. En la figura los codones representan al RNA mensajero. La informacin gentica contenida en cada molcula de RNAm, es traducida en molculas de protenas a travs de un proceso enzimtico que se realiza en los organelos celulares llamados ribosomas. En este mecanismo biosinttico llamado traduccin, participan principalmente tres tipos distintos de RNA: el RNA ribosomal (RNAr), que junto con varias protenas forman los ribosomas; el RNAm, que acarrea la informacin gentica contenida en 95

segmentos especficos (genes) del DNA y finalmente, los RNAs llamados de transferencia (RNAt), que sirven como adaptadores especficos para cada aminocido, durante el ordenamiento lineal de stos en la sntesis de protenas, conforme la secuencia del RNAm . La sntesis de protenas, que de hecho es la traduccin de la secuencia de nucletidos presentes en el RNAm, se lleva cabo tambin en direccin 5' a 3', mediante la polimerizacin de aminocidos en protenas, a nivel de los ribosomas en donde la secuencia del RNAm, se lee de tres en tres nucletidos de acuerdo con el cdigo gentico, incorporando en cada paso de lectura un aminocido de la protena. Este proceso es similar al que ocurre al pasar una cinta de un casete musical en una grabadora, en donde la informacin para cada cancin, que est contenida en un segmento de esta cinta, es traducida en meloda cuando esta seccin de la cinta del casete pasa a travs de las cabezas lectoras de la grabadora. En el caso de la clula viva, la cinta corresponde al RNA mensajero que lleva la informacin y los ribosomas corresponden a las cabezas de la grabadora que leen la cinta y transforma (traduce) la informacin en protenas, las cuales seran en analoga, las melodas o canciones biolgicas. El RNA mensajero es, pues, una molcula formada por una secuencia de nucletidos. Esta informacin es traducida en protenas al ser ledos estos nucletidos, de tres en tres, por los ribosomas. En un cdigo de cuatro letras genticas (AGCU) organizado en tripletes, puede haber 64 diferentes tripletes (figura 3.32). Como puede verse, hay aminocidos que estn codificados hasta por seis diferentes tripletes, como leucina (leu), y hay aminocidos como triptfano (trp), que slo est codificado por un solo triplete (en este caso UGG). Existe un codn AUG, que codifica para metionina y que es el codn o triplete, con el que se inicia la sntesis de la mayor parte de las protenas; existen tambin tres codones UGA, UAA y UAG, que son tripletes que al leerse en los ribosomas son responsables de que finalice el proceso de traduccin; esto es, se termina en este punto la sntesis de una molcula de protenas y sta se libera de los ribosomas para ser utilizada por la clula de acuerdo con su funcin biolgica.

3.12. Los Ribosomas Los ribosomas son los organelos de la clula donde se sintetizan las protenas. Los ribosomas en bacterias estn formados por una subunidad pequea (30S) y una grande (50S), el RNAr difiere en cada uno de ellos. Las unidades S se refieren a la sedimentacin en gradientes de densidad. La subunidad 30S tiene un RNAr 16S y 21 protenas diferentes. La subunidad 50S consiste en RNAr 23S y 5S y 34 protenas diferentes. La subunidad pequea tiene el sitio para que se pegue el RNAm. Tiene un papel crucial en la decodificacin del RNA pues monitorea el apareamiento de bases entre el codn del RNAm y el anticodn de RNAt. Tambin trabaja con la subunidad 50S en el proceso denominado translocacin (proceso por el cual el RNAt 96

asociado al RNAm se mueve un codn). La subunidad grande junto con la pequea, tienen tres sitios para el RNAt y catalizan la formacin de la unin peptdica. La Figura 3.33 muestra la estructura molecular de un ribosoma y los sitios en los que los RNA transportadores se pueden ubicar.

Figura 3.33. Estructura de un ribosoma. En la parte izquierda se muestra la estructura molecular de un ribosoma, la subunidad ribosomal pequea (oscura) est unida a la subunidad ribosomal grande (clara). Existen 3 sitios donde los RNAt se pueden acomodar en el ribosoma y se esquematizan en el dibujo de la derecha. Se indica tambin el sitio de unin al RNA mensajero.

3.13. RNA de transferencia (RNAt). Son los ms pequeos y con nmero mayor de bases modificadas, tiene entre 73 y 93 bases y de 7 a 15 bases modificadas por molcula. Durante la sntesis de una protena, los aminocidos se van aadiendo en el orden codificado en el RNAm. Cada aminocido se encuentra unido covalentemente al extremo 3 de una molcula especfica de RNAt, por lo que debe haber cuando menos un RNAt diferente y especfico para cada aminocido. En E. coli hay cerca de 60 RNAt. Los RNAt tienen una serie de caractersticas comunes que hacen que tengan una estructura secundaria definida. De manera simplificada se representa como un trbol con 4 regiones de doble hlice y 4 asas de cadena sencilla. En todos los RNAt, el extremo 5 tiene un fosfato, mientras que el 3 97

termina en CCA. En una asa se encuentra una secuencia de tres bases denominada anticodn, la cual interacta de manera antiparalela y complementaria (A = U; C G) con el codn correspondiente del RNAm. (Figura 3.34).

Figura 3.34. Estructura general de un RNA transportador. En la parte izquierda se muestra la estructura secundaria y en la parte derecha la estructura tridimensional. El brazo aceptor es el que une el aminocido. El brazo del anticodn reconoce el codn o triplete en el RNA mensajero.

La unin del aminocido apropiado al RNAt est controlado por enzimas aminoacil-RNAt sintetasas, de las cuales existe al menos una para cada aminocido en las clulas. La energa para la unin del aminocido al RNAt proviene de la conversin de ATP (adenosn-trifosfato) a AMP (adenosnmonofosfato). Una vez que el aminocido se une a su RNA transportador ste ahora seleccionar su codn en el RNA mensajero. El resultado neto es que al final un aminocido es seleccionado por su codn (Figura 3.35).

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Figura 3.35. Unin del aminocido fenilalanina a su RNA transportador, por parte de la aminoacil tRNA sintetasa especfica. El RNA transportador unido a la fenilalanina reconoce el codn UUU en el RNA mensajero.

3.14. La traduccin y sntesis de protenas En la sntesis de protenas el RNA mensajero (RNAm) es el intermediario en la sntesis de protenas. El RNA mensajero al ser copia del DNA, lleva la informacin gentica de los genes hacia los ribosomas, donde sta es traducida en protena. Las cadenas polipeptdicas o protenas, son sintetizadas cuando los ribosomas se mueven leyendo sobre las molculas de RNAm, donde el extremo 5' del RNAm es ledo o traducido primero (Figura 3.36).

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Figura 3.36. Ribosomas traduciendo simultneamente en el RNA mensajero. Las protenas van plegndose conforme el crecimiento de la cadena de aminocidos se lleva a cabo. El RNA mensajero se lee a partir del extremo 5.

3.14.1. Complejo de iniciacin en bacterias El inicio de la sntesis de protenas en bacterias ocurre por el ensamblaje del RNA mensajero, la subunidad pequea ribosomal y el RNA transportador que lleva el aminocido metionina formilado. La subunidad 30S se une a los factores IF3 e IF1 y posteriormente se les une un factor IF2 con GTP. El RNA transportador con formilmetionina se une al codn AUG, para que posteriormente la subunidad 50S se una y quede el complejo de iniciacin ensamblado (Figura 3.37).

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Figura 3.37. Ensamblaje del complejo de iniciacin en bacterias.

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3.14.2. Complejo de iniciacin en eucariontes Hershey y Merrick (2000) han descrito de manera general el ensamblaje del ribosoma completo 80S de eucariontes al RNA mensajero, para iniciar la sntesis de protenas y consiste en el siguiente modelo: a) La unin del factor eIF2 forma un complejo ternario con GTP y el iniciador Met-tRNAi, b) La asociacin del complejo ternario con la subunidad ribosomal 40S y otros factores de iniciacin, incluyendo eIF1, eIF1A y eIFI3, forman el complejo de preiniciacin 43S, c) La unin del complejo 43S al extremo 5 al RNA mensajero ocurre por la interaccin con protenas del complejo eIF4F (previamente unido al RNAm) y se forma otro complejo conocido como 48S d) La subunidad ribosomal con el conjunto de factores se mueve a travs del RNAm en la direccin 5 a 3 hasta que encuentra el codn AUG en un contexto favorable e) Los factores de iniciacin asociados a la subunidad ribosomal pequea son liberados en un proceso mediado por el factor eIF5, el cual estimula la hidrlisis de GTP por eIF2 f) La liberacin de factores de iniciacin permite la unin de la subunidad 60S y el inicio de la fase de alargamiento en la sntesis de protenas. En la figura 3.38 se presenta un modelo del inicio de la traduccin, considerando los diferentes factores. Ntese que existe un barrido de la subunidad pequea asociada al RNA transportador con metionina y otros factores, desde el extremo del RNA mensajero hasta que se encuentra con un codn AUG en un contexto adecuado. Entonces se une la subunidad ribosomal 60S para formar el ribosoma completo con el RNA transportador en el sitio P y se liberan los factores de iniciacin.

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Figura 3.38. Iniciacin de traduccin en eucariontes. Los factores de iniciacin aparecen en crculos, con el nombre respectivo obviando las letras eIF en todos los casos para mayor simplicidad. Las subunidades ribosomales aparecen tambin en crculos y el Met-RNAti y el RNAm son evidentes. 103

3.14.3. Alargamiento de las cadenas de protenas Despus del ensamblaje del complejo de iniciacin de la traduccin, tanto en bacterias como en eucariontes, el proceso de alargamiento de las cadenas de protenas es muy similar en ambos tipos de organismos. Los RNAt que llegan al ribosoma entran por el sitio A (aminoacil) con el correspondiente aminocido, que identifica el codn correspondiente del RNA mensajero. Entonces el RNAt que se encuentra en el sitio P (peptidil) transfiere su cadena de aminocidos al nuevo RNAt, por lo que la cadena crece en un aminocido. Esto es posible porque el ribosoma cataliza una reaccin haciendo reaccionar el grupo amino del aminocido que est unido al RNAt del sitio A, con el grupo carboxilo del aminocido que est unido al RNAt del sitio P. Entonces la cadena polipeptdica queda unida al RNAt del sitio A y el RNAt del sitio P se queda sin aminocidos. A esta actividad cataltica se le denomina peptidil transferasa. Posteriormente el ribosoma se mueve para que en el sitio A quede libre un codn del RNA mensajero, por lo que el RNAt del sitio P pasa al sitio E, e inmediatamente sale del ribosoma. Ahora el RNA transportador que estaba en el sitio A queda en el sitio P. El ciclo se repite cuando llega un nuevo RNAt con un aminocido y entra al sitio A reconociendo el nuevo codn. (Figura 3.39). La terminacin de la traduccin ocurre cuando en el sitio A se encuentra uno de los siguientes codones en el RNA mensajero: UUA, UAG o UGA. No existe ningn RNAt que reconozca alguno de estos codones y en cambio existe una protena conocida como factor de liberacin, que es similar en tamao y forma a los RNAt (Figura 3.40). La entrada del factor de liberacin al sitio A ocasiona una desestabilizacin del complejo ribosomal, la protena y el RNA mensajero, ocasionado la separacin (Figura 3.41).

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Figura 3.39. Alargamiento de la cadena de protena. Se repiten ciclos sucesivos del paso 1 al paso 3 y luego nuevamente al paso 1. Se omite la intervencin de algunos factores necesarios tanto para la entrada del aminoaciltRNA al sitio A como para el movimiento del ribosoma.

Figura 3.40. Estructura molecular del factor de liberacin (izquierda) y de un RNA transportador (derecha). 105

Figura 3.41. Terminacin de la sntesis de protenas. El factor de liberacin entra al sitio A donde se encuentra el codn UAG. Hay una hidrlisis para separar la protena del RNAt y el ribosoma se separa es sus subunidades liberando el RNA mensajero. 106

4. REGULACIN DE LA EXPRESIN DE LOS GENES

Simultneamente a los trabajos encaminados a determinar los mecanismos involucrados en la traduccin del RNA mensajero en protenas, se inician esfuerzos dirigidos a comprender la regulacin de la expresin de los genes, es decir, mediante qu sensores y mecanismos las clulas deciden expresar o transcribir un gene particular, para que as pueda sintetizarse la protena codificada por ese gene. Los mecanismos que regulan la expresin de la informacin gentica de una bacteria permiten a sta adaptarse con rapidez a los cambios del medio ambiente. Al evolucionar los organismos y diferenciarse las clulas, aparecieron mecanismos reguladores ms sofisticados que permiten a los organismos multicelulares ms complejos disponer de un conjunto ms amplio de respuestas diferentes con miras a la supervivencia. En principio, los genes funcionan, se expresan o se transcriben, nicamente cuando el organismo lo requiere, proveyendo as el producto proteico para el cual codifican y slo en aquellas clulas que lo requieren. En general, hay dos tipos de regulacin gentica: las llamadas positiva y negativa; cuando la expresin de los genes es aumentada cuantitativamente, la regulacin es positiva, en tanto que si dicha expresin es disminuida, entonces la regulacin es negativa. Los elementos que participan en el control de ambos tipos de regulacin son protenas y RNA que reconocen secuencias especficas en el DNA, en regiones cercanas a los genes que regulan. Adems, en algunos casos, las secuencias de nucletidos en el DNA son capaces de modular por s mismas la expresin de los genes. Esta etapa de la gentica se inicia en 1960, gracias a los esfuerzos de los investigadores franceses Jacob y Monod, los cuales son complementados por Gilbert y Ptashne, quienes fueron responsables del aislamiento de los primeros represores genticos. Estos investigadores demostraron que los reguladores eran protenas. El aislamiento y caracterizacin de estos primeros represores genticos permiti demostrar su modo de accin, lo cual, como se ha sealado, implica su asociacin o unin con el DNA, en regiones especficas de los genes, llamadas regiones reguladoras, las cuales se localizan normalmente en uno o ambos extremos de los genes.

4.1. Transcripcin y elementos de control gentico En el DNA hay regiones especficas que regulan la expresin de los genes, es decir, que regulan y permiten la sntesis del RNA a partir de ese gene. Una de estas regiones es la del promotor. El promotor (descrito en el captulo anterior) es una regin de DNA localizada en uno de los extremos del gene que es reconocida por la enzima RNA polimerasa para, a partir de ah, iniciar la sntesis de la molcula de RNA, la cual posteriormente es traducida en protena. La regin de los promotores en los organismos procariontes es un 107

fragmento de aproximadamente veinticinco pares de nucletidos que contiene dos conjuntos denominados regiones de -10 y -35. Estas regiones son altamente conservadas en los promotores bacterianos. La sntesis de RNAm inicia en bacterias en la posicin +1, es decir, 10 pares de nucletidos despus de la regin -10. Cuando ocurren mutaciones en las regiones -10 o -35, la enzima RNA polimerasa ya no es capaz de reconocer, con la misma eficiencia, esta regin del promotor; en esos casos puede cancelarse la sntesis de RNAm. Los mecanismos particulares de regulacin de la expresin gentica varan de una especie a otra. Hasta la fecha, estos mecanismos han sido estudiados, en forma detallada en varios organismos, aunque es en la bacteria Escherichia coli en la que mejor se conocen, por ser ste el microorganismo mejor caracterizado. El conocimiento de los mecanismos de regulacin bacterianos ha servido como base para estudiar la compleja regulacin de la expresin gentica en organismos eucariontes, incluyendo al hombre. Adems del promotor existen otras secuencias que permiten regular la expresin de los genes, y protenas conocidas como activadores y represores. En las figuras 4.1 y 4.2 se esquematizan las regulaciones positivas y negativas y la participacin de secuencias y protenas en la regulacin.

Figura 4.1. Regulacin negativa. En el control negativo una protena represora se une a un sitio llamado operador, el cual se encuentra cercano a la secuencia del promotor. El resultado neto es que la protena represora impide que la RNA polimerasa se una al promotor bloquendose de esta manera la transcripcin.

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Figura 4.2. Regulacin positiva. En el control positivo la polimerasa por si sola no se puede unir al promotor y requiere de factores que se unen cerca del promotor y que interaccionan con la RNA polimerasa permitiendo la unin de esta enzima al promotor. El resultado neto es que se enciende la transcripcin.

4.2. Regulacin de la expresin gentica en procariontes La expresin o transcripcin de los genes de organismos procariontes como las bacterias puede estar o no regulada. Los genes cuya expresin no est regulada se denominan genes constitutivos; los genes que responden a uno o varios mecanismos de regulacin son llamados inducibles. Los genes inducibles han sido objeto de una extensa investigacin, ya que en ellos se encuentran presentes mecanismos de regulacin del fenmeno de la transcripcin. Una gran parte de los genes estudiados en bacterias forman agrupamientos, en donde cada uno de los genes codifica para protenas funcionalmente relacionadas, y en muchos casos estos genes se transcriben en una sola molcula de RNAm. El grupo de genes con funciones relacionadas que es regulado y transcrito como una unidad en una sola molcula de RNAm, se denomina opern y normalmente las protenas codificadas por los genes de un opern son enzimas que intervienen en la misma va metablica. Los RNAm que se sintetizan a partir de un opern se denominan policistrnicos o polignicos; este trmino indica que una molcula de un RNA mensajero es portadora de la informacin de varios genes que especifican varias protenas, cada una de las cuales est codificada por un solo gene. Sin embargo, no todos los genes que son controlados como una unidad estn agrupados en operones. Por ejemplo, los ocho genes que codifican las enzimas de la va de biosntesis del aminocido arginina, se encuentran dispersos en el cromosoma de Escherichia coli; no obstante, la expresin es regulada en forma coordinada. 109

Los genes que exhiben esta organizacin dispersa constituyen una unidad funcional que recibe el nombre de reguln. La expresin de los genes en organismos procariontes est regulada bsicamente a nivel de la sntesis o transcripcin del RNAm, por lo que existen diferentes tipos de mecanismos de control a este nivel, aunque no todos ellos estn presentes en la totalidad de los genes, operones y regulones. Se conocen los siguientes mecanismos especficos que hacen posible la regulacin gentica a nivel transcripcional: represin, induccin, activacin, represin catablica, terminacin, antiterminacin y atenuacin. Tambin se ejerce la regulacin de la expresin a nivel traduccional.

4.2.1. Control transcripcional En procariontes, el punto ms importante de regulacin de la transcripcin de cualquier gene es el comienzo de este proceso. El promotor es la secuencia de DNA donde se une la enzima RNA polimerasa, en la regin que precede a los genes, para iniciar la transcripcin del DNA. La frecuencia con la que se inicia el proceso de la transcripcin de un gene especfico es resultado, en buena medida, de la secuencia de las bases nucleotdicas que forman el promotor, ya que dicha secuencia puede variar. Un promotor clsico en la bacteria Escherichia coli consiste en dos conjuntos de nucletidos bien conservados: el primero de stos consta de seis pares de nucletidos y est colocado hacia arriba del sitio de iniciacin de la sntesis del RNAm (alrededor de la posicin -10). El segundo grupo tiene tambin seis pares de nucletidos y se encuentran generalmente a 17 o 18 nucletidos del primer grupo (alrededor de la posicin -35). Estas secuencias permiten el reconocimiento y la subsiguiente unin de la enzima RNA polimerasa al promotor para que, posteriormente, en la regin -10, se separen las dos hebras del DNA, y con ello se permita la iniciacin de la sntesis del RNAm. Generalmente, mientras menos se parezca un promotor a la llamada secuencia consenso, menor es la afinidad de la RNA polimerasa por esta secuencia y consecuentemente menos eficiente es el promotor para promover la transcripcin. La secuencia consenso de un promotor se determin teniendo en cuenta el nmero de veces que aparece un nucletido particular en una posicin especfica en todos los promotores con secuencia nucleotdica conocida. Adems del promotor, existen en su vecindad sitios donde otro tipo de molculas reguladoras pueden interaccionar con el DNA para modular el inicio de la transcripcin. As, la frecuencia con la que un gene u opern es transcrito depende no slo de la afinidad de la RNA polimerasa por el promotor, sino tambin del grado en que las regiones reguladoras y sus molculas receptoras restrinjan o favorezcan el paso de la RNA polimerasa hacia el gene estructural. Para modular la actividad de un promotor, la clula suele utilizar dos estrategias generales: la represin y la activacin (Regulacin negativa y positiva). En ambas, la actividad del promotor (principalmente su unin a la RNA polimerasa), es modulada por la unin de protenas especficas a regiones 110

cercanas (o traslapadas) al promotor. Estas protenas moduladoras estn, a su vez, codificadas por genes reguladores. En el caso de la represin, la protena moduladora llamada represor se une a la regin reguladora, llamada operador, que es normalmente una regin del DNA que incluye parte del promotor. En el operador se ejerce el control negativo, ya que la interaccin de una molcula del represor con el operador bloquea la transcripcin del gene al impedir que la RNA polimerasa se una al promotor. (Figura 4.1) En contraste, mediante un gene activador y su producto, se ejerce el control positivo, ya que a travs de la interaccin de una molcula reguladora, llamada activador, con cierta regin del DNA, se propicia que inicie el fenmeno de la transcripcin. (Figura 4.2) El represor activo est constituido por una protena, codificada por un gene regulador, a la que se le une una molcula receptora. Dicha protena, que no despliega actividad de represor por s misma, recibe el nombre de aporrepresor, y la molcula receptora se denomina correpresor. La funcin del correpresor consiste en incrementar la afinidad del aporrepresor por los sitios de interaccin con el DNA (operadores), y su concentracin refleja adems las condiciones metablicas prevalecientes. Con este tipo de estrategias y elementos, un organismo puede apagar o prender la transcripcin o expresin de un gene u opern, como respuesta a cambios en su medio ambiente. El efecto contrario a la represin de la transcripcin es la induccin. Este proceso es mediado por otras molculas pequeas, los inductores, que a su vez se unen al represor disminuyendo su afinidad por el operador. De esta forma, la clula puede volver a iniciar la expresin de un sistema gentico. La represin y la induccin son mecanismos mediante los cuales se modula la expresin de los genes y las molculas efectoras (correpresores e inductores), estn cercanamente relacionadas o son productos de las vas metablicas que regulan algunos operones y genes que estn naturalmente reprimidos y slo son inducidos cuando las condiciones metablicas as lo demandan. Estos sistemas, denominados sistemas inducibles, suelen ser de carcter catablico y confieren al organismo la habilidad de adaptarse a cambios en la disponibilidad de nutrientes. Por lo general, las molculas pequeas que actan como receptores de las protenas reguladoras, son sustratos de las vas metablicas. En la figura 4.3 se muestra como el opern lac es regulado por un represor, el cual se inactiva cuando se combina con el carbohidrato lactosa, el cual acta como un inductor. El caso inverso son los operones o genes que se encuentran naturalmente inducidos y que slo se reprimen en caso de que sus productos no sean necesarios. Estos sistemas, que se denominan sistemas represibles son de carcter generalmente biosinttico, y capacitan al organismo para utilizar productos presentes en el medio ambiente en vez de tener que sintetizarlos de novo. Las molculas receptoras en estos sistemas suelen ser los productos finales de las vas biosintticas. Este mecanismo se ejemplifica en la figura 4.4 con el opern de triptfano. 111

Figura 4.3. Regulacin del opern de lactosa. El opern consiste de 3 genes estructurales cuya expresin est controlada por un promotor y un operador. El represor, codificado por otro gen, cuando se encuentra libre se une al operador e impide la transcripcin. La lactosa acta como un inductor al unirse al represor e inactivarlo, permitiendo as la transcripcin de los genes estructurales. Se dice que hay una regulacin negativa por induccin.

112

Figura 4.4. Regulacin del opern de triptfano. El opern consiste de 5 genes estructurales que codifican para enzimas que se encargan de la sntesis del aminocido triptfano. Los genes estructurales se regulan por un promotor (que une a la RNA polimerasa) y un operador (que une a un represor). El represor es codificado por un gen independiente y la protena represora cuando es sintetizada es inactiva y no se une al operador permitiendo la transcripcin (parte izquierda). Cuando el represor se une al triptfano ste activa al represor, lo que permite que se una al operador e impida la transcripcin (parte derecha). En este caso el opern es un sistema represible mediante el aminocido triptfano. En este caso se dice que hay una regulacin negativa por represin. Adems de los mecanismos en que intervienen operones o genes individuales, los sistemas procariontes tienen la capacidad de regular simultneamente varios genes u operones a travs de algunas molculas comunes. Los mecanismos individuales capacitan al organismo para responder con un elevado grado de especificidad, a las condiciones del ambiente. Los mecanismos de regulacin simultnea, por su parte, permiten al organismo coordinar grupos de respuestas. Una vez que la enzima RNA polimerasa se une al promotor de un gene, se inicia la transcripcin, sintetizndose RNAm, el cual es alargado con la adicin de nucletidos complementarios correspondientes a la secuencia del DNA. Una vez sintetizado ste es posteriormente traducido en los ribosomas para sintetizar protenas. Es relevante sealar que existen mecanismos adicionales que permiten modular la 113

transcripcin del RNAm. Entre estos mecanismos vale la pena sealar el llamado efecto de atenuacin el cual es un mecanismo que permite, al modular la estructura del RNAm, atenuar su lectura a nivel de los ribosomas.

4.2.2.

Control a nivel de la traduccin del RNA mensajero

Se ha sealado que los niveles de expresin de un gene estn determinados por la transcripcin de su RNAm y por la traduccin de ste en los ribosomas. La regulacin a nivel de la traduccin del RNA mensajero explica el porqu en muchos casos las enzimas codificadas por un mismo opern son sintetizadas en concentraciones diferentes. Lo anterior se debe a que la traduccin de ciertos RNAm polignicos puede comenzar no slo en el extremo 5' del mismo, sino adems en sitios internos del mensajero. La iniciacin de la traduccin del RNAm depende de la existencia de un grupo de nucletidos en el RNAm localizados en la regin anterior al codn de iniciacin. Esta secuencia se denomina sitio de unin ribosomal y su secuencia es complementaria al extremo 3' del RNA que constituye la subunidad pequea del ribosoma. En este punto las bases del RNA ribosomal y del RNAm se asocian, inicindose as la traduccin del mensajero. Existen protenas que modulan la unin del RNA mensajero a la subunidad pequea del ribosoma y por ello puede darse el efecto de una traduccin diferencial.

