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AUTARQUIA ASSOCIADA UNIVERSIDADE DE SO PAULO

SNTESE DO COMPOSTO TETRAFLUORBORATO DE COBRE (I) TETRACIS (2-METOXI ISOBUTIL ISONITRILA)(Cu[MIBILBFJ: SUBSTRATO UTILIZADO NA PRODUO DO RADIOFRMACO SESTAMIBI-^'^Tc

KATIA SUZI DA SILVEIRA SILVA

Dissertao apresentada como parte dos requisitos para obteno do Grau de Mestre em Cincias na rea de Tecnologia Nuclear-Aplicaes. Orientadora: Dra. Elaine Bortoleti de Arajo

So Paulo 2005

Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares


AUTARQUA ASSOCIADA UNIVERSIDADE D E SO PAULO

SNTESE D O C O M P O S T O T E T R A F L U O R B O R A T O D E COBRE (l) T E T R A C I S (2-METOXI ISOBUTIL ISONITRILA)-(Cu[MIBI ]4BF4): SUBSTRATO UTILIZADO NA PRODUO D O RADIOFRMACO SESTAMIBI -^^^Tc

K A T I A SUZI D A SILVEIRA SILVA

Dissertao apresentada como parte dos requisitos para obteno do Grau de Mestre em Cincias na rea de Tecnologia Nuclear Aplicaes Orientadora: Dra. Elaine Bortoleti de Arajo

So Paulo
2005

OTtsso wamL re

OERA NaEAvsp-iPE

AGRADECIMENTOS
Ao Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares (IPEN-CNEN/SP) nas pessoas do Superintendente Dr. Claudio Rodrigues e ao corpo docente e pesquisadores. *l* A Dra. Constancia Pagano Gonalves da Silva, Centro de Radiofarmcia, pela oportunidade concedida. Dra. Elaine Bortoleti de Arajo, pela orientao, apoio e sugestes durante o decorrer desta dissertao. Dra. Emiko Muramoto, pelo apoio e colaborao fornecida na realizao da distribuio biolgica do produto e sugestes dadas na fase de dissertao deste trabalho. Ao Sr. Wagner Nieto, pelo apoio na montagem dos "aparatos" da sntese e desenvolvimento do sistema de vcuo. Ao Dr. Leoberto C.Tavares e Vanderson Galan, da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo, pela colaborao fornecida. Ao Dr Jorge Cruz Arencibia, do Centis (Centro de Istopos)-Cuba, conhecimentos tcnicos compartilhados. Aos pesquisadores, tcnicos e secretrias do Centro de Radiofarmcia que apoiaram durante a realizao deste trabalho. Ao Centro de Medicina Nuclear, na pessoa de Miriam Roseli Yoshie Okamoto, pela colaborao prestada na realizao das imagens cintilogrficas deste trabalho. Aos colaboradores e, acima de tudo, amigos: Edson Vieira Alves, Bluma L. Faintuch, Eliane Aldegheri, Josefina Silva, Tatiana Lavinas, Maria Teresa Colturato, Katiane S. Silveira. Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior- Capes, pelo pelos

fornecimento da bolsa- auxilio concedida durante o tempo do projeto.

RESUMO

SNTESE DO COMPOSTO TETRAFLUORBORATO DE COBRE (I) TETRACIS (2-METOXI ISOBUTIL ISONITRILA)-(Cu[MIBI]4BF4): SUBSTRATO UTILIZADO NA PRODUO DO RADIOFRMACO SESTAMIBI-^^'"Tc

Kata Suzi da Silveira Silva

RESUMO

O radiofrmaco SESTAMBI-^^'^Tc apresenta interesse e aplicao na rotina clnica em Medicina Nuclear, especialmente para avaliao da funo do miocrdio, alm de aplicao no diagnstico diferencial de alguns tipos de tumores e o Centro de Radiofarmcia do IPEN possui interesse no desenvolvimento deste radiofrmaco para atendimento das necessidades da classe mdica nuclear. Neste trabalho foi demonstrada a sntese e caracterizao do composto ativo tetrafluoroborato de cobre (I) tetracis (2-metoxi isobutil isonitrila)-(Cu[MIBI ]4BF4), visando o preparo de reativos liofilizados para marcao com tecncio-99m e realizao de estudos de marcao e distribuio biolgica do composto. A sntese do composto Cu[MIBI]4BF4 foi realizada de acordo com procedimento descrito por diversos autores em 5 etapas e os compostos caracterizados por

Infravermelho, Ressonncia Nuclear Magntica, Ponto de Fuso e

Cromatografia em

Camada Delgada. A caracterizao do sal quelato de MIBI - (Cu[MIBI]4BF4) foi realizada utihzando-se Cromatografia Liquida de Alta Eficincia e os resultados foram comparados com uma amostra padro do produto, apresentando resultados similares, conforme descrito em literatura. Os reagentes liofilizados foram preparados e marcados com tecncio-99m, tendo sido obtida a pureza radioqumica acima de 97%, mantendo-se estvel em armazenamento. Nos resultados de distribuio biolgica em diferentes animais foram observadas boas captaes pelo corao, em tempo adequado para aquisio de imagens cintilogrficas, demonstrando a aplicabihdade do reagente sintetizado na cintilogrficas cardacas. obteno de imagens

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mams^m.

ABSTRACT

SYNTHESIS OF THE COMPOUND TETRAKIS (2- METHOXYISOBUTYL ISONITRILE) COPPER (I) TETRAFLUORBORATE -(Cu[MIBIl4BF4): SUBSTANCE USED IN THE PRODUCTION OF THE RADIOPHARMACEUTICAL SESTAMIBI-'^^Tc

Katia Suzi da Silveira Silva

ABSTRACT

The radiopharmaceutical SESTAMIBI-^^'"Tc presents interest and application in the clinical routine in Nuclear Medicine, especially for evaluation of the myocardium function and in the diagnosis of some tumors types, and the Center of Radiopharmacy of the IPEN has interest in the development of this radiopharmaceutical for attendance of the nuclear medicine class necessities. In this work it was demonstrated the synthesis and characterization of the active compound tetrakis (2- methoxy isobutyl isonitrile) copper (I) tetrafluoroborate Cu[MIBI]4BF4- to be used in the preparation of lyophilized reagents for labeling with technetium-99m as well as labeling studies and biological distribution. The synthesis of the reagent Cu[MIBI]4BF4 was carried out in accordance with previously described procedures, in 5 steps and the compounds were characterized for Infra-red, Magnetic Nuclear Resonance, Melting Point and Thin Layer Chromatography. The characterization of the chelate of MIBI -Cu[MIBI ]4BF4 - was carried out using High Performance Liquid Chromatography, compared with a standard sample of the product and presented similar results, as described in literature. The lyophilized reagent was prepared and labeled with technetium-99m, showing high radiochemical purity, higher than 97%, with high stability. Biological distribution in different animals showed good uptake in the heart, in time compatible with the acquisition of scintigraphy images, demonstrating the applicability of the reagent synthesized in the attainment of cardiac scintigraphy images.

1. INTRODUO

1. INTRODUO

radiao

proveniente

da

desintegrao

dos

radionucldeos

largamente empregadas em cincias da sade com a finalidade de diagnstico e terapia de doenas, assim como no desenvolvimento de modelos experimentais em pesquisa. Esses istopos radioativos podem ser artificiais ou naturais. Os naturais existem na natureza sem a interveno do ser humano, enquanto os artificias so representados pelos radionucldeos produzidos em reatores

nucleares ou mquinas aceleradoras de partculas (cclotrons). O uso dessas fontes est restrito aos laboratrios, nos quais os profissionais que neles trabalham, possuem experincia e qualificao para manipulao dessas fontes, sendo devidamente credenciados pela Comisso Nacional de Energia Nuclear. Inmeros radionucldeos so utilizados

rotineiramente em todos os servios de medicina nuclear, sendo que o critrio de escolha depende do procedimento clnico a ser executado, diagnstico ou terapia. De acordo com o procedimento, a seleo do istopo radioativo depende de suas caractersticas fsicas, como o tipo de emisso radioativa, a meia-vida e a energia da radiao emitida. Esses radionucldeos esto normalmente ligados a uma estrutura mais complexa, molecular, particulada ou celular, sendo o conjunto denominado de radiofrmaco Os radiofrmacos so submetidos a controles

de qualidade, tais como o de apirogenicidade, esterilidade, dentre outros, que permitem que eles possam ser administrados a seres humanos Os radionucldeos usados em diagnstico em medicina nuclear so preferencialmente emissores de radiao gama, uma vez que essas radiaes apresentam baixa taxa de transferncia de energia e so facilmente detectadas externamente ao corpo humano quando ocorre a administrao do radiofrmaco Preferencialmente so usados os ismeros nucleares e os radionucldeos que realizam o fenmeno de captura eletrnica, tambm conhecido como captura K. Desse modo, os radiofrmacos marcados com tecncio-99m, iodo-123, ndio-111, glio-67 e tlio-201 esto largamente presentes na prtica mdica ^^'^^ Alm dos radioistopos emissores de energia gama, os emissores de psitrons so tambm utilizados em procedimentos diagnsticos. No primeiro caso, as imagens so adquiridas em tomgrafos para emisso de ftons.

conhecidos em ingls pela sigla SPECT ("Single Photon Emission Computer Tomography") e no segundo caso, so detectados em tomgrafos para emisso de psitrons denominados PET ("Positron Emission Tomography")

1.1 RADIOISTOPO TECNCIO-99m

1.1.1 Histrico

Uma vez que o tempo de meia-vida do istopo mais estvel de tecncio curto na escala de tempo geolgica, o tecncio no um elemento particularmente abundante. Indicado como o elemento 43 na tabela peridica, logo abaixo do mangans, algumas das suas propriedades foram previstas por Mendeleev em 1869 o qual chamou-o, ento, de ekamangans e lhe deu o

smbolo Em. Embora Noddack e Tacke afirmem ter isolado o elemento 43 em 1925, os crditos da descoberta so atribudos a Perrier e Sgre, em 1937. Estes produziram quantidades mensurveis a partir de reaes de transmutao de duterons e protons com molibdnio. Depois da Segunda Guerra Mundial, Perrie e Sgre deram ao elemento 43 o nome de tecncio a partir do grego technetos (artificial) j que se tratava do primeiro elemento artificial produzido pelo homem
6,7,8 )

Na dcada de 60, os istopos radioativos de iodo predominavam nos exames de diagnstico, enquanto que a partir dos anos 70, o ^^"^Tc passou a predominar nos exames de medicina nuclear como demonstrado em 1996 estudos realizados nos Estados Unidos da Amrica do Norte Um levantamento recente realizado em servios de medicina nuclear nos EUA demonstrou que os procedimentos que utilizam o elemento tecncio99m representam cerca de 90 % dos realizados em medicina nuclear. O mesmo estudo comprova a importncia dos estudos diagnsticos em cardiologia. Nos EUA, 58 % dos procedimentos diagnsticos so destinados cardiologia. No existem levantamentos oficiais no Brasil. Sabe-se, entretanto, que a importncia do tecncio-99m na medicina nuclear diagnstica por

incontestvel A sua aceitao como o radionucldeo de escolha para inmeros procedimentos nessa especialidade mdica deve-se a algumas de suas

caractersticas, tais como: tempo de meia-vida de 6 horas, decaimento por transio isomrica a ^^Tc de 99,9%, correspondendo emisso gama (y) de 140 l<eV. obtido por meio de gerador molibdnio-99/tecncio-99m (^^IVIo/^^'^Tc) a um custo relativamente baixo comparado a outros radioistopos e suas reaes radioqumicas possibilitam a marcao de vrias molculas

1.1.2

Caractersticas qumicas e obteno

O istopo de tecncio utilizado em medicina nuclear o tecncio-99m ^99m-pj A qumica do ^^"^Tc semelhante a dos elementos de transio vizinhos, mangans e rnio. O tecncio d origem a uma multiplicidade de estados de oxidao e forma complexos de coordenao com uma variedade de ligantes orgnicos e inorgnicos^^ ""'^^^ Muitos dos compostos de tecncio termodinamicamente estveis tm oxignio ligado ao metal (TCO4", TCO2.2H2O, TcOL, e t c ) . Em soluo aquosa, o estados de oxidao mais estveis so: +7 (Tc04') e +4 (TCO2) A larga aceitao do ^^"^Tc deve-se a uma srie de propriedades vantajosas desse radionucldeo, a comear pela facilidade de obteno utilizandose sistema gerador, que pode ser facilmente transportado e serve como fonte de radionucldeo em instituies distantes do local onde foi produzido. Entre os sistemas geradores de radionucldeos, alguns tm grande relevncia em medicina nuclear alm do molibdnio-99/tecncio-99m (^^Mo/^^'^Tc), tais como o sistema estrncio-90/trio-90 e tungstnio-188/rnio-188 i-^-S-ia-i^) O esquema a seguir representa o decaimento do ^^Mo, que pode ser obtido por reao {r],y)a partir do ^^Mo, ou ainda a partir da fisso do ^^^U.

Amostras de ^^"^Tc04" so obtidas a partir da eluio de geradores de ^^Mo-^^'^Tc. A concentrao de pertecnetato obtida por eluio de um gerador varia de 10"^ a 1 0 ' ^ M .

P"
99Mo ^ ^^nc

^^Tc

^^Ru (estvel)

87,5%

12,5%

^^Mo = 66 horas ^^""Tc = 6,02 horas ^^Tc = 2 x l o z a n o s

(tempo de meia vida fsico)

No gerador de ^^Mo/^^'^Tc, o molibdato (

^^MoOa

) adsorvido em uma

coluna de alumina colocada em contentor porttil com escudo de chumbo (figura 1). No dia de utilizao, o ^^"^Tc, na forma de pertecnetato
(TCO4'),

eluido do

gerador com soluo salina. Na maioria dos radiofrmacos, as solues de pertecnetato so simplesmente injetadas em frascos contendo uma mistura liofilizada de agente redutor, o ligante complexante e algum antioxidante originando complexos com diferentes estabilizador clnicas,

aplicaes

dependendo da natureza do ligante

- Bliiii)eii3m

* Barda.cni dn chumbo

Figura 1: Esquema de um gerador de Tecncio-99m

;0 HCil^L K * f i ^ NUQJlR/SP-iPEff

pertecnetato (TCO4) o ion que o Te tem o maior estado de

oxidao possvel. Ele no pode ligar-se diretamente a nenhum ligante. Agentes redutores so utilizados para transformar o estado de oxidao +7 do tecncio em estados de oxidao menores, sendo o mais utilizado o cloreto estanoso (SnCb)
(2,4,7,11)

Durante a reduo, a presena do ligante estabiliza o tecncio em seu estado de oxidao mais baixo; caso contrrio, TcOa formado como subproduto
(2,4,7,11)

Pode haver um ou mais produtos resultantes dependendo do tipo de ligante, quando o tecncio reduzido. Um ligante pode ser um anin inorgnico ou uma molcula orgnica contendo tomos doadores de eltrons para o tomo de tecncio. Molculas contendo tomos de oxignio, enxofre ou nitrognio geralmente servem como tomos de coordenao (2.4.7.8,11) A estabilidade do complexo fator preponderante para o sucesso do radiotraador in vivo, porque se o ^^"^Tc se desligar do complexo e se reoxidar, a biodistribuio da radiao correspondente ser a do pertecnetato e no a do complexo injetado A marcao com tecncio envolve a coordenao de ligantes com

peso molecular relativamente baixo para formar pequenos complexos de tecncio. O comportamento biolgico dos complexos de tecncio determinado pela molcula como um todo, entretanto, o metal central determina primariamente a estabilidade global do complexo e transmite a distribuio espacial dos ligantes e suas propriedades magnticas e eltricas. o ligante que determina as

propriedades biolgicas do complexo (de acordo com a geometria e carga do complexo) apresentando duas faces: uma dirigida ao metal central (Tc) e outra para o meio biolgico, com o qual interage Sendo a massa de Tc presente nas ligaes muito pequena, pode-se considerar que o ligante encontra-se presente em excesso e a sua massa

preponderante para o sucesso da marcao. A pequena massa do complexo de tecncio resultante limita a sua caracterizao. A anlise estrutural dos complexos de Tc tem sido realizada utilizando-se o istopo emissor beta, o ^ c (t V = 2,3 x

lozanos), que disponvel em quantidades macroscpicas Os mtodos clssicos de espectrometria de massa, magntica nuclear, ultravioleta, anlise elementar e ressonncia

cristalografia de raios-X, tm

permitido estabelecer a

estrutura qumica tridimensional dos complexos. Estes

dados no s contribuem para o conhecimento da reatividade qumica dos complexos como permitem estudar com mais detalhes o metabolismo ou toxicidade dos radiotraadores de uso clnico, alm de possibilitar a considerao da relao entre estrutura qumica e atividade biolgica '^^''^^ A associao entre radiotraadores ou ^^"^Tc com diferentes ligantes qumicos formam complexos com coordenao que podem variar de 4 a 10. As caractersticas de lipofilicidade, carter inico e esfrico dos complexos

determinaro sua distribuio biolgica ^''''^^ Os complexos de Tc(l) so muito estveis quando os seis stios de coordenao so ocupados. A formao de tais complexos favorecida sob as condies empregadas na sntese de radiofrmacos de ^^"^Tc sem carregadores, porque o excesso de ligantes induz a completa coordenao em torno do metal e mantm as condies redutoras c o . 2 . 1 3 ) A estabilidade do complexo fator preponderante para o sucesso do radiotraador in vivo (io-''i.''2.i3)_

1.2 AGENTES MIOCRDICOS

As

enfermidades

cardacas

constituem, na atualidade, uma

das

principais causas de morte em vrios pases. O resultado do tratamento destes pacientes, em grande parte, depende da deteco precoce da afeco e um correto seguimento durante a etapa teraputica. Os problemas coronrios constituem que conduzem uma das causas fundamentais

s afeces cardacas, pois originam reduo ou perda da e aporte de nutrientes ao

perfuso sangnea e, portanto, da oxigenao miocrdio, provocando disfuno do msculo

cardaco com defeitos na

motilidade e diminuio da

vazo cardaca. Isto incrementa a hipoxia no

miocrdio e extremidades a qual se manifesta com dor ou angina Uma avaliao cardiolgica completa inclui estudos angiogrficos, de perfuso sangnea, metablicos , localizao e determinao da extenso de um infarto do miocrdio.

Um radiofrmaco ideal para estudos do miocrdio deve apresentar


(10,18, 20) .

a) Caractersticas timas do radionucldeo; b) Acmulo alto e rpido no msculo cardaco; c) Rpido clareamento sangneo e fgado; d) Captao pelo miocrdio diretamente proporcional ao fluxo sanguneo e depurao cardaca lenta, de modo que permita a realizao seqenciais. de tomadas baixo nvel de atividade em pulmes e

1.2.1 Histrico

Desde 1973, quando o ^^TI foi produzido pela primeira vez, na forma de cloreto de tlio, este se tornou muito importante na Medicina Nuclear

cardiovascular, pela sua aplicao nos estudos no invasivos de esforo e repouso, para avaliao do fluxo sangneo regional miocrdio isqumico e infartado ^^^\ Entretanto, o uso do ^"""TICI apresenta uma srie de inconvenientes tais como tempo de meia-vida longo (73 horas), fton gama de baixa energia (70-80 keV), requerendo a administrao de altas doses. Alm disto, seu custo elevado, relacionado ao processo ''^^ de produo em ciclotrn e baixa e distribuio entre

disponibilidade do composto

Em funo destas desvantagens apresentadas por este radionucldeo, os esforos se concentraram com o radionucldeo no desenvolvimento de novos agentes marcados que pudessem imitar as propriedades

tecncio-99m

biolgicas do cloreto de tlio ^^^l Foram sintetizados numerosos complexos de tecncio-99m, todos lipoflicos e com carga monopositiva obtendo-se, em muitos casos, a captao pelo miocrdio em algumas espcies animais, mas sem sucesso em humanos
23,24)

Entre estes compostos, esto os complexos

que utilizaram como

ligantes os derivados de fosfinas e arsinas tendo como tomo central o Tc em estados de oxidao III e V (23,24,) ^s^gg complexos mostraram-se favorveis em

distribuio miocrdica canina, mas no foi demonstrado comportamento anlogo em humanos Posteriormente, as aplicaes de complexos catinicos monovalentes de isonitrilas [Tc(CN-R)6] se caracterizaram na obteno de imagens cardacas para localizao de infartos do miocrdio, demonstrando ociuso coronaria,

anormalidade na perfuso e determinao da funo ventricular e do fluxo sangneo regional miocrdico ^^'^^^

1.2.2 Caractersticas qumicas dos compostos isonitrilas

As isonitrilas ou nitrilas ismeras

tambm

chamadas carbilaminas

foram descobertas por Gautier em 1866. So compostos orgnicos derivados do isocianeto de hidrognio [ (H-N=C:) cido isociandrico em soluo aquosa], pela substituio do tomo de hidrognio por radical orgnico monovalente alquila ou arila. A unio nitrognio- carbono de natureza mista covalente coordenada e o carbono terminal atua como um aceptor do par de eltrons do nitrognio. A isonitrila um dos poucos ligantes, cujo tomo de carbono bivalente tem um par de eltrons separados e por isso so semelhantes estrutura do monxido de carbono (figura 2).
GRUPO SUBSTITUINTE

FRMULA GERAL:

R - NC

R - N =C

NC

- N =C

Sendo - R radical orgnico

grupo isonitrila

Figura 2 - Grupos isonitrila

Nas alquilas, a valencia livre est presa ao carbono saturado (R-N=C: ou R-N^= C":) e nas arilas a valencia livre est presa diretamente ao ncleo

benznico

^^^'^^l
Os alquil derivados ou alquil-isonitrila e arilisonitrilas so lquidos

incolores de odor repelente, pouco solveis em gua e, por aquecimento quase sempre se isomerizam em nitrilas correspondentes ( R - N s C: R - C s N: ). As

isonitrilas so mais reativas do que as nitrilas e menos estveis do que estas


(28,29)

Os cido minerais diludos hidrolisam as isonitrilas em amina primaria e cido frmico As isonitrilas podem ser obtidas por (21.32,33). a) Reao de haletos com cianeto de prata segundo a reao : R-X + AgCN => R-NC + AgX b) Reao de aminas primrias (aminas secundrias e tercirias no produzem esta reao) com clorofrmio, em meio fortemente bsico: R-NH2 + CHC13+ 3 NaOH => R-NC + 3 NaCI + 3 H2O As reaes mais importantes das isonitrilas so: a) Hidrlise (origina cidos carboxlicos e aminas): R-NC + 2 H2O => HCOOH + R-NH2 Com base na reao de hidrlise das isonitrilas em meio cido, o armazenamento de complexos contendo como ligante uma isonitrila deve ser adequado de modo a proteger o produto de contato como o meio aquoso e cido para evitar sua decomposio. b) Reao com composto de Grignard (produz aldedos e aminas): R-NC + RMgX + 2 H2O => RCHO + R-NH2 + Mg(OH)X c) Reduo (produz aminas secundrias): R-CN + H2 => R-N =CH2 (imina) R-N =CH2 + H2 => R-NH -CH3 (amina secundria) d) Reaes de adio: R-NC + 1/2 O2 => R-C=N=0 (isocianato) R-NC + S => R-C=N=S (isotiocianato)

1.2.3 Complexos de isonitrila - ^^'"Tc aplicados em estudos cardiolgicos

Os complexos isonitrilas de ^^"^Tc no estado de oxidao +1 so estruturas octadricas com 6 ligantes isonitrilas ligados pelo carbono ao tecncio. O grupo R de cada ligante (figura 3) pode ser variado, produzindo mudanas no tipo e tamanho da esfera de coordenao interna do complexo de tecncio resultante, o que pode ocasionar alteraes de densidade e lipofilicidade, com conseqente alterao das propriedades biolgicas do composto ^^'^\

10

C = N R

Figura 3 - Estrutura do complexo isonitrila-^^'^ Tc

Deutsch e colaboradores, manifestaram a importncia do estado de oxidao do complexo (deve ser de +1) para que o composto seja captado pelo miocrdio j que, sistemas redox do contrrio, a carga total do complexo ser afetada pelos

biolgicos. Isto explica a ausncia

de acmulo no miocrdio

quando se administram em humanos complexos com estado de oxidao diferente Foram desenvolvidos complexos monocatinicos de hexaquis isonitrila tecncio (I) para estudo de perfuso do miocrdio, em substituio ao ^o ^jr^ Trs isonitrilas desenvolvidas apresentaram resultados clnicos interessantes: tercio butil isonitrila (TBI), carboxi isopropil isonitrila (CPI) e 2-metoxi isobutil

isonitrila (MIBI) <2^'^^'^^'2^ \ Dos complexos catinicos derivados de isonitrila, o primeiro ensaiado clinicamente foi o (TBI)6 -^^"^ Tc, desenvolvido por Davison e Jones Este

ction exibe vrias caractersticas favorveis incluindo depurao sangnea rpida, baixa ligao s protenas plasmticas e um fenmeno de redistribuio precoce que pode ser til para distinguir entre isquemia e infarto, eliminao miocrdica mnima e uma razo corao/pulmo aceitvel em 1 hora aps a injeo. Entretanto, a persistente e alta captao heptica mascara o pice cardaco e este fenmeno uma deficincia sria que limitou o uso deste composto na rotina clnica Para diminuir a atividade heptica associada ao (TBOe-^^'^Tc, Jones e Davison ^^^^ desenvolveram um derivado relativamente prximo, o (CPI)6-^^"^Tc,

que contm um ster hidrolisvel. Este derivado exibe uma eliminao sangunea rpida caracterstica dos complexos de isonitrilas e tambm sofre eliminao rpida do pulmo e fgado. Porm, h duas formas nas quais a biodistribuio deste agente difere significativamente do anlogo TBI:

11

a) no h redistribuio nniocrdica precoce aps esforo; b) h uma eliminao relativamente rpida do miocrdio devido, provavelmente, ao metabolismo cardaco do ster hidrolisvel, permitindo que injees repetidas sejam feitas dentro de um perodo de 3-4 horas. O agente CPI poderia ser til nas aplicaes de rotina clnica, mas os grupos de ster hidrolisveis tornaram-no radiofrmaco com estabilidade aceitvel ^^^\ Complexos de ^^'"Tc de TBI e CPI foram os primeiros compostos de isonitrila que apresentaram ambos os algumas caractersticas clnicas taxa promissoras. de atividade difcil para a formulao de um

Entretanto,

agentes

apresentaram

baixa

miocrdio/radiao de fundo Para contornar as desvantagens apresentadas por estes dois

complexos, foi desenvolvido na classe dos compostos de isonitrila, o composto 2metoxi isobutil isonitrila (MIBI) que marcado com ^^"^TC origina o complexo, hexaquis 2-metoxi isobutil isonitrila-^^'"Tc (SESTAMIBI-^^'^Tc ou (MIBOe-^^'^Tc)^^^^ O SESTAMIBI - ^^"^Tc demonstrou ser o mais completo da srie, com rpida captao pelo miocrdio, mantendo a concentrao da atividade

relativamente constante no tempo, rpida e completa depurao sangnea, atividade pulmonar desprezvel, permitindo a aquisio prvia de imagens e menor concentrao no figado, em comparao com os outros derivados. Ele foi comercializado como Cardiolite pela DuPont Pharma .