4.3.

Regulacin gentica en eucariontes

Indudablemente las clulas de organismos superiores tienen mecanismos de regulacin gentica que comparten elementos generales con las bacterias. Sin embargo, entre las clulas de organismos unicelulares y pluricelulares hay una diferencia importante: la diferenciacin morfolgica y funcional inherente a las clulas de organismos pluricelulares. Ello requiere de mecanismos de control preciso de la expresin gentica en las diferentes clulas del organismo, de modo que las clulas diferenciadas realicen sus funciones de manera adecuada. En las clulas de los eucariontes hay varios sistemas genticos encargados de transcribir la informacin del DNA en copias del RNAm; es decir, hay varios sistemas de RNA polimerasa. Por otro lado, el DNA se encuentra no slo en el ncleo sino tambin en mitocondrias y cloroplastos y adems, muchos de los genes de los eucariontes tienen intrones y exones, a diferencia de los procariontes que solo tienen exones. Sin embargo, se han descrito varios tipos de secuencias reguladoras en los organismos eucariontes en donde algunas de ellas guardan similitudes importantes con las regiones de regulacin de los procariontes, aunque tambin se han descrito otras que tienen caractersticas diferentes. 114

La regulacin de la transcripcin en eucariontes ocurre a dos niveles amplios, uno similar al que ocurre en bacterias, que se da por la unin de protenas a secuencias en el DNA y se permite al final la unin de la RNA polimerasa especfica para que proceda la transcripcin. El otro nivel amplio de regulacin precede al primero y tiene que ver con modificaciones del DNA e histonas, lo que se conoce como epigentica y ser considerado en una seccin posterior.

4.3.1. Regulacin de la transcripcin a nivel del DNA Como se mencion con anterioridad, los promotores eucariticos suelen presentar secuencias conservadas como la caja TATA, caja GC y otras, que determinan que protenas especficas se unan a estas secuencias. Estos mismos elementos pueden estar en regiones ms alejadas del promotor conocidas como enhancers o potenciadores y tienen como caracterstica el estimular la transcripcin a partir de los promotores aunque se encuentren alejados miles de bases y se encuentren en posiciones hacia delante o hacia atrs del gen que estimulan. La organizacin del promotor y enhancer del virus del simio 40 (SV40) se muestra en la figura 4.5. La habilidad de los enhancers de funcionar an cuando se encuentran separados por distancias largas sugiri que stos trabajaban por mecanismos diferentes a los promotores, sin embargo, se ha determinado que tambin funcionan mediante la unin de factores de transcripcin. Lo anterior es posible, ya que el plegado del DNA permite que los factores unidos a los enhancers puedan interaccionar con la RNA polimerasa o los factores generales de transcripcin (figura 4.6). El enhancer del gen de la cadena pesada de inmunoglobulina contiene al menos 9 elementos de secuencia distintos que sirven como sitios de unin de protenas (Figura 4.7).

Figura 4.5. El promotor y el enhancer de SV40. El promotor de SV40 tiene una caja TATA y seis cajas GC acomodadas en tres juegos de secuencias repetidas. Adicionalmente, la transcripcin eficiente requiere un enhancer ubicado hacia atrs (5) del promotor y consiste en dos repetidos de 72 pares de bases.

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Figura 4.6. Formacin de asas en el DNA y enhancers. Los factores de transcripcin unidos a los enhancers distantes son capaces de interaccionar con los factores generales de transcripcin que se unen al promotor, debido a que el DNA puede formar asas. No existe una diferencia fundamental entre la accin de los factores de transcripcin unidos al DNA en el promotor con los factores de transcripcin que se unen al enhancer.

Figura 4.7. Enhancer de inmunoglobulina. El enhancer de la cadena pesada de inmunoglobulina se extiende alrededor de 200 bases y contiene nueve elementos de secuencia funcionales (E, mE1-5, p, mB, and OCT), los cuales de manera conjunta estimulan la transcripcin en linfocitos B.

4.3.1.1. Protenas activadoras de transcripcin El aislamiento de protenas reguladoras de la transcripcin se ha basado en su unin a secuencias especficas ya sea de los promotores o de los enhancers, por la tcnica conocida como cambio de movilidad electrofortica. Las protenas ms estudiadas de este tipo son los activadores 116

transcripcionales. En la siguiente tabla se describen algunos activadores de transcripcin y las secuencias a las cuales se unen: Factor de transcripcin Sp1 (protena de especificidad 1) Protena de unin a enhancer (C/EBP) AP1 (Protena activadora 1) Protenas de unin a octmero (OCT-1 y OCT-2) Protena de unin a caja E (E12, E47, E2-2) Secuencia consenso de unin GGGCGG CCAAT TGACTCA ATGCAAAT CANNTG

Los activadores de transcripcin son el aspecto central en la regulacin de la expresin gentica, por lo que el entender sus mecanismos de accin es una de las tareas importantes de la biologa molecular. Los activadores transcripcionales como Sp1 se unen a secuencias del DNA y estimulan la transcripcin. Estos factores suelen tener dos dominios o regiones en la estructura de la protena: una regin que se une al DNA y otra que activa la transcripcin al actuar con los componentes de la maquinaria de transcripcin (figura 4.8).

Figura 4.8. Estructura de los activadores transcripcionales. Los activadores transcripcionales consisten de dos dominios o regiones independientes. El dominio de unin al DNA reconoce secuencias especficas del DNA y el dominio de activacin interacciona con componentes de la maquinaria de transcripcin.

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Los dominios de unin al DNA o motivos pueden ser de varios tipos, uno de ellos es el de dedos de zinc, que contienen los aminocidos cistena e histidina que pueden unir iones de zinc y formar estructuras plegadas a manera de dedos. Otros tipos de motivos son la hlice-vuelta-hlice, los cierres de leucina y la hlice-asa-hlice. Los dominios de activacin de la transcripcin suelen ser ricos en cargas negativas por la presencia de grupos cidos de los aminocidos aspartato y glutamato; otros son ricos en prolina y glutamina. Los dominios de activacin estimulan la transcripcin al interaccionar con los factores generales de la transcripcin como TFIIB o TFIID, facilitando la unin del complejo de transcripcin al promotor. Diferentes activadores de la transcripcin se pueden unir a diferentes TAFs de TFIID, proporcionando un mecanismo mediante el cual la accin combinada de factores mltiples puede estimular la transcripcin de manera sinergstica (Figura 4.9).

Figura 4.9. Accin sinergstica de los activadores transcripcionales. Los diferentes activadores transcripcionales pueden interaccionar con diferentes TAFs del factor general de transcripcin TFIID.

4.3.1.2.

Represores de la transcripcin

Al igual que los activadores transcripcionales, los represores pueden actuar al nivel de la transcripcin. Los represores pueden unirse al DNA e inhibir la transcripcin y en otros casos simplemente interfieren con la unin de otros factores de transcripcin al DNA (Figura 4.10A). Otros represores, como Krppel que se encuentra implicado en el desarrollo embrionario de Drosophila, contienen dominios funcionales especficos que inhiben la transcripcin a travs de interacciones protena-protena (Figura 4.10B). 118

Figura 4.10. Accin de represores eucariticos. A) Algunos represores bloquean la unin de los activadores a las secuencias reguladoras. B) Otros represores tienen dominios de represin que inhiben la transcripcin mediante la interaccin con factores generales de transcripcin.

4.3.2. Regulacin epigentica. La revolucin de la biologa molecular inici con el descubrimiento de los mecanismos para la replicacin, la transcripcin en RNA y la traduccin en protenas. La informacin para estos procesos primeramente se encontr en las secuencias del DNA, sin embargo, los organismos eucariontes han desarrollado formas adicionales de especificar la informacin y de heredarla. En los eucariontes el DNA se encuentra asociado a protenas bsicas llamadas histonas, formando en un primer orden de organizacin a los nucleosomas, la 119

unidad primaria repetitiva de la cromatina. En un principio se asumi que el empaquetamiento de la cromatina tena como propsito el formar un material empaquetado relativamente estable, pero ahora los nucleosomas son considerados como participantes dinmicos e instructivos en todos los procesos cromosmicos, incluyendo transcripcin, replicacin y reparacin del DNA. El trmino epigentica se refiere al control de la expresin gentica basado en la organizacin de la cromatina en vez de la secuencia primaria en el DNA. La cromatina se ha dividido histricamente en dos dominios distintos, heterocromatina y eucromatina. La heterocromatina se define por regiones del cromosoma que permanecen densamente teidas y altamente condensadas a travs del ciclo celular, mientras la eucromatina se encuentra descondensada en la interfase. La heterocromatina frecuentemente est asociada con telmeros y regiones pericntricas de los cromosomas y son ricas en secuencias repetitivas y transposones y presentan una baja densidad de genes. En contraste, las regiones eucromticas de los cromosomas son ricas en genes y arreglos de nucleosomas de manera irregular y espaciada, incluyendo regiones libres de nucleosomas. Existen varias maneras por las cuales la estructura de la cromatina puede ser modulada (Figura 4.11): a) La posicin de los nucleosomas puede ser reconfigurada por complejos remodeladores dependientes de ATP y pueden de manera temporal abrir y cerrar la cromatina para reacciones enzimticas especficas. b) La composicin de nucleosomas puede ser modificada reemplazando las histonas mayores o clsicas con variantes. c) Las modificaciones post-traduccionales de protenas histonas por acetilasas, desacetilasas y metiltransferasas pueden formar dominios cromosmicos localizados que pueden reclutar complejos diversos que se unen a la cromatina. d) La metilacin de citosinas por DNA metiltransferasas puede modular la estructura de la cromatina al reclutar complejos proteicos que se unen a DNA metilado. Existe una inter-relacin entre los mecanismos anteriores los cuales pueden actuar en concierto y definir un estado de la cromatina especfico.

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Figura 4.11. Propiedades dinmicas nucleosomas. a) Las histonas clsicas pueden ser reemplazadas por variantes de histonas como H3.3 y H2A.Z. b) Las colas de histonas pueden ser modificadas covalentemente; se muestra slo la acetilacin por simplicidad. c) El reposicionamiento de los nucleosomas ocasionado por complejos remodeladores de la cromatina permite la unin de factores reguladores, necesarios para que se inicie la transcripcin.

4.3.2.1. Complejos remodeladores dependientes de ATP Estos complejos facilitan el movimiento de las histonas con relacin al DNA, permitiendo la condensacin o descondensacin de la cromatina. Todos los eucariontes tienen al menos cinco familias de remodeladores de la cromatina: SWI/SNF, ISWI, NURD/Mi-2/CHD, INO80 y SWIR1. Las familias mejores estudiadas son SWI/SNF y ISWI, los cuales han permitido entender de manera considerable el proceso de la remodelacin. Algunas de las diferencias funcionales de estos complejos son las siguientes: a) Los complejos ISWI tienen papeles centrales en el ensamblaje de la cromatina, lo cual implica el ordenamiento y espaciado de los nucleosomas siguientes a la replicacin del DNA. Este ordenamiento y 121

espaciado permite mantener la estructura de la cromatina en estructuras de niveles de organizacin superior (Figura 4.12). b) El complejo SWI/SNF principalmente desordena y reorganiza el posicionamiento de los nucleosomas y generan nucleosomas con diferentes posiciones traduccionales a lo largo de la superficie del octmero (Figura 4.12), para promover la unin de factores de transcripcin y activar los genes. (Figuras 4.13). El complejo SWI/SNF se une de manera preferencial en las colas de histonas que tienen residuos acetilados.

Figura 4.12. Propiedades de deslizamiento de los complejos remodeladores SWI/SNF y ISWI. Los complejos remodeladores de la cromatina tienen propiedades contrastantes en el arreglo de los nucleosomas. SWI/SNF desordena las posiciones de los nucleosomas que inicialmente estn en un arreglo en fase. ISWI, tales como ACF y CHRAC, generan nucleosomas con una posicin uniforme (en fase). La remodelacin de la cromatina por los complejos SWI/SNF y otros que desordenan a los nucleosomas es un prerrequisito para que los factores de transcripcin se unan y se puedan ensamblar las RNA polimerasas a los promotores eucariticos. La manera en que los remodeladores de la cromatina ejercen su funcin implica una unin al nucleosoma en una posicin definida, un cambio conformacional en el remodelador, rompimiento de contactos de histona-DNA y el movimiento del DNA a manera de una ola.

122

Figura 4.13. Efecto de los complejos remodeladores de la cromatina. Los complejos remodeladores de la cromatina como SWI/SNF desplazan los nucleosomas y los ubican en otra posicin, lo que permite el acceso y unin de factores de transcripcin al DNA, para que posteriormente se d el ensamblaje de la RNA polimerasa.

4.3.2.2. Variantes de histonas Los nucleosomas estn construidos normalmente de las cuatro histonas clsicas (H2A, H2B, H3 y H4), sin embargo en los ltimos aos se han descrito variantes de estas formas cannicas, las cuales especializan la cromatina en regiones particulares. Las histonas clsicas y algunas de sus variantes encontradas se resumen en la siguiente tabla:

Protenas histonas H2A, H2B, H3 y H4 H2A.Z (Htz1) MacroH2A CenH3 H3.3 (H3.2 en plantas)

Propiedades Histonas clsicas que son codificadas por genes acoplados a la replicacin Variante de H2A que tiene un dominio de interaccin propio. Est en todos los eucariontes. Variante de H2A especfica de vertebrados, con un dominio carboxilo terminal globular. Es abundante en el cromosoma X inactivo de mamferos Es una forma centromrica de H3, caracterizada por colas variables del extremo amino Variante de H3. Reemplaza en algunos sitios a H3 y es depositada de manera independiente de la replicacin. Se relaciona con la presencia de eucromatina. 123

La variante H3.3 difiere de H3 en slo cuatro posiciones de aminocidos, y es depositada a travs de todo el ciclo celular, mientras que la histona clsica H3 es depositada estrictamente en la horquilla de replicacin. H3.3 es caracterstica de la eucromatina y reemplaza a H3 despus de la induccin transcripcional mediante un mecanismo que es independiente de la replicacin, por lo que se ha propuesto que H3.3 marca la cromatina activa. Se ha propuesto un modelo por Henikoff y colaboradores en el que durante la transcripcin algunos factores como HirA y FACT van reemplazando H3 por H3.3, lo cual se ha interpretado como una forma que facilita la movilizacin de nucleosomas durante la transcripcin. Esta forma, H3.3 puede modificarse covalentemente de una forma ms enriquecida para que se active la transcripcin (ver siguiente seccin), lo que puede facilitar el desenrrollamiento y movilizacin de los nucleosomas por los complejos remodeladores. De esta manera, H3.3 proporciona un mecanismo dinmico para la activacin rpida de la cromatina mediante la metilacin de la lisina 9. La histona H2A.Z, una variante de H2A, tiene la propiedad de disociarse fcilmente del DNA en condiciones in vitro, lo que sugiere que tiene una funcin en la iniciacin de la transcripcin, al permitir una desestabilizacin de la cromatina y permitir el acceso a los factores reguladores de transcripcin y a la RNA polimerasa. Sin embargo, existen resultados controversiales sobre la ubicacin de esta histona. Raisner y colaboradores encontraron una preferencia importante en la incorporacin de H2A.Z en los dos nucleosomas que flanquean una regin libre de nucleosomas hacia atrs del inicio de transcripcin de los genes (aproximadamente 200 bases hacia atrs).

4.3.2.3. Modificaciones post-traduccionales de histonas Las protenas histonas se han conservado estructuralmente a travs de la evolucin y contienen colas terminales en el extremo amino, las cuales se proyectan hacia fuera de los nucleosomas. Las colas de histonas pueden ser modificadas post-traduccionalmente por modificaciones covalentes que incluyen principalmente la acetilacin, metilacin y fosforilacin (Figura 4.14). Estas modificaciones modulan la estructura de la cromatina influenciando la actividad de los genes y juegan un papel importante en mediar la herencia de la cromatina. La teora del cdigo de histonas propone que las distintas modificaciones de histonas actan de manera sequencial o en combinacin para reclutar protenas de unin que realizan tareas especficas. Adems, se sugiere que distintas regiones del cromosoma son funcionalmente diferentes de otras con base en las diferentes modificaciones de histonas, lo que resulta en el reclutamiento de diferentes complejos que se unen a cromatina y distintos resultados en el funcionamiento.

124

Figura 4.14. Acetilacin de lisinas de la histona H3. Los complejos proteicos con actividad de acetilasas (HATs) o desacetilasas (HDACs) pueden adicionar grupos acetilo a las cadenas de lisina o bien removerlos. Las acetilasas (HATs) adicionan los acetilos y las desacetilasas (HDADc) los remueven. La acetilacin reduce la carga neta positiva de las histonas y puede debilitar su unin con el DNA. Las histonas acetiladas estn correlacionadas con regiones que se pueden transcribir, las cuales son sensibles al corte por DNasaI. La acetilacin ocasiona una neutralizacin de las cargas positivas de las histonas y debilita los contactos del DNA y las histonas, lo cual facilita la unin de complejos remodeladores de la cromatina y se promueve la transcripcin. Los sitios preferidos para la acetilacin son las lisinas; en H3 se acetilan las posiciones 9, 14, 18 y 23 y en H4 se acetilan las posiciones 5, 8, 12 y 16. Existen activadores transcripcionales con funcin de acetilacin (HATs) y represores transcripcionales con funcin de desacetilacin (HDACs), los cuales estn asociados con complejos proteicos de varias subunidades. Tanto HATs como HDACs pueden ser reclutados a sitios especficos en el DNA mediante la interaccin con protenas que se unen al DNA. Las histonas puedes ser metiladas en los sitios de lisinas. La histona H3 se puede metilar en las posiciones 4, 36 y 79, lo cual se correlaciona con la actividad transcripcional, y en cambio las metilaciones en las posiciones 9, 27 y 125

20 se encuentran correlacionadas con la cromatina silenciada y que no se transcribe. Adicionalmente, las lisinas pueden tener 2 o tres metilaciones en condiciones in vivo y en la planta Arabidopsis la heterocromatina (silenciada) est asociada con un alto nivel de dimetilacin en la lisina 9 de la histona H3, mientras que la eucromatina (activa) est correlacionada con la dimetilacin en la lisina 4 de H3. Como se mencion en la seccin de variantes de histonas, H3.3 proporciona un mecanismo dinmico para la activacin rpida de la cromatina mediante la metilacin de la lisina 9. Los grupos Polycomb (PcG) y Trithorax (trxG) son complejos proteicos que permiten regular el desarrollo de organismos multicelulares mediante una regulacin epigentica de la transcripcin, lo cual es crucial para determinar la identidad celular y la herencia en cada linaje celular. Los complejos PcG funcionan manteniendo el estado silenciado de la transcripcin al compactar la cromatina, mientras que los complejos trxG mantienen el estado activo de la transcripcin manteniendo la estructura de la cromatina abierta. En Drosophila y en mamferos PcG funciona metilando la histona H3 en la posicin 27, lo cual recluta complejos de represin. trxG funciona tambin como una metiltransferasa en la posicin 4 de la histona H3 determinando la activacin de genes. En Arabidopsis existen al menos cinco protenas parecidas a trxG, de las cuales ATX1 se requiere para el desarrollo normal de la flor y la identidad de las partes florales.

4.3.2.4. Metilacin del DNA La metilacin del DNA es una de las modificaciones epigenticas ms abundantes en plantas superiores y en animales. En la metilacin se adiciona un grupo metilo de manera covalente a la posicin 5 de la citosina, lo cual ocurre por una familia de enzimas denominada DNA metiltransferasas (Figura 4.15). En las plantas, vertebrados y algunos hongos la metilacin se presenta en el dinucletido simtrico CG, aunque en plantas tambin puede ocurrir en otras secuencias como CNG y CNN (donde N es cualquier nucletido). Los patrones de metilacin de CG se mantienen despus de la replicacin del DNA (Figura 4.16), ya que cada hebra parental retiene su metilacin y en la hebra nueva la metilacin se reestablece por DMNT1 en mamferos y MET1 en plantas, ambas metiltransferasas. De esta manera, la metilacin del DNA proporciona un mecanismo eficiente para almacenar informacin epigentica, la cual puede ser heredada establemente a travs de las divisiones celulares. La metilacin del DNA est frecuentemente asociada con el silenciamiento de los genes y se encuentra de manera preferencial en la heterocromatina y en los transposones. En los animales se ha visto que la metilacin del DNA se encuentra relacionada con la desacetilacin de histonas y el silenciamiento de los genes, ya que protenas MBD se unen al DNA metilado y reclutan enzimas desacetilasas (HDACs). Aunque en plantas no se ha demostrado esta relacin existen evidencias de protenas MBD que pudieran ligar la metilacin del DNA y la desacetilacin de histonas. 126

Figura 4.15. Metilacin de la citosina en el carbono 5.

Figura 4.16. Mantenimiento de los patrones de metilacin del DNA. En el DNA parental se encuentran metiladas ambas cadenas en las secuencias complementarias CG, Despus de la replicacin slo la hebra parental de cada molcula hija se encuentra metilada. Las hebras hijas sintetizadas de nuevo son metiladas por una enzima que reconoce especficamente secuencias CG opuestas a un sitio metilado. Tambin se ha encontrado una relacin entre la metilacin del DNA y la metilacin de histonas en animales, plantas y hongos. La trimetilacin de la lisina 9 de la histona H3 se requiere para la metilacin del DNA en hongos. 127

4.3.2.5. Imprinting La regulacin epigentica en la que una de las copias parentales de genes es expresada mientras la otra copia parental es silenciada se conoce como imprinting. Este mecanismo est relacionado con una metilacin diferencial de los genes durante la gametognesis, de manera que la unin del huevo y el espermatozoide produce un embrin que contiene un alelo metilado (inactivo) y otro no metilado (activo)(Figura 4.17). Se ha descrito alrededor de una docena de estos en humanos y en ratones. En humanos, el gen gfr2 que codifica para un receptor de factor de crecimiento parecido a insulina, se expresa de manera materna, mientras que el gen grf1, que codifica para el factor 1 relacionado en la ruta de sealizacin de RAS, se expresa de manera paterna.

Figura 4.17. Representacin de la inactivacin de uno de los genes parentales por metilacin (imprinting).

4.3.2.6. Silenciamiento de genes inducido por RNA La produccin de RNA que se pliega formando doble cadena (dsRNAs) disparan dos tipos de silenciamiento de genes en los cuales el RNA se une al RNA complementario que se est transcribiendo impidiendo su traduccin al unirse al extremo 3 o bien ocasionando la degradacin de ste. Este mecanismo se conoce como RNA de interferencia. Se ha encontrado que existe una relacin entre el RNA de interferencia y la modificacin de la cromatina. La maquinaria del RNAi es esencial para la metilacin de la lisina 9 en la histona H3 en las regiones centromricas. Adems, el RNAi es responsable del silenciamiento de retrotransposones 128

mediante la formacin de heterocromatina. El mecanismo preciso de cmo los RNAi encuentran sus secuencias homlogas para silenciarlas no se conoce todava.

4.4. El RNA de interferencia. El RNA de interferencia (RNAi) es un proceso bioqumico comn a la mayora de los eucariontes por medio del cual molculas de RNA (cido ribonucleico) de doble cadena dirigen la supresin de la expresin gentica de una manera especfica de secuencia. La primera pista de la existencia de este mecanismo emergi de un trabajo de modificacin gentica de plantas a fines de los aos 80. En este estudio se intentaba profundizar el color violeta de petunias por la expresin de altos niveles de la enzima involucrada en la sntesis del pigmento, pero inesperadamente se observ la aparicin de flores blancas. La introduccin de copias extras del gen provoc un decremento en su expresin ms que un incremento. Por algn tiempo esto permaneci sin explicacin y pronto se reportaron observaciones similares en el hongo filamentoso Neurospora crassa y el gusano nemtodo Ceanorhabditis elegans. En 1998 estas observaciones condujeron al acuamiento del trmino RNA de interferencia. Posteriormente se demostr que este RNA de doble hebra fue capaz de dirigir la degradacin del RNA mensajero (RNAm) con secuencias complementarias a una u otra hebra. Despus de algunos aos se estableci el mecanismo de funcionamiento del RNAi trabajando con organismos diversos, especialmente con el gusano y la mosca de la fruta. Se ha considerado al RNA de interferencia como un mecanismo evolutivamente antiguo para proteger a los organismos de los virus. Muchos virus contienen en su estructura RNA como su material gentico y en algn momento de su ciclo de vida elaboran RNA de doble cadena. Todos los organismos multicelulares poseen una maquinaria proteica que reconoce molculas de RNA de doble cadena. Una enzima denominada Dicer degrada estas molculas en pequeos fragmentos de aproximadamente 20 pares de nucletidos de longitud. Un complejo enzimtico denominado Complejo de Silenciamiento Inducido por RNA (RISC, en ingls) usa los pequeos fragmentos de RNA producidos por Dicer como templados para degradar molculas de RNA con la misma secuencia, tales como copias de RNAm que utilizan los virus para la sntesis de protenas virales (Figura 4.18). Este mecanismo evita la expresin de secuencias similares por degradacin de los transcritos de RNAm, proceso denominado silenciamiento post-transcripcional de genes. El RNA de interferencia en la actualidad se usa comnmente en investigacin biolgica y biomdica para estudiar el efecto de bloquear la expresin de genes. Esto es particularmente fcil en C. elegans, donde simplemente alimentando los gusanos con bacterias que expresan RNA de doble cadena causa interferencia en el tejido del gusano. La investigacin utilizando sistemas de mamferos ha resultado ms difcil. La mayor parte de la investigacin se ha enfocado a introducir pequeas molculas de RNA en 129

clulas de tejidos en cultivo. Estas molculas causan una inhibicin eficiente de la expresin de genes homlogos, si bien durante slo unos pocos das, fenmeno al que se le ha denominado knock down. Otra alternativa para introducir RNA de interferencia en clulas es el uso de vectores virales de expresin, lo cual podra resultar en una inhibicin ms estable de la expresin de genes. Virus como los retrovirus, los adenovirus y los lentivirus se han utilizado como vehculos para construir RNA de interferencia.

Figura 4.18. Mecanismo de accin del RNA de interferencia. Se representa la cascada de eventos iniciados por la introduccin de RNA de doble hebra (dsRNA) a una clula. La nucleasa Dicer corta el dsRNA en fragmentos pequeos de 21-25 nucletidos (siRNA). Estos ltimos inician el ensamblaje del complejo RISC, el cual media la degradacin del RNA mensajero (mRNA) con secuencia homologa al dsRNA. El RNA de interferencia claramente promete mucho como herramienta de laboratorio, lo mismo promete en el aspecto clnico?. En principio, podra ser usado para tratar cualquier enfermedad relacionada con la expresin elevada de algn gen ya identificado. Por ejemplo, podra ser usado para combatir enfermedades virales, cnceres y enfermedades inflamatorias. Sin embargo, actualmente existen muchas limitaciones tcnicas y cientficas para que esta nueva tecnologa se pueda aplicar en humanos.

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5. MUTACIONES
La informacin gentica contenida en el DNA es susceptible de sufrir cambios, los cuales se denominan mutaciones. Las mutaciones son causa de varias enfermedades como veremos ms adelante. Se sabe que todos los organismos experimentan mutaciones en su DNA debido a factores ambientales, tales como la radiacin solar, interaccin con productos qumicos o infecciones virales y tambin como resultado de errores cometidos al replicar el DNA. Son varios los tipos de cambios que puede sufrir el DNA, y stos pueden alterar desde un solo nucletido, hasta cromosomas completos. Las mutaciones pueden producir cambios aparentes en el fenotipo, como los mostrados para la mosca Drosophila en la figura 5.1.

Figura 5.1. Fenotipo silvestre y diferentes mutantes de la mosca Drosophila melanogaster.

5.1. Mutaciones puntuales o gnicas Las alteraciones en la secuencia de los nucletidos de un gene pueden ocasionar un cambio en la fase de lectura del gene, al nivel del RNA mensajero, y por ello generarse una protena con su secuencia de aminocidos diferente, la cual ya no sea capaz de realizar su funcin original. Sin embargo, puede haber cambios en la secuencia del DNA que no afecten el funcionamiento de la protena codificada por el gene particular (figura 5.2). Estos cambios son 131

responsables de la aparicin de los llamados polimorfismos genticos en los genes de una especie como la humana.

Figura 5.2. Diferentes tipos de mutaciones que pueden ocurrir para cambiar la secuencia original de nucletidos en cualquier molcula de DNA. a) Sustitucin, b) Adicin y c) Delecin. En la figura se muestra el efecto de la sustitucin, adicin y delecin de un par de nucletidos; sin embargo, las adiciones o deleciones pueden involucrar uno o muchos pares de nucletidos. Al cambiar la secuencia de nucletidos de un gene, se pueden tener resultados diversos sobre el producto peptdico o protena para la que codifica. Si el cambio es slo de un par de nucletidos, en muchos casos no hay efecto en la actividad de la protena. Sin embargo, en algunos casos este cambio s afecta la funcin biolgica. 132

5.2. Efecto de mutaciones en protenas Las protenas son molculas biolgicas informacionales, pero a diferencia del DNA que es la molcula en donde reside la informacin gentica para sintetizar las protenas, stas son las herramientas que tienen las clulas para llevar a cabo la mayor parte de sus funciones; en otras palabras, en las protenas reside la informacin funcional de la clula. Ejemplos de estas protenas son las siguientes: la insulina, una protena que regula el nivel de azcar en la sangre; la hemoglobina, transporta en los glbulos rojos el oxgeno de los pulmones a todas las clulas del organismo; la tripsina, una protena que trabaja en nuestro aparato digestivo para digerir otras protenas provenientes de otros organismos y que forman parte de nuestro alimento. Como estas tres protenas, existen al menos cuarenta mil en nuestro organismo, y gracias a ellas y a la informacin funcional especfica en cada una de ellas, el organismo y sus diferentes rganos, tejidos y clulas, llevan a cabo sus tareas. Las protenas son polmeros biolgicos que estn constituidos por decenas o centenas de veinte tipos de monmeros diferentes llamados aminocidos. Cada protena tiene una secuencia especfica de aminocidos dada por la secuencia de nucletidos del gene que la codifica y esta secuencia es la que se conoce como la estructura primaria de la protena. La secuencia de los nucletidos en el gene es responsable de la secuencia de los nucletidos del RNA mensajero. Este orden, en particular el de cada tres nucletidos, es a su vez, el de la secuencia de los aminocidos en la protena codificada por el gene particular (figura 5.3). La estructura final de la protena depende del orden, a nivel primario, es decir de la secuencia de los aminocidos que la integran Si este orden se altera, la funcin de la protena puede tambin alterarse. Las mutaciones o cambios que ocurren en un gene pueden dar lugar a su vez a cambios en los aminocidos en la protena que se obtiene a partir de dicho gene. La anemia falciforme es una enfermedad ocasionada por una mutacin en el gen que codifica para la cadena beta de la hemoglobina. El cambio se da en el codn que codifica para el aminocido 6. En el gen silvestre o normal la secuencia del codn es G A Pu (purina), lo cual se traduce en el aminocido glutamato en la protena, mientras que el gen mutado tuvo un cambio en el codn reemplazndose una adenina por una timina, lo cual se traduce en el aminocido valina en la protena (Figura 5.4). La hemoglobina S producto de la mutacin de la cadena beta ocasiona que en los individuos la hemoglobina se precipite a bajas concentraciones de oxgeno. Los glbulos rojos adquieren una forma de hoz, lo que dificulta su movimiento por los vasos capilares, ocasionando una falta de oxigenacin en ciertos tejidos (Figura 5.5) 133

Figura 5.3. Colinearidad entre la secuencia de nucletidos en el RNA y la secuencia de aminocidos en la estructura primaria de una protena. Gracias a esta secuencia primaria, la protena puede adquirir una estructura secundaria que puede ser fundamentalmente de dos tipos: -hlice o plegada. Las estructuras secundarias, a su vez, permiten el doblamiento de las protenas en estructuras terciarias y finalmente, las estructuras terciarias permiten la asociacin de varias molculas de protenas en lo que se conoce como estructura cuaternaria.

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Figura 5.4. Mutacin en el gen que codifica para la cadena beta de hemoglobina. El cambio de una base en el codn 6 ocasiona que en la protena se cambie el aminocido glutamato por valina.

Figura 5.5. Fotografa de glbulos rojos de individuos con anemia falciforme. La forma de hoz aparece en varios glbulos rojos.

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5.3. Los cambios tautomricos de las bases Las bases nitrogenadas pueden encontrarse en una forma estable y en una forma inestable debido a que los grupos qumicos amino y ceto pueden convertirse en las formas imino y enol, respectivamente. Estos cambios se ilustran en la figura 5.6.

Figura 5.6. Formas tautomricas de las bases nitrogenadas. El equilibrio se encuentra desplazado hacia la izquierda.

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Los cambios tautomricos ocasionan que las bases nitrogenadas que normalmente se unen por puentes de hidrgeno con la correspondencia Adenina con Timina y Guanina con Citosina, puedan cambiar sus propiedades de apareamiento, como se ilustra en la figura 5.7.

Figura 5.7. Apareamientos de bases cuando una de ellas se encuentra en la forma tautomrica rara. Cuando el DNA se encuentra en replicacin y ocurre el cambio de una de las bases que servir de templado, a la forma tautomrica rara, podr ocurrir la incorporacin de una base incorrecta, dando como resultado en posteriores replicaciones la fijacin de una mutacin. En el ejemplo mostrado en la figura 5.8 ocurre un cambio del par GC al par AT.

Figura 5.8. Mutacin generada por un cambio tautomrico en la guanina durante la replicacin. En la segunda generacin se fija una mutacin en el DNA. El par de bases GC cambia por AT. 137

5.4. Transiciones y transversiones Las mutaciones puntuales en las que una base cambia por otra, se clasifican en transiciones y transversiones. En las transiciones una purina se cambia por otra purina o una pirimidina cambia por otra pirimidina. En el ejemplo de la figura 5.8 la mutacin es una transicin, ya que en la cadena superior la G cambi por A y en la cadena inferior la C cambi por T. En las transversiones una purina cambia por una pirimidina o viceversa. Este tipo de mutaciones son menos frecuentes que las transiciones.

5.5. Factores externos Se conocen agentes externos que producen mutaciones. Uno de ellos lo representan los rayos X, utilizados por Mller en la dcada de los aos 20s. Este investigador encontr que existe una relacin directa entre las dosis de rayos X y la aparicin de mutaciones en Drosophila, lo cual se ilustra en la figura 5.9.

Figura 5.9. Relacin entra las dosis de radiacin de rayos X y la aparicin de mutaciones en Drosophila. 138

La radiacin ultravioleta tambin genera mutaciones en el DNA, debido principalmente a la generacin de lo que se conoce como dmeros de timina (Figura 5.10). La formacin de estas estructuras ocasiona problemas durante la replicacin con incorporacin errnea de nucletidos, produciendo principalmente transiciones, aunque tambin se llegan a producir transversiones, deleciones e inserciones. Como la luz UV ha acompaado a los seres vivos desde su aparicin, stos han desarrollado un sistema de reparacin conocido como SOS y que se encuentra conservado desde las bacterias hasta los humanos.

Figura 5.10. Formacin de dmeros de timina por luz UV. Estructura del dmero (izquierda) y accin del sistema de fotoliasa en presencia de luz blanca, que rompe los dmeros de timina (derecha).

5.6. Mutaciones cromosmicas La sustitucin de un nucletido por otro no es el nico tipo posible de mutacin. Algunas veces se puede ganar o perder por completo un nucletido. Adems, es posible que se produzcan modificaciones ms obvias o graves, o que se altere la propia forma y el nmero de los cromosomas. Es probable que la mayora de estos reordenamientos cromosmicos sean la consecuencia de errores en el proceso de sobrecruzamiento.

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5.6.1. Deleciones y duplicaciones de segmentos cromosmicos. La ausencia de un segmento de un cromosoma se conoce como delecin. Las grandes deleciones pueden ser detectadas citolgicamente, pero las pequeas no. En un organismo diploide la delecin de un segmento de un cromosoma resulta en una hipoploidia. La hipoploidia puede estar asociada con un efecto fenotpico, especialmente si la delecin es grande. Un segmento adicional de un cromosoma se conoce como una duplicacin. El segmento adicional puede ser unido a un cromosoma, o puede existir como un cromosoma nuevo y separado. En cualquier caso el efecto es el mismo: el organismo es hiperploide para parte de su genoma. Al igual que con la hipoploidia este fenmeno puede estar asociado con un efecto fenotpico.

5.6.2. Inversiones Las inversiones suceden cuando el segmento de un cromosoma es separado, girado 180 grados y unido de nuevo al resto del cromosoma y como resultado el orden de los genes del segmento se invierte. Las inversiones pueden ser inducidas en el laboratorio por irradiacin con rayos X. Los citogenetistas distinguen entre dos tipos de inversiones basndose en si se incluye el centrmero del cromosoma. Las inversiones pericntricas incluyen al centrmero, mientras que las paracntricas no. La significancia es que una inversin pericntrica puede cambiar la longitud de los dos brazos del cromosoma, mientras que una inversin paracntrica no produce tal efecto.

5.6.3. Translocaciones Las translocaciones ocurren cuando un segmento de un cromosoma es separado y unido a un cromosoma diferente, resultando en que genes de un cromosoma se transfieren a otro alterando sus relaciones de ligamiento. Las translocaciones pueden ser inducidas por irradiacin con rayos X, la cual puede romper dos cromosomas simultneamente. Ocasionalmente los fragmentos rotos de cromosomas diferentes se fusionan. En humanos existe una translocacin entre el cromosoma 8 y 14 de manera tal que el gen c-myc implicado en la divisin celular queda bajo el control del promotor del gen de la cadena pesada de inmunoglobulina, lo que ocasiona un cncer conocido como linfoma de Burkitt, que inicia con una deformacin de la mandbula y se expande hacia toda la cara (Figura 5.11). Este cncer es frecuente en las poblaciones de frica Central, donde representa un problema de salud pblica en la poblacin infantil.

5.6.4. Efectos fenotpicos de los rearreglos cromosomales En condiciones homocigotas, las deleciones que remueven algunos genes casi siempre son letales porque algunos de los genes faltantes pueden ser esenciales para la vida. Por el contrario, las duplicaciones pueden ser 140

viables, siempre y cuando no sean muy grandes. En condiciones heterocigotas, las deleciones y las duplicaciones pueden afectar el fenotipo por alteracin del nmero de grupos de genes. Las inversiones y las translocaciones pueden tambin afectar el fenotipo. Algunas veces estos fenmenos interrumpen genes produciendo una mutacin. En otros casos los genes involucrados pueden alterar su expresin por colocarse en nuevas posiciones cromosomales.

Figura 5.11. Translocacin entre el cromosoma 8 y 14 en humanos. Esta translocacin puede modificar la expresin del gen c-myc, implicado en el encendido de algunos genes en la divisin celular. Al quedar el gen c-myc bajo la regin reguladora del gen de inmunoglobulina tiene una expresin mayor y ocasiona que se produzca un cncer conocido como linfoma de Burkitt.

5.7. Cambios numricos de cromosomas Este tipo de cambios afectan a la dotacin cromosmica de un individuo, es decir, los individuos que las presentan tienen en sus clulas un nmero distinto de cromosomas al que es propio de su especie. No son mutaciones propiamente dichas, porque no hay cambio de material gentico, sino una aberracin, la cual suele ser el resultado de una separacin anormal de los cromosomas durante la meiosis. En la figura 5.12 se ilustra lo que ocurre en la meiosis cuando la separacin de una pareja de cromosomas homlogos falla en la primera o en la segunda divisin. Esto puede originar gametos (y por lo tanto cigotos) con cromosomas de ms, y otros donde faltan uno o ms cromosomas. La aneuploidia describe un cambio numrico en parte del genoma, usualmente un cambio en el nmero de un solo cromosoma. Los individuos que tienen un 141

cromosoma adicional, que les falta un cromosoma, o que tienen una combinacin de estas anomalas son aneuploides.

Figura 5.12. Efecto de la no disyuncin de cromosomas homlogos durante la primera divisin (arriba) o segunda divisin (abajo), durante la meiosis.

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En el hombre, existen varios sndromes provocados por la no separacin de una pareja de cromosomas homlogos durante la meiosis, con lo cual permanecen unidos y se desplazan juntos a un mismo gameto provocando lo que se denomina trisoma, es decir un individuo con un cromosoma triplicado. Los individuos con un cromosoma de ms se denominan trismicos, y aquellos en los que falta uno, monosmicos. Ambas situaciones tienden a producir incapacidades graves. En la siguiente tabla se presentan los efectos de las principales trisomas y monosomas de los autosomas y de los cromosomas sexuales en humanos:

SNDROME Sndrome de Down

TIPO DE ANEUPLOIDA Trisoma 21

Sndrome de Edwars Sndrome de Patau

Trisoma 18 Trisoma 13 o 15

Caractersticas y sntomas de la aneuploida Retraso mental, ojos oblicuos, piel rugosa, crecimiento retardado Anomalas en la forma de la cabeza, boca pequea, mentn huido, lesiones cardiacas. Labio leporino, lesiones cardiacas, polidactilia. Escaso desarrollo de las gnadas, aspecto eunocoide. Elevada estatura, personalidad infantil, bajo coeficiente intelectual, tendencia a la agresividad y al comportamiento antisocial. Aspecto hombruno, atrofia de ovarios, enanismo. Infantilismo y escaso desarrollo de las mamas y los genitales externos.

Sndrome de Klinefelter

44 autosomas + XXY

Sndrome del doble Y

44 autosomas + XYY

Sndrome de Turner Sndrome de Triple X

44 autosomas + X 44 autosomas + XXX

El Sndrome de Down es una de la aneuploidas ms frecuente en la poblacin humana. El esquema de un cariotipo de una mujer con este sndrome se presenta en la figura 5.13, en la que se observa que existen 3 cromosomas del nmero 21. 143

Figura 5.13. Esquema del cariotipo de una mujer con sndrome de Down. Destaca la presencia de tres cromosomas del nmero 21. Los pliegues de la mano son caractersticos.

5.8. Poliploides La meiosis fracasa a veces en la separacin de un grupo o juego completo de cromosomas; es decir, se origina un gameto con el doble del nmero normal de cromosomas. Si dicho gameto se une con otro que contiene el nmero normal de cromosomas, el descendiente tendr tres grupos de cromosomas homlogos en lugar de los dos habituales. Si se unen dos gametos con el doble del nmero normal de cromosomas, el descendiente estar dotado de cuatro grupos homlogos. Los organismos con grupos adicionales de cromosomas reciben el nombre de poliploides. La poliploida es el nico proceso conocido por el cual pueden surgir especies nuevas en una generacin nica. Se han observado poliploides viables y frtiles casi exclusivamente en organismos hermafroditas, como la mayora de las plantas con flores y algunos invertebrados. Por lo general, las plantas poliploides son mayores y ms robustas que sus antecesoras diploides Estos poliploides as formados son genticamente muy interesantes en las plantas cultivadas, y hoy en da la mayora de variedades gigantes de fresas, tomates y trigo que existen en el mercado, tienen este origen. Algunas veces se originan fetos poliploides en la poblacin humana, pero fallecen en una fase precoz del desarrollo fetal y se produce un aborto. Un individuo se dice diploide cuando en sus clulas somticas estn presentes 2 juegos idnticos de x cromosomas cada uno, de forma que cada 144

uno de dichos x cromosomas son todos diferentes entre s. Al conjunto de los x cromosomas, se les denomina genomio o nmero bsico. Por lo tanto, una clula, tejido u rgano es diploide cuando sus ncleos poseen los 2x cromosomas (autosomas) tpicos del individuo a que pertenecen. Un individuo que contiene en sus clulas somticas la mitad de los cromosomas pertenecientes a su especie se llama monoploide o haploide. Cuando la dotacin cromosmica normal de un individuo est compuesta por varios genomios o juegos completos de cromosomas se dice que es un poliploide. Si los genomios son iguales, el poliploide es un autopoliploide y se lo denomina autotriploide, autotetraploide, autopentaploide, n-ploide, segn que sus clulas somticas tengan 3, 4, 5 o n juegos idnticos de cromosomas. Sus nmeros cromosmicos sern, por lo tanto 3x, 4x, 5x, nx, siendo x el nmero bsico antes definido. Si los genomios que componen la dotacin cromosmica del poliploide no son iguales, entonces se le llama alopoliploide. El alopoliploide rene en su complemento cromosmico los genomios de dos o ms especies diploides. Si una especie alopoliploide est formada por dos genomios distintos, se llama alotetraploide (G1 G1 G2 G2 ), si son tres lo genomios, se trata de un alohexaploide (G1 G1 G2 G2 G3 G3 ), etc. La poliploida es muy comn en plantas, especialmente en angiospermas, Actualmente, se piensa que entre el 30 y el 70% de las Angiospermas son poliploides. Se sabe que las herbceas perennes muestran mayor porcentaje de formas poliploides que las anuales y stas menos que las leosas aunque las herbceas perennes y las leosas se comportan de diferente manera en las regiones tropicales. En la siguiente tabla se presentan los niveles de ploida de algunas plantas. Planta Nmero cromosmico bsico 7 10 10 11 12 12 13 17 145 Nmero cromosmico 42 40 80 22,33 48 48 52 34,51 Nivel de ploida.

avena cacahuate caa de azcar pltano papa tabaco algodn manzana

6x 4x 8x 2x,3x 4x 4x 4x 2x,3x

El pltano, una especie comnmente triploide es uno de los frutos ms importantes en la economa de muchos pases tropicales (figura 5.14).

Figura 5.14. El pltano es una especie comnmente triploide y estril.

5.8.1. Origen de los poliploides Existen sustancias como la colchicina que permiten formar poliploides de manera experimental. Es un alcaloide que se encuentra en las semillas y en los bulbos de la planta Colchicum autummnale L. La colchicina afecta a las clulas en divisin de tal forma que a la separacin de las cromtidas de cada cromosoma no sigue la migracin de las mismas hacia los polos opuestos porque el efecto de la misma es inhibir la formacin del huso acromtico. Al no haber movimiento de las cromtidas a los polos no se establecen las corrientes citoplsmicas que determinan la formacin de la membrana celular que se formar entre las dos clulas hijas; por tanto la mitosis que se produce bajo la influencia de la colchicina se denomina c-mitosis dando lugar a la duplicacin del complemento cromosmico completo. La colchicina se puede aplicar a semillas en germinacin, plntulas o plantas adultas.

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La poliploida puede aparecer espontneamente como consecuencia de fallas en la meiosis, que conducen a la formacin de gametos no reducidos, por la formacin de quimeras o mosaicos poliploides que, afectando a la lnea germinal, dan origen a gametos poliploides, por duplicacin cromosmica de un diploide o por hibridacin, esto es, el cruzamiento entre dos especies de plantas seguida de un proceso de diplodizacin y evolucin del hbrido que conduce a la formacin de una nueva especie. Ambos mecanismos, fallas en la meiosis e hibridacin son comunes en plantas pero no en animales debido a que las plantas (en su mayora) carecen de cromosomas sexuales y toleran mejor que los animales los desbalances genticos y se pueden propagar vegetativamente. Un autotriploide puede surgir de la fusin de un gameto haploide (n) con un gameto no reducido y por lo tanto 2n. El cigoto ser 3n. Los triploides puede tambin originarse a partir de un cruzamiento en el que uno de los padres es diploide (y por ende produce gametos, n) y el otro es tetraploide (produce gametos 2n). La meiosis de los autotriploides origina gametos desbalanceados debido a la presencia de un juego cromosmico adicional, razn por la cual estos autopoliploides son estriles y se propagan vegetativamente. Ejemplos de autotriplodes lo constituye el pltano y la sanda sin semilla. Como se dijo anteriormente, la hibridacin (cruzamiento entre dos especies) seguida de duplicacin del hbrido estril es una forma de especiacin. Los alopoliploides renen en sus genomas los genomas de al menos dos especies diferentes (G1 G1G2G2 ). Uno de los objetivos de la mejora ha sido el desarrollo de alopoliploides que poseyeran caracteres nuevos que no estuvieran presentes en otras especies. Entre los alopoliploides que ms xito ha tenido se halla el Triticale que result de la polinizacin del trigo (Triticum aestivum, 2n = 6x = 42 cromosomas) con centeno (Secale cereale, 2n = 2x = 14 cromosomas). Trigo y centeno son dos especies relacionadas (pertenecen a la misma tribu, Triticinae). El objetivo del experimento era sintetizar un hbrido que poseyera las buenas cualidades productivas del trigo con la rusticidad del centeno obtenindose un cereal, el Triticale con un nmero cromosmico de 2n= 8x = 56 cromosomas. El trigo (Triticum aestivum) ha jugado un papel importante en el desarrollo de la civilizacin mundial. La domesticacin del trigo ha sido uno de los hechos ms importantes que ha ocurrido ya que permiti que el hombre del Neoltico dejara de ser nmada (cazador-recolector) para asentarse en un sitio determinado. El trigo es un alopoliploide que ha llegado hasta nuestros das. En 1928 se realiz un cruzamiento interespecfico entre el rbano (Raphanus sativus n = 9) que presenta una gama importante de variedades y cuyas races pueden ser rojas o blancas, con la col (Brassica n = 9). El hbrido interespecfico Raphanobrassica posea dos juegos cromosmico de 9 cromosomas cada uno procedente de cada uno de los parentales (R y C respectivamente) y era estril ya que los cromosomas, por no ser totalmente 147

homlogos, no se podan aparear en la meiosis. La diploidizacin del hbrido estril (RC) con colchicina origin un alotetraploide frtil (RRCC) que produjo gametos y semillas viables ya que existan en el mismo dos juegos cromosmicos R y dos C cuyos cromosomas podan aparear entre s. Esta planta desafortunadamente tena las hojas del rbano y las races de la col. Los haploides poseen slo un juego de cromosomas (n = 1) y es el mismo que el de las gametos (ovoclula o polen). Los haploides pueden diferenciarse de los diploides usando marcadores moleculares que estn ligados a un carcter de inters o bien pueden diferenciarse por sus caractersticas fsicas. Se utilizan en mejora para obtener lneas puras que sean homocigticas. La obtencin de lneas puras pasa por tratar las regiones meristemticas del haploide con colchicina con el objeto de duplicar el nmero cromosmico. Los dobles haploides tienen dos juegos de cromosomas idnticos a los del haploide y pueden formar ovoclulas y granos de polen viables. La utilizacin de haploides en programas de mejora acelera la obtencin de la nueva variedad porque se llega ms rpidamente a la homocigosis ya que se obtienen dobles haploides en pocos aos luego de multiplicar los genotipos diploides homocigticos derivados del tratamiento con colchicina de haploides seleccionados. Por regla general se necesitan ms de cinco generaciones de autofecundacin para llegar a la homocigosis En los haploides es ms fcil distinguir los genotipos recesivos. La haploida tambin puede utilizarse para obtener plantas masculinas o femeninas a partir de una planta dioica como el esprrago.

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6. TCNICAS DE DNA RECOMBINANTE

Esta tecnologa se desarroll desde principios de los aos 1970s y permite manipular las molculas de DNA en condiciones in vitro y hacer estudios muy detallados en condiciones in vivo. Por ejemplo, se pueden obtener fragmentos de DNA en cantidades ilimitadas, recombinar molculas de DNA de diferentes especies, introducir genes de una especie en otra especie diferente, estudiar los genomas completos de las especies y usar las molculas de DNA como marcadores para estudiar la variabilidad entre los individuos de una o varias especies, entre otras aplicaciones.