^NCH2C(CH30CH3CH3)

(H3CH3COH 3C )CH 2CN = C " . . . .-pj. . . v C = N C H 2C (CH 3OCH 3CH3)

(H 3CH 3COH aOCH 2CN = C ^ ^ ^ . ^ ^ ^ C = N C H 2C (CH 3OCH 3CH 3)


^NCH2C(CH30CH3CH3) Figura 4- Estrutura do complexo SESTAMIBI-^^'^Tc

12

O MIBI forma com o tecncio um complexo de carga + 1 , coordenado com seis grupos de isonitrila (figura 4). Utilizado para deteco de anormalidades na perfuso do miocrdio, particularmente para localizao de infarto do

miocrdio. Tambm til na determinao da funo do miocrdio usando a tcnica de ventriculografia radionucldica de primeira passagem c^'^o^i) O SESTAMIBI- ^^"^Tc um complexo catinico, lipoflico, que captado pelos micitos na proporo do fluxo sangneo do miocrdio. A captao

miocrdica regional de um traador difusvel dependente do fluxo regional e da extrao do miocrdio. A proporo da atividade do traador para o fluxo sangneo do miocrdio deca quando as taxas de fluxo so mais altas, o que ocorre durante hiperemia reativa ou vasodilatao farmacolgica, provavelmente em funo da diminuio da eficincia de extrao Aproximadamente 90% do SESTAMIBI-^^"'Tc intracelular est

associado com a mitocndria como um complexo catinico livre ^^^^'^\ O fato da depurao miocrdica do SESTAMIBI-^^'^Tc ser mais lenta que do ^^TICI, obriga a empregar-se, geralmente, injees em situao de repouso e esforo separadamente. Imagens obtidas com SESTAMIBI-^^'^Tc em srie apresentam importante papel na avaliao clnica da viabilidade miocrdica aps o infarto A permeabilidade capilar do miocrdio para o ^^TICI maior que para o SESTAMIBI-^^'^Tc, mas a permeabilidade do parnquima celular e o volume de distribuio do SESTAMIBI-^^'^Tc so muito maiores que o do ^^TICI, resultando em um tempo de residncia maior no miocrdio para o SESTAMIBI-^^'^Tc. A causa destas diferenas no transporte miocelular dos dois radiofrmacos devida a pequenas diferenas observadas no acmulo inicial no miocrdio dos dois agentes, apesar do SESTAMIBI-^^'^Tc demonstrar depurao miocrdica mais lenta que o TICI ^ ' ' ' ' ' ' ' ' \

O radiofrmaco SESTAMIBI-^^'^Tc no puramente um traador de fluxo e no retido em reas necrticas. Desta forma, o complexo, assim como o ^^TICI um marcador da viabilidade miocrdica. Em presena de necrose, a distribuio miocrdica do SESTAMIBI-^^'^Tc criticamente dependente do momento em que a injeo realizada em relao a reperfuso e de quando a imagem realizada em relao injeo do traador ^^''^''^).

13

Imagens

tomogrficas

de

repouso

utilizando

SESTAMIBI-^^'^Tc

permitem o diagnstico no invasivo quantitativo do tamanho e localizao do infarto. O tamanho da rea infartada determinada com o radiofrmaco

correlaciona-se com a funo ventricular esquerda e tem importante valor prognstico


(13.17.18,)

Desta forma, o radiofrmaco SESTAMIBI-^^'^Tc apresenta interesse e aplicao na rotina clnica em Medicina Nuclear, especialmente para avaliao da funo do miocrdio, em substituio ao radiofrmaco ^^TICI, alm de aplicao no diagnstico diferencial de alguns tipos de tumores.

1.2.4 Outras Aplicaes do SESTAMIBI-^^nc

Alm da aplicabilidade em estudos cardacos, o uso do SESTAMIBI^^"^Tc, semelhana do ^^TICI, tambm tem sido relatado em estudos de diferenciao entre leses benignas e malignas, para diferentes tipos de tumores
(43,44.45,46)

vantagens da molcula marcada com ^^"^Tc que, alm da meia-

vida curta que permite o uso de altas doses do radiofrmaco, tambm propicia imagens ntidas, em tempos curtos e sequenciais <'*^''*^\ Conforme descrito em literatura, o SESTAMIBI-^^'^Tc tem sido usado para deteco de tumores/leses nas mamas de at 4 mm, para avaliar leses mamrias com imagens de alta resoluo para leses maiores que 1,5 cm de tamanho e distinguir tumores mamrios benignos dos malignos com sensibilidade de 70-96% e especificidade de 71 - 1 0 0 % Existem relatos do uso do SESTAMIBI-^^'^Tc para avaliar metstase de cncer de tireide em pacientes de alto risco que apresentam nvel elevado de tireoglobulina e radioiodeto negativo, em pacientes com clulas de Hunthie ou carcinoma medular osteosarcomas O uso do complexo SESTAMIBI-^^'^Tc tambm tem sido relatado em estudos clnicos preliminares como agente de imagem para tumor cerebral. Os resultados com o uso de ^^TICI e SESTAMIBI-^^'^Tc em tumores cerebrais em crianas foram similares para astrocitomas, que puderam ser claramente
(58'59,60)

prognstico de resposta para terapias em

identificados. Tumores como meduloblastomas, gliomas e disgerminomas no apresentaram avidez pelos radiofrmacos

14

A sntese do sal de MIBI, Cu(MIBI )4BF4, utilizado na produo do reagente liofilizado para pronta marcao com Tc representa economia

substancial, quando considerada a necessidade de importao deste insumo.

2. OBJETIVO

15

2. OBJETIVO
Para elaborao dos reagentes liofilizados de MIBI pelo Centro de Radiofarmcia do IPEN, ocorre a necessidade primeira de sintetizar-se o sal de MIBI [Cu(MIBI)4BF4], de modo a viabilizar os custos de produo do reagente liofilizado. Tendo em vista que, o reagente liofilizado de MIBI para marcao com tecncio-99m somente pode ser adquirido no mercado, de empresa internacional, sendo oferecido a um custo alto e o interesse no desenvolvimento deste

radiofrmaco para atendimento das necessidades da classe mdica nuclear na utilizao do SESTAMIBI- ^^"^Tc na rotina clnica, especialmente para avaliao da funo do miocrdio, em substituio ao radiofrmaco ^^TICI, alm de aplicao no diagnstico diferencial de alguns tipos de tumores, nosso objetivo consistiu em:

Promover a sntese e caracterizao do composto tetrafluorborato de cobre(l) tetracis (2-metoxi isobutil isonitrila)- [Cu(MIBI)4BF4 ] e avaliar para pronta

sua utilizao na formulao de reagentes liofilizados marcao com tecncio-99m.

3. MATERIAIS E MTODOS

16

3. MATERIAIS E MTODOS

3.1 - MATERIAIS

3.1.1 Reagentes e Solues

> > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > >

3-cloro-2-metil-1-propeno, grau de pureza 98 %, Merck; Acetato de etila, grau HPLC, Merck; Acetato de mercrio II, grau de pureza p.a., Merck; Acetato de sdio, grau de pureza p.a., Merck; Acetonitrila, grau de pureza p.a., Merck; Acetonitrila, grau de pureza de 99,9%, Mallinckrodt; cido actico, grau de pureza p.a., Merck; cido actico glacial, 99,9%, Merck; cido brico, grau de pureza p.a., Merck; cido Clordrico 37%, grau de pureza p.a., Merck; cido fluorobrico 50%, grau de pureza p.a, Fluka; Benzeno , grau de pureza 99,9 %, Merck; Borohidreto de sdio, grau de pureza 99,9 %, Merck; Cloreto de clcio anidro, grau de pureza 99,8 %, Merck; Cloridrato de L-cistena monoidratada para bioqumica, Merck; Clorofrmio anidro grau de pureza 99,9 %, Merck; Clorofrmio, grau de pureza HPLC, Merck., Mallinckrodt; Clorofrmio deuterado, grau de pureza 99,9 %, Merck; Diclorometano anidro, grau de pureza 99,9 %, Merck; D-manitol, reagente ACS, Sigma-Aldrich; Etanol absoluto, grau de pureza 99,9 %, Merck; Etanol, grau de pureza p.a., Merck; ter dietlico anidro, grau de pureza 99,9 %, Merck; ter etlico, grau de pureza p.a,, Merck; Etilformiato, grau de pureza 99,9 %, Merck; Ftalimida de potssio, grau de pureza 99,9 %, Merck; Hidrato de hidrazina 85%, grau de pureza 99,9 %, Merck; Hidrxido de potssio, grau de pureza p.a., Merck;

17

> > > > > > > > > > > >

Hidrxido de sdio, grau de pureza p.a., Merck; Liquemine, heparina sdica 5.000 Ul/ mL, Roche; Metanol anidro, grau de pureza 99,9 %, Merck; Metanol, grau de pureza p.a., Merck; N,N,dimetilformamida (DMF), grau de pureza 99,9 %, Merck; Nitrognio gasoso seco. White Martins; Oxicloreto de fsforo, grau de pureza 99,9 %, Fluka; xido de cobre I, grau de pureza 98,9 %, Merck; Pentxido de fsforo, grau de pureza 99,9 %, Merck; Piridina, grau de pureza p.a., Merck; Silica gel azul (1-3 mm), Merck; Soluo de pertecnetato de sdio (Na^^'^Tc04 ) obtido de gerador de ^^Mo^^"^Tc (IPEN-TEC);

> > > > >

Sulfato de amnia , grau de pureza 99,9 %, Merck; Sulfato de magnesio anidro , grau de pureza 99,9 %, Merck; Tamiz molecular 3 , 4 A e 5 A (3-5 nm), Merck; Tetrahidrofurano (THF), grau de pureza de 99,9%, Merck; Trietilamina (TEA), grau de pureza de 99,9%, Merck;

3.1.2 Equipamentos

>

Agitador magntico com placa de aquecimento, Heidolph, Alemanha;

> Agitador mecnico, Hipperquimica, Brasil; > Aparelho medidor de pH, modelo DMF/NTC, Digimed, Brasil;

> Aparelho para determinao do ponto de fuso tipo capilar, modelo FP5, Mettler, Sua; > > > > > > Aparelho Vortex Genie 2-VWR Scientific lnd.,USA; Balana analtica, modelo B6, Mettler, Alemanha; Banho Ultratennosttico, Fanem, Brasil; Bomba de Vcuo-Edwards 2, Edwards, Inglaterra; Bomba refrigeradora Polysat mod.12101, Cole Parmer, USA; Calibrador de doses modelo CRM-35R, Carpintee, Inc, EUA;

18

>

Cmara de cintilao, modelo Gammatomo MB9300, matriz 128, zoom 70, Siemens LEM/IMAGAMMA- Centro de Medicina Nuclear da Faculdade Medicina da USP (C.M.N. -FMUSP); de

> >

Capela de exausto. Bras Lab., Brasil; Contador automtico tipo poo, com cristal Nal(TI), modelo D5002, cobra II, Packard, Gamberra, EUA;

>

Cromatgrafo lquido de alta eficincia composto pelos seguintes mdulos: Bomba de solventes com injetor manual de amostras, modelo 600 E, Waters, EUA; Desgaseficador, Waters, EUA; Detector UV/visvel (210 - 600 nm), modelo 486, Waters, EUA; Integrador, modelo 746, Waters, EUA; Radiocromatgrafo Camberra, EUA; de fluxo, modelo Radiomatic-150TR, Packard,

>

Espectrmetro na regio do infravermelho, Shimadzu IR-470, Japo, do Departamento de Tecnologia Farmacutica da Faculdade de Cincias

Farmacuticas da Universidade de So Paulo; > Espectrmetro de ressonncia nuclear magntica, modelo 300 MHz, Brooker, EUALaboratrio de anlise instrumental do Instituto de Qumica da

Universidade de So Paulo; > > > > > > > Estufa para secagem, Hipperquimica, Brasil; Lacrador e deslacrador manual, Wheaton, EUA; Lmpada U V - 8 W , GE; Liofilizador Edwards, supermdulo 40, BOC do Brasil; Mscara com filtro para amnia e nitrilas, 3M, Niosh, EUA; Micropipetas: de 1 -1000,0 ^iL, Weaton Socorex, Suia; Purificador de gua. Water Purification System, modelo Milli-RX 45, Millipore, EUA; > > Rotaevaporador Waterbath B-480, BUCHI R-124, Sua; Termmetro, -30C a 300C, Incoterm, Brasil.

19

3.1.3 Outros

>

Coluna

Partisil

10

ODS-1

(RP-Cis) para

Cromatografia Liqida de Alta

Eficincia (CLAE), 250 x 4,6 mm, 10 |im, WCS Analytical column, Whatman; > > > > Papel 3MM para cromatografia, Whatman; Papel filtro qualitativo, Whatman; Papel indicador de pH (1-11), Merck; Placas cromatogrficas de silicagel G-60 Kieselgel 60, Merck; > > Membrana filtrante de poro 0,22 \irr\, Millipore; Vidraria: Adaptadores Aspirador de pipetas 0-20 mL com vlvula de vcuo rpido Balo esfrico de 2 bocas 250 mL Balo esfrico de 2 bocas 500 mL Balo esfrico de 3 bocas 1000 mL Balo forma de corao de 2 bocas esmerilhadas de 50 mL Frascos erlenmeyer com junta esmerilhada 250,500,1000 mL Bales esfricos de colo curto de 5 mL ,10,100,250,500 e 1000 mL Bales esfricos para Rotaevaporador de 250,500 e 1000 mL Bales volumtricos com tampa de vidro 5,10,25,250,500 mL Barra para agitao magntica Bequeres 50,100,250,500,1000,2000 mL Coluna vigraux com junta esmerilhada Condensador de serpentina Condensador Serpentina para refluxo (boca 29/32) Condensador Liebing-West com boca esmerilhada Cubas cromatogrficas Dessecadoras para vcuo Equipamento de microdestilao para alto vcuo Frasco lavador de gases Funil de separao cnico de 100, 250, 500 e 1000 mL com torneira de agulha de teflon tampa de vidro e unio esmerilhada inferior F 254 20x20 0,2mm, Alufolien,

20

Funil Buchner Funil cnico, conicidade 60 , curto e largo Hlice com aspas e eixo de vidro Kitassato 100, 250, 500 e 1000 mL para vcuo Mangueiras para gua Mangueiras para vcuo Multi suporte universal Pea moldada em 75 com junta esmerilhada para termmetro Pipetas graduadas 1,2,5,10 mL Proveta graduada base hexagonal 10,25,50,100,250,500,1000 mL Tampes machos com oliva Terminal moldado em 105 com conexo para vcuo Tubo para cloreto de clcio com unio esmerilhada

3.1.4 Animais

>

Camundongos da raa Swiss, adultos, machos, pesando entre 22 - 28 g, biotrio IPEN-CNEN/SP;

>

Ratos da raa Wistar, adultos, machos, pesando entre 200-250 g, biotrio do IPEN-CNEN/SP;

>

Coelhos da raa New Zeland , do Centro de Medicina Nuclear da Faculdade de Medicina da USP (C.M.N. -FMUSP):

adulto macho, idade 1 ano e seis meses, pesando aproximadamente 3,60 Kg;

adulto macho, Idade 5 anos, pesando aproximadamente 3,45 Kg .

21

3.2 - MTODOS

3.2.1 Rota de sntese do tetrafluorborato de cobre (I) tetracis (2-metoxi isobutil lsonitrila)-(Cu[MIBI]4BF4)

A sntese do composto ativo IVIIBI foi realizada adaptando-se procedimentos descritos por diversos autores c4,19,20,34,41,62)

os

g fases,

detalhadas abaixo, a partir do cloridrato de N-(2-metilalil) amina. Como a N-(2-metilalil) amina, produto de partida da sntese, deixou de ser um produto disponvel comercialmente
<27.28)

(apenas

sob

encomenda),

foi

executada inicialmente sua sntese

Desta forma, a sntese do Cu(MIBI )4 BF4 pode ser dividida em cinco etapas (figura 5): Etapa I. Sntese de Cloridrato de N-(2-metilalil) amina [1] Etapa II. Sntese de N-(2-metilalil) formamida [2] Etapa III. Sntese de N-(2-metoxi isobutil) formamida [3] Etapa IV. Sntese de 2-metoxi isobutil isonitrila, (MIBI) [4] Etapa V. Em duas fases: A) Preparao do aduto : tetrafluorborato de tetracetonitrila de cobre (I) [5A] B) Sntese de tetrafluoroborato isonitrila)-(CuIMIBI]4BF4) [5B] de cobre (I) tetracis (2-metoxi isobutil

22

CH, H-K DWF ^

Etilformato

e x c e s s o
CH, POCU NaBH, "a^' CH, HCI MgSOMeOH/HgtOAcjj "r^S -N*==CH Piridina MgS04

H,C'

C H 3

CulCHjOO^Jgp^

CHjCN CujO HBF. PREPARO DO ADUTO

C H 3
Cu

HjCOCH,

BF

Figura 5- Rota de sntese de tetrafluorborato de cobre (I) tetracis (2- metoxi isobutil isonitrila)

3.2.2 Preparao das solues de trabalho ^ ^ ^ ^ Hidrxido de sdio 50% Foram pesados 50 g de NaOH e dissolvidos em 50 mL de gua destilada. Aps alcanar a temperatura ambiente, o volume do balo volumtrico foi completado com gua destilada a 100 mL. Soluo de hidrxido de sdio em metanol Foram pesados 45,2 g de NaOH e dissolvidos em 390 mL de metanol (absoluto). Aps alcanar a temperatura ambiente foi mantido em geladeira para posterior uso.

Acetato de sdio 0.5 M Foram pesados 340 mg de acetato de sdio e dissolvidos em gua destilada at 10 mL em balo volumtrico.

23

3.2.3

Purificao dos solventes orgnicos (^^wes)

Metanol anidro Em um balo de 2 litros de capacidade foram misturados 10 a 15 g de magnesio em fita e 0,10 g de cloreto de mercrio (II). Em seguida, foi adicionado 1000 mL de metanol em pequenas pores. A mistura foi refluxada durante 1 hora e destilada sobre tamiz molecular tipo 3 A. Foi coletada a frao com ponto de ebulio de 65C. ter dietlico anidro Em um balo equipado com condensador de refluxo e tubo de CaCl2 foram adicionados 1000 mL de ter dietlico e lminas bem finas de sdio metlico. A mistura foi refluxada durante uma hora, destilada e coletada tamiz molecular tipo 4 A a frao com ponto de ebulio de 35 C. Precaues: sdio metlico explosivo em contato com ar. Diclorometano Foi refluxado um litro de diclorometano durante 1 hora com cloreto de clcio anidro, destilado e coletada a frao com ponto de ebulio de 40-41 C. Conservado sob tamiz molecular tipo 3 A. Piridina Foram aquecidos 100 mL de piridina sob refluxo com prolas de hidrxido de potssio ou de sdio. A mistura foi destilada com coluna de fracionamento em presso reduzida a 115 C a 40 mm Hg. N, N. Dimetilformamida Foi mantida em tamiz molecular tipo 3 A por 72 horas para secagem, destilada sob presso reduzida e coletada a frao com ponto de ebulio 76 C a 40 mm Hg. Clorofrmio Foi refluxado 1000 mL de clorofrmio sobre cloreto de clcio anidro, durante 60 minutos, destilado e coletada, sobre tamiz molecular tipo 4 A, a frao com ponto de ebulio 60-62 C. sobre

24

Benzeno Foi mantido com CaC2 anidro por 24 horas, filtrado e conservado com tamiz molecular tipo 5 . Nitrognio gasoso seco O nitrognio utilizado durante as diferentes etapas de sntese foi passado por frascos lavadores de gases em srie contendo separadamente

CaCb anidro, P2 O5 e silicagel Indicador, para secagem.

3.2.4 Procedimentos de Sntese

Etapa I -Sntese de cloridrato de N-(2-metilalil) amina [1] Sntese de Gabriel: partindo-se de uma ftalimida e uma alila, seguida de uma reao de hidrazinlise, foi obtida uma amina primria. Esta sntese no produz aminas secundrias ou terciarias.

CH, N-K

C H 3 JML
N-C cHr MeOH-THF K O H

H 3 C ,NH,HCI

H j C

PROCEDIMENTO: Em um balo de 250 mL equipado com condensador de refluxo, acoplado a um tubo com cloreto de clcio e sob agitao magntica (entre 300550 rpm), foram adicionados 90 mL de dimetilformamida e {purificada 55,5 g (0,3

recentemente),

30 mL (0,3 moles) de 3-cloro-2-metil-1propeno

moles) de ftalimida de potssio. Esta mistura foi refluxada por 5 h (banho de leo em temperatura de 165-170 C ), mantendo-se sempre a temperatura da gua do condensador de refluxo entre 10-14 C e o balo envolto em papel alumnio. A dimetilformamida (DMF) foi eliminada mediante a rotaevaporao. O slido denso de cor amarelo escuro obtido foi lavado com 800 mL de gua destilada formando imediatamente um slido de cor beige.

25

Os cristais obtidos foram mantidos em dessecador com NaOH silicagel durante uma noite (ponto de fuso dos cristais secos: 88-92 C).

e O

slido foi triturado para ser dissolvido em 90 mL de uma soluo de MeOH.THF (1:1) com agitao magntica e um suave aquecimento (30-35 C) at desaparecer o slido no fundo do balo. Em seguida, foi adicionado 21,2 mL de soluo de hidrato de hidrazina a 85 % e mantido em repouso at o

aparecimento de um slido gomoso compacto. Em seguida, o slido foi ressupenso em 250 mL de uma soluo de HCI 1,5 N e, filtrado o precipitado at que deixou de aparecer o slido. O filtrado recolhido foi rotaevaporado at aparecer um slido amarelo (cloridrato impuro) aderido s paredes do frasco. Foi adicionado lentamente 135 mL de uma soluo de KOH a 50 % (usando banho de gelo e NaCI). Por meio de destilao fracionada com coluna Vigraux, foram

coletadas as fraes em temperatura de 75-77 C . O destilado foi acidificado com HCI a 0-5 C (lentamente) e rotaevaporado. Os cristais brancos foram mantidos em dessecador (NaOH e silicagel) sob vcuo. Rendimento de literatura de 43,3%. O produto foi avaliado por meio da determinao do ponto de fuso e por cromatografia em camada delgada (CCD) e espectroscopia de infravermelho (IV). Etapa II -Preparao de N-(2-Metilalll) formamida [2]
(i4.i9,36,4o,4i.62)

Na etapa II, a amida foi obtida por meio de uma reao de formilao. O cloridrato de N-(2-metilalil) amina foi formilado utilizando-se o etilformiato como agente formilante na presena de trietilamina para formar a formamida. N-(2-metilalil)

Etilformiato

NH2HCI
trietilamina

26

PROCEDIMENTO: Em um balo de fundo redondo de 250 mL equipado com um condensador de refluxo e tubo com cloreto de clcio foram adicionados 25 g (0,23 moles) de cloridrato de N-(2-metilalil) amina [produto 1], 57 mL (0,71 moles) de etilformiato e 36 mL (0,19 moles) de trietilamina. A mistura foi refluxada durante 17 horas entre 73-74 C. Aps 5 horas de reao foram adicionados 15 mL de etilformiato. Ao finalizar a reao a mistura foi resfriada e adicionado o ter

dietlico anidro. O precipitado suspenso na fase orgnica foi filtrado em vcuo e lavado com ter (100 200 mL). O slido foi desprezado. O filtrado foi

rotaevaporado para eliminar a fase etrea at aparecer um lquido denso de cor acinzentada. A purificao foi realizada mediante destilao fracionada presso reduzida com rendimento terico de 80 % de N-(2-metilalil) formamida, coletandose a frao com ponto de ebulio de 88-92 C a 64 mmHg. O produto incolor foi avaliado por cromatografia em camada delgada (CCD) e espectroscopia de infravermelho (IV).

Etapa III - Preparao de N-(2-metoxi isobutil) formamida [3]

(14,19,36,40,41,62)

Por meio de uma reao de oximercuriao foi feita uma

adio

seletiva de metanol no produto [2], N-(2-metilalil) formamida, na presena de acetato de mercrio, seguida por uma reduo com borohidreto de sdio para originar o produto N-(2-metoxi isobutil) formamida. Os estgios de

oximercuriao e reduo, fortemente exotrmicos, foram adio lenta dos reagentes e temperatura baixa.

controlados com a

CH3

yO ^ C^^^^^^"^" H

MeOH/Hg(OAc) MeOH/NaOH

NaBH4 HCI ""^^ OCH,

27

PROCEDIMENTO: Em um balo de fundo redondo de 3 bocas de volume de 1000 mL, com agitao mecnica constante e funil de adio acoplado, foram adicionados 190 mL de metanol anidro e 60 g de acetato de mercrio II. A mistura foi

aquecida suavemente at 52 C . Nesta temperatura foram adicionados 18,6 g de N-(2-metilalil)formamida (produto 2), atravs do funil e por um perodo de 5 minutos com agitao contnua. A mistura de reao foi mantida em agitao a 25 C por mais 45 minutos. Durante este tempo foram dissolvidos os grumos formados. A mistura foi resfriada em banho de gelo (O - 5C) e adicionou-se a

soluo pr-gelada de hidrxido de sdio em metanol (conforme item 3.2.2) por gotejamento atravs do funil de adio em um perodo de tempo de 15 minutos e agitao contnua. Durante a adio a soluo tornou-se escura. O funil foi retirado e adicionou-se 3.55 g de borohidreto de sdio em pequenas pores, mantendo-se a agitao. Durante a etapa de adio a temperatura foi mantida abaixo de 20 C. Em seguida, a mistura foi agitada durante 10 horas a 0-5 C (em banho de gelo e sal em uma cmara fria com temperatura 6 C). A mistura da reao foi filtrada em celite ( para eliminar o mercrio elementar formado). Ento, foram adicionados 400 mL de gua destilada ao filtrado e a fase orgnica foi extrada com 138 mL de clorofrmio, repetindo a operao quatro vezes. As fraes de clorofrmio reunidas foi mantida com

sulfato de magnsio anidro, para secagem durante dois dias (com troca diria). O slido foi filtrado e desprezado. O filtrado foi rotaevaporado para eliminao do clorofrmio. A purificao do produto foi realizada por destilao fracionada em presso reduzida e a frao foi coletada no ponto de ebulio de 97-115C a 64 mmHg, para se obter um lquido transparente com caracterstica de leo, com rendimento terico de 46% . O produto incolor foi avaliado por cromatografia em camada delgada (CCD) e espectroscopia de infravermelho (IV).

28

Etapa IV - Preparao de 2-metoxi isobutil isonitrila - MIBI [4]

(14,19.36,40,41,62)

O produto [3], N-(2- metoxi isobutil) formamida, foi desidratado com oxicloreto de fsforo na presena de piridina para produzir a isonitrila, MIBI.