6.1. Corte y ligamiento del DNA Las endonucleasas de restriccin son enzimas que reconocen secuencias cortas de DNA y rompen el DNA de doble cadena en sitios especficos, dentro del sitio de reconocimiento o en sitios adyacentes. El rompimiento del DNA en fragmentos definidos por estas enzimas es uno de los procedimientos bsicos en la biologa molecular. En la figura 6.1 se presentan las secuencias cortadas por diferentes enzimas y el organismo del cual provienen. En la Figura 6.2 se esquematiza el corte de DNA con la enzima EcoRI y PvuI; en el primer caso el corte genera extremos cohesivos y en el segundo extremos rasurados. Diferentes factores afectan las reacciones de las endonucleasas de restriccin. El fenol, cloroformo, EDTA, SDS o restos de protenas pueden inhibir la digestin con estas enzimas. El efecto de los contaminantes puede controlarse incrementando la cantidad de enzima (10 a 20 unidades por microgramo de DNA) o incrementando el volumen de reaccin para diluir a los inhibidores. Los componentes tpicos de una reaccin de digestin con endonucleasa incluyen cloruro de magnesio, sodio o potasio, Tris-HCl, y suero de albmina de murino, lo que se proporciona en amortiguadores comerciales concentrados 10 veces (10X). Las reacciones de digestin tpicamente son en un volumen de 20 microlitros (l), sin embargo, puede ser escalada de acuerdo a las necesidades. Un ejemplo de una reaccin podra ser el siguiente: 2 l de solucin de DNA (aproximadamente 200 nanogramos) 2 l de amortiguador 10X 15 l de agua 1 l de enzima EcoRI

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Figura 6.1. Endonucleasas de restriccin y secuencias del DNA en las que cortan. El nombre de la enzima proviene de la especie y cepa de la cual proviene. 150

Figura 6.2. Corte de DNA con EcoRI o PvuII.

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El tiempo de incubacin depende de la actividad de la enzima, pero se considera que en la mayora de los casos 2 horas son suficientes. La temperatura de incubacin normalmente es de 37 0C, aunque algunas pocas enzimas requieren otras temperaturas. Los fragmentos de DNA pueden unirse mediante enzimas conocidas como ligasas, las cuales calatizan la formacin de enlaces fosfodister entre un fosfato 5 y un grupo hidroxilo terminal 3. La principal ligasa utilizada proviene del bacterifago T4. La unin de dos fragmentos de DNA con extremos cohesivos generados por la misma enzima se muestra en la Figura 6.3. La unin de fragmentos con extremos cohesivos se hace usualmente a 16 0C, mientras que los extremos romos ligan mejor a 25-30 0C. Para llevar a cabo una reaccin de ligacin es necesario utilizar un amortiguador comercial, el cual viene en una presentacin 5X. El volumen de reaccin generalmente es de 20 l. Una reaccin tpica de ligacin sera la siguiente: 2 l de solucin de DNA 1 (aproximadamente 50 nanogramos) 2 l de solucin de DNA 2 (aproximadamente 150 nanogramos) 4 l de buffer 5X 11 l de agua 1 l de enzima T4 DNA ligasa

Figura 6.3. Unin de fragmentos de DNA cortados previamente con EcoRI.

152

6.2. Electroforesis La electroforesis se basa en el principio de que una molcula colocada en un campo elctrico migra al electrodo apropiado a una velocidad (movilidad electrofortica), proporcional al campo de fuerza y a su propia carga neta. Por esta razn, una mezcla de molculas de DNA (o de protenas), puede separarse electroforticamente en funcin de: a) el tamao, b) la forma o conformacin molecular y c) la magnitud de las cargas netas. Cuando se coloca una mezcla de molculas en la misma posicin en un campo elctrico, los componentes individuales se resuelven en bandas discretas que migran en distintas posiciones. En soluciones acuosas en condiciones fisiolgicas, los grupos fosfato de los cidos nucleicos se encuentran ionizados con una carga negativa (aniones) por lo que migrarn al electrodo positivo (nodo), cuando son sometidos a un campo elctrico. Asimismo, al aumentar la viscosidad del medio o soporte en el que migran las molculas, las de menor peso molecular se movern con mayor facilidad que las de tamaos mayores, y as las molculas son separadas exclusivamente en funcin de su tamao. Los soportes ms utilizados en los mtodos de separacin por electroforesis son la agarosa y la poliacrilamida. La agarosa forma geles o gelatinas al establecer puentes de hidrgeno cuando se encuentra en soluciones acuosas fras; el tamao del poro, a travs del cual deben migrar las molculas de cidos nucleicos, depende directamente de la concentracin de la agarosa. Para la migracin de las molculas de DNA en los geles de agarosa se utilizan comnmente cmaras de tipo horizontal (Figura 6.4). El gel se prepara disolviendo la agarosa en una solucin amortiguadora de Tris-Acetato-EDTA (TAE), la cual consiste en Tris-Acetato (0.04 M) y EDTA (0.01 M). La solucin caliente se vaca al molde y se coloca un peine para generar pozos donde se colocarn las muestras de DNA. Cuando el gel se encuentra slido se retira el peine y se adiciona solucin TAE para que llene los depsitos de los extremos y cubra el gen unos 2 mm, para permitir el movimiento de los iones. Las soluciones de DNA se colocan en los pozos mezclndolas previamente con un amortiguador que contiene glicerol y dos colorantes (glicerol 30%, 0.25% de azul de bromofenol, 0.25% de xilencianol). Este amortiguador permite que el DNA se vaya al fondo del pozo y los colorantes permiten observar la migracin cuando el gel se encuentra corriendo. El corrimiento es posible mediante la aplicacin de un voltaje de entre 50 y 100 voltios, mediante una fuente de poder. (Figura 6.4).

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Figura 6.4. Equipo de electroforesis para geles de agarosa. El DNA migrar hacia el polo positivo, por lo que los pozos con el DNA se encuentran orientados hacia el polo negativo. Los fragmentos de DNA sometidos a electroforesis se pueden visualizar si se les tie, por ejemplo, con sustancias que fluorecen al ser irradiadas con luz ultravioleta, como es el caso del bromuro de etidio. Para ello, los geles de agarosa o acrilamida se sumergen directamente en una solucin de este compuesto, el cual se intercala entre las bases del DNA, y as las bandas se observan de color naranja al irradiar el gel con luz ultravioleta (Figura 6.5). Importa destacar que la intensidad de la tincin es directamente proporcional al tamao de los segmentos de DNA; en consecuencia, las bandas de mayor peso molecular tendrn fluorescencia ms intensa que las bandas de menor peso molecular. Cada fragmento de DNA observado en el gel representa una poblacin homognea en tamao de molculas de DNA, de modo que el anlisis de patrones de restriccin de genomas pequeos o segmentos de DNA clonados constituye un poderoso mtodo para el estudio de estos DNAs. Cuando se separan fragmentos de DNA es conveniente utilizar fragmentos de DNA de tamao conocido (marcadores), para estimar el tamao de los fragmentos o cromosomas analizados (Figura 6.5).

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Figura 6.5. Gel de agarosa y marcadores de tamao. En la parte izquierda se muestran fragmentos de DNA de tamao conocido separados en un gel de agarosa; el tamao en pares de bases se muestra a la derecha de cada banda. A la derecha se muestra un gel de agarosa fotografiado en luz ultravioleta. Los carriles muestran lo siguiente: 1 (Marcadores), 2 y 3 (plsmidos N6 cortados con la enzima HindIII o BamHI, respectivamente), 4 (plsmido N6 sin cortar), 5 (marcadores), 6 y 7 (Plsmido pBSKS cortado con HindIII o BamHI, respectivamente), 8 (plsmido pBSKS sin cortar). Los geles de poliacrilamida se generan por el entrecruzamiento covalente de los polmeros de acrilamida y su monmero bisacrilamida. Con estos polmeros puede obtenerse una amplia gama de tamaos de poro variando las proporciones de acrilamida-bisacrilamida y el grado de polimerizacin y de esta manera se controla el tamao del fragmento de DNA que se mueve por el gel. Por regla general, los geles de agarosa al 1% pueden resolver y separar fragmentos lineales de DNA en el rango de 200 a 20 000 nucletidos, mientras que los geles al 7.5% de poliacrilamida resuelven fragmentos de 50 a 2000 nucletidos (Figura 6.6).

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Figura 6.6. Separacin de fragmentos de DNA por electroforesis. En la Figura se observa que al digerir la molcula de DNA del plsmido pBR322 con la enzima EcoRI, slo se forma una banda ya que esta molcula solamente tiene un sitio de reconocimiento para esta enzima (carril F). Si se digiere con la enzima HindII, aparecen dos bandas (carril E), ya que hay dos sitios de reconocimiento para esta enzima. Al digerir el DNA del plsmido con la enzima AluI se forman muchos fragmentos (carril A), ya que hay varios sitios de reconocimiento para esta enzima en el DNA del plsmido). En el extremo izquierdo del gel aparecen nmeros que indican el tamao, en nmero de nucletidos, de los fragmentos de DNA que se generan.

6.3. Clonacin de DNA en vectores La clonacin o multiplicacin de un fragmento de DNA implica primero su insercin en vectores de clonacin, que son los agentes transportadores capaces de introducirlos en las clulas hospedadoras. Los vectores de clonacin son pequeas molculas de DNA, que tienen capacidad para autorreplicarse dentro de las clulas hospedadoras. Se utilizan con frecuencia dos tipos de vectores de clonacin: plsmidos y virus. Los plsmidos son molculas de DNA circular, con un tamao menor que el del cromosoma bacteriano. Se replican con independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su propio origen de replicacin. En la figura 6.7 se muestra uno de los plsmidos ms usados para clonar fragmentos de DNA ya que permite hacer una seleccin de colonias por color. En la figura 6.8 se muestra la secuencia de insercin de un fragmento en un vector de clonacin y en la figura 6.9 se muestra su introduccin en bacterias utilizando el mtodo de cloruro de calcio.

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Figura 6.7. pBluescript. Este plsmido es comercializado por una empresa y tiene como caractersticas que confiere resistencia a ampicilina para permitir la seleccin de colonias. Los fragmentos exgenos de DNA se pueden insertar en los sitios nicos de corte como KpnI, SacI, EcoRI, BamHI y Hindi, entre otros. El gen lac codifica para un fragmento de protena que complementa la actividad de la enzima -galactosidasa y con los reactivos adecuados produce colonias azules; cuando se inserta un fragmento de DNA e interrumpe este gen las colonias de E. coli son blancas. El origen de replicacin permite la replicacin del plsmido en E. coli y bacterias relacionadas.

Figura 6.8. Secuencia de eventos para insertar un fragmento de DNA en un vector de clonacin. El gen que se desea clonar y el vector se cortan con la misma enzima para que los extremos de los fragmentos del DNA sean complementarios. La unin de los fragmentos se obtiene utilizando la enzima T4 DNA ligasa. 157

Figura 6.9. Introduccin de DNA de plsmido en bacterias y seleccin de las bacterias transformadas en medios especficos. El procedimiento se lleva a cabo en fro y se da un choque trmico a 42 0C por 90 segundos y se les regresa a hielo. 158

6.4. Reaccin en cadena de la polimerasa La reaccin en cadena de la polimerasa, ya ms conocida como PCR, es una tcnica que permite replicar entre cientos de miles y millones de veces, en el transcurrir de pocas horas e in vitro, pequeas cantidades de DNA. Uno de los aportes fundamentales de esta metodologa a la investigacin bsica en biologa molecular consiste, precisamente, en la rapidez y eficiencia mediante las cuales se realiza una tarea que antes requera largas y tediosas jornadas. El producto que se obtiene al finalizar la reaccin (una gran cantidad de un fragmento gnico con alto grado de pureza) favorece la tarea de los investigadores empeados en ampliar nuestros conocimientos sobre la estructura y funcin de los genes. Por su alta sensibilidad, esta tcnica permite identificar un gen a partir de un solo cabello, una clula somtica o un espermatozoide. Ha facilitado, y en muchos casos hecho posible, la tarea de identificacin de personas, por ejemplo de hijos de desaparecidos, mediante el anlisis de muestras del nio y de su abuela materna. El mtodo se basa, en su forma ms simple en la realizacin de tres reacciones sucesivas llevadas a cabo a distintas temperaturas. Estas reacciones se repiten cclicamente entre veinte y cuarenta veces (vase la figura 6.10). La muestra se calienta, en el primer paso, hasta lograr la separacin de las dos cadenas que constituyen el DNA, hecho que se conoce como desnaturalizacin. En el segundo paso, la temperatura se reduce para permitir el apareamiento o alineamiento de cada una de dos cadenas cortas de nucletidos (oligonucletidos) con cada una de las hebras separadas del DNA molde. Los oligonucletidos son segmentos de DNA de cadena simple, sintetizados en el laboratorio y diseados de manera tal que permiten definir los lmites del tramo de DNA que se desea replicar. Obviamente, para que se pueda producir el apareamiento, cada uno de estos oligonucletidos, a los que se denomina iniciadores o primers, debe ser complementario del tramo al que tienen que unirse en las cadenas separadas del DNA molde. En tercer lugar, una enzima DNA polimerasa extiende los primers en el espacio comprendido entre ambos, sintetizando las secuencias complementarias de las hebras del DNA molde. Para el alargamiento o extensin del DNA, la enzima DNA polimerasa usa desoxirribonuclesidos trifosfato (dNTPs) agregados a la mezcla de reaccin. La temperatura a la que se realiza el tercer paso est condicionada por aqulla a la cual funciona la enzima DNA polimerasa. Al cabo del primer ciclo de tres reacciones (desnaturalizacin, apareamiento, extensin) el tramo de DNA elegido se ha duplicado y el doble de su cantidad original se encuentra disponible para ser nuevamente replicado en un segundo ciclo. El resultado de la aplicacin de numerosos ciclos "en cadena" da lugar a la amplificacin geomtrica del segmento de DNA delimitado por los primers.

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Figura 6.10. Etapas del proceso de reaccin en cadena de la polimerasa.

La polimerasa I de DNA utilizada inicialmente por Mullis (1983) era derivada de Escherichia coli y se inactivaba en cada ciclo al incrementar la temperatura, por lo que en cada ciclo haba que adicionar ms DNA polimerasa, lo que converta el procedimiento en algo tedioso y poco eficiente. Para resolver este problema se buscaron polimerasas en organismos que habitan fuentes termales y la primera de ellas (Taq) se aisl del Archea Termus acuaticus (figura 6.11). Aunque se han aislado otras polimerasas termoestables, la Taq sigue siendo el caballo de batalla en la mayora de los laboratorios. Las temperaturas del procedimiento de PCR se han automatizado mediante la 160

fabricacin de termocicladores por parte de varias empresas comerciales. (Figura 6.11).

Figura 6.11. Automatizacin de la Reaccin en cadena de la polimerasa. La polimerasa Taq termoestable aislada de Thermus acuaticus (izquierda) permiti junto con los termocicladores (centro) la automatizacin de los ciclos de temperatura del proceso. Se muestra la amplificacin de diferentes fragmentos de DNA por PCR y su anlisis por electroforesis (derecha).

6.5. Transformacin gentica de plantas Se han desarrollado diferentes mtodos para introducir genes forneos en plantas. Una caracterstica comn es que el DNA transformante tiene que vencer diferentes barreras; primero tiene que entrar a la clula vegetal atravesando la pared celular y la membrana plasmtica y posteriormente tiene que llegar al ncleo e integrarse en los cromosomas residentes. Para la mayora de las especies la transferencia de genes se lleva a cabo usando explantes que son competentes para la regeneracin y de esa manera obtener plantas frtiles completas. Esto implica el uso de la tecnologa de cultivo de tejidos que frecuentemente llega a ser un arte. Aunque la tecnologa de transferencia de genes se ha convertido en una rutina en varias especies, en otras el paso limitante no es propiamente la transformacin sino la ausencia de protocolos de regeneracin eficientes. Los mtodos de transformacin ms exitosos y ms ampliamente utilizados son el de Agrobacterium tumefaciens y la transferencia directa mediante el bombardeo con micropartculas.

6.5.1. El sistema de Agrobacterium Agrobacterium es una bacteria Gram negativa, capaz de infectar plantas dicotiledneas, a travs de heridas, e inducir la formacin de agallas en las plantas infectadas. 161

Las cepas virulentas de Agrobacterium contienen un plsmido, denominado Ti (Tumor-inducing) de un tamao que vara entre los 130 y los 230 kb. El plsmido Ti determina las caractersticas de la agalla y la produccin de aminocidos poco comunes denominados opinas (nopalina, octopina). Una cepa de Agrobacterium que produce la formacin de una agalla que sintetiza por ejemplo octopina, tiene tambin la capacidad de catabolizar octopina. Las plantas son incapaces de catabolizar estos aminocidos, por lo que Agrobacterium puede desviar el metabolismo de la planta para producir compuestos que nicamente la bacteria puede utilizar. El mecanismo de infeccin de Agrobacterium involucra la transferencia y la integracin de una regin del plsmido Ti al genoma nuclear de la clula vegetal. Esta regin se denomina T-DNA (Transfer-DNA). El T-DNA contiene genes que codifican para algunas fitohormonas (auxinas y citocininas) y para la sntesis de opinas. Estos genes se expresan nicamente al ser integrados al genoma. El plsmido Ti puede usarse como vector de transformacin de plantas. Mediante la manipulacin del mecanismo natural de infeccin de Agrobacterium se han podido generar una serie de vectores que permiten la introduccin de secuencias de DNA de inters a los genomas nucleares de varias plantas superiores. El sistema binario (en dos partes) se ha podido desarrollar gracias a dos caractersticas del mecanismo de transferencia del T-DNA: a) Las secuencias necesarias para la integracin al genoma se encuentran en los bordes del T-DNA (secuencias repetidas terminales), pudiendo ser reemplazado el resto de la secuencia del T-DNA. b) Los genes de virulencia (vir) responsables de la transferencia del TDNA, actan en trans, por lo que no tienen que estar situados en el mismo plsmido que el T-DNA. Esto permiti el desarrollo de sistemas binarios. El sistema binario consiste en: a) Una cepa de Agrobacterium con un plsmido Ti desarmado. Este plsmido contiene todos los genes vir pero no contiene el T-DNA, por lo que no es oncognico pero es capaz de transferir el T-DNA presente en otro plsmido ms pequeo (vector binario). b) Un plsmido vector que contiene los bordes del T-DNA (vector binario). Este plsmido es pequeo y de fcil manipulacin en E. coli para el clonado de secuencias. No presenta los genes para la produccin de fitohormonas ni opinas. Presenta sitios de restriccin mltiples dentro de los bordes del T-DNA para la clonacin de secuencias. Contiene tambin un marcador para la seleccin de las clulas transformadas, como por ejemplo, resistencia a kanamicina, herbicida o marcador metablico. (figura 6.12). 162

Figura 6.12. Vector de clonacin binario CAMBIA. Presenta un borde izquierdo y uno derecho que delimita el segmento de DNA que Agrobacterium transfiere a la planta. Existen dos genes de seleccin, uno para bacterias y otro para plantas. En el sitio mltiple de clonacin se puede cortar el DNA para insertar el fragmento de DNA deseado. El gen reportero permite monitorear la presencia del segmento de T-DNA en la planta. Las tcnicas de transformacin de plantas utilizando Agrobacterium tumefaciens varan segn la planta. En general, se deben adaptar los mtodos de manipulacin y cultivo de clulas y tejidos vegetales, as como los mtodos de infeccin con Agrobacterium y la posterior seleccin de las clulas transformadas. La seleccin de las clulas transformadas se realiza dependiendo de la construccin utilizada. Los mtodos de transformacin para la generacin de plantas transgnicas consisten en general de las siguientes etapas: a) Infeccin de la planta o partes de la planta (hojas, tallo, races, etc.) con Agrobacterium (cocultivo). b) Seleccin de las clulas infectadas. Este paso se mantiene durante el proceso entero de generacin de plantas transgnicas (crecimiento en medio selectivo). 163

c) Eliminacin de Agrobacterium, utilizando antibiticos que no afectan el crecimiento de la planta. d) Regeneracin: induccin del crecimiento y multiplicacin de las clulas transformadas, mediante la utilizacin de auxinas y citocininas que estimulan la produccin de callos y brote. La insercin del T-DNA en el genoma nuclear es aleatoria y puede ocurrir en varios sitios dentro de una misma clula. La expresin de los genes contenidos en el T-DNA puede estar afectada dependiendo de la zona del genoma donde se integre (transcripcionalmente activa, heterocromatina, etc.). El procedimiento general se presenta en la figura 6.13.

Figura 6.13. Transformacin de plantas por el mtodo de Agrobacterium. Los genes necesarios para la transferencia del DNA se encuentran en un megaplsmido y el gen o genes forneos que sern insertados se proporcionan en un vector separado (vector binario), con secuencias de transferencia especficas. La seleccin se lleva a cabo en un antibitico especfico, por ejemplo kanamicina, y la regeneracin depende de la especie en particular, pero invariablemente se utilizan hormonas vegetales. 164

Debido a que la transformacin de plantas usando ya sea el sistema de Agrobacterium o el de biobalstica hace necesario el cultivo de tejidos que requieren protocolos refinados y habilidades tcnicas, se buscaron mtodos para transformar plantas mediante un procedimiento que evitara estos cultivos. Una de las plantas modelo en la investigacin ha sido Arabidopsis thaliana, por su pequeo tamao, ciclo de vida corto y produccin de semillas numerosas y desde el ao 2000 se dispone del conocimiento completo de su genoma (vase captulo 7). Aunque los primeros protocolos de transformacin de Arabidopsis requirieron de explantes, posteriormente se desarrollaron mtodos que utilizaron plantas a las que se aplicaba la bacteria Agrobacterium tumefaciens en las inflorescencias. Sin embargo, estos mtodos tenan una eficiencia de transformacin prcticamente igual al mtodo que utilizaba cultivo de tejidos. Con otro mtodo que se desarroll posteriormente, se utiliz infiltracin por vaco en las inflorescencias de las plantas, lo que permiti que el aire atrapado en los espacios de la planta saliera y fuera reemplazado con la solucin que contena a Agrobacterium. Con este ltimo mtodo se obtuvieron eficiencias de transformacin de hasta el 1% , por lo que se dispuso de un mtodo eficiente que ya no hizo necesario el uso de cultivos de tejidos y regeneracin de plantas, adems de que se elimin la variacin somaclonal. Si bien el mtodo de infiltracin por vaco result sencillo y confiable, se ha simplificado an ms con el procedimiento de inmersin floral reportado por Clough y Bent (1998) en el que fundamentalmente se sustituy el tratamiento por vaco con el uso de un detergente. En la figura 6.14 se muestran plantas de Arabidopsis y algunos de los pasos utilizados en su transformacin.

6.5.3.

El mtodo de biobalstica

El mtodo de biobalstica fue desarrollado como una necesidad para transformar especies de plantas originalmente recalcitrantes a la transformacin por el sistema de Agrobacterium, incluyendo los cereales econmicamente importantes. Este mtodo consiste en la introduccin de proyectiles, usualmente de tungsteno u oro cubiertos de DNA e impulsados al interior de las clulas blanco por aceleracin. La velocidad de las partculas puede ser generada por la explosin de una pistola convencional o una descarga por gases a alta presin, tales como helio o bixido de carbono. El anlisis molecular de plantas transformadas por biobalstica revela un patrn complejo de la integracin del transgn, sin embargo, ha sido demostrado que las copias mltiples se encuentran arregladas formando un locus simple y segregan siguiendo un patrn mendeliano. Al igual que con Agrobacterium un gran numero de especies diversas de plantas han sido transformadas por el mtodo de biobalstica. Algunas ventajas del mtodo de biobalstica son las siguientes: 1) Pueden ser utilizados una amplia variedad de tipos de explantes para ser bombardeados y obtener plantas frtiles; 2) No hay necesidad de utilizar vectores de transformacin especializados; y 3) Es el nico mtodo confiable para la transformacin de cloroplastos. La figura 6.15 muestra el procedimiento general de transformacin y en la figura 6.16 se muestran diferentes pasos de la transformacin de plantas de arroz. 165

Figura 6.14. Transformacin de Arabidopsis thaliana. a) Aplicacin del inculo de Agrobacterium a botones florales de las plantas, utilizando una micropipeta. b) Aplicacin del inculo por inmersin en una suspensin con Agrobacterium, de acuerdo a Clough y Bent (1998). c) Seleccin de plantas de Arabidopsis en medio MS con kanamicina a una concentracin de 50 g/ml. D) y E) Plntulas de Arabidopsis analizadas por tincin para determinar que se integr el gen de inters. 166

Figura 6.15. Transformacin de plantas por biobalstica. El tejido blanco es bombardeado con micropartculas impregnadas con el DNA que se desea introducir. En este caso no se requiere insertar previamente el DNA en un vector especfico. Despus del bombardeo el procedimiento de seleccin y regeneracin es igual al seguido para la transformacin con Agrobacterium.

6.5.3. Comercializacin y bioseguridad de plantas transgnicas Los tomates de maduracin lenta fueron las primeras plantas transgnicas en llegar al mercado en 1994 y en la actualidad se tienen plantas de varias especies que se producen comercialmente con tolerancia a herbicidas y resistencia a insectos y virus). El rea cultivada de plantas transgnicas se increment de 1.7 millones de hectreas en 1996 a 90 millones de hectreas en 2005, siendo USA, Argentina, Canad, Brasil y China los principales productores, con un 99% del rea cultivada. Actualmente existen 21 pases que han adoptado la tecnologa de los transgnicos, incluyendo Inglaterra, Francia, Alemania y Espaa, lo que significa que cada ao ms pases y agricultores se convencen del uso de esta tecnologa. Los principales cultivos transgnicos cultivados en 2005 fueron la soya, el maz, el algodn y la canola. Actualmente el 60% de la soya que se cultiva es transgnica, el 28% del algodn, el 18% de la canola y el 14% del maz. Los principales rasgos fenotpicos que se han generado en los transgnicos son la tolerancia a herbicidas, la resistencia al ataque de insectos y la resistencia a virus. 167

Figura 6.16. Etapas de la transformacin de arroz. A) Callos obtenidos a partir de escutelo de semillas. B) y C) Seleccin de callos en higromicina a una concentracin de 50 y 80 mg/L, respectivamente. D) Expresin transitoria de un gen reportero (GUS) en callos bombardeados con pSPS950 y pCAMBIA1300. E) Expresin estable de GUS en callos seleccionados en higromicina F) Generacin de brotes a partir de callos G) Cultivo de plantas en condiciones de invernadero. H) Produccin de flores en plantas de arroz transformadas. I) Expresin de GUS en hoja de plantas transformadas J) Expresin de GUS en granos de polen de plantas heterocigotas para el gen uidA. K) Expresin de GUS en granos de polen en plantas transformadas homocigotas para uidA. L) Polen de plantas T1 que no manifiestan la expresin de GUS. 168

A los organismos que han adquirido una combinacin gentica novedosa mediante las tcnicas de la biotecnologa moderna se les llama organismos genticamente modificados (OGMs). Dentro de los OGMs, los que han causado ms polmica en nuestro pas son las plantas transformadas genticamente o transgnicas, debido por un lado a que existe ya un mercado amplio de estos cultivos propiciados por empresas que han invertido en esta rea, y por otro lado a que uno de los cultivos comercializados es el maz, del cual Mxico es centro de origen y de diversidad gentica. Mientras las empresas biotecnolgicas argumentan que los incrementos en la produccin agrcola permitirn alimentar a mayor nmero de personas, se ha cuestionado que esta mayor produccin va acompaada de mayores insumos, debido principalmente a la compra de semilla, lo que al final de cuentas no representa un beneficio real. Adems, se menciona que la transferencia de esta tecnologa va diseada principalmente para los grandes productores, por lo que los pequeos agricultores quedarn al margen de ella. Aunado al problema de la productividad, se encuentra el de la transferencia de informacin gentica de las plantas transgnicas a los cultivos no transgnicos o bien a sus parientes silvestres, pero este asunto slo puede resolverse mediante estudios de campo a largo plazo para cada cultivo. El consumo de alimentos derivados de OGMs ha sido tambin motivo de debate, con aseveraciones de que producen cncer o intoxicaciones y en el otro extremo, de que no producen ningn trastorno para la salud. Todos estos argumentos, en pro y en contra, deben ser resueltos con base en pruebas cientficas y datos sociales confiables y ser analizados caso por caso. En Mxico se aprob en el ao 2005 una Ley de Bioseguridad de OGMs, lo cual desat una gran polmica en el medio social y poltico. A continuacin se resumen los aspectos esenciales que contempla esta ley: 1) La responsabilidad en materia de bioseguridad se descarga principalmente en tres Secretaras: la SEMARNAT, SAGARPA y SSA, y en caso de importaciones de OGMs a la SHCP, las cuales resolvern en una primera etapa si es procedente la expedicin de permisos. La SAGARPA tiene la competencia sobre las especies agrcolas, ganaderas y pesqueras, quedando las especies silvestres y forestales a cargo de la SEMARNAT. No obstante esta separacin de especies, se tiene contemplado el intercambio de opiniones obligadas para determinar sobre los permisos. La SSA participar en todos los casos en que exista un riesgo para la salud humana. 2) Para la liberacin de un OGM al medio ambiente la presente ley contempla tres niveles, siendo la menos riesgosa la liberacin experimental, que considera medidas de contencin de tipo fsico, qumico o una combinacin de varias. La liberacin en programa piloto puede o no contemplar medidas de contencin y constituye una etapa previa a la liberacin comercial, y en esta ltima ya no se adoptan medidas de contencin. Si bien la generalidad de la ley 169

no permite especificar en detalle las consideraciones para la liberacin de OGMs, se manejan los siguientes aspectos: a) Un anlisis de caso por caso de acuerdo a la mejor evidencia cientfica y tcnica disponible. b) Un anlisis paso por paso, que contempla los tres niveles de liberacin mencionados anteriormente. c) La presencia de centros de origen y de diversidad gentica, que slo autoriza liberaciones de OMGs cuando se trata de especies distintas a las nativas. d) Proteccin de los cultivos agrcolas de tipo orgnico en aquellos casos en los que no sea posible la coexistencia con los OMGs. e) Proteccin de las reas Naturales Protegidas, donde slo se permitirn actividades con OMGs para fines de biorremediacin, es decir, para proteger a las especies silvestres. 3) Se contempla en la ley de OMGs la elaboracin de Normas Oficiales Mexicanas que definirn los criterios especficos para la liberacin de este tipo de organismos. 4) Con respecto a las actividades de investigacin realizadas con la utilizacin de OGMs, se utiliza la definicin de utilizacin confinada, en la que existen barreras efectivas para evitar el contacto de estos organismos con la poblacin y con el medio ambiente. Para este propsito es necesario dar aviso a la SEMARNAT o a la SAGARPA, en formatos especiales que se definirn para este propsito. 5) Los OMGs que se destinen para consumo humano o que tengan finalidades de salud pblica sern considerados en una categora especial de anlisis y requerirn de la autorizacin de la SSA, utilizando los criterios que se definirn en las Normas Oficiales Mexicanas. 6) Para formular las polticas de la Administracin Pblica Federal relativas a la bioseguridad de los OGMs se considera una Comisin Intersecretarial (CIBIOGEM), integrada por los titulares de SEMARNAT, SAGARPA, SSA, SHCP, Secretara de Economa, SEP y el CONACYT. Esta Comisin contempla la opinin de un Consejo Consultivo Cientfico, que se conformar por expertos en diferentes disciplinas, provenientes de instituciones de investigacin y sociedades cientficas de reconocido prestigio. Los integrantes de este Consejo se elegirn mediante convocatoria pblica que emitir el CONACYT. Se contempla adems un Consejo Consultivo Mixto con representantes de asociaciones, cmaras y empresas, que podrn opinar sobre aspectos sociales y econmicos relativos a las polticas de regulacin y de fomento, as como para el mejoramiento de trmites y procedimientos. 170

7) Se contemplan en esta ley medidas de seguridad o de urgente aplicacin cuando se pudieran causar daos o efectos adversos y significativos a la salud humana o a la diversidad biolgica o a la sanidad animal, vegetal o acucola, que implican la clausura de los lugares donde se manejen los OGMs e incluso la destruccin de los mismos. Existen adems sanciones que se aplican en los casos en que se trabaje sin los permisos correspondientes o cuando no se d el aviso correspondiente en el caso de la utilizacin confinada. Estas sanciones varan desde 500 a 15 000 das de salario mnimo general vigente en el Distrito Federal. No obstante, slo se contempla un arresto administrativo hasta por 36 horas. 8) Para los productos destinados al consumo humano que contengan OGMs, se contempla el etiquetado, haciendo referencia explcita del uso de estos organismos en su elaboracin, pero slo en los casos en que las propiedades nutrimentales sean significativamente diferentes respecto a los productos convencionales.

6.6. Animales transgnicos Un animal transgnico es el resultado de insertar un gen forneo (transgn) deliberadamente en su genoma, con el fin de modificar alguna caracterstica del animal, ya sea porque el transgn introduzca una nueva funcionalidad o porque bloquee la expresin de un gen particular del husped. La obtencin de animales transgnicos se ha logrado con una frecuencia mucho menor en comparacin con las plantas debido a la mayor complejidad de las funciones biolgicas de los animales y a la mayor dificultad del manejo de sus clulas in vitro o in vivo. El primer animal transgnico creado hace aproximadamente 20 aos, fue un ratn gigante en cuyo genoma se haba incorporado el gen de la hormona del crecimiento de rata. Actualmente existen ratas, pollos, conejos, cerdos, vacas, ovejas, cabras y peces transgnicos, si bien, el 95% de los animales transgnicos existentes son ratones. Estos animales, especialmente los ratones, se emplean de manera rutinaria en investigacin, y no se producen animales transgnicos para el consumo humano. Los animales transgnicos se estn utilizando para: a) Profundizar en el estudio del desarrollo y fisiologa del animal b) Estudiar enfermedades y contribuir al desarrollo de tratamientos ms efectivos c) Producir productos biolgicos tiles d) Ensayar la seguridad de vacunas y productos qumicos e) Incrementar en animales de granja la calidad y cantidad de sus productos f) Conseguir rganos que puedan utilizarse en transplantes 171

6.6.1. Mtodos de obtencin de animales transgnicos El primer paso consiste en identificar y aislar el gen que se desea insertar en el genoma del animal con el fin que manifieste un carcter determinado o produzca la sntesis de una protena. Para introducir el gen existen distintos mtodos: A) Microinyeccin de DNA en el proncleo de un cigoto. Se extraen los vulos de hembras en la que se ha inducido una sper ovulacin, y se fecundan in vitro. Bajo un microscopio, el vulo fecundado se inmoviliza con una micropipeta y se inyecta una pequea cantidad de una solucin que contiene muchas copias del transgn en el proncleo masculino. Posteriormente, estos vulos fecundados se introducen en madres adoptivas, previamente tratadas con hormonas que induzcan el momento adecuado de su ciclo ovrico para recibir el embrin y que progrese el embarazo. (Figura 6.17). Este mtodo no permite controlar la integracin del gen en el lugar adecuado del genoma, sino que la integracin se efecta al azar. A causa de ello, no todos los animales que nacen han incorporado el transgn (no son transgnicos), o lo han incorporado en un lugar no deseado, lo cual puede provocar que nazcan con terribles deformidades. Slo en un pequeo porcentaje, el gen se ha introducido en el lugar adecuado y se expresa de un modo satisfactorio. Los animales que se identifiquen como transgnicos sern la generacin inicial, a partir de la cual y mediante cruzamientos se obtendr una lnea transgnica donde el transgn ser estable. B) Transferencia del gen empleando retrovirus como vectores. En este mtodo se emplean virus capaces de transportar el transgn hasta las clulas embrionarias e insertarlo en su genoma. Al igual que la microinyeccin, la insercin se efecta al azar, por lo que para tener lneas puras es necesario proceder a una seleccin de la progenie. C) Transformacin de clulas madre embrionarias. Este mtodo es menos aleatorio que los anteriores y se utiliza para dirigir los transgenes a lugares especficos del genoma. El proceso consiste en transformar las clulas madre en cultivo con el transgn utilizando los vectores adecuados. Las clulas madre transformadas se inyectan en embriones en fase de blastocisto, y se implantan en una madre adoptiva. Al igual que en los mtodos anteriores, ser necesario proceder a la seleccin y cruzamiento para obtener una lnea transgnica pura. (Figura 6.18).

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Figura 6.17. Microinyeccin de genes humanos en vulos de cerdos fecundados.

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Figura 6.18. Obtencin de ratones transgnicos mediante la transformacin de clulas madre embrionarias. Mediante seleccin se llegan a obtener lneas puras.

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6.7. Uso de organismos transgnicos para estudiar la funcin de los genes Existen varias estrategias para estudiar la funcin de los genes utilizando ya sea plantas o animales transgnicos. Una de las estrategias consiste en utilizar genes reporteros, cuya protena puede ser detectada directamente como en el caso de la protena verde fluorescente (GFP), la cual al ser iluminada con luz de onda corta (azul) emite una fluorescencia verde. La GFP es ampliamente utilizada, tanto en plantas, hongos y animales. Un gen reportero que es utilizado en plantas es uidA (GUS) y se obtuvo de la bacteria Escherichia coli. El gen GUS codifica para la enzima -glucuronidasa y su actividad puede ser detectada por mtodos histoqumicas y fluoromtricos. Con el mtodo histoqumico la -glucuronidasa produce un precipitado azul cuando se utiliza el sustrato x-gluc. El gen de la GFP o GUS pueden ser fusionados a regiones reguladoras (promotores) de diferentes genes y de esta manera determinar en que lugar y tiempo se expresan los diferentes genes nativos, sin afectar la viabilidad del organismo. En la figura 6.19 se presentan 6 casos en los que se utiliza el gen de GFP o uidA para estudiar la funcin de algunos genes.

6.8. Clonacin de individuos Con el trmino clonacin nos referimos a la multiplicacin de organismos sin que sea necesaria la reproduccin sexual. Un ejemplo muy sencillo de clonacin es la multiplicacin de las plantas por medio de esquejes. El concepto de clonacin se aplica a cualquier tipo de organismo, no slo a plantas, y, de forma parecida al caso de los esquejes, se pueden clonar otros tipos de organismos. Para que se pueda producir una clonacin es necesario que pueda desarrollarse un organismo completo a partir de una porcin de uno adulto. As, por ejemplo, en el caso de los esquejes, se puede producir una planta completa a partir de una rama de geranio plantada en una maceta. Esto quiere decir que, a partir de la rama utilizada como esqueje, se desarrollan nuevas races, nuevo tallo, nuevas ramas y nuevas hojas. A esta capacidad de regenerar rganos completos a partir de partes del organismo se le denomina totipotencia. De esta forma, muchas plantas son totipotentes, porque pueden regenerar organismos adultos a partir de partes aisladas. Y, por esto, la clonacin de plantas (llamada, normalmente multiplicacin vegetativa) es una prctica habitual.

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Figura 6.19. Estudio de la expresin de genes en plantas y animales transgnicos. A) y B) Son races de plantas transformadas de Arabidopsis thaliana; en A) el promotor sinttico DR5 se fusion a uidA y en B) el promotor del gen CycB1;1 se fusion al mismo gen reportero. Esto permite determinar la presencia de auxinas y la actividad mittica, respectivamente. En C) y D) se muestran hojas y semillas de arroz transgnico en el que el promotor del gen Sacarosa Fosfato Sintasa se fusion al gen reportero uidA, lo que permite determinar los sitios y tiempos de expresin del gen nativo en hoja y semillas. E) Embrin transgnico de pez zebra, en el que el promotor del gen de actina B se fusion al gen de GFP. F) Embrin de Drosophila melanogaster transgnico en el que el promotor del gen engrailed se fusion al gen de GFP; este gen est implicado en la determinacin de la polaridad de los segmentos del cuerpo en este insecto. 176

La totipotencia es mucho ms infrecuente en animales. Slo en los ms simples se pueden observar ejemplos de ella: si una planaria se corta en dos, cada una de las mitades puede regenerar la parte que le falta y dar lugar a una nueva planaria (por ejemplo). De esta forma, se podran multiplicar planarias, como se hace con geranios (aunque el nmero de copias que se pueden hacer tiene un lmite). Algunos animales un poco ms complejos tienen una totipotencia parcial que se manifiesta en la capacidad de regeneracin de rganos perdidos. As, por ejemplo, si se corta el rabo a una lagartija, la lagartija es capaz de desarrollar un nuevo rabo (pero el rabo no es capaz de desarrollar una nueva lagartija). En los ltimos aos, la clonacin de animales ha tenido un mayor desarrollo porque se ha podido trabajar con embriones en vez de con individuos adultos. Los embriones, durante algunas fases de su desarrollo, son totipotentes y, por tanto, pueden ser utilizados para realizar clonaciones. Lo que ha ocurrido, durante estos ltimos aos para que la clonacin de animales se haya desarrollado, es que ha sido posible fabricar embriones en el laboratorio (fertilizando vulos con espermatozoides) y se han desarrollado las tcnicas que permiten cultivar estos embriones fuera del tero durante un tiempo. La oveja Dolly fue clonada hace unos aos por el equipo de Ian Wilmut. La particularidad de este caso no es que la oveja proceda de un embrin fragmentado, sino de que este embrin no fue producido por fertilizacin de un vulo por un espermatozoide. En el caso de Dolly se tom un vulo, y en l se introdujo el ncleo de una clula adulta de la "madre" de Dolly. Esta clula proceda de una glndula mamaria y, por lo tanto, corresponde a un rgano totalmente desarrollado. Bajo ciertos tratamientos, este embrin puede desarrollarse y producir un individuo que es genticamente idntico a su madre. De esta forma se produce la clonacin a partir de un adulto. Esto ha permitido clonar ratones, gatos, vacas y caballos (Figuras 6.20 y 6.21). La empresa Advanced Cell Technology anunci que haba logrado una clonacin humana pero que slo se desarrollaron pocas clulas. Si embargo esto abre una polmica sobre las consecuencias que la clonacin de personas pudiera ocasionar. Recientemente se detect que hubo un fraude por parte de cientficos coreanos que hablaban de una clonacin humana y la produccin de un embrin de pocas clulas.

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Figura 6.20. Clonacin mediante la transferencia de ncleos. La vaca descendiente ser igual al individuo de la parte superior izquierda. 178

Figura 6.21. Animales clonados. En a) se muestra la hembra donadora y en b) el gato clonado y la madre sustituta. En c) se muestra un caballo clonado y en d) 3 terneras.

6.9. Clonacin teraputica y clulas madre Las clulas madre son aquellas clulas dotadas simultneamente de la capacidad de auto renovacin (es decir, producir ms clulas madre) y de originar clulas hijas comprometidas en determinadas rutas de desarrollo, que se convertirn finalmente por diferenciacin en tipos celulares especializados. En el contexto de la actual investigacin, se pretende obtener clulas madre que se mantengan como tales en cultivo en el laboratorio, y que bajo determinados estmulos puedan conducir a poblaciones de clulas diferenciadas. El cigoto (vulo fertilizado) es una clula totipotente, capaz de dar origen a todo el organismo. Durante las primeras divisiones el embrin es una esfera compacta (mrula), en la que todas las clulas son totipotentes, y de hecho esto se refleja de modo natural en los gemelos monocigticos. A los pocos das comienza una primera especializacin, de modo que se produce un 179

blastocisto, con una capa superficial que dar origen al trofoblasto, del que deriva la placenta, y una cavidad casi hueca (rellena de fluido) en la que est la masa celular interna (m.c.i.)(Figura 6.22).

Figura 6.22. Desarrollo de un cigoto hasta blastocisto. a) Cigoto con los dos proncleos. b) y c) Etapas de 8 y 12 clulas. d) Etapa de blastocisto en la que se observa la masa interna de clulas (flecha) que se utilizan en la clonacin teraputica.

Las clulas de esta m.c.i. son pluripotentes, porque aunque por s solas no pueden dar origen al feto completo (necesitan el trofoblasto), son el origen de todos los tejidos y tipos celulares del adulto. Aunque las clulas de la masa celular interna del blastocisto son pluripotentes, no son en s mismas clulas madre dentro del embrin, porque no se mantienen indefinidamente como tales in vivo, sino que se diferencian sucesivamente en los diversos tipos celulares durante la fase intrauterina. Lo que ocurre es que cuando se extraen del embrin y se cultivan in vitro bajo ciertas condiciones, se convierten en clulas inmortales que pueden dar origen a diferentes tejidos. Lo anterior ha permitido que se hayan iniciado estudios tendientes a una clonacin teraputica, para generar rganos o bien restaurarlos cuando se encuentran daados (Figura 6.23). 180

Figura 6.23. Clonacin teraputica. Se ilustra el procedimiento para aislar clulas madre embrionarias de blastocisto, su posterior diferenciacin y su incorporacin en tejidos daados. 181

Las clulas madre tambin pueden obtenerse de otras fuentes aunque tienen una capacidad menor para regenerar diferentes tejidos: a) Clulas madre germinales (EG): se aslan de fetos, a partir de la cresta germinal, donde se est produciendo la diferenciacin de la lnea germinal, b) Clulas madre de adulto (AS): El caso paradigmtico es la clula madre hematopoytica (HSC), que genera todos los tipos de clulas sanguneas y del sistema inmunitario, y que reside en la mdula sea (aunque en la fase fetal se encuentra en hgado y bazo). Esto ha supuesto una sorpresa alentadora, ya que aumenta la perspectiva de obtener a largo y medio plazo terapias celulares, sin los problemas ticos asociados a destruir embriones para obtener clulas madre.

6.10. Secuenciacin del DNA El anlisis ms detallado de la estructura del DNA consiste en averiguar la secuencia de nucletidos. A lo largo del tiempo se han desarrollado diferentes mtodos para obtener la secuencia de nucletidos del DNA, sin embargo, actualmente el mtodo ms utilizado es el de terminacin de cadenas desarrollado por Sanger en 1977. 6.10.1. Mtodo enzimtico de terminacin de cadena o mtodo de Sanger Para obtener la secuencia de nucletidos de un segmento de DNA por el mtodo enzimtico de terminacin de cadena, se necesitan los siguientes compuestos: a) El DNA molde o segmento de DNA que se desea secuenciar. Para poder secuenciar un segmento de DNA, previamente se necesita tener gran cantidad de ese fragmento, y por tanto, hay que clonarlo en un vector apropiado. b) Una enzima que replique el DNA, normalmente la DNA Polimerasa I de E. coli. Esta enzima usa como molde DNA de hlice sencilla y siguiendo las reglas de complementariedad de las bases nitrogenadas va aadiendo nucletidos a partir de un cebador o "primer". c) Un cebador o "primer" que suele ser un oligonucletido corto de alrededor de 20 bases de longitud necesario para que la DNA polimerasa I comience a aadir nucletidos por el extremo 3' OH. Este cebador debe poseer una secuencia de bases complementaria a la del fragmento de DNA que se desea secuenciar. Debido a que la secuencia de nucletidos del segmento que se quiere secuenciar es desconocida, se emplea un "primer" con secuencia complementaria al vector empleado para clonar el fragmento de DNA, adems, este cebador procede de una regin del vector muy cercana al punto de 182

insercin del DNA problema cuya secuencia se conoce. El "primer" utilizado suele marcarse radiactivamente. d) Los cuatro nucletidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). A veces en vez de marcar radiactivamente el cebador, se marca radiactivamente uno de los cuatro nucletidos trifosfato en cada reaccin. e) Por ltimo, se necesitan nucletidos dideoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP). Los nucletidos dideoxi son nucletidos modificados que se sintetizan sin el grupo hidroxilo de la posicin 3' de la desoxirribosa (Figura 6.24). Estos nucletidos pueden incorporarse a la cadena de DNA naciente, pero no es posible que se una a ellos ningn otro nucletido por el extremo 3'. Por tanto, una vez incorporado un nucletido dideoxi se termina la sntesis de la cadena de DNA.

Figura 6.24. Estructura de un dideoxinucletido. El oxidrilo de la posicin 3 de la desoxirribosa es sustituido por un hidrgeno, lo que hace posible que una vez que se incorpora este nucletido en la cadena de DNA en crecimiento ya no es posible adicionar ms nucletidos y la sntesis de DNA se detiene en esa cadena.

6.10.2. Breve descripcin del mtodo enzimtico de terminacin de cadena En primer lugar, deben realizarse en cuatro tubos diferentes, cuatro mezclas de reaccin. Cada mezcla de reaccin contiene los cuatro nucletidos trifosfato (dATP, dCTP, de dTTP y dGTP), DNA polimerasa I, un cebador marcado radiactivamente y un nucletido dideoxi, por ejemplo ddATP, a una concentracin baja. El nucletido dideoxi utilizado (ddATP en este ejemplo) 183

competir con su homlogo (dATP) por incorporarse a la cadena de DNA que se est sintetizando, produciendo la terminacin de la sntesis en el momento y lugar donde se incorpora. Por este sistema, en cada mezcla de reaccin se producen una serie de molculas de DNA de nueva sntesis de diferente longitud que terminan todas en el mismo nucletido y marcadas todas radiactivamente por el extremo 5' (todas contienen en el extremo 5' el cebador utilizado). (Figura 6.25)

Figura 6.25. Terminacin de cadenas por la incorporacin de dideoxinucletidos. Se muestra una reaccin en donde adems de los nucletidos normales trifosfatados se adiciona un dideoxinucletido de timina (ddTTP). Esto produce una poblacin de molculas que se detienen en la sntesis cuando se incorpora el ddTTP.

Los fragmentos de DNA de nueva sntesis obtenidos en cada mezcla de reaccin se separan por tamaos mediante electroforesis en geles verticales de acrilamida muy finos (0,5 mm de espesor) y de gran longitud (cerca de 50 cm) que permiten distinguir fragmentos de DNA que se diferencian en un solo nucletido. Los productos de cada una de las cuatro mezclas de reaccin se depositan en cuatro carriles diferentes del gel. Una vez terminada la electroforesis, el gel se pone en contacto con una pelcula fotogrfica de autorradiografa. La aparicin de una banda en una posicin concreta de la autorradiografa en una de las cuatro calles nos indica que en ese punto de la secuencia del DNA de nueva sntesis (complementario al DNA molde) est la base correspondiente al nucletido dideoxi utilizado en la mezcla de reaccin correspondiente (Figura 6.26). La figura 6.27 muestra dos autorradiografas que contienen secuencias del fago lambda. 184

Figura 6.26. Separacin de cadenas de DNA por electroforesis en un gel de secuenciacin. La posicin de las bandas de DNA que aparecen en la autorradiografa permite hacer la lectura de la secuencia del DNA. Teniendo en cuenta que el DNA de nueva sntesis crece en la direccin 5' 3', si comenzamos a leer el gel por los fragmentos de menor tamao (extremo 5') y avanzamos aumentando el tamao de los fragmentos (hacia 3'), obtendremos la secuencia del DNA de nueva sntesis en la direccin 5' 3'. 6.10.3. Automatizacin del mtodo de secuenciacin de Sanger Una de las modificaciones que han permitido la automatizacin del mtodo de Sanger es que en vez de radiactividad se utiliza fluorescencia y lo habitual es realizar cuatro mezclas de reaccin, cada una con nucletido trifosfato (dTTP) marcado con un fluorocromo distinto. Este sistema permite automatizar el proceso de manera que es posible leer al mismo tiempo los DNAs de nueva sntesis producto de las cuatro mezclas de reaccin. La segunda diferencia radica en el sistema de deteccin de los fragmentos de DNA. La deteccin del tipo de fluorescencia correspondiente a cada reaccin se lleva a cabo al mismo tiempo que la electroforesis, de manera que los fragmentos de DNA de menor tamao que ya han sido detectados se dejan escapar del gel, permitiendo este sistema aumentar el nmero de nucletidos que se pueden determinar en cada electroforesis y, por consiguiente, en cada secuenciacin. (Figura 6.28). 185

Figura 6.27. Autorradiografas de geles de secuenciacin. Las secuencias corresponden a la regin del terminador tI del fago lambda. El vector utilizado fue M13. En la parte derecha de cada figura se detalla parte de las secuencias que se pueden leer con base en la posicin de las bandas. .