[3]

[4]

POCI, ^ OCH, piridina iVlgSO^

N^CH H,C OCH,

PROCEDIMENTO: Em um balo de fundo redondo de 2 bocas de 250 mL equipado com um condensador de serpentina, tubo com cloreto de clcio e agitao magntica, foram adicionados 11,4 g de N-{2-metoxi isobutil) formamida e 42 mL de piridina (purificada recentemente, item 3.2.3 ). Quando a mistura alcanou a temperatura de 0-5 C foi adicionado 4,4 mL de POCI3, lentamente, por um perodo de 45 minutos sob agitao constante. Durante a adio a mistura foi mantida a 0-5 C (banho de gelo e sal), e sob agitao constante. No incio da adio a soluo se tornou amarela e ao terminar a

mesma adquiriu aspecto pastoso de cor caramelo claro. A mistura da reao foi aquecida 65 C por outros 45 minutos, tornando-se marrn escura. Quando a mistura foi resfriada novamente e atingiu a temperatura de 0-5 C, foram

adicionados 85 mL de gua destilada gelada para dissolver todo o slido. Em seguida, a fase orgnica foi extrada com 66 mL de benzeno. A operao de extrao foi repetida por quatro vezes. O extrato orgnico coletado foi lavado com 1000 mL de gua destilada e mantido com sulfato de magnesio anidro durante 2 dias (com troca diria). A soluo foi filtrada e o filtrado foi submetido

destilao por coluna em presso normal para eliminar o benzeno. Foi obtido um lquido oleoso com odor muito forte e irritante, caracterstico das isonitrilas. O

produto foi mantido vedado dentro de recipiente com vedao contendo slica gel, em congelador, para ser destilado novamente aps o preparo do aduto.

29

Ento, o produto foi purificado por destilao fracionada com coluna Vigraux a vcuo, em meio previamente anidro por passagem de N2seco. envolvida em papel alumnio ou manta protetora, destilado em balo coletor em

temperatura de 0-5 C durante a destilao j que o produto muito voltil. Foi coletada a frao com ponto de ebulio 40-49 C em 60 a 64 mmHg. Rendimento terico de 24 %. O produto incolor foi avaliado por cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) utilizando como solvente o acetato de etila. Obs: o composto [4] deve ser muito puro de forma a promover a formao do quelato cuproso. Ocasionalmente, ele pode estar contaminado com piridina, se as etapas de purificao, durante o procedimento, no forem bem conduzidas. Neste caso, uma segunda destilao fracionada do composto recomendada. Cuidados: o produto, 2-metoxi isobutil isonitrila, extremamente voltil, txico e com um odor muito desagradvel. As reaes devem ser conduzidas em capela bem ventilada, com mscara adequada, culos e luvas.

Etapa

- Preparao de tetrafluorborato de cobre (I) tetracis (2-metoxi

isobutil isonitrila) A) Aduto: Tetrafluorborato de cobre (I) tetra acetonitrila [5A]


(14.19.36,40,41,62)

Nesta etapa, ocorre a formao do aduto sob forma de um complexo de coordenao tendo como ligante a acetonitrila ao cobre (I).

(5 A)

CU2O

CHoCN - HBF^

[Cu(CH 3CN) 4 ] BF 4

PROCEDIMENTO: Em um balo de fundo redondo de duas bocas de 250 mL e funil de adio acoplado, foram adicionados 3,5 g de xido de cobre (I), algumas limalhas de cobre elementar, 11,5 mL de acetonitrila agitao magntica por 15 minutos em e 82 mL de gua destilada, com mistura da

temperatura ambiente.

reao foi acrescentado, por gotejamento e com agitao contnua, 10 mL de

30

cido fluorobrico 50 % atravs do funil, em temperatura ambiente. A reao foi aquecida com agitao contnua em vapor de gua fervente (sem introduzir o

balo na gua). Aps dissoluo de todo o slido, a soluo foi filtrada, rapidamente, quente e coletada em balo em banho de gelo. O precipitado branco formado foi filtrado e fervido com 100 mL de acetonitrila e filtrado novamente. Foi colocado 100 mL de ter dietlico (anidro) gelado e resfriada a mistura para formar um slido branco. Em seguida, foi filtrado rapidamente o precipitado branco presso reduzida sob atmosfera de
N2(g)Seco.

O produto foi colocado imediatamente com

o funil dentro do dessecador com vcuo e pentxido de fsforo (P2 O 5 ) para secagem e mantido nestas condies at seu uso. Nota: o tetrafluorborato de cobre (I) tetracetonitrila altamente

sensvel a umidade tomando uma colorao verde. Todo o procedimento deve ser rpido para evitar contato dos produtos com atmosfera ambiente.

B) Preparao d o de Tetrafluorborato de cobre (I) tetracis (2-metoxi isobutil isonitrila) [5B] Nesta etapa foi executada a reao de complexao do aduto de

cobre solvel e tendo como ligante uma isonitrila (MIBI) para um complexo de coordenao , em substituio acetonitrila.

(4)

m
+
[Cu (CH3CN)4] BF^

N=CH
OCH.

Cu HoC

PROCEDIMENTO: Toda vidraria utilizada nesta etapa foi previamente seca a 120 C durante 1 hora. Os solventes utilizados para esta etapa foram antes conforme os procedimentos citados no item 3.2.3. purificados

31

Em um balo de 2 bocas de fundo redondo de 50 mL acoplado com tubo de cloreto de clcio, foram colocados 1,09 g ( 0,01 mol) de MIBI (recm sintetizado) e 3,2 mL de diclorometano anidro, em agitao magntica e banho de gua a 0 C, sob atmosfera de nitrognio seco. Foi adicionado aos poucos, com a ponta de esptula, 617 mg de tetrafluoroborato [ produto 5A] durante 10 minutos. mistura foi acrescentado 6,5 mL de diclorometano purificado. Durante a adio pode ser observado, ocasionalmente, o aparecimento de uma colorao, amarela ou azul muito tnue, porm a reao pode continuar. Aps a adio, o balo foi tampado rapidamente mantendo-se a atmosfera inerte e selado com

parafilme. Ento foi retirado do banho frio e a mistura (incolor e transparente) ficou em agitao por 12 horas em temperatura ambiente. O diclorometano foi extrado por meio de rotoevaporador at se obter um concentrado denso de cor caramelo claro, que foi mantido vedado em freezer at o aparecimento dos cristais brancos. O precipitado branco foi dissolvido em etanol anidro (colocado aos poucos para diluio no menor volume possvel, aproximadamente 2-3 mL). Foi recristalizado com ter dietlico anidro, que foi colocado lentamente (aproximadamente 10 mL, com agitao manual) at

aparecer o precipitado branco, que foi filtrado. Foi obtido um slido branco muito fino, que foi mantido em dessecador a vcuo sobre pentxido de fsforo e atmosfera de N2(g) e avaliado por

cromatografia em camada delgada (CCD), espectroscopia de infravermelho (IV), ressonncia nuclear magntica-^H (RMN-^H ), cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) e ponto de fuso.

3.2.5 Caracterizao dos compostos

Os

produtos

obtidos

foram

analisados

pelas

tcnicas

abaixo

relacionadas, conforme descrito por diversos autores o '6,17,18,19.20,21,23.24,29). . . . . . Infravermelho (IV) - Produtos 1,2, 3 e 5B Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE) - Produto 4 e 5B Cromatografia em Camada Delgada (CCD): Produtos 1,2,3,4 e 5B Ressonncia Nuclear Magntica-^H (RMN-^H): Produto 5B Ponto de fuso: para produto 1 e 5B (slidos)

32

A) Ponto de Fuso (PF) As faixas de fuso dos produtos [1] e [5B] foram determinadas em aparelho da marca Mettler.

B) Espectrofotometria na Regio do Infravermelho (IV) Os espectros na regio do IV das amostras (produtos 1, 2, 3 e 5) foram registrados em espectrofotmetro Shimadzu IR-470 (amostras no estado slido utilizando disperso KBr) no Departamento de Tecnologia Farmacutica da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo (USP) e analisada na regio de IV no intervalo de freqncia de 500 - 4000 c m ' \

C) Espectroscopia de Ressonncia Magntica Nuclear (RMN- ^H) Os espectros de RMN-''H do produto [5] e amostra do produto,

sintetizado e cedido pelo Centro de Istopos - Havana, Cuba foram obtidos no Laboratrio de Anlise Instrumental do Instituto de Qumica da Universidade de So Paulo (IQ-USP), utilizando-se como solvente clorofrmio deuterado como padro de referncia interno.

D) Cromatografa em Camada Delgada (CCD) Cromatografa em Camada Delgada (CCD) foi utilizada para anlise para todos os produtos (exceto produto 4 e 5A) utilizando-se como suporte

placas de silicagel com indicador de fluorescncia (SG 60-F254) e os solventes abaixo relacionados: Produto [1]: N -butanol: cido actico: gua (4:1:1) Produto [2]: acetato de etila Produto [3]: acetato de etila Produto [5B]: metanol :acetonitrila : tetrahidrofurano : acetato de sdio 0,5 M (3:3:2:2)

33

E) Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE) Cromatografia lquida de alta eficincia foi realizada utilizando-se como solvente acetato de etila para analisar o produto [4] e a amostra deste produto, obtida comercialmente da empresa ABX-Alemanha. A CLAE tambm foi utilizada para analisar o produto [5B] e amostra do produto sintetizado e cedido por Cuba( usado como padro comparativo) utilizando-se como fase mvel a mistura de solventes metanol :sulfato para ambos os produtos: > Coluna: RP Ci8 -Whatman, 2 5 0 x 4 , 6 mm, 10 ^ m ; > Comprimento de onda: 254 nm; > Fluxo: 1 mL/minuto; > Detetor de UV (254 nm) de amnia 0,025 M (95:5); nas seguintes condies

3.2.6

Formulao do reagente liofilizado de tetrafluorborato de cobre (I)

tetracis (2-metoxi isobutil isonitrila) para marcao com tecnclo-99m. O reagente tetrafluoroborato de cobre (I) tetracis (2-metoxi isobutil isonitrila) para marcao com tecncio-99m foi formulado com a seguinte composio por frasco
<^^'62,67).

1,00 0,10 1,00 5,00

mg mg mg mg

do produto [Cu(MIBI )4]BF4 de cloreto estanoso**(SnCl2.2H20) de cloridrato de L-cistena monohidratada; de citrato de sdio de manitol

20,00 mg

O processo de liofilizao foi executado em um tempo total de 23 horas e os reagentes liofilizados foram armazenados sob refrigerao ( 7-10C). O reagente de MIBI para marcao com tecncio-99m foi preparado de acordo com procedimento previamente descrito ^^^'^^':

34

a) Preparo da soluo de cloreto estanoso** Foram pesados 500 mg de SnCb. 2 H 2 O e dissolvidos em cido clordrico concentrado (37%) e diluido em 10 mL de 2 mL de

gua destilada,

previamente nitrogenada por meio de borbuihamento com nitrognio gasoso. b) Para preparo de 25 frascos do reagente foram utilizados: 25,0mg 50,0p-L 27,75 125,0 500,0 do produto [Cu(MIBI )4 ]BF4 da soluo de cloreto estanoso** (item a) mg mg mg de cloridrato de L-cisteina monohidratada; de citrato de sdio de manitol agitao

Em um bquer de 100 mL, sob nitrogenao constante,

magntica e monitoramento de pH, foram adicionados 12,5 mL de gua , o citrato de sdio e medido o pH (deve ser mantido em 7 a 8,0). Em seguida, foi

adicionado o manitol e medido o pH (deve ser mantido por volta de 8,0). Posteriormente, foi adicionado o sal de MIBI at dissoluo completa e novamente medido o pH (7,5 a 8,00). Adicionou-se a cistena. O ajuste do pH (6-6,5) foi feito com a soluo de NaOH 2N e HCI 2N. Por ltimo foi adicionado o cloreto estanoso, gota a gota, e com controle de pH (no deve ser inferior a 5,0) e agitao forte. Ento foi ajustado o pH em 5,7 a 5,9, completada a diluio com gua at 25 mL e medido o pH final (5,7 a 5,9) A soluo resultante foi filtrada em membrana filtrante de poro 0,22 |xm e dispensada em frascos de penicilina (1 mL). Os frascos assim preparados podem ser armazenados congelados ou podem ser submetidos liofilizao, fechados sob vcuo e armazenados sob refrigerao (7-10C).

3.2.7 Produo do reagente liofilizado de MIBI Os frascos preparados conforme descrito no item 3.2.6 foram

liofilizados adotando-se as seguintes condies: tempo total de liofilizao de 23 horas 1 hora para congelar as prateleiras (-10C); 4 horas de congelamento do produto/amostra (-45C) 19 horas de aquecimento gradual para secagem do produto at atingir 20C.

35

Os reagentes liofilizados foram armazenados sob refrigerao (7-10C) para avaliao da estabilidade do produto.

3.2.8 Marcao do reagente de [Cu(MIBI)4]BF4 com tecncio-99m O reagente liofilizado de MIBI foi reconstituido pela adio de 1-3 mL de soluo de pertecnetato de sdio,^^"^Tc04" ( atividade de 185 - 3700 MBq/mL) eluida do gerador ^^Mo- ^^"^Tc. A mistura foi aquecida por 10 minutos em banhomaria fervente e ento resfriada ^^^\

N-R

R.CN '-rrr7 |??C.R


CN-R

3.2.9 Avaliao da pureza radioqumica do composto marcado Foram adotados os seguintes mtodos analticos de pureza radioqumica do SESTAMIBI ou MIBI-^^'^Tc para determinao

(19.20.34,36,40,41.62).

a) Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE) A mistura reagente foi analisada por cromatografa lquida de alta eficincia utilizando-se: Mistura de solventes para a fase mvel metanol: sulfato de amnia 0,025 M (95:5); Coluna: RP Cis-Whatman, 250 x 4,6 mm, 10 i^m; Comprimento de onda: 254 nm Fluxo: 1 mL/minuto; Detetor de UV (254 nm) e detetor de radiao.

b) Cromatografa em Papel Wathman 3 MM

A pureza radioqumica foi determinada utilizando - s e cromatografa em papel Wathman n 3, fitas de 2,0 x 12 cm, utilizando-se como solvente a mistura metanol: acetato de etila (2:8) e metanol: gua (8:2) para determinao das espcies radioqumicas envolvidas na marcao (Tabela 1).