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Figura 6.28. Automatizacin del mtodo de secuenciacin de Sanger. Las cadenas son marcadas con compuestos fluorescentes en cuatro reacciones diferentes que luego se mezclan y son sometidas a electroforesis en geles de tipo capilar. El paso de las cadenas fluorescentes es ledo por un lser que pasa la informacin a un procesador que grafica la absorcin con base en la intensidad de la fluorescencia. La lectura se obtiene con base en la grfica. 187

6.11. Transferencia e hibridacin de cidos nucleicos 6.11.1. Tcnicas de Southern y Northern La tcnica de hibridacin Southern se utiliza comnmente para identificar genes en genomas. El DNA digerido con una enzima de restriccin y separado por electroforesis es desnaturalizado por tratamiento con lcali y luego transferido a una membrana o soporte. Luego se incuba la membrana con una "sonda" marcada radiactivamente que es complementaria al fragmento de DNA que se quiere detectar. Como sonda se puede utilizar RNA purificado, DNA obtenido por clonamiento, o un oligonucletido sinttico. Como el DNA de la membrana se encuentra desnaturalizado (se han separado las dos hebras del DNA) es capaz de aparearse con el fragmento de DNA complementario, proceso que se denomina hibridacin. Posteriormente, se lava el exceso de sonda no hibridada y es posible detectar el fragmento que contiene la secuencia deseada exponiendo la membrana a una pelcula radiogrfica (Figura 6.29). Esta tcnica se denomina transferencia e hibridacin Southern en honor a su descubridor. Esta tcnica ha sido de gran utilidad para identificar genes asociados con enfermedades de transmisin gentica, en particular para detectar polimorfismos de diversos genes. Tambin se utiliza para la deteccin de genes introducidos en plantas o animales (Figura 6.30). La variante del mtodo aplicada al anlisis de RNA se denomina "Northern". En ella se utilizan sondas de DNA que hibridan con secuencias de RNA complementarias. Esta es una herramienta muy til para el estudio de los productos de la transcripcin gnica (RNA mensajero) y de su regulacin ya que se pueden estudiar las potenciales variaciones en la abundancia de especies de RNA mensajeros en diferentes condiciones experimentales. En la figura 6.31 se muestra una autorradiografa en la que se detectan transcritos del gen de galactocinasa en E. coli.

6.11.2. Microarreglos Con la tcnica de Northern, la mayora de los investigadores interesados en observar cambios en los niveles de expresin de los genes, tenan que estudiarlos uno por uno. Actualmente con la tecnologa de los microarreglos diseada por Brown P.O. y Botstein D. en 1999, es posible hacer preguntas a todos los genes de un organismo determinado, en un solo experimento. Con la secuenciacin sistemtica de los genomas completos actualmente es posible obtener en el laboratorio el genoma completo de un organismo, generando cada uno de los marcos de lectura abierta (ORF) completos o fragmentos de cada uno de ellos. Actualmente se pueden adquirir las colecciones completas de los genes de varios organismos como: Humano, Arabidopsis thaliana, Saccharomyces cerevisiae y E. coli, por mencionar algunas. 188

Figura 6.29. Hibridacin de DNA mediante la tcnica tipo Southern o Northern. El DNA previamente cortado o RNA extrado se separa en un gel de agarosa por electroforesis y se transfiere a un papel nitrocelulosa o nylon y se hibrida con una sonda de DNA complementaria marcada radiactivamente. El papel se seca y se expone a una pelcula fotogrfica para obtener una autorradiografa. El DNA o RNA con el que hibrid la sonda marcada aparecer como bandas oscuras en la autorradiografa. Es conveniente usar marcadores de peso molecular para determinar el tamao de las bandas observadas.

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Figura 6.30. Anlisis de Southern blot de plantas transformadas de arroz. El DNA genmico de plantas de arroz fue extrado y cortado con la enzima BamHI. La hibridacin se realiz utilizando una sonda de 1201 pb para el gen uidA. La posicin de los marcadores moleculares se indica a la izquierda. Las flechas indican los fragmentos esperados de 2.0 o 2.4 Kb (secuencia codificadora de uidA, el terminador nos y en el ltimo caso una regin lder adicional del gen sps1) despus de digerir con BamHI. Carril 1: DNA de plantas silvestres, carriles 2 y 3: DNA de plantas derivadas de la lnea 2, carril 4: DNA de planta derivada de la lnea 3, carriles 5, 6, 7 y 8: DNA de plantas derivadas de la lnea 7.

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Figura 6.31. Autorradiografas de ensayos tipo Northern. Se aisl RNA total de E.coli y despus de correrse en un gel desnaturalizante de agarosa se transfiri a papel nylon. A y B fueron hibridados con la sonda anti-galK para detectar transcritos del gen galactocinasa y C y D con la sonda anti-tI para detectar transcritos de la regin del terminador de transcripcin tI. Los carriles corresponden a diferentes construcciones genticas que eliminan regiones de la regin del terminador de transcripcin tI.

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La tcnica de microarreglos consiste en ubicar los genes o fragmentos de stos en placas. Posteriormente, se extrae RNA total de clulas que se encuentren en dos situaciones fisiolgicas diferentes para poder compararlas. A partir del RNA mensajero presente en la muestra de RNA total se sintetiza DNA complementario y se marca con fluormetros que tengan diferente color de fluorescencia cada una de las muestras, usualmente rojo (control) y verde (tratamiento). Las laminillas con los microarreglos se hibridan con las muestras de cDNA marcado fluorescentemente y posteriormente se hace una excitacin con lser para que las muestras control y experimental generen fluorescencia. La fluorescencia es leda y procesada en computadora. Esto permite determinar cules genes aumentan su expresin o la disminuyen con respecto al control. En la figura 6.32 se muestra el procedimiento general utilizado El aislamiento del RNA para su utilizacin en microarreglos no difiere de los protocolos habituales para purificar RNA total. Se requieren al menos 30 g de RNA total para realizar un experimento; no se requiere aislar el RNA mensajero y puede no ser importante la presencia de DNA genmico. Para el marcado del RNA (sonda) se utiliza la sntesis in vitro de cDNA de cadena sencilla. En los mtodos ms comunes; se coloca el RNA total junto con un deoxioligonucletido poli-T y un conjunto de hexmeros al azar, permitiendo que reconozcan sus sitios en el RNA mensajero. Posteriormente se agregan los deoxinucletidos A, C, G y T, ms una proporcin de deoxinucletido T marcado con una molcula fluorescente (comercialmente se pueden obtener dUTP-Cy3, dUTP-Cy5, dUTP-alexa3 y dUTP-alexa5; tambin se pueden obtener los mismos fluorforos unidos a dCTP). A la mezcla se agrega transcriptasa inversa que sintetiza el cDNA a partir del mRNA, incorporando el deoxinucletido poli-T marcado en dos reacciones estndar. Finalmente el cDNA marcado se purifica para eliminar el deoxinucletido fluorescente no incorporado al cDNA y se tiene la sonda marcada, lista para probarla en un microarreglo. En la figura 6.33 se muestra un gel de electroforesis en el que se corrieron RNA total y RNA mensajero, marcados con los fluorforos descritos. La hibridizacin de un microarreglo no difiere significativamente de las condiciones que comnmente se utilizan para un experimento tipo Southern o Northern, dependiendo del experimento se fijar la temperatura y la astringencia de la solucin de hibridizacin. El procedimiento consiste en aplicar la solucin de hibridizacin con las sondas sobre la laminilla y cubrirla con un cubreobjetos para permitir que la solucin cubra todo el microarreglo de igual forma que se hace una preparacin para microscopa.

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Figura 6.32. Principios del uso de los microarreglos. 193

Figura 6.33. Imagen de fluorescencia de las sondas marcadas con los fluorforos Cy3 rojo y Cy5 verde, corridas en un gel desnaturalizante de poliacrilamida al 12.5%. Para la obtencin de los valores cuantitativos de cada una de las seales de fluorescencia contenidas en el microarreglo, se requiere del anlisis de las imgenes. Comercialmente se pueden adquirir programas de cmputo para estos fines, tambin se les puede encontrar en sitios de software libre (por ejemplo: http://linus.nci.nih.gov/BRBArrayTools. html). En la mayora de estos programas existen una serie de pasos bsicos para la interpretacin de estas imgenes. En los lectores se utiliza un lser para excitar las molculas fluorescentes unidas al cDNA y poder obtener la imagen de cada una de las muestras contenidas en el microarreglo. Este procedimiento se hace para cada uno de los fluorforos obtenindose dos imgenes, una para el fluorforo Cy3 (rojo) y una para el fluorforo Cy5 (verde) (figura 6.34), las cuales son luego combinadas para obtener una imagen que permite determinar el aumento o disminucin de la expresin de los genes con respecto al control. En la figura 6.34 se muestra un ejemplo, en el que podemos observar puntos amarillos, verdes, rojos y un sin numero de tonalidades entre el verde y el rojo (ver archivo digital). Si para este experimento se marc la muestra experimental en rojo y la control en verde, todos aquellos puntos que se ven rojos o tonalidades anaranjadas, pueden ser interpretados como genes que aumentaron su expresin. Los puntos verdes o tonalidades entre el amarillo y el verde sern aquellos genes que disminuyeron su expresin. Y finalmente los puntos amarillos representan a los genes que en ambas condiciones se expresan de igual forma. Los investigadores reconocieron pronto que la visualizacin de las tonalidades de colores del verde al rojo pasando por el amarillo no era la mejor manera de interpretar la expresin de los genes, por lo que las intensidades de fluorescencia fueron usadas para determinar las relaciones de intensidad de fluorescencia verde/rojo.

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Figura 6.34. Imagen de fluorescencia para un microarreglo hibridizado. En la parte superior izquierda se muestra la fluorescencia derivada de la sonda marcada con dUTP-Cy3 (rojo) y en la parte superior derecha la de la sonda marcada con dUTP-Cy5 (verde). La parte inferior muestra la superposicin de las dos imgenes superiores y permite determinar si aument, disminuy o se conserv igual la expresin de un gen. (Ver archivo digital). 195

Con base en lo anterior se establecieron colores falsos desde el verde pasando por el negro hasta el rojo. Cuando la relacin de fluorescencia es 1 se representa un color negro e indica que no hubo cambio de la expresin del gen con respecto al control. Cuando la relacin es mayor de 1 significa que el gen aumento su expresin con respecto al control y se representa con un color rojo con una brillantez del color proporcional a la expresin diferencial. Cuando la relacin es menor de 1 tendr un color verde con la intensidad de brillantez proporcional a la disminucin de la expresin (Figura 6.35; ver archivo digital).

Figura 6.35. Representacin de la expresin en un microarreglo hipottico con color falso. Inicialmente los genes estn desordenados con relacin a sus patrones de expresin. En la figura derecha los genes ya estn ordenados. Se observa que los genes DOWN, YOYO, MID y LATE se agrupan en clases, sugiriendo que los genes desconocidos (UNK) pueden tener funciones similares a cada una de las clases de genes con los que se agrupan. (Ver archivo digital).

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7. GENOMAS
La ciencia genmica es el estudio de la estructura, contenido y evolucin de los genomas. Esta ciencia ha sido acelerada por el gran volumen de secuencias de nucletidos generadas y que junto con el desarrollo de disciplinas relacionadas como la bioinformtica, han permitido analizar los genomas de alrededor de 100 organismos, algunos terminados y otros en proceso. Un genoma se define por la secuencia completa de su DNA y por lo tanto por el conjunto completo de genes de un organismo, aunque no es posible identificar cada gen inequvocamente sobre la base de su secuencia. Los proyectos de genomas tienen varios objetivos en comn, los cuales son: a) Establecer una base de datos integrada a la Web. b) Ensamblar los mapas fsicos y genticos de un genoma para facilitar estudios de comparacin de genomas e hibridacin de plantas o animales. c) Determinar e identificar el juego completo de genes codificado en un genoma. d) Acumular datos funcionales, incluyendo las propiedades bioqumicas y fenotpicas de los genes. Aqu se incluyen la caracterizacin de transcriptomas y proteomas, que se definen posteriormente. El transcriptoma es el conjunto completo de genes expresados bajo condiciones particulares. Se define en trminos del conjunto de molculas de RNA que estn presentes, y pueden referirse a un solo tipo de clula, a un conjunto ms complejo de clulas o a un organismo completo. Es probable que el transcriptoma sea ms grande que el nmero de genes definidos directamente por el genoma, porque algunos genes generan RNAs mltiples. El transcriptoma incluye RNAs tanto no codificadores como codificadores (RNAm). El proteoma es el conjunto completo de protenas. Debera de corresponder a los RNAm del transcriptoma, si bien puede haber diferencias que reflejen cambios en la abundancia relativa o estabilidad de los RNA mensajeros y de protenas. Puede referirse como proteoma al conjunto de protenas codificadas por todo el genoma, por alguna clula particular o un tejido.

7.1. Los mapas de genomas Un mapa gentico es la descripcin del orden relativo de marcadores genticos en grupos de ligamiento, en los cuales la distancia entre marcadores es expresada como unidades de recombinacin. En los organismos diploides 197

los mapas genticos son ensamblados de datos de cosegregacin de marcadores genticos o rasgos fenotpicos. La unidad estndar de distancia gentica es el centiMorgan (cM), que indica el porcentaje de progenie en los que ocurrieron eventos de recombinacin entre dos marcadores genticos. De esta manera 1 cM es una unidad arbitraria correspondiente a una recombinacin de 1%, y su equivalencia en distancia fsica en el DNA es variable y depende de la especie biolgica. Mientras que en el humano 1 cM equivale aproximadamente a 1000 kb, en la mosca Drosophila la relacin es de 500 kb. Un mapa de restriccin es construido por rompimiento del DNA con enzimas de restriccin y por medicin de las distancias entre los sitios de rompimiento. Estos mapas no se relacionan necesariamente con los genes, pero si permiten determinar la variacin ocasionada por las mutaciones y comparar diferentes individuos. El mapa final de un genoma lo determina la secuencia de su DNA. De una secuencia se pueden determinar las distancias entre los genes y adems determinar si tal secuencia representa una secuencia codificadora de una protena. El mtodo utilizado para secuenciar DNA se basa en el uso de dideoxinucletidos, que al adicionarse interrumpen las cadenas de DNA que se estn alargando, y la automatizacin de ste ha permitido la generacin de secuencias de manera rpida y ha permitido abaratar el costo de la secuenciacin de genomas completos. Los mapas citolgicos elaborados mediante la tincin de Giemsa para generar patrones de bandeado en los cromosomas de la mitosis (captulo 1), ha permitido dividir los cromosomas en bandas. El brazo corto de los cromosomas se designa como p (petite) y el brazo largo como q y las bandas se van numerando partiendo del centrmero hasta los extremos. En el genoma humano se ha conservado la nomenclatura de bandas para relacionarlas con la ubicacin de los genes en las bases de datos. En la figura 1 se presenta el cromosoma Y, y su relacin con mapas fsicos.

7.2. Tamao de los genomas La cantidad total del DNA en el genoma (haploide) es una caracterstica de cada especie de organismo y se conoce como su valor C. Hay una enorme variacin en el valor C, de < 106 pares de bases (pb) para los micoplasmas hasta >1011 pb para algunas plantas y anfibios. La figura 7.2 resume los valores C encontrados en diferentes Phyla. Hay un incremento en el tamao mnimo del genoma en cada grupo cuando se incrementa su complejidad, aunque puede haber una variacin grande dentro de las especies de los Phyla de eucariontes superiores.

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Figura 7.1. El cromosoma Y de humanos, su patrn de bandeado y la relacin con algunas secuencias nucleotdicas determinadas.

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Figura 7.2. El contenido del DNA de genomas haploides est correlacionado con la complejidad morfolgica de eucariontes inferiores, pero vara extensivamente en eucariontes superiores. Se observa que la cantidad mnima de DNA requerido para un miembro de cada grupo, se requiere un incremento en el tamao del genoma para hacer procariontes y eucariontes inferiores ms complejos. Los micoplasmas son los procariontes ms pequeos y tiene un genoma de slo 3 veces el tamao de un bacterifago grande. Las bacterias comienzan con aproximadamente 2 millones de pares de bases. Los eucariontes unicelulares tambin tienen genomas pequeos, si bien ms grandes que los de las bacterias. Ser eucarionte no implica un gran incremento en el tamao del genoma, pues una levadura tiene un tamao de genoma de 1.3 x 107 pb, no mucho ms grande 200

que el tamao de los genomas de las bacterias ms grandes. Un incremento de dos veces en el tamao del genoma es adecuado para formar al moho D. discoideum, capaz de vivir de un modo ya sea unicelular o multicelular. Otro incremento en complejidad es necesario para producir el nemtodo C. elegans, un organismo multicelular sencillo, que tiene un contenido de DNA de 8 x 107 pb. Se requiere incrementar el tamao del genoma para hacer insectos, pjaros, anfibios o mamferos. Sin embargo, despus de este punto no hay buena correlacin entre el tamao del genoma y la complejidad morfolgica del organismo. A continuacin se presenta el tamao del genoma de algunas especies.

Tamao de genomas de algunas especies Phylum Especie Tamao (pb) Algas Pyremonas salina 6.6 x 105 Micoplasma M. pneumoniae 1.0 x 106 Bacterias E. coli 4.2 x 106 Levaduras S. cerevisiae 1.3 x 107 Mohos D. discoideum 5.4 x 107 Nemtodos C. elegans 8.0 x 107 Insectos D. melanogaster 1.4 x 108 Anfibios X. laevis 3.1 x 109 Mamferos H. sapiens 3.3 x 109

Sabemos que los genes son mucho ms grandes que las secuencias necesarias para codificar protenas, porque los exones (las regiones de codificacin) pueden comprender slo una pequea parte de la longitud total del gen. Esto explica porque hay mucho ms DNA del que es necesario para los marcos de lectura de todas las protenas de un organismo. Las partes grandes de un gen interrumpido pueden no estar involucradas en la codificacin de una protena. Puede haber tambin longitudes significantes de DNA entre genes. As, es posible deducir poco del tamao del genoma y del nmero de genes que puede contener. La paradoja del valor C se refiere a la carencia de correlacin entre el tamao del genoma y la complejidad gentica. Hay algunas variaciones extremadamente curiosas en relacin al tamao del genoma. El sapo Xenopus 201

y el hombre tienen esencialmente genomas del mismo tamao. Pero asumimos que el hombre es ms complejo en trminos de desarrollo gentico! En algunos Phyla hay variaciones extremadamente grandes en el contenido de DNA entre organismos que no varan mucho en complejidad (figura 7.2). (Esto es especialmente marcado en insectos, anfibios y plantas, pero no ocurre en pjaros, reptiles y mamferos, los cuales muestran poca variacin dentro del grupo, con un rango de 2 veces el tamao del genoma). Un grillo tiene un genoma de 11 veces el tamao de la mosca de la fruta. En anfibios, los genomas ms pequeos son de < 109 pb, mientras que los ms grandes son de 1011 pb. Es improbable que haya grandes diferencias en el nmero de genes necesarios para especificar a estos anfibios. Actualmente no se entiende por qu la seleccin natural permiti esta variacin y si esto tiene consecuencias evolutivas.

7.3. Los genomas eucariontes contienen secuencias de DNA repetido y no repetido Entre las caractersticas estructurales de los genomas de inters biolgico se encuentra la presencia de elementos repetitivos. Estos elementos fueron determinados primeramente por las cinticas de reasociacin del DNA desnaturalizado. Esta cintica identifica dos tipos generales de secuencias genmicas: 1. El DNA no repetido, que consiste de secuencias que son nicas, hay slo una copia en un genoma haploide. 2. El DNA repetido, que consiste de secuencias que estn presentes en ms de una copia en cada genoma. El DNA repetido se divide en dos tipos generales: a) DNA moderadamente repetido; consiste de secuencias relativamente cortas repetidas entre 10 y 1000 veces en el genoma. Las secuencias estn dispersas a travs del genoma, y son responsables del alto grado de formacin de estructuras secundarias en el pre-RNA porque cuando se encuentran repetidos en un par de intrones forman regiones duplex. b) DNA altamente repetido; consiste de secuencias muy cortas (tpicamente de <100pb) que estn presentes muchas miles de veces en el genoma, con frecuencia organizadas como largas secuencias repetidas. Entre estas secuencias se encuentran los microsatlites, que se consideran hasta un tamao de 13 bases, mientras que tamaos mayores son definidos como minisatlites. Este DNA, frecuentemente est presente en la heterocromatina. 202

Adems de los elementos repetitivos anteriores pueden existir duplicaciones de segmentos grandes de los genomas de hasta 300 kpb. La proporcin del genoma ocupado por el DNA no repetido vara ampliamente. La figura 7.3 resume la organizacin del genoma de algunos organismos representativos.

La proporcin del ADN repetitivo vara de acuerdo al genoma

No repetitivo Porcentaje en el genoma 120 100 80 60 40 20 0
Dr os op h il a X. l ae vis e le ga ns Ra t n ol i Ta ba co E. c

Moderadamente repetitivo

Altamente repetitivo

Figura 7.3. Las proporciones de diferentes componentes de secuencia varan en los genomas eucariontes. Los procariontes contienen slo DNA no repetido. Para los eucariontes inferiores, la mayora del DNA es no repetido; <20% contienen uno o ms componentes moderadamente repetidos. En clulas animales, la mitad del DNA con frecuencia est formado por componentes moderada o altamente repetidos. En plantas y anfibios estos componentes pueden ocupar hasta el 80% del genoma, as el DNA no repetido es reducido a un componente menor. Una parte significante del DNA moderadamente repetido consiste de transposones, secuencias cortas de DNA (1 kpb) que tienen la habilidad para moverse a nuevas posiciones en el genoma y/o hacer copias adicionales de ellos mismos. En algunos genomas de eucariontes superiores pueden ocupar ms de la mitad del genoma.

C.

203

La figura 7.4 muestra que una pequea proporcin (1%) del genoma humano codifica para protenas, de acuerdo a los exones. Los intrones constituyen las secuencias restantes de los genes. Un gen humano en promedio tiene 27 kb de longitud con 9 exones que incluyen una secuencia de codificacin total de 1340 pb. El promedio de la secuencia de codificacin es por lo tanto de slo 5% de la longitud del gen.

Figura 7.4. Distribucin del DNA repetitivo en el genoma humano. El mayor componente consiste de transposones. Los genes que codifican para protenas (exones + intrones) representan la cuarta parte del genoma.

7.4. Genomas bacterianos y el genoma mnimo Los primeros genomas celulares en ser secuenciados fueron de procariontes, empezando con Haemophilus influenzae en 1995, seguido por Micoplasma genitalium en el mismo ao. El arquea Methanococcus jannaschii fue secuenciada en 1996 y E. coli en 1997. El nmero de genes entre procariontes no vara en ms de 10 veces, debido principalmente a que no existe DNA repetitivo, exceptuando los clusters de DNA ribosomales. A continuacin se presenta el nmero de genes y el tamao del genoma de 6 procariontes: 204

Especie Micoplasma genitalium Rickettsia prowazekii Haemophilus influenzae Methanococcus jannaschii Bacillus subtilis Escherichia coli

Tamao del genoma (Mpb) 0.58 1.11 1.83 1.66 4.2 4.6

Nmero de genes

470 834 1743 1738 4100 4288

Hasta el momento de esta revisin se haban secuenciado 341 genomas completos de bacterias y arqueas y se tenan 17 genomas incompletos de otras bacterias. Una fuente actualizada de informacin se puede obtener en http://www.ncbi.nih.gov/genomes/lproks.cgi. El rango de tamao del genoma en procariontes es aproximadamente una orden de magnitud, y el tamao del genoma es proporcional al nmero de genes. Un gen tpico tiene aproximadamente una longitud de 1000 pb. Todas las bacterias con tamaos del genoma menor a 1.5 Mpb son parsitos intracelulares obligados (viven dentro de un hospedero eucarionte que los provee de molculas pequeas). Sus genomas contienen el nmero mnimo de funciones requeridas para construir una clula. Las Archaea tienen propiedades biolgicas que son intermedias entre los procariontes y los eucariontes, pero su tamao del genoma y nmero de genes es parecido al de las bacterias. Su tamao de genoma vara de 1.5 a 3 Mpb, que correspondera a 1500 o 2700 genes. El tamao del genoma de E. coli, la cepa bacteriana ms utilizada en el laboratorio, tiene 4288 genes, con un promedio en longitud de 950 pb, y una separacin promedio entre genes de 118 pb. Pero puede haber diferencias bastante significativas entre cepas. Los extremos conocidos de E. coli son desde la cepa que tiene el genoma ms pequeo, con 4.6 Mpb con 4249 genes y la cepa que tiene el genoma ms grande con 5.5 Mpb con 5361 genes. Actualmente no se conoce la funcin de todos los genes de un genoma. En la mayora de estos genomas aproximadamente el 60% de los genes se pueden identificar en base a su homologa con genes conocidos de otras especies. Los productos de estos genes estn relacionados con el metabolismo, la estructura de la clula, el transporte de componentes y la expresin y 205

regulacin de genes. En virtualmente cada genoma > 25% de los genes no tienen una funcin adscrita. Muchos de estos genes se pueden encontrar en organismos relacionados, lo cual implica que tienen una funcin conservada. Dada su importancia mdica se ha puesto nfasis en secuenciar genomas de bacterias patognicas. Una idea importante sobre la naturaleza de la patogenicidad de las bacterias resulta de la demostracin de que aislados patognicos tienen un rasgo caracterstico. Tienen regiones grandes, 10-200 kpb presentes en su genoma, pero estn ausentes de genomas de variantes no patognicas de la misma especie o especies relacionadas. El contenido de las bases de guanina-citosina de estas regiones con frecuencia difiere del resto del genoma. El concepto de genoma mnimo se refiere al complemento mnimo de genes necesarios y suficientes para mantener un organismo de vida libre y en cierto sentido definir genticamente Qu es la vida?. ste se ha tratado de determinar mediante dos estrategias, una bioinformtica, que pretende identificar los genes que estn presentes en todas y cada una de los genomas secuenciados. La otra estrategia consiste en determinar los genes que son letales para un organismo; en Bacillus subtilis se han encontrado 271 genes letales de los 4100 que posee la bacteria. Con base en estas estrategias se ha inferido que la vida puede ser sostenida con un genoma de entre 250 a 350 genes.

7.5. El nmero total de genes se conoce para algunos eucariontes Cuando se analizan los genomas de los eucariontes la relacin entre el tamao del genoma y el nmero de genes se pierde. Los tamaos de los genomas de los eucariontes unicelulares son parecidos a los genomas bacterianos ms grandes. Los eucariontes superiores tienen ms genes, pero su nmero no correlaciona con el tamao del genoma, como se observa en la figura 7.5.

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Figura 7.5. Relacin de nmero de genes y tamao de genomas en algunos eucariontes. El nmero de genes en un eucarionte vara de 6000 a 40000 pero no existe una relacin directa con el tamao del genoma en los organismos ms complejos. Los datos de secuencia disponibles ms extensivos para los eucariontes inferiores son los de los genomas de las levaduras S. cerevisiae y de S. pombe. Los genomas de las levaduras de 13.5 y 12.5 Mpb tienen 6000 y 5000 genes, respectivamente. El promedio de los marcos de lectura abierto es de 1.4 kb, as que el 70% del genoma est ocupado por regiones de codificacin. La diferencia entre ellos es que solo el 5% de los genes de S. cerevisiae tienen intrones, en comparacin con 43% de S. pombe. La densidad de genes es alta, la organizacin es generalmente similar, si bien los espacios entre genes son un poco ms cortos en S. cerevisiae. Aproximadamente la mitad de los genes identificados por secuencia se conocan previamente o se relacionan a genes conocidos. Los restantes son nuevos, lo que da un indicio del nmero de tipos nuevos de genes que pueden ser descubiertos. El genoma de C. elegans vara entre regiones ricas en genes y regiones en las cuales los genes son menos abundantes. La secuencia total contiene 18500 genes. Si bien el genoma de la mosca (D. melanogaster) es ms grande que el del nemtodo, tiene menos genes ( 13600 genes). Se 207

desconoce por qu la mosca, un organismo mucho ms complejo, tiene slo el 70% del nmero de genes que el gusano. Esto enfatiza de manera convincente la carencia de una relacin exacta entre el nmero de genes y la complejidad del organismo. La planta Arabidopsis thaliana tiene un tamao de genoma intermedio entre el gusano y la mosca, pero tiene un nmero de genes ms grande que cualquiera de los dos (25000). Esto demuestra que las plantas pueden tener ms genes que las clulas animales. El genoma del arroz (Oryza sativa) es 4 veces ms grande que el de A. thaliana, pero su nmero de genes es slo 50% ms grande, con 40000 genes. El DNA repetitivo ocupa entre el 42 y el 45% del genoma. Ms del 80% de los genes encontrados en Arabidopsis estn presentes en el arroz. De estos genes comunes 8000 se encuentran en Arabidopsis y arroz pero no en los genomas de bacterias ni animales que han sido secuenciados. Estos probablemente pertenecen a un conjunto de genes que codifican para funciones especficas, tales como la fotosntesis. Recientemente (septiembre de 2006) se report la secuencia de la primera planta leosa, Populus trichocarpa (Figura 7.6), la cual contiene 45000 genes posibles, y representa un modelo para el estudio de plantas forestales. De los genes reportados slo 5248 de ellos (11 %) no tienen similitud con genes de Arabidopsis. La terminacin del primer borrador de la secuencia del genoma humano fue anunciada en una conferencia de prensa en mayo de 2000, aunque la publicacin se demor hasta 2001. Durante este tiempo se inici una fase de refinamiento del ensamblaje de la secuencia junto con la prediccin de genes. Las estimaciones del nmero de genes del genoma humano han variado desde 20000 hasta 100000 y el consenso actual es que se encuentra alrededor de 30000 a 40000 genes.

208

Figura 7.6. Populus trichocarpa, primera especie arbrea de la que se conoce su genoma. Esta especie tiene un crecimiento rpido y alcanza su madurez reproductiva entre los cuatro y seis aos y se plantea como una de las fuentes de energa renovable.

7.6. Las funciones de los genes en los genomas Las funciones de los genes pueden ser determinadas por los mtodos clsicos mediante la induccin de mutaciones y por las propiedades bioqumicas de las protenas para las cuales codifican. Cuando se conoce la funcin de un gen en una especie es posible inferir la funcin del gen de otra especie si existe una similitud alta entre ambos genes. La identificacin de las funciones de los genes en los genomas permite identificar funciones metablicas especializadas que reflejan la adaptacin de un microbio a un nicho ecolgico. El nmero de genes implicados en procesos celulares definidos en cuatro especies de procariontes se presenta a continuacin:

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FUNCIN Metabolismo central intermedio Metabolismo energtico Metabolismo de lpidos Biosntesis de cofactores Biosntesis de aminocidos Metabolismo de nucletidos Replicacin y reparacin de DNA Transcripcin Traduccin

M. genitalium 6 (1.3)* 31 (6.6) 6 (1.3) 5 (1.1) 1 (0.2) 19 (4.0) 32 (6.8)

H. influenzae 30 (1.7) 112 (6.4) 25 (1.4) 54 (3.1) 68 (3.9) 53 (3.0) 87 (5.0)

E. coli 188 (4.4) 243 (5.7) 48 (1.1) 103 (2.4) 131 (3.1) 58 (1.4)

M. jannashii 18 (1.0 158 (9.1) 9 (0.5) 49 (2.8) 64 (3.7) 37 (2.1)

115 53 (3.0) (2.7) 12 (2.5) 27 (1.5) 55 (1.3) 21 (1.2) 101 (21.4) 141 (8.1) 182 117 (6.7) (4.2) Funciones 7 (1.5) 64 (3.7) 178 18 (1.0) reguladoras (4.2) Transporte 34 (7.2) 123 (7.0) 427 56 (3.2) (10.0) Estructura celular 17 (3.6) 84 (4.8) 237 25 (1.4) (5.5) Procesos celulares 21 (4.5) 53 (3.0) 327 26 (1.5) (7.6) Otras categoras 27 (5.7) 93 (5.3) 364 38 (2.2) (8.5) No clasificados 152 (32.3) 736 (42.1) 1632 1049 (38) (60.4) TOTAL 471 1750 4288 1738 * Los nmeros en parntesis representan porcentajes de todos los genes Destacan en los datos anteriores que en M. genitalium, un parsito, slo un gen se destina para el metabolismo de aminocidos, ya que normalmente los obtiene de su hospedero. M. jannashii, un arquea, dedica una proporcin alta de sus genes (9.1%) al metabolismo energtico, seguramente por su metabolismo energtico especializado. Del genoma de la mosca Drosophila melanogaster se puede determinar que tantos genes son dedicados en los eucariontes a cada tipo de funcin. Entre los genes identificados, se encuentran 2500 enzimas, 750 factores de transcripcin, 700 transportadores y canales inicos, y 700 protenas 210

involucradas con transduccin de seales. La mitad de los genes codifican para productos de funcin no conocida. Aproximadamente el 20% de las protenas reside en la membrana. La secuencia de la planta Arabidopsis thaliana se public para cada cromosoma en 1999 y 2000 en la revista Nature. La porcin secuenciada fue de aproximadamente 115 Mpb, con una prediccin de genes de 25500. El genoma presenta dos rondas de duplicacin genmica seguida de intercambios de regiones cromosmicas y una considerable prdida de genes. Del total de genes slo el 9% se han caracterizado experimentalmente y el resto hasta cerca de un 70% se han clasificado de acuerdo a la similitud de secuencias de protenas de funciones conocidas en otros organismos. La clasificacin de las funciones de 17833 genes se presenta en la figura 7.7.

Figura 7.7. Funciones de los genes en Arabidopsis thaliana. En esta planta se estiman 25500 genes, de los cuales 17833 tienen una funcin posible identificada. Entre los genes con funciones nuevas en Arabidopsis y que no existen en los animales se encuentran los de defensa de la planta, que representan el 211

11.5% (2055 genes). Asimismo, en las plantas existen genes que codifican enzimas para la sntesis de la pared celular y para movilizar nutrientes. En el genoma del rbol Populus trichocarpa las funciones de los genes son similares con respecto a Arabidopsis, con la excepcin de que se encuentran sobre representados los genes asociados con la sntesis de pared celular, lo cual se considera que es debido a la estructura leosa de la especie. En el genoma humano, la empresa Celera Genomics report la secuenciacin de 2.91 X 109 bases de la regin eucromtica. Se hizo la prediccin de 26383 genes, de los cuales el 41.7 % permanece con funcin desconocida. Las funciones de los grupos principales de genes se presentan en la figura 7.8. Destaca que al igual que Arabidopsis una parte importante se destina a la sealizacin o transduccin de seales, as como a las enzimas del metabolismo. Uno de los problemas en la comparacin de las funciones de genes en los genomas es la clasificacin de los mismos, que puede variar en cada caso.

Figura 7.8. Funciones principales de los genes del genoma humano de 26 383 genes potenciales identificados.

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7.7. Familias de genes El nmero de tipos diferentes de genes es menor que el nmero total de genes, porque algunos genes estn presentes en ms de una copia o estn relacionados con otros. Una familia de genes relacionados se produce por duplicacin de un gen ancestral seguida por acumulacin de cambios en la secuencia entra las copias. Frecuentemente los miembros de una familia estn relacionados pero no son idnticos. La figura 7.9 compara el nmero total de genes con el nmero de distintas familias. En las bacterias, la mayora de genes son nicos, as el nmero de familias distintas es parecido al nmero total de genes. La situacin es diferente en el eucarionte inferior S. cerevisiae, donde hay una proporcin significante de genes repetidos. El efecto ms llamativo es que el nmero de genes se incrementa ms notoriamente en eucariontes superiores, pero el nmero de familias de genes no cambia mucho.

Figura 7.9. Relacin entre el nmero de genes y familias distintas de genes en el genoma de algunas especies. Los genes que codifican para protenas correspondientes en diferentes organismos se denominan ortlogos. Operacionalmente, dos genes en diferentes organismos se consideran con la misma funcin si sus secuencias son similares en ms del 80% en su longitud. Por este criterio, 20% de los genes de la mosca tiene ortlogos en la levadura y el gusano. Estos genes probablemente se requieren en todos los eucariontes. Esta proporcin se 213

incrementa a 30% cuando se compara la mosca con el gusano, probablemente representa la adicin de funciones comunes a eucariontes multicelulares. Un ejemplo de familias de genes son los que codifican para enzimas que sintetizan sacarosa en plantas, denominados SPS. En Arabidopsis thaliana se han reportado 5 genes SPS y el mismo nmero en el trigo y en el arroz. En la figura 7.10 se presenta un alineamiento esquemtico de los genes SPS de arroz de la subespecie japonica. La similitud o identidad entre los genes son altas al nivel de la secuencia de aminocidos de las protenas para las cuales codifican. La similitud o identidad menor se encuentra entre SPS1 y SPS2 con 57% de identidad, mientras que la identidad ms alta se presenta entre SPS2 y SPS6 con 87%. La duplicacin de algunos genes SPS ocurri antes de la separacin de algunos grupos de plantas, ya que por ejemplo la protena SPS2 de trigo presenta una identidad de 88% con la SPS8 de arroz, lo cual sugiere que ambas provienen de un gen ancestral comn y por lo tanto son ortlogos.

Figura 7.10. Representacin esquemtica de los 5 genes SPS de Oryza sativa subespecie japonica. El nmero asignado a cada gen indica el cromosoma en el que se encuentra ubicado. Los rectngulos negros representan los exones y las lneas que los unen a los intrones. Los codones de inicio y terminacin de la traduccin aparecen en los extremos.

7.8. El genoma humano y la evolucin de especies complejas Una de las preguntas que ms se ha planteado es de qu persona fue el genoma que sirvi como base para la secuenciacin?. El borrador del genoma fue presentado por dos organismos independientes, The Internacional Human Genome Sequencing Consortium (IHGSC) y por la empresa privada Celera Genomics, los cuales reportaron que ensamblaron sus secuencias de bibliotecas mltiples provenientes de diferentes individuos de varias etnias, aunque sus identidades permanecen desconocidas. El IHGSC escogi 8 214

bibliotecas de individuos de etnias desconocidas, mientras que Celera Genomics escogi 5 bibliotecas, de un africano, un asitico, un hispano y dos caucsicos. El genoma haploide humano contiene 22 autosomas ms los cromosomas Y o X. El rango en tamao de los cromosomas va de 45 a 279 Mb de DNA, constituyendo un tamao total del genoma de 3,286 Mb (3.3 x 109 pb). De acuerdo a la estructura del cromosoma, la totalidad del genoma puede ser dividido en regiones de eucromatina (que contiene genes activos) y heterocromatina. Hasta 1994 se haba publicado el 99% de las secuencias de la eucromatina, con una tasa de error de 1 evento por cada 100000 bases. Sin embargo, trechos largos de la heterocromatina, asociada principalmente a los centrmeros, que puede representar hasta el 20% del total del genoma, no ha sido secuenciada y posiblemente no se secuenciar durante varios aos ms. En base a la comparacin con otras especies y con genes conocidos que codifican para protenas hay 24000 genes claramente identificables. El anlisis de la secuencia identifica otros 12000 genes potenciales ms. Esto muestra un incremento relativamente pequeo sobre la mosca y el gusano (13600 y 18500, genes respectivamente). Los genomas de mamferos y roedores se ubican en un rango de tamao estrecho, 3 x 109 pb. El genoma de ratn es 14% ms pequeo que el genoma humano. Los genomas contienen un nmero de genes y de familias de genes similares, con la mayora de genes con ortlogos en el otro genoma, pero con diferencias en el nmero de miembros de una familia, especialmente en aquellos casos donde las funciones son especficas para las especies. El nmero estimado de 30000 genes para el genoma de ratn est en el rango mnimo estimado para el genoma humano. Adems de los 30000 genes que codifican para protenas hay 4000 pseudogenes y 800 genes que representan otros RNAs que no codifican para protenas. La diferencia en secuencia de DNA entre el hombre y el chimpanc es extremadamente pequea (> 99% de similitud) y el 29% de las protenas ortlogas son exactamente iguales y el resto difieren en promedio en la sustitucin de 2 aminocidos. La comparacin de la secuencia del genoma humano con secuencias encontradas en otras especies revela algunos aspectos sobre el proceso de evolucin y demuestra que las especies ms complejas evolucionaron por adicin de genes con funciones nuevas. La figura 7.11 analiza genes humanos de acuerdo a la amplitud de su distribucin en la naturaleza. El 21% de los genes son comunes a eucariontes y procariontes y codifican para protenas que son esenciales para la vida, esencialmente para el metabolismo bsico, la replicacin, la transcripcin y la traduccin. Otro 32% de los genes se adicionan en eucariontes en general y codifican para protenas involucradas en funciones que son especficas para clulas eucariontes pero no para bacterias, como por ejemplo pueden estar 215

relacionadas con la formacin de organelos o componentes del citoesqueleto. Otro 24% de los genes son necesarios especficamente para los animales como grupo e incluyen genes necesarios para la multicelularidad y para el desarrollo de diferentes tipos de tejidos. El 22% de los genes son nicos para los vertebrados y codifican principalmente para protenas de los sistemas inmune y nervioso. Estas comparaciones permiten apreciar que la progresin de bacterias a vertebrados requiere la adicin de grupos de genes que representan las nuevas funciones necesarias en cada estado.

Figura 7.11. Evolucin de la complejidad del genoma humano con base en la relacin de genes homlogos distribuidos en otras especies. Un anlisis del proteoma humano con otros eucariontes revela que existe un grupo clave de aproximadamente 1300 protenas que se encuentran presentes en los proteomas de levadura, C. elegans, Drosophila y humano. Estas protenas realizan funciones esenciales de mantenimiento general de la clula y sus funciones se presentan en la figura 7.12. Las protenas comunes son protenas de mantenimiento bsicas que se requieren para funciones esenciales. Las funciones principales estn relacionadas con la transcripcin y la traduccin, metabolismo transporte, replicacin y modificacin del DNA, plegamiento y degradacin de protenas y procesos celulares.

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Figura 7.12. Las protenas que son comunes a todos los eucariontes tienen funciones celulares esenciales.

7.9. Genes esenciales en eucariontes La seleccin natural es la fuerza que asegura que genes tiles sean retenidos en el genoma. Las mutaciones ocurren al azar, y el efecto ms comn en un marco de lectura abierto es daar el producto proteico. Un organismo con una mutacin daina estar en desventaja evolutiva y finalmente la mutacin ser eliminada por fracaso competitivo de los organismos que la contienen. Si la proporcin de genes humanos esenciales es similar a otros eucariontes, se calcula un promedio de entre 4000 a 8000 genes en los cuales las mutaciones deberan ser letales o producir efectos evidentemente dainos. Hasta ahora, 1300 genes han sido identificados en los cuales las mutaciones causan defectos evidentes. Esto es una proporcin substancial del total esperado, especialmente en vista del hecho de que muchos genes letales pueden actuar tan temprano que sus efectos no se puedan ver. La mayora de los defectos conocidos son debido a mutaciones puntuales. Cmo se explica que la deplecin de genes parezca no tener efecto en la supervivencia?. Una posibilidad es la redundancia gentica, esto es, que tales genes estn presentes en copias mltiples. Esto se ha observado para algunos casos en los cuales genes mltiples deben de ser bloqueados para producir un efecto. Es claro que hay casos en los cuales un genoma tiene ms de un gen capaz de proveer una protena para cubrir una misma funcin. 217

7.10. Genomas de organelos La primera evidencia de la presencia de genes fuera del ncleo fue proporcionada por la herencia no mendeliana en plantas, en la cual frecuentemente se presenta una herencia uniparental, cuando el genotipo de un solo padre es heredado, mientras que el del otro progenitor es perdido permanentemente. Usualmente es el genotipo de la madre el que es heredado por lo que se le llama herencia maternal. Se acepta ampliamente que las mitocondrias y los cloroplastos evolucionaron de bacterias que fueron engullidas por clulas ancestrales nucleadas. Como una reliquia de su pasado evolutivo ambos tipos de organelos poseen sus propios genomas, as como su propia maquinaria biosinttica para elaborar RNA y protenas del organelo. Los organelos tienen menos genes que los de una bacteria independiente, y han perdido varias de las funciones genticas que son necesarias para una vida independiente, tales como las vas metablicas. La transferencia de DNA entre el organelo y el ncleo ha ocurrido durante periodos evolutivos y an contina, aunque se acepta que la transferencia mayor de genes del organelo al ncleo ocurri en un periodo cuando los compartimentos estuvieron menos rgidamente definidos, de manera que fue ms fcil para el DNA ser reubicado. La relacin entre los sistemas genticos de los organelos y el ncleo se presenta en la figura 7.13.

Figura 7.13. Relacin entre los genomas de organelos y nucleares en organismos eucariontes. 218

Las mitocondrias y plastidios nunca son formados a partir de sus componentes aislados, sino que se originan por el crecimiento y divisin de mitocondrias y plastidios ya existentes. La biosntesis de estos organelos requiere de dos sistemas genticos separados, ya que la mayora de sus protenas son codificadas en el DNA nuclear, sintetizadas en los ribosomas del citosol y posteriormente importadas e internalizadas a los organelos. Otras protenas son codificadas por el DNA de los organelos y sintetizadas en ribosomas que se encuentran el interior del organelo. Los genomas de los organelos generalmente consisten de una molcula circular y con pocas excepciones son lineales, en el caso de eucariontes inferiores. Usualmente hay varias copias del genoma en el organelo individual y puesto que hay varios organelos por clula, se tiene una secuencia repetida mltiples veces, con respecto a la secuencia nuclear que es nica. Las cantidades de DNA de organelos en varias clulas y tejidos se presentan en la siguiente tabla.

Cantidades relativas de DNA de organelos en algunas clulas y tejidos

ORGANISMO TIPO CELULAR O TEJIDO MOLCULAS DE DNA POR ORGANELO ORGANELOS POR CLULA DNA DEL ORGANELO COMO PORCENTAJE DEL DNA CELULAR

DNA MITOCONDRIAL Rata Levadura Rana Hgado Vegetativo Huevo 5-10 2-50 5-10 1000 1-50 10 000 000 1 15 99

DNA DEL CLOROPLASTO Alga Chlamydomonas Maz Vegetativo Hojas 80 20-40 1 20-40 7 15

7.10.1. Genomas mitocondriales Los genomas mitocondriales varan en su tamao total por ms de 10 veces. Las clulas animales tienen genomas mitocondriales pequeos, de aproximadamente 16.5 kb en mamferos, mientras que las plantas tienen un mnimo de 100 kb. En la siguiente tabla se muestra el tamao de algunos genomas mitocondriales. 219

Tamao de genomas mitocondriales y genes que codifican para protenas y RNA ribosomal y de transferencia Especie Hongos Protistas Plantas Animales Tamao en kilobases 19-100 6-100 186-366 16-17 Genes que codifican protenas 8-14 3-62 27-34 13 Genes que codifican RNA 18-28 2-29 21-30 4-24

El DNA mitocondrial humano es una molcula circular de 16569 pares de bases. Este tamao corresponde al primer DNA secuenciado (secuencia Cambridge) aunque existen otras variantes con un nmero de pares de bases que oscila entre 16559 y 16570. El cido desoxirribonucleico mitocondrial humano (mtDNA, por sus siglas en ingls) es una molcula circular compuesta por 16569 pares de bases, que contiene informacin para 37 genes: dos cidos ribonucleicos ribosmicos (rRNA), componentes de los ribosomas especficos mitocondriales, 22 de transferencia (tRNA), que son capaces de leer todo el cdigo gentico, y 13 polipptidos que forman parte de cuatro de los cinco complejos multienzimticos del sistema de fosforilacin oxidativa, etapa terminal de la ruta de produccin de ATP. Estos pptidos corresponden a siete subunidades (ND1, 2, 3, 4, 4L, 5, 6) del dinucletido de nicotinamida y adenina reducido (NADH): ubiquinona xido-reductasa (complejo I); una subunidad (cyt b) de la ubiquinol: citocromo c xido-reductasa (complejo III); tres subunidades (CO I, II, III) de la citocromo c oxidasa (complejo IV), y dos subunidades de la ATP sintetasa (complejo V). (Figura 7.14). En muchos casos, el contenido de GC (guanina-citosina) del DNAmt difiere en gran medida del DNA nuclear, y esto permite separar el DNAmt del nuclear por centrifugacin en un gradiente de cloruro de cesio. No existen histonas u otras protenas semejantes asociadas al DNAmt. Existen muchas copias del genoma mitocondrial en cada mitocondria, las que se ubican en ciertas regiones llamadas nucleoides. En muchos animales, las dos hebras que componen el DNAmt difieren en densidad porque las bases nitrogenadas no estn distribuidas de forma equilibrada en ambas hebras. Esto hace que una hebra sea ms "pesada" y otra ms "liviana". en el DNAmt (Figura 7.14).

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Figura 7.14. Mapa gentico del DNA mitocondrial humano. Se representan las dos hebras del DNA con los genes que codifican: rRNA (12S y 16S), tRNAs, sealados con la abreviatura del aminocido que transportan, y secuencias codificadoras de protenas (CO: subunidades citocromo c oxidasa; Cyt b: citocromo b y ND: subunidades de NADH deshidrogenasa). H1, H2 y L indican los lugares de iniciacin de la transcripcin de las hebras pesada y ligera, respectivamente. OH y OL simbolizan los orgenes de replicacin de la cadena pesada y ligera

La transcripcin en el DNAmt de los mamferos es bastante particular: tiene un solo lugar de inicio y se transcribe en forma continua formando un solo transcrito, inusualmente largo. Este transcrito es procesado luego para producir distintas molculas de RNAt y de RNAr, adems de molculas maduras de RNAm para la produccin de cadenas polipeptdicas. Para eso es interesante observar que los genes que codifican RNAr o RNAm estn separados por genes que codifican RNAt (Figura 7.14). En el largo transcrito original, las molculas de RNAt son identificadas por enzimas que cortan el transcrito y separan los RNAt, dejando libres a los RNAm y RNAr. Estos transcriptos as procesados luego son modificados para producir RNAr maduros. El proceso de modificacin incluye tambin el agregado de la cola de poliadenina al extremo 3' de los RNAm y la secuencia CCA en el extremo 3' de los RNAt. Los RNAm de las mitocondrias no tienen la caperuza (cap) caracterstica del extremo 5' que se agrega en los RNAm del genoma nuclear de los eucariontes. 221

Gracias a que en el genoma mitocondrial humano existe una regin de aproximadamente 400 pares de bases que es altamente polimrfica, y al hecho que las mitocondrias se heredan a travs del citoplasma materno (el del vulo), se puede decir que ese DNA se mantiene inalterable a travs de la lnea materna. Esto permite analizar parentescos por medio de estudios de PCR del DNA mitocondrial, porque el DNAmt de cada individuo es idntico al DNAmt de su madre. El DNAmt puede ser obtenido de muestras de sangre u otros tejidos, pero tambin de los huesos, por lo que es posible usar esta tcnica incluyendo a individuos que hayan muerto hace muchos aos. El anlisis del DNAmt est siendo usado para estudios de relaciones filogenticas no slo en humanos sino tambin en muchos otros organismos. Por ejemplo, este sistema puede ser usado para estimar la variabilidad gentica existente en poblaciones naturales. Estos estudios pueden ser de mucha utilidad en polticas de conservacin de especies, particularmente de aquellas bajo amenaza de extincin.