36

A amostra do produto foi aplicada a 1,5 cm de distancia da margem inferior da fita, percorrendo o solvente urna distncia de 10 cm no papel Whatman 3 MM. Todas as anlises foram feitas em triplicatas. Aps o trmino dos processos cromatogrficos, as fitas foram secadas em temperatura ambiente,

cortadas a cada centmetro e cada segmento foi colocado em tubos apropriados para avaliao da radioatividade. Foram realizados os testes de estabilidade do produto liofilizado, repetindo-se a marcao com tecncio-99m, em diferentes perodos, com baixa atividade (185 - 296 MBq /2-3 mL) e alta atividade (3663 - 4070 MBq/2-3 mL) para avaliao da pureza radioqumica das marcaes.

Tabela 1 : Comportamento cromatogrfico do ^^"'Tc04', ^^'^Tc02 , e SESTAMIBI^^"^Tc na Cromatografia em papel


VALOR DO Rf SUPORTE SOLVENTE MeOH:Ac.Etila Papel Wathman (2:8) MeOHiHaO (8:2) 0,0-0,4 0,0 0,8- 1,0 0,6-0,7 0,0 0,8- 1,0
'"""TCO4 '"""TCO2

SESTAMIBI-^^^Tc

3 MM

c) Extrao por Solventes

Foram

realizados

alguns

ensaios

de

determinao

de

pureza

radioqumica pela tcnica de extrao por solventes utilizando-se a mistura clorofrmio: NaCI 0,9 % (1:1). Uma amostra do produto marcado foi adicionada mistura de

solventes ( 3 mL de cada) e agitada em aparelho vrtex por 15 segundos. Aps 1 minuto de repouso para separao das fases, foi retirado 1 mL de cada fase de solvente (soluo fisiolgica na parte superior do frasco e clorofrmio na parte inferior) e colocadas no calibrador de doses para leitura.

37

A porcentagem de marcao foi obtida pela soma da atividade de cada fase como atividade total orgnica: comparada com a atividade apresentada pela fase

SESTAMIBI-^^"'Tc % =

Atividade

da

fase

orgnica

100

Atividade da f.orgnica + fase salina

3.2.10 Estudo de distribuio biolgica do complexo SESTAMIBI-^^^c A) Estudos invasivos Foram realizados estudos de biodistribuio do composto marcado

para determinar a porcentagem de acmulo em rgos com relao a atividade injetada, considerando-se que a radioatividade medida pode estar associada ao composto injetado ou a um produto de sua degradao. Realizou-se a distribuio biolgica em camundongos machos

adultos da raa Swiss, pesando entre 22-28 g. O radiofrmaco foi injetado (3,7 MBq /0,1 mL) pela veia caudal e nos tempos de 15, 30, 60 e 120 minutos aps a administrao, foram sacrificados por decapitao. Para cada tempo foi utilizado um nmero de 5 camundongos (n). Antes do sacrifcio dos animais, coletou-se amostra de 100 [iL de sangue do plexo orbirtal em tubos previamente heparinizados (Liquemine) e foram retirados os seguintes rgos: pulmo, tireide, corao, bao, fgado com vescula biliar, estmago vazio, intestinos (com contedo), rins, msculo (frao anterior da coxa esquerda) e crebro. Os rgos foram pesados e colocados em tubos para contagem em detetor de radiao tipo poo. A porcentagem da dose administrada presente nos diferentes rgos (% dose / rgo), bem como a % dose/ grama de rgo foram determinadas a partir de um padro de dose administrada, de acordo com as equaes 1 e 2, utilizando-se o programa de computador MS Excel-7.0 - Microsoft Office: = Determinao da % Dose/rgo: Cpm Cpm rgo padro X 100 (Equao 1)

38

Determinao da % Dose/grama de tecido: % dose / rgo peso rgo correspondente (Equao 2)

Os clculos da porcentagem da dose administrada presente no sangue total e da volemia foram determinados de acordo com Altman e col. segundo as

equaes 3 e 4 abaixo descritas: = Determinao da Volemia (mL): (Equao 3)

Peso corpreo do animal (g) X 0,07 Determinao da % Dose sangue total:

Cpm de 1 mL de sangue X volemia

(Equao 4)

Para a determinao da porcentagem da dose do msculo total, considerou-se o clculo de Jones e col. ^^^\ como demostrado na equao 5: Determinao da % Dose msculo total: (Equao 5)

= 40% peso do animal (g) X cpm de 1g de msculo

Os estudos de distribuio biolgica do radiofrmaco SESTAMIBI^^'"Tc foram repetidos utilizando-se a mesma tcnica adultos, machos, pesando entre 200-250 g. em ratos da raa Wistar,

B) Estudo de imagens cintilogrficas do SESTAMIBI-^^'^Tc em animal de mdio porte

Foram realizados estudos cintilogrficos do complexo SESTAMIBI^^"^Tc, em coelhos da raa New Zeland , no Centro de Medicina Nuclear da Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo (C.M.N.-FMUSP), com um estudo dinmico (fluxo) do composto, adquirido em 30 imagens sequenciais imagens estticas. As imagens foram adquiridas posicionado- se os animais em decbito ventral (para aquisio de imagem frontal), aps a injeo do radiofrmaco na veia lateral da orelha direita. Manteve-se o coelho imobilizado durante todo o procedimento. As imagens foram adquiridas na cmara de cintilao de e

39

experimentao animal do C.M .N. -FMUSP, com colimador de baixa energia e alta resoluo, em dois coelhos Animal 1 - idade 1 ano e seis meses, injetado 85,61 MBq/0,3 mL do radiofrmaco para obteno de imagens dinmicas em 30 minutos (1 imagem/

minuto) e estticas em 15, 30, 60 e 120 minutos aps a administrao da dose. Animal 2 - idade 5 anos, injetado 113,66 MBq/0,3 mL do radiofrmaco para obteno de imagens dinmicas durante os primeiros 30 minutos (1

imagem/minuto) e estticas em 15, 30, 60 e 120 minutos aps a administrao da dose. As porcentagens de captaes do fgadoe corao foram estimadas selecionando-se os respectivos rgos com a rea de interesse e relacionando as contagens obtidas com a contagem do restante do corpo.

4. RESULTADOS

40

4. RESULTADOS

4.1 ANLISE DO CLORIDRATO DE N- (2- METILALIL) AMINA- PRODUTO [1]

4.1.1

Caractersticas Organolpticas O produto [1], Cloridrato de N-(2- metilalil) amina, com frmula

molecular C4H10CIN, altamente higroscpico, foi obtido com rendimento mdio de 52% sob a forma de cristais brancos.

4.1.2

Ponto de Fuso (PF) Nesta etapa de sntese foi obtido um produto intermedirio, uma

alquilftalimida,

que

foi

analisada

para

confirmar

sua

presena

dar

prosseguimento etapa I de obteno da amina. O produto intermedirio e a amina foram caracterizados por esta tcnica, conforme demonstrado na tabela 2. Uma

amostra do Cloridrato de N-(2- metilalil) amina, da marca Sigma Aldrich tambm foi submetida anlise de ponto de fuso.

Tabela 2 - Ponto de Fuso PONTO DE FUSO (C)


EXPERIMENTAL

TERICO LITERATURA '""'"^

PRODUTO

IPEN

Alquilftalimida (Intermedirio) Cloridrato de N-(2- metilalil) amina- sintetizado Cloridrato de N-(2-metilalil) amina-Sigma Aldrich

86,0 - 91,2 180,0 -186,8 181,0-185

88,5 - 90,0 184,0 -190 184,0-190

41

4.1.3 Espectrofotometria na Regio do Infravermelho (IV)

produto

[1],

Cloridrato

de

N-(2-metilalil)amina

tambm

foi

caracterizado por meio da espectrofotometria na regio do infravermelho (IV), sendo que as bandas de absoro dos grupamentos caractersticos do produto foram identificadas, conforme demonstrado na figura 6: Amina primria: -3200 - 3500 cm"^ de freqncia (elongao N-H ) 1570 - 1620 cm'^ de freqncia (bandas de deformao) 1350 e 1250 cm"^ de freqncia (bandas de estiramento)

Aliftico: - 1 6 7 8 cm'^ de freqncia N-H cloridrato: 3122 - 3394 cm"^ de freqncia.


H3C

1 0 0 0

\
H2C-

H H

^N^---cr

n.o

c=c

C-NH

5 0 0 . 0 o

Figura 6 - Espectro no Infravermelho do cloridrato de N-(2- metilalil) amina (produto [1]) sintetizado.

42

Observando-se o espectro no IV do produto [1] sintetizado, constata-se a presena das principais bandas de absoro correspondentes estrutura qumica do Cloridrato de N-(2- metilalil) amina ^^^'^^^

tDO) 100.0 NGOQ C O O C D ' O iri 80 0 e n ^ (DtDrn O ) OOO) ' " o O K:T-O too N O

s
o

60.0

cooo y N en en C M Bcn-'-/ o

o1

40.0

20.0 CSl G O ( C M IR

4000.0

3000.0

2000.0

1500.0

1000.0

500.0

Figura 7- Espectro de Infravermelho do cloridrato de N-(2- metilalil) amina (produto [1]) amostra Sigma Aldrich. A figura 7 tambm apresenta o espectro no infravermelho do cloridrato de N-(2- metilalil) amina, amostra Sigma Aldrich, onde identificaram-se as mesmas bandas de absoro correspondentes aos grupamentos, descritos para a figura 6.

4.1.4

Cromatografa em Camada Delgada (CCD)

Cloridrato

de

N-(2-metilalil)amina,

analisado

por

meio

de

Cromatografa em Camada Delgada (CCD) utilizando-se como suporte placas de silicagel com indicador de fluorescencia (SG 60-F254) e a mistura de solventes Nbutanol: cido actico: gua ( 4 : 1 :1), apresentou o fator de reteno (Rf) de O, 5 para as amostras do produto sintetizado e de referncia da Sigma Aldrich.

43

4.2 - ANLISE DE N- ( 2 -METILALIL) FORMAMIDA - PRODUTO [2]

4.2.1 Caractersticas Organolpticas

O produto [2], N-( 2-metilalil) formamida, foi obtido com um rendimento mdio
(64,76)

de 60%, sob forma de um leo viscoso incolor ou levemente amarelado

4.2.2 Espectrofotometria na Regio do Infravermelho (IV)

O produto [2], N-( 2-metilalil) fonnamida, foi caracterizado por meio de espectrofotometria na regio do infravermelho (IV), sendo que as, bandas de absoro, correspondente aos grupamentos mais caractersticos do produto, foram identificadas, conforme demonstrado na figura 8: N-H: 3304 cm""" de freqncia 3060 cm'^ de freqncia 3040 cm""* de freqncia 1520 cm"^ de freqncia 1660 cm'"' de freqncia (formamida)

- AMIDA: OLEFINA:

- AMIDA I I : NHC=0:

Observando-se o espectro no IV do produto [2] sintetizado, constata-se a presena das principais bandas de absoro correspondentes estmtura qumica do N-( 2-metilalil) formamida (''3.74,75)_

44

Figura 8 - Espectro de Infravermelho de N-( 2-metilalil) formamida -produto [2] 4.2.3 Cromatografia em Camada Delgada (CCD) O produto [2], analisado por meio de CCD utilizando-se como suporte placas de silicagel com indicador de fluorescncia (SG 60-F254) e como solvente acetato de etila, apresentou o fator de reteno (Rf) de 0,6.

4.3 ANLISE DE N- (2- METOXI ISOBUTIL) FORMAMIDA- PRODUTO [3]

4.3.1 Caractersticas Organolpticas O produto [3], N-( 2-metoxi isobutil) formamida, foi obtido com um rendimento mdio de 48%, sob forma de um leo viscoso incolor ^^^jej?)

4.3.2 Espectrofotometria na Regio do Infravermelho (IV) O produto [3], foi caracterizado por meio de espectrofotometria na regio do infravermelho (IV), sendo que as bandas de absoro correspondentes aos grupamentos mais caractersticos do produto foram identificadas, conforme

demonstrado na figura 9:

45

N-H: AMIDA: NHC=0: AMIDA II


OCH3:

3200 - 3300 cm"'' de freqncia 3060 cm"^ de freqncia 1682 cm'^ de freqncia 1530 cm"^ de freqncia 1180, 1160, 1070 cm"^ de freqncia

Observando-se o espectro do IV do produto [3], constata-se a presena das principais bandas de absoro correspondentes estrutura qumica do N-( 2metoxi isobutil) formamida ^^'^^^.

10 . Q i.

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cTt -icoKoi::'

Figura 9 -Espectro de Infravermelho de N-(2-metoxi isobutil)formamida- produto [3]

46

4.3.3 Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

O produto [3] analisado por meio de CCD, utilizando-se como suporte placas de silicagel com indicador de fluorescncia (SG 60-F254) e como solvente acetato de etila, apresentou fator reteno (Rf) de 0,6.

4.4

ANLISE DE 2- METOXI ISOBUTIL ISONITRILA- PRODUTO [4]

4.4.1 Caractersticas Organolpticas O produto [4], 2- metoxi isobutil isonitrila (MIBI), foi obtido com um rendimento mdio de 35%, sob forma de um leo viscoso incolor, com odor caracterstico das isonitrilas e extremamente voltil em temperatura ambiente
,76,77,78)

4.4.2 Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE)

O produto [4], 2-metoxi isobutil isonitrila foi analisado apenas pela tcnica de CLAE (figura 10) por se tratar de um produto txico, altamente voltil e de odor extremamente forte, caracterstico das isonitrilas, utilizando como padro comparativo uma amostra do produto obtido comercialmente da empresa ABX (Alemanha) com teor de pureza de 97% (figura 11).

47

3.6

3,2

Figura 10Perfil cromatogrfico de CLAEamostra do produto sintetizado no IPEN. Nas seguintes condies: fase mvel metanol :sulfato de amnia 0,025 M (95:5); Coluna: RP
Ci8-Whatman, 250 x 4,6 mm, 10 fim;

Comprimento de onda: 230 nm; Fluxo: 1 mL /minutojDetetor de UV (254 nm)

Figura 11Perfil cromatogrfico de CLAEamostra do produto adquirido comercialmente da ABX (Alemanha). Nas seguintes condies: fase mvel metanohsulfato de amnia 0,025 M (95:5); Coluna: RP Ci8-Whatman, 250 X 4,6 mm, 10 um; Comprimento de onda: 230 nm; Fluxo: 1 mL /minuto;Detetor de UV (254 nm)

48

4.5

ANLISE

DO

TETRAFLUORBORATO

DE

COBRE

(I)

TETRA

(ACETONITRILA) - (Cu[CH3CN]4BF4) - PRODUTO [5A]

4.5.1 Caractersticas Organolpticas

O produto [5A], tetrafluorborato de cobre (I) (Cu[CH3CN]4BF4), foi obtido com um rendimento mdio

tetra

(acetonitrila)-

de 3 g, sob forma de

cristais finos branco, altamente higroscpico.

4.6 ANLISE DO TETRAFLUORBORATO DE COBRE (I) TETRACIS ( 2METOXI ISOBUTIL ISONITRILA)- (Cu[MIBI]4BF4) - PRODUTO [5 B].

4.6.1

Caractersticas Organolpticas O produto [5 B], sal quelato de MIBI, tetrafluorborato de cobre (I) tetracis

(2-metoxi isobutil isonitrila) -(Cu[MIBI]4BF4), foi obtido com um rendimento mdio de 45%, sob forma de cristais brancos, com odor caractersticos das isonitrilas. 4.6.2 Ponto de Fuso (PF) O do sal quelato de MIBI, (Cu[MIBI]4BF4), foi obtido na faixa de 100 101C. O PF do sal foi comparado faixa de PF de uma amostra do produto cedido por Cuba e com uma amostra adquirida comercialmente da ABX

(Alemanha), que apresentaram a mesma faixa de fuso, embora sejam relatados em literatura ^^'^^^^^^^^faixas diferentes variando de 77-91 C.

4.6.3 Espectrofotometria na Regio do Infravermelho (IV)

O produto [5 B], Cu[MIBI]4BF4, tambm foi caracterizado por meio da espectrofotometria na regio do infravermelho (IV), sendo que as bandas de absoro, abaixo citadas, dos grupamentos caractersticos ao produto, foram identificadas, conforme demonstrado na figura 12, que representa o produto sintetizado. A figura 13 representa o espectro de IV para o Cu[MIBI]4BF4 cedido por Cuba.

49

2190-2195 cm"'' de freqncia ( - N S C ) 1180, 1160, 1070 cm"^ de freqncia


(OCH3)

Figura 12- Anlise de infravermelho (IV) do sal Cu[MIBI]4BF4 sintetizado IPEN

50

Figura 13 - Anlise de infravermelho (IV) do sal Cu[MIBI]4BF4 cedido por Cuba

Foram analisados os espectros de IV para o produto sob esta forma de sal , tetrafluorborato de cobre (I) tetracis (2-metoxi isobutil isonitrila), produzido no IPEN e urna amostra produzida e cedida por Cuba, e ambas demonstraram

possuir os grupamentos <''^'^^'^^) que caracterizam o MIBI. O espectro de absoro do infravermelho das isonitrilas caracterizado pela banda 2190-2195 cm"^
(62,76,77,79,80)

COESO

m.\G-^.L K

ENtHA ^UQ^R/SP-IPEM

51

4.6.4 Cromatografia em Lquida de Alta Eficincia (CLAE)

O produto final, (Cu[MIBI ]4BF4), tambm foi analisado por CLAE e os perfis dos cromatogramas obtidos nas figuras 14 (amostra IPEN) e 15 (amostra Cuba), apresentaram picos de tempo de reteno (Rt) bastante prximos .

o s

Figura 14- Perfil cromatogrfico de CLAE do sal Cu[MIBI ]4BF4 -IPEN

Figura 15- Perfil cromatogrfico de CLAE do sal Cu[MIBI ]4BF4 - CUBA

Condies: Mistura de solventes para a fase mvel metanohsulfato de amnia 0,025 M (95:5); Coluna: RP Cig-Whatman, 250 x 4,6 mm, 10 ^im; Comprimento de onda: 254 nm; Fluxo: 1 mL/minuto;Detetor de UV (254 nm) e detetor de radiao.

52

4.6.5 Cromatografia em Camada Delgada (CCD) O tetrafluorborato de cobre (I) tetracis (2-metoxi isobutil isonitrila) (Cu[MIBI]4BF4), analisado por meio de CCD utilizando-se como suporte placas de silicagel com indicador de fluorescncia (SG 60-F254) e a mistura de solventes metanol: acetonitrila: tetrahidrofurano:acetato de sdio (3:3:2:2), apresentou o fator de reteno (Rf) de O, 7 para as amostras (Cuba e IPEN) do produto.

4.6.6

Ressonncia Magntica Nuclear (RMN-^H ) A anlise de R M N - ' ' H em


CDCI3

do composto revelou

os espectros que

com picos em 1,2 (6H,S,2x CH3); 3,25 ( 3 H , s , O C H 3 ) ;

3,65(2H,s ,CH2),

caracterizam o produto conforme descrito na literatura (62,76,77,79) Foram analisadas as amostras do produto Cu[MIBI]4BF4 produzido no IPEN (figura 16), produzido e cedido por Cuba (figura 17) e amostra obtida comercialmente da empresa ABX-Alemanha (figura 18) que se mostraram

semelhantes na comparao dos espectros.

A ;

PpRI

Figura 16- R M N - ' ' H em

CDCI3

do Cu[MIBI]4BF4 produzido no I P E N

5
70

CD

O O o
Q.

-7.27209

O c

DO
T3

5
o
Q. C N Q!

1.0000 1.5168

-3.58038 -3.23001

O c cr
0)
3.0467 -1.36517

O CO

54

N-Ctlr-l-OM. M. 9 O - J ! O V - 0 - C u - C S N -lC HH i I 0-0M -C i M> Me

a e

-|IIIIIIIr 5 4

T - T 0 PP

Figura 18- R M N - ' ' H em C D C I 3 do Cu[MIBI]4BF4, amostra ABX-Alemanha

55

4.7 FORMULAO DE

E MARCAO DE REAGENTES LIOFILIZADOS ["KITS"]

TETRAFLUORBORATO DE COBRE (I) TETRACIS (2-METOXI ISOBUTIL

ISONITRILA) - (Cu[MIBI ]4BF4)

Aps

caracterizao do sal

quelato de MIBI- Tetrafluorborato de

cobre (I) tetracis (2-metoxi isobutil isonitrila) -(Cu[MIBI]4BF4) por meio de CLAE e RMN - H ^ e constatada a sua pureza, com os resultados comparados com

amostras do produto cedido por Cuba e com a amostra obtida comercialmente da ABX (Alemanha), foi formulado o reagente liofilizado, de acordo com literatura A liofilizao, realizada para propiciara estabilidade no armazenamento^^""^e posterior marcao com Tc-99m. A formulao do reagente liofilizado contm o sal quelato de MIBI e uma quantidade de um agente redutor pr-determinada (cloreto estanoso) para reduzir o radionucldeo selecionado ( Tc-99m) (^'^''\ Um excesso do complexo de isonitrila foi misturado ao agente redutor em meio aquoso, conforme descrito no item 3.2.6. O citrato de sdio foi utilizado como agente neutralizador e estabilizador, e o

cloridrato de L-cistena e o manitol como agente transferidor e estabilizador dos ons de estanho
<8o.8i.82)

Uma frao do produto foi utilizada na elaborao do reagente liofilizado (1 lote) sob as condies relatadas no item 3.2.6. e, posteriormente armazenado sob refrigerao. O rendimento deste lote foi de 85% de obteno em frascos, utilizando 50 mg de sal de MIBI para a produo de 42 frascos do conjunto liofilizado. O restante do produto, foi mantido em dessecador devidamente armazenado em frasco hermticamente fechado. Aps seis meses de armazenamento, outra frao do produto (2 lote), mantido no dessecador, foi novamente formulado e liofilizado nas mesmas condies do 1 "lote, para verificar sua estabilidade. O rendimento manteve-se na mesma porcentagem do primeiro lote para produo de 20 frascos. sem refrigerao,

56

4.8

MARCAO COM Tc-99m E AVALIAO DE PUREZA RADIOQUMICA DE TETRAFLUORBORATO DE

DOS REAGENTES LIOFILIZADOS ["KITS"]

COBRE (I) TETRACIS (2-METOXI ISOBUTIL ISONITRILA)- (Cu[MIBI]4BF4)

A marcao do complexo liofilizado de MIBI com Tc-99m foi feita de acordo com as condies descritas no item 3.2.8. Durante o preparo dos reagentes liofilizados foi feita uma marcao prliofilizao para avaliao do produto final e avaliao da pureza radioqumica,

antes da liofilizao da frmula. A pureza radioqumica da marcao com tecncio-99m do 1 lote de liofilizado foi avaliada utilizando-se cromatografia em papel Whatman 3MM, conforme procedimento relatado no item 3.2.9, obtendo-se 98,34 0,08%. Aps a liofilizao, os reagentes de MIBI foram avaliados em sua pureza radioqumica e estabilidade, tanto para os conjuntos liofilizados logo aps a sntese de sal de MIBI (lote 1) como para os conjuntos liofilizados aps decorrido seis

meses de armazenamento do sal em dessecador em condies anidras e atmosfera de nitrognio (lote 2). A tabela 3 mostra os dados da determinao da pureza radioqumica dos reagentes liofilizados do lote 1 marcado com tecncio- 99m aps diferentes tempos de estocagem, utilizando-se baixa atividade de marcao (< 366 MBq), indicando boa estabilidade do produto liofilizado.

57

Tabela 3- Pureza radioqumica dos reagentes liofilizados marcados com tecncio99m X tempo de armazenamento.

Tempo de armazenamento Pr liofilizado Imediato 7 dias I ms 4 meses


Q)

% PUREZA RADIOQUMICA (% DE MIBI-'""Tc) Imediato aps marcao 98,34 0,08 98,05 1 , 4 5 98,76 0,01 96,02 0,07 98,53 0,08 98.92 0,05 98,75 0,05 95.93 4,07 97,68 0,40 98,28 0,25 99,17 0 , 6 7 99,11 0 , 2 0 Aps 4 horas marcao 98,52 0,23

a o

9 meses 10 meses I I meses

N= 2 para cada tempo

A tabela 4 expressa os resultados de pureza radioqumica, comparando as marcaes realizadas com baixa e alta atividade para os lotes 1 e 2 . A tabela tambm permite avaliar os mtodos empregados na determinao de pureza radioqumica.

58

Tabela 4. Pureza radioqumica do reagente liofilizado de MIBI marcado com tecncio - 9 9 m x atividade de marcao

Mtodo W3 Ac.Etila/ Metanol


WS

Marcao Baixa' atividade lote 1 95,93 4,07

% DE SESTAMIBI-^^'^Tc Marcao Marcao Alta^ Baixa' atividade atividade lote lote 1 2 98,38 1,70 98,26 1,74

Marcao Alta^ Atividade lote 2 98,49 1,56

95,65 4,25

97,74 2,36

98,31 1,39

97,96 2,04

Ac.Etila Extrao solvente CHCI3/ salina


N= 2 para cada mtodo '' 185-296 MBq/2-3 mL * 3663-4070 MBq/2-3 mL

98,93 1,07

94,70 5,30

97,51 2,59

98,26 1,74

4.9

ESTUDOS DE BIODISTRIBUIO

4.9.1

Estudos Invasivos Os estudos da distribuio biolgica do reagente liofilizado e marcado

com tecncio- 99m, para diferentes tempos e animais, demonstraram indicao de boa captao cardaca, similares literatura clareamento em rgos. A tabela 5 expressa, em porcentagem, os resultados dos estudos de biodistribuio em lotes de camundongos Swiss, em relao dose mdia de captao nos rgos selecionados, nos tempos de 15, 30, 60 e 120 minutos, aps a administrao do radiofrmaco SESTAMIBI-^^'^Tc. assim como a distribuio e

59

Tabela 5 - % dose/rgo em camundongos Swiss para o SESTAMIBI-^^'^Tc

% dose/ rgo rgo


15 minutos 30 minutos 60 minutos 120 minutos

Crebro Tireide Pulmo Corao Bao Fgado Estmago Rins 1. Delgado 1. Grosso
Sangue total

0,06 0,02 0,11 0,04 0,42+ 0,11 1,38+ 0,51 0,23+ 0,06 10,95+ 2,29 1.21 0,42 11,49 3,14 13,48 7,02 2,09+ 0,73 0,44+ 0,28 23,03+ 9,05

0,09 0,04 0,06 0,01 0,26 0,04 1,12 0,13 0,16 0,04 10,24 0,53 0,78 0,22 9,64 2,09 13,88 1,98 2,94 0,98 0,23+ 0,08 22,25 4,53

0,05 0,00 0,06 0,00 0,17+ 0,01 1,05 0,13 0,13+ 0,09 10,12 1,87 0,67 0,12 9,89 2,00 11,91 + 0,42 4,89 1,22 0,10 0,03 20,68 3,97

0,05+ 0,02 0,05 0,00 0,13+ 0,03 1,05+ 0,19 0,05+ 0,01 8,86 1,08 0,59 0,17 5,03 0,76 12,43 1,13 8,56 1,66 0,01 0,00 20,96 3,32

Msculo total

Os mesmos resultados da tabela 5 podem ser visualizados na figura 21

60

Figura 2 1 - % dose /rgos em camundongos Swiss para o SESTAMIBI- ^'"Tc

A tabela 6

e figura 22 expressam, em porcentagem dose/grama de

tecido, os resultados dos estudos de biodistribuio em lotes de camundongos Swiss nos tempos de 15, 30, 60 e 120 minutos, para o estudo do radiofrmaco SESTAMIBI-^^""Tc.

61

Tabela 6- % Dose /grama em camundongos Swiss para o SESTAMIBI-^^'^Tc % Dose / grama


rgo
Crebro Pulmo Corao Bao Fgado Estmago Rins /. Delgado /. Grosso

15 minutos

30 minutos

60 minutos

120 minutos

0,15 0,05 1.70 0.28 9,70 3.42 2,85 0.59 7,43 1.57 3,87 0,82 24,25 7,90 6,34 2,05 2,57 0,52
0.22 0,13 2.06 0,76

0.15 0,01 0,99 0,23 8.96 1.25 1.74 0.44 6,89 0.72 2,74 0,64 26.22 4,94 7.46 1,13 3.67 1,03
0,12 0,04 2,08 0,42

0,13 0,01 0,72 0,25 8,14 0,77 1.43 0.81 7.81 1,32 2,67 0,46 28,56 7,65 6,32 0,81 6.14 1.39
0,08 0,02 2,06 0,47

0.13 0,05 0,48 0,08 8,32 1,74 0,63 0,15 6,49 0,38 2,04 0,70 13,79 2,07 7,20 1,36 11.26 2.24
0,07 0,02

Sangue total Msculo total

3,00 0,64

62

Figura 22- % dose/grama em camundongos Swiss para o SESTAMIBI- ^"^Tc

Para comparar a distribuio biolgica (particularmente heptica) em diferentes animais, como no caso dos ratos que so desprovidos, ao contrrio dos camundongos e coelhos, de vescula biliar, foi executado um estudo de

biodistribuio em ratos Wistaii figura 23-A). O valor da captao heptica para esta classe de animais, aps 60 minutos da administrao do radiofrmaco, mostrou-se bastante reduzido, conforme demonstrado no grfico exposto na figura

23.

63

45 40 35 30 25 20 15 10 5

^
CORAO MDIA DESVIO
1,76 0,19

^
PULMO
0,31 0,07

i
F gado
4,40 1,07

_.
25,55 4,90

3
RINS
2,90 0,39

.
0,46 0,11

^
M SCULO
40,51 9,10

INTESTINOS

SANGUE

TOTAL

Figura 23- % dose/rgos em ratos Wistar para o SESTAMIBI- ^""Tc

% Dose/grama em ratos Wistar para o Sestanibi250

(60 nin.)

200

1,50
% Dose/grama

1,00

Q50

0,00 Meda Desvio

CORAO

I I 3

PULMO

RINS

MUSCULO

224 021

026 008

040 007

1,48 023

037 010

Figura 23 -A- % dose/grama em ratos Wistar para o SESTAMIBI- ^"'Tc.

64

As razes corao/fgado determinadas a partir dos valores expressos em % dose/grama de tecido dos ratos (figura 23-A ) e camundongos para o tempo de 60 minutos e coelhos para o tempo de 30 minutos foram respectivamente de 5,6; 1,3 e 1,4 como demonstrado na figura 24 .

Fator de captao CoraoFgado

CXDELHOS

/q^^;>^^*^X
RATOS

CAMUNDONGOS

IVEDA DESVIO

Figura 24- Anlise comparativa da razo corao /figado dos valore expressos em % dose/grama de tecido aps administrao do SESTAMIBI- ^"^Tc, em diferentes animais.

65

Os valores obtidos na razo corao/pulnno para camundongos e ratos, em %dose/grama de tecido, aps 60 minutos da administrao de SESTAMIBI^ ' " T c foram de 11,3 e 8,6 respectivamente, conforme demonstrado pelo grfico na figura 25.
RAZO CORAO/PULMO

12,00^

MDL\

0 D E S V IO

ANIMAIS

Figura 25- Anlise comparativa da razo corao /pulmo dos dados de camundongos e ratos expressos em % dose/grama de tecido aps 60 minutos de administrao do SESTAMIBI- ^"'Tc.

4.9.2

Estudos cintilogrficos Os estudos cintilogrficos foram feitos em dois coelhos de idades

diferentes, para obteno de imagens cintilogrficas e avaliao da biodistribuio do radiofrmaco SESTAMIBI- ^^""Tc. A figura 26 e 27 representam o estudo dinmico (fluxo) do

radiofrmaco, sequencial de 30 imagens cintilogrficas obtidas a cada minuto sucessivo administrao intravenosa do complexo para cada coelho.

66

'9

Figura 26- Estudo dinmico : distribuio do

complexo SESTAMIBI-^^"^Tc em

coelho de 1 ano e seis meses de idade , durante 30 minutos, em intervalos de 1 minuto por imagem.

67

Figura 27- Estudo dinmico : distribuio do

complexo SESTAMIBI-^^'^Tc em

coelho de 5 anos de idade , durante 30 minutos, em intervalos de 1 minuto por imagem.

68

As figuras 28 e 29 representam as imagens cintilogrficas estticas adquiridas aps 15, 30, 60 e 120 minutos da administrao da dose.

Vescula biliar

Figura 28- Estudo esttico: distribuio do complexo SESTAMIBI-^^'^Tc em coelho aps 15, 30, 60 e 120 minutos (da esquerda para direita respectivamente) da administrao da dose, para o coelho com a idade de 1 ano e seis meses.

Vescula biliar

f-

Figura 29- Estudo esttico: distribuio do complexo SESTAMIBI-^^'^Tc em coelho aps 15, 30, 60 e 120 minutos (da esquerda para direita respectivamente) da administrao da dose, para o coelho com a idade de 5 anos.

5. DISCUSSO

69

5. DISCUSSO

5.1 Consideraes gerais

O radiofrmaco SESTAMIBI-^^"^Tc apresenta interesse e aplicao na rotina clnica em Medicina Nuclear, especialmente para avaliao da funo do miocrdio, alm de aplicao no diagnstico diferencial de alguns tipos de tumores
('^^.46,45,8i)_

Centro

de

Radiofarmcia

do

IPEN

possui

interesse

no

desenvolvimento deste radiofrmaco para atendimento das necessidades da classe mdica nuclear. O objetivo deste trabalho foi promover a sntese e caracterizao do composto ativo Tetrafluorborato de Cobre (I) Tetracis (2-Metoxi isobutil isonitrila)(Cu[MIBI]4BF4), realizada de acordo com procedimento descrito por diversos autores em 5 etapas, visando o preparo de reativos liofilizados para marcao com tecncio-99m e a realizao de estudos de marcao, estabilidade e distribuio biolgica do composto.

5.2 Etapas da sntese do Tetrafluorborato de cobre (I) tetracis (2-metoxi isobutil isonitrila) -(Cu[M!B!]4BF4) O produto de partida para a sntese do composto Tetrafluorborato de cobre (I) tetracis (2-metoxi isobutil isonitrila) -(Cu[MIBI]4BF4) uma amina que foi obtida, na etapa I, utilizando a sntese de aminas redutivos A sntese de Gabriel de aminas primrias foi uma metodologia mediante mtodos no

empregada no preparo da amina primria sem nenhuma contaminao de aminas secundrias ou tercirias, fenmeno este que no ocorre com alquilao do amonaco Este mtodo usa o nion ftalimida potssica para reagir com o haleto de alquila (3-cloro-2-metil-1-propeno) em uma reao que envolve o ataque do tipo S n ^ ao carbono ligado ao halognio. O produto da reao uma Nalquilftalimida. A reao pra no processo de monoalquilao, porque a N-

70

alquilftalimida resultante muito pouco nucleoflica e no pode atacar a um segundo equivalente de haleto de alquila
o
O
SN2

^^^^'^l

.f->K

RBr

tJr-H + KBr
o
N -lquiinalimieia

Reao S N ^ entre o nion ftalimida e o haleto de alquila

N-alquilftalimida

resultante resistente hidrlise, mas reage

rapidamente com a hidrazina (hidrazinlise) originando uma ftalilhidrazida com a formao da amina primria Cloridrato de N-(2- metilalil) amina - Produto [1]
83,84)

.0 M

o
_ J ^ ^ hidrazina H,N-R amifia

|1
O

prwnatia

Hidrazinlise da N-alquilftalimida

O
C4H11CIN,

Cloridrato de

N-(2-

metilalil)amina, com

frmula

molecular

sob forma de cristais brancos, altamente higroscpico, foi obtido com relatado em

rendimento mdio de 52%, acima do valor terico de 40-43% literatura

Analisando-se os dados experimentais, observou-se uma variao no ponto de fuso (literatura e experimental), atribuindo-se esta diferena ao

tempo de secagem do produto ou sua caracterstica higroscpica, embora como resultado final estivesse dentro da faixa de temperatura caracterstica do produto
(66, 7 2 )

O cloridrato de N-(2- metilalil) amina, produto de partida para sntese do sal de MIBI [Cu(MIBI )4 B F 4 ] , comercializado pela empresa Sigma Aldrich, atualmente no est disponvel para venda. Por este motivo, houve a

necessidade de sintetizar-se primeiro este produto de partida.

71

O Ipen mantinha em seu estoque uma amostra do produto, que

foi

submetido anlise de ponto de fuso e I.V. para verificar sua integridade. Isto feito, os resultados obtidos com a amostra do produto da marca Sigma Aldrich foram utilizados para formar um padro comparativo com o produto sintetizado. O produto [1], cloridrato de N-(2- metilalil) amina, foi sintetizado em

duplicata para obter-se a quantidade necessria para a segunda etapa. Foi feita uma tentativa de obteno de um rendimento maior do produto com a duplicao da quantidade de reagentes/solventes e adequando os procedimentos e tcnicas de laboratrio, mas o resultado final foi de apenas 17% de rendimento, sendo mais vantajoso seguir o procedimento com as quantidades relatadas em

literatura, uma vez que os rendimentos da sntese do produto [1], executada em duplicidade, foram satisfatrios para o prosseguimento da sntese do sal de MIBI. Na etapa II, a formao da amida foi obtida por meio de uma reao de formilao utilizando-se o etilformiato em excesso como agente formilante, para produzir a formamida .

As funes amidas caracterizam-se por possurem o grupo carbonila diretamente ligado ao nitrognio. As amidas podem ser sintetizadas a partir de aminas, neste caso amina primria com etilformiato em temperaturas abaixo de 100 C, em meio anidro ^^^'^^^
CHj

NH-HCI
^

Etilformiato

trietilamini^

HjC^

. ^ ^ .^"H^u
^

Os compostos N-formilas so usados em sntese orgnica como um grupo protetor de aminas, precursor para preparao de isonitrilas como

intermedirios de produtos a partir de aminas primrias catalisador para alilaao ou reduo. Inmeros mtodos de formilao tm sido relatados O anidrido frmico actico continua a ser o reagente de formilao

mais usado. De acordo com Jung e col., a reao de aminas com acido frmico apareceu em 1955, quando Fieser relatou que aminas reagiam com cido frmico na obteno N-metil formamida. Ainda de acordo com o mesmo autor, o uso em excesso do etilformiato sob refluxo propicia pequenas quantidades do produto desejado, devido racemizao do produto ^^^^.

72

De acordo com protocolo, utilizado

nesta etapa e baseado no

documento tcnico emitido pela lAEA ^^^\ a sntese foi reproduzida 8 vezes com rendimento inicial baixo (em torno de 40%) porm, aps adequao de tcnicas, equipamentos e vidrarias obteve-se maior rendimento (60- 70%) nas snteses posteriores do produto [2]. Em literatura ""^ so citadas diferentes

variaes de tcnicas e reagentes para obteno desta fase intermediria do MIBI relatando-se rendimentos de 69 % ^^^^ at 90%, algumas com adio de uma etapa para formar a N-( 2-metilalil) amina livre e ento prosseguir a reao de formilao da amina A opo pela rota de sntese clssica embora no reproduzindo o

rendimento terico relatado, possibilitou a obteno do produto [2] com boa pureza qumica e em quantidades adequadas para o prosseguimento da etapa III, produo de N-(2-metoxi isobutil) formamida, conforme demonstrado pela identificao das bandas dos grupamentos caractersticos ao produto II, similares
aos indicados em literatura (^O'^s, ss. 86)

Na terceira etapa da sntese, a entrada do grupamento metxi (OCH 3) em olefinas obtida por meio de reao de adio do tipo eletroflica, tendo

como base o mtodo Markovnikov, que regioseletiva por meio da sntese de teres por alcoximercuriao- desmercuriao ^''K

Esta reao permite a hidratao de lcenos com o reagente Hg(0Ac)2, em presena de um lcool, com a a formao de um on mercrio cclico

(intermedirio), que aberto com o ataque do lcool para completar a alcoximercuriao. O acetato de mercrio, ao se ligar amida, rompe a dupla ligao, promovendo carga positiva no carbono 2, possibilitando a entrada do grupo metoxi
(OCH3)

Na desmercuriao ocorre a reduo deste composto com NaBH4, permitindo a obteno de teres. Nesta etapa, ocorrem reaes fortemente exotrmicas que tiveram a temperatura controlada por meio de banho de gelo e adio lenta dos reagentes. O grupo alila produz um boa quantidade de produto hidratado resultando em dil, dependendo da base utilizada para a reao. O grupamento metxi introduzido em lcenos tem efeito 1" ^^^^\

73

CH, xO MeOH/ Hg(0Ac)2 MeOH/NaOH NaBH, HCI MgSO^ OCH, -NH O

O mercrio recupera-se sob a forma de uma bola de Hg elementar ^^'que separada por celite, que um polmero sob forma de p que tem afinidade por mercrio. Para diminuir a contaminao com o produto a operao de filtragem foi repetidas diversas vezes e, embora o mercrio seja altamente contaminante, o seu ponto de ebulio muito alto (357C) para contaminar o produto que tem temperatura para destilao