7.10.2. Genomas de cloroplastos Se han secuenciado ms de 20 genomas de cloroplastos. Los genes de estos organelos estn implicados en cuatro tipos de procesos principales: transcripcin, traduccin, fotosntesis y la sntesis de pequeas molculas, tales como aminocidos, cidos grasos y pigmentos. La sntesis de protenas dentro del cloroplasto se realiza en ribosomas especficos del cloroplasto que son de 70S con dos subunidades de 50S y 30S. Las subunidad de 50S contiene una copia de cada una de las molculas de RNAr de 23S, 5S y 4,5S y la subunidad 30S contiene una molcula de RNAr de 16S. Los cloroplastos vegetales codifican adems para 40 protenas cuyas funciones son an desconocidas. En la siguiente tabla se presenta la relacin de genes y sus funciones en cloroplastos de plantas terrestres. Genes de cloroplastos de plantas terrestres. Tipo de genes Nmero de genes RNA ribosomal 16S 1 RNA ribosomal 23S 1 RNA ribosomal 4.5S 1 RNA ribosomal 5S 1 RNAs transportadores 30-32 Protenas ribosomales 20-21 RNA polimerasa 3 Otros 2 Protenas de fijacin de bixido de carbono y 31-32 presentes en los tilacoides relacionadas con la produccin de energa NADH deshidrogenasa 11 222

De manera caracterstica, el genoma del cloroplasto contiene dos copias de cada uno de los genes para la produccin de RNA de transferencia (RNAt). Los dos sets de genes de RNAt se localizan en dos regiones de 10 a 25 kb con secuencias repetitivas idnticas pero con orientacin invertida que se conocen como IRA e IRB. Hay otros genes en estas secuencias repetitivas invertidas y por lo tanto esos genes tambin estn repetidos. La ubicacin de estas secuencias repetitivas definen otras dos regiones del genoma donde los genes no estn repetidos: una regin corta SSC (short single copy) y una regin ms larga llamada LSC (long single copy). (figura 7.15).

Figura 7.15. Organizacin del genoma del cloroplasto del arroz (Oryza sativa). ORF = marcos de lectura abiertos que codifican para protenas. 16S, 23S, 4.5S y 5S indican los genes que codifican para DNA ribosomales. Los trn representan los genes de RNA transportadores. Atp son los genes de ATP sintasa. Los genes para la RNA polimerasa se indican con rpo. 223

GLOSARIO

ADN o DNA o cido desoxirribonucleico: cido presente en todas las clulas, es el material hereditario que contiene toda la informacin gentica. Al enrollarse con ayuda de las protenas llamadas histonas, forma los cromosomas. ADN o DNA recombinante: Molcula de DNA formada por recombinacin de fragmentos de DNA de orgenes diferentes. Agrobacterium: Gnero de bacterias del suelo que introducen ciertos genes vegetales mediante sus plsmidos. Alelos: Cada uno de los dos genes presentes en el mismo lugar (locus) del par de cromosomas homlogos. En general, uno de los diferentes estados alternativos del mismo gen. Aminocido: Molcula orgnica que contiene los grupos amino y carboxilo. Son los monmeros de las protenas. De su diversidad como del enorme nmero de combinaciones y longitudes resulta la enorme variedad de protenas existentes. Aneuploidia: Condicin en la que una clula u organismo contiene algunos cromosomas de ms o de menos que la forma normal. Antibitico: Literalmente destructor de la vida. Trmino que comprende todas las sustancias antimicrobianas independientemente de su origen, ya sean derivadas de microorganismos (bacterias, hongos, etc.) de productos qumicos sintticos o de ingeniera gentica. Anticodn: Secuencia de tres nucletidos en una molcula de RNAt que forma puentes de H con el triplete complementario (codn) de RNAm. Anticuerpo monoclonal: Anticuerpo monoclonado a partir del cultivo de un nico tipo de clulas (un clon de hibridoma), y que contiene por tanto un solo tipo de protenas (inmunoglobulina). RNA heterogneo nuclear: RNAm primario: localizado en el ncleo y de tamao variable. Precursor del RNA mensajero, se transforma en l despus de la eliminacin de los intrones, las secuencias que no codifican genes. ARN o RNA: Abreviatura comn del cido ribonucleico, uno de los dos cidos nucleicos, localizado esencialmente en los ribosomas del citoplasma celular. Ciertas clases de RNA intervienen en la transcripcin de la informacin gentica contenida en el DNA (RNAm), transportan aminocidos a los ribosomas para su incorporacin en protenas (RNAt) y constituyen a los ribosomas (RNAr). 224

ARNm o RNAm: RNA mensajero: molcula de RNA que representa una copia en negativo de las secuencias de aminocidos de un gen. Las secuencias no codificantes (intrones) han sido ya extradas. Con pocas excepciones el RNAm posee una secuencia de cerca de 200 adeninas (cola de poli A), unida a su extremo 3' que no es codificada por el DNA. Auxtrofo: Organismo mutante (bacteria) que no crece en un medio mnimo pues necesita de la presencia de algn factor de desarrollo. Bacterifago: Virus que ataca a las bacterias. Estos virus son llamados bacterifagos porque destruyen a la bacteria que los hospeda. Biologa molecular: Rama de la biologa que estudia el origen, transformacin e interaccin de los genes y sus productos en el individuo, poblacin o especie. Biotecnologa: Toda aplicacin tecnolgica que utilice sistemas biolgicos y organismos vivos o sus derivados para la creacin o modificacin de productos o procesos en usos especficos. Cncer: Tumor maligno en general. La caracterstica bsica de la malignidad es una anormalidad de las clulas transmitida a las clulas hijas que se manifiesta por la reduccin del control del crecimiento y la funcin celular. Carcter: Rasgo distintivo como expresin de un gen. Catalizador: Sustancia que altera la velocidad de una reaccin qumica, acelerndola o retrasndola, pudiendo recuperarse sin cambios esenciales en su forma o composicin al final de la reaccin. Clula: Unidad morfofuncional de los seres vivos. Puede presentarse aislada (organismos unicelulares) o en grupos (organismos multicelulares). Clulas sexuales: Clulas que al unirse forman el huevo fertilizado. En la especie humana los gametos o clulas sexuales son el espermatozoide (masculino) y el vulo (femenino). Cepa: En microbiologa, conjunto de virus, bacterias u hongos que tienen el mismo patrimonio gentico. Cistrn: Segmento de DNA que comprende dos regiones, intrn y exn; al momento de la traduccin al RNA slo se copia el exn. Citoplasma: Parte fundamental de toda clula viviente (animal o vegetal), excluyendo el ncleo; est compuesta esencialmente de protenas y contiene gran nmero de corpsculos (organelos celulares) de funciones diversas (mitocondrias, vacuolas, plastos, etctera). 225

Clonacin celular: Proceso de multiplicacin de clulas genticamente idnticas, a partir de una sola clula. Clonacin molecular: Insercin de un segmento de DNA ajeno, de una determinada longitud, dentro de un vector que se replica en un husped especfico. Clones: Grupo de clulas o de organismos de idntica constitucin gentica entre s y con el antepasado comn del que proceden por divisin binaria o por reproduccin asexual. Cloroplasto: Organelo celular exclusivo de las clulas de las plantas, donde se lleva a cabo la fotosntesis. Codificar: Capacidad que tiene la secuencia de nucletidos en el cido desoxirribonucleico (DNA) para determinar o especificar la secuencia aminocida que debe tener la cadena polipeptdica de cada tipo de protena. Cdigo del triplete: Sucesin de tres bases de tres nucletidos en la molcula de DNA que cifra un aminocido. Cdigo gentico: Cdigo cifrado por la disposicin de nucletidos en la cadena polinucletida de un cromosoma que rige la expresin de la informacin gentica en protenas, es decir, la sucesin de aminocidos en la cadena polipeptdica. Codn: Conjunto de tres nucletidos (bases del DNA o RNAm) adyacentes que regularmente codifican un aminocido (o la terminacin de una cadena). (Vase triplete.) Comercializacin de OMG: Todo acto que suponga una entrega a terceros de OMG o de productos que los contengan. Sinnimo de puesta en el mercado. Conjugacin: Uno de los procesos naturales de transferencia de material gentico de una bacteria a otra, junto con la transduccin y la trasformacin, realizado por contacto entre ellas. Cristalografa de rayos X: Empleo de modelos de difraccin producidos por la dispersin de los rayos X a travs de cristales, con el objeto de determinar la estructura tridimensional de las molculas. Cromatina: Material nuclear compuesto de DNA y protenas, forma los cromosomas durante la divisin celular. Cromosoma: Estructura visible al microscopio que se observa antes de la duplicacin celular en el ncleo de las clulas. Est compuesto por el llamado cido desoxirribonucleico (DNA) y algunas protenas. 226

Diploide: Clula u organismo con dos juegos de cromosomas. Ploidia significa, en griego, el nmero de juegos de cromosomas. Divisin celular: Forma de reproduccin de las clulas. Existen diferentes procesos mediante los cuales se lleva a cabo, desde la simple divisin del citoplasma con material gentico disperso que realizan las bacterias, hasta los procesos ms elaborados conocidos como mitosis y meiosis. DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGA MOLECULAR: Formulado por Crick, postula que la informacin gentica contenida en los cromosomas determina la sntesis de las protenas mediante la traduccin de un molde intermediario de RNA, formado anteriormente por la transcripcin del DNA. Dominancia: Cuando hay alelos alternativos de un gene, la dominancia la ejerce aqul que se manifiesta en el fenotipo en la presencia del otro. Enzimas de restriccin: Enzimas bacterianas sintetizadas como reaccin defensiva frente a la invasin de DNA extrao, como, por ejemplo, bacterifagos de DNA, a los que degrada mientras que el propio est protegido por metilaciones especficas. Cada una de estas enzimas escinde el DNA siempre en el mismo sitio, en loci especficos o secuencias objetivo. Son las tijeras de la ingeniera gentica que abrieron las puertas a la manipulacin gentica. ES (clulas): Clulas embrionarias no diferenciadas. Pueden cultivarse in vitro de manera prolongada y modificadas genticamente. En un ratn, por ejemplo, una vez implantadas en un embrin contribuyen a la formacin de un individuoquimera que puede transmitir genticamente la modificacin a su descendencia. Escherichia coli: Bacteria alargada, de tres milsimas de micra de largo, que forma parte de la flora microbiana habitual del intestino humano. Eucarionte: Clula que tiene un ncleo bien definido, rodeado por una membrana, en el cual se encuentra el material gentico. Exones: Bloques (fragmentos) de secuencias de DNA que constituyen a los genes y que codifican para dominios discretos de las protenas; se intercalan con regiones que no codifican (intrones) en numerosos genes de clulas de organismos superiores (los eucariontes). Expresin del gen: Producto proteico resultado del conjunto de mecanismos que efectan la decodificacin de la informacin contenida en un gen, procesada mediante transcripcin y traduccin. Fenotipo: Caractersticas morfolgicas, fisiolgicas y conductuales de un individuo o poblacin.

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Fotosntesis: Mecanismo fisiolgico complejo gracias al cual los vegetales verdes, provistos de clorofila, son capaces de fijar el bixido de carbono del aire y transformarlo en materia orgnica, utilizando como fuente de energa la luz solar. Gameto: Clula sexual, espermatozoide y vulo, que porta cada uno la mitad del material gentico (por lo que son haploides) y que al unirse conforman el cigoto o huevo fecundado, a partir del cual se genera un nuevo ser vivo. Gen estructural: El que regula la formacin de un enzima o de una protena estructural. Gen hbrido: El formado por recombinacin in vitro de dos o ms fragmentos de DNA. Gen operador: El que pone en funcionamiento el gen estructural. Gen recesivo: El que necesita doble "dosis" para expresarse. Gen regulador: El que modifica la accin del operador. Gen represor: El que reprime el operador. Gen: Unidad hereditaria que determina cada alternativa (alelo) de un carcter o rasgo gentico. Genes homlogos: Genes que se hallan en pares, cada uno en un cromosoma distinto, pero equivalente (homlogo), provenientes de cada uno de los progenitores. Gentica: Ciencia que trata de la reproduccin, herencia, variacin y el conjunto de fenmenos y problemas relativos a la descendencia. Genoma: Conjunto de todos los genes de un organismo, de todo el patrimonio gentico almacenado en el conjunto de su DNA o de sus cromosomas. Genotipo: Conjunto de la informacin gentica que porta un individuo. Haploide: Estado en el que cada cromosoma est representado una sola vez, en contraste con el estado diploide. Heterocigoto: Constitucin gentica de un individuo que porta un alelo dominante de un progenitor y un alelo recesivo del otro progenitor. Heterodplex: Molcula de DNA de doble cadena, formada por hibridacin de cadenas sencillas complementarias, de diferentes orgenes. 228

Hibridacin: Proceso de generacin de una molcula, clula u organismo combinado con material gentico procedente de organismos diferentes. Hbrido: Individuo cuya constitucin gentica para un determinado carcter consiste en un alelo de un progenitor y un alelo del otro progenitor. Histonas: Protenas ligeramente bsicas solubles en agua y coagulables por el calor; presentes de manera mezclada con el DNA en casi todas las clulas eucarinticas. Pueden servir para enrollar DNA en los cromosomas y afectan la regulacin de la actividad de los genes. Homocigoto: Individuo cuya constitucin gentica consiste en el mismo alelo, dominante o recesivo, para un carcter hereditario. Huella gnica: Representacin grfica de determinadas secuencias del genoma que funcionan como un cdigo de barras de la identidad de un individuo. Husped: Animal o vegetal que alberga o nutre otro organismo (parsito). En manipulacin gentica, organismo de tipo microbiano, animal o planta cuyo metabolismo se usa para la reproduccin de un virus, plsmido o cualquier otra forma de DNA extrao a ese organismo y que incorpora elementos de DNA recombinado. In vitro: Literalmente en el vidrio, en el tubo de ensayos del laboratorio, investigado y manipulado fuera del organismo vivo. Ingeniera gentica: Conjunto de tcnicas utilizadas para introducir un gen extrao (heterlogo) en un organismo con el fin de modificar su material gentico y los productos de expresin. Integracin gentica: Insercin de una secuencia de DNA en otra por recombinacin. Intrones: Bloques de secuencias inactivas del DNA en los genes de eucariontes que se intercalan con los exones (secuencias que codifican la protena) y que se transcriben, pero no se traducen. Kilobase (Kb): Unidad empleada para medir la longitud de los fragmentos de DNA constituidos por una serie de bases. 1 Kb = 1000 bases. loci. Plural de locus. Macromolcula: Molcula de gran tamao. Trmino utilizado para designar molculas de protenas, cidos nucleicos, polisacridos y otras molculas voluminosas. 229

Manipulacin gentica: Formacin de nuevas combinaciones de material hereditario por insercin de molculas de cido nucleico, obtenidas fuera de la clula, en el interior de cualquier virus, plsmido bacteriano u otro sistema vector fuera de la clula. Mapa citogentico: Configuracin de las bandas coloreadas de los cromosomas observada en el microscopio ptico despus de su tincin. Mapa gentico: Diagrama descriptivo de los genes en cada cromosoma Material gentico: Todo material de origen vegetal, animal, microbiano o de otro tipo que contenga unidades funcionales de la herencia. Meiosis: Proceso de divisin celular que llevan a cabo las clulas sexuales mediante el cual se obtienen gametos. Microinyeccin: Tcnica que permite introducir en una clula un gen en solucin, gracias a una micropipeta y bajo microscopio. Mitocondria: Organelo celular donde se lleva a cabo la respiracin. Mosaico: Individuo que presenta dos o mas lneas celulares genticamente diferentes como consecuencia de una anomala en las primeras mitosis del cigoto. Sinnimo de quimera. Mutacin: Cambio en la informacin hereditaria debida al azar. Este cambio puede comprender desde un par de bases en el DNA hasta segmentos enteros de cromosomas. Mutante: Individuo en el que uno o varios caracteres hereditarios estn modificados en relacin con sus ascendientes, despus de producirse la modificacin qumica de un gene. Un gene modificado. Nuclesido: Combinacin de un azcar pentosa con una base nitrogenada prica o pirimidnica. Nucleosoma: Unidad estructural bsica del cromosoma eucarintico. Nucletido: Monmero de los cidos nucleicos, integrado por la combinacin de una base nitrogenada (purina o pirimidina), un azcar (ribosa o desoxirribosa) y un grupo fosfato. Se obtiene como producto de la hidrlisis de cidos nucleicos por accin de nucleasas. OMG = Organismo Modificado Genticamente: Cualquier organismo cuyo material gentico ha sido modificado de una manera que no se produce de forma natural en el apareamiento (multiplicacin) o en la recombinacin natural. 230

Oncogn o gen transformante: Gen que produce la transformacin morfolgica de clulas o formacin tumoral en animales. Se han identificado oncogenes en retrovirus de transformacin aguda o en ensayos de transfeccin de DNA de tumores. Operador: Segmento especial del DNA adyacente al promotor que forma parte de la regin controladora de la transcripcin de un opern. El operador interacciona con la protena represora regulando de esta manera el proceso de la transcripcin sincronizada del opern correspondiente. Opern: Conjunto del gen operador con los genes estructurales que controla. Palndromos: fragmento de dos cadenas de DNA en que las bases complementarias de la doble hlice estn ordenadas segn una simetra rotacional. Constituyen el sustrato de las endonucleasas de restriccin que rompen la molcula en el entorno del eje de simetra y en ambas cadenas. Partenognesis: En animales, produccin de un embrin a partir de un vulo sin la fertilizacin por el esperma masculino. Pptido: Polmero o cadena de aminocidos. Plsmido: Segmento de DNA en bacterias con capacidad de separarse y moverse de una regin a otra. Polmero: Compuesto qumico formado por la combinacin de unidades estructurales repetidas (monmero) o cadenas lineales de la misma molcula. Polimorfismo: Existencia dentro de una poblacin de dos o ms genotipos para una caracterstica. Existencia de variacin fenotpica dentro de una poblacin. Polinucletido: Secuencia lineal de nuclotidos unidos en el DNA o el RNA. Polipptidos. Cadenas polimricas compuestas de dos o ms aminocidos y uno o ms grupos peptdicos (enlaces). Semejantes compuestos son llamados dipptidos, tripptidos, etc., de acuerdo con el nmero de aminocidos que contienen. Poliploidia: Condicin en la que en un organismo, a consecuencia de una anomala de la divisin celular, multiplica el nmero de cromosomas, que normalmente es 2n, ya sea natural o experimentalmente, por 2, 3 o 4. Algunas plantas cultivadas, tanto ornamentales (petunias, crisantemos) como de uso agrcola (lino, remolacha, centeno) presentan esta condicin. Prin: Protena de carcter infeccioso capaz de autorreproducirse, procedente de una protena natural e inocua que se transforma en una forma nociva, resistente a las proteasas y a las radiaciones ionizante y ultravioleta, 231

responsable de enfermedades como la encefalopata espongiforme bovina, la de Creutzfeldt-Jacob o el kuru. Procarionte: Clula que carece de ncleo, mas no por ello de material hereditario. Son las clulas ms sencillas y pequeas, entre ellas se encuentran las bacterias. Protenas: Macromolculas formadas por cientos o miles de aminocidos, encargadas de diversas funciones en los seres vivos, como transportadores, catalizadores (enzimas), estructuras, etctera. Protooncogenes: Genes de clulas normales que tienen la capacidad potencial de convertirse en oncogenes despus de su activacin por transduccin debida a retrovirus, reordenamientos de DNA o mutaciones puntuales. Proyecto Genoma Humano: Programa de Investigacin consistente en determinar la secuencia completa de nucletidos de los cromosomas de la especie humana y de organismos modelo. Quiasma: Punto de contacto entre los cromosomas homlogos mediante los cuales se lleva a cabo la combinacin de material hereditario. Se observan durante la meiosis, en la etapa de la profase I. Quimeras: Hbridos interespecficos. Organismos cuyos tejidos son de dos o ms clases genticamente distintas. Sinnimo de mosaico. Recesivo: Alelo o gene cuya expresin genotpica est encubierta si la forma dominante del alelo est presente. Recombinacin gentica: Redisposicin gentica in vitro entre fragmentos de DNA de orgenes diferentes o no contiguos. In vivo entre copias homlogas de un mismo gen (manipulacin cromosmica), o como resultado de la integracin en el genoma de un elemento gentico. Replicacin: Proceso por el que una molcula de DNA o RNA origina otra idntica a la preexistente. En general, duplicacin del cido nucleico. Replicn: Estructura de cido nucleico con capacidad de autoduplicacin. Son replicones los cromosomas de las clulas eucariontes, el DNA nuclear de los procariontes, los plsmidos y los cidos nucleicos de los virus. Retrovirus: Virus cuyo genoma est constituido por RNA monocatenario, que es transcrito de forma inversa en DNA durante su infeccin y replicacin. La copia de DNA se integra en el DNA cromosmico del husped.

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Ribosomas: Pequeas partculas donde se realiza la sntesis de protenas en todos los organismos vivos. Secuencia de DNA: Orden de encadenamiento de las bases nitrogenadas de los nucletidos que constituyen el DNA y que cifra toda la informacin gentica. Cuando es codificante (exn), define el orden de los aminocidos que forman la protena correspondiente. Segregacin: Separacin de los cromosomas homlogos durante la meiosis o formacin de las clulas sexuales masculinas y femeninas. Sntesis de protenas: Proceso por el que la informacin gentica, codificada en el DNA, es transcrita a una secuencia codificada del RNAm, presumiblemente usando una banda del DNA como plantilla y, por ende, convertida en una cadena de polipptidos. Sonda de DNA: Fragmento de DNA conocido que se utiliza para averiguar si los cromosomas investigados contienen la secuencia complementaria. Tcnica de recombinacin del DNA: Conjunto de tcnicas de manipulacin gentica que emplea la recombinacin in vitro asociada a la insercin, rplica y expresin del DNA recombinado dentro de clulas vivas. Terapia gnica: Conjunto de los procesos destinados a la introduccin in vitro o in vivo de un gen normal en clulas, germinales o somticas, en las que el mismo gen, anormal, provoca una deficiencia funcional, origen de una enfermedad, o la de un gen codificador de una protena. Totipotente: Capaz de todo. Se aplica a las clulas que pueden dar origen a clulas de todos los rdenes. Traduccin: Fenmeno en el cual los codones o tripletes del RNA son traducidos a aminocidos para formar las protenas. Transcripcin. Produccin de RNA a partir de un molde de DNA. Proceso por el cual la informacin gentica contenida en el DNA especifica una molcula complementaria de RNA. Transcripcin inversa: Proceso de sntesis de DNA complementario a partir del RNA genmico de los retrovirus efectuado por la enzima transcriptasa inversa. Transduccin: Transferencia de informacin gentica entre bacterias, donde el agente que transporta el DNA de unas a otras es un virus. Transfeccin de DNA: Introduccin en una clula en cultivo convertida en permeable al DNA, de molculas de molculas de DNA extraas (heterlogas) 233

insertadas en un vector. Rene caractersticas comunes a la transformacin y a la infeccin por bacterifagos. La transformacin requiere la integracin del DNA exgeno en el cromosoma bacteriano mientras que la transfeccin usualmente no la requiere. El DNA extrao se asocia con el del cromosoma del husped y se expresa como un fenotipo identificable. Transformacin: Adquisicin por una bacteria de nuevos caracteres hereditarios despus de la penetracin de un fragmento de cromosoma (DNA) proveniente de una bacteria muerta de cepa diferente. El fragmento cromosmico se integra en el genoma de la bacteria. Transgnesis: Conjunto de procesos que permiten la transferencia de un gen (que se convierte en transgn) a un organismo receptor (llamado transgnico), que generalmente puede transmitirlo a su descendencia. Esta tcnica permite la asociacin de genes que no existe en la naturaleza, saltndose las barreras entre especies y entre reinos. Transicin: Mutacin causada por la sustitucin de una purina por otra purina o de una pirimidina por otra pirimidina en el DNA o el RNA. Translocacin: Cambio de posicin de un segmento de cromosoma hacia otra parte del mismo o a otro cromosoma no homlogo, como resultado de un rompimiento. Transmisin horizontal: Proceso natural por el que las bacterias adquieren o dan material gentico fuera de la reproduccin, mediante multiplicacin celular por conjugacin, transduccin o transformacin. Transposicin: Movilidad de la informacin gentica: fenmeno mediante el cual ciertos elementos genticos (transposones) se desplazan o transportan de un lugar a otro en el seno del genoma. En otras palabras, fenmeno en el cual ciertos genes saltan a nuevas posiciones en el cromosoma. Transversin: Mutacin causada por la sustitucin de una purina por una pirimidina, o de una pirimidina por una purina en el DNA o el RNA. Transposn: Elemento gentico mvil con una secuencia de DNA definida, que se puede trasladar a nuevas posiciones en el cromosoma de la clula sin prdida de la copia en su posicin original. Tripletes: Conjuntos de tres bases (nucletidos) sucesivos en el DNA que constituyen las unidades fundamentales en la codificacin individual de aminocidos (sntesis de protenas). Vase tambin codn. Vacuna: Antgeno procedente de uno o varios organismos patgenos que se administra para inducir la inmunidad activa protegiendo contra la infeccin de dichos organismos. Es una aplicacin prctica de la inmunidad adquirida. 234

Variacin gentica: Variacin en el carcter de un organismo, resultado de una mutacin o de recombinacin gentica. Vector: portador, que transfiere un agente de un husped a otro. Sistema que permite la transferencia, la expresin y la replicacin de un DNA extrao en clulas husped para una posterior clonacin o transgnesis. Virin: Unidad estructural de los virus. Consta fundamentalmente de dos estructuras imprescindibles: un cido nucleico (DNA o RNA) y una envoltura proteica (cpside). A estas estructuras bsicas se aade en algunos casos una envoltura lipdica y/o espculas de glucoprotena. Viroides: Agente causal de ciertas enfermedades de las plantas denominado as por su semejanza con los virus, de los que se diferencia por carecer de cpside. Se trata de cido nucleico envuelto por una membrana procedente de la clula en la que se replic. Por extensin se aplicaba a lo que hoy se denomina priones. Virus defectivo: Virus incapaz de reproducirse en una clula husped sin la ayuda de un virus auxiliar que aporta los genes que le faltan. Virus: Entidad acelular infecciosa que, aunque puede sobrevivir extracelularmente, es un parsito absoluto porque solamente es capaz de replicarse en el seno de clulas vivas especficas, pero sin generar energa ni ninguna actividad metablica. Los componentes permanentes de los virus son cido nucleico (DNA o RNA, de una o de dos cadenas) envuelto por una cubierta proteica llamada cpside.

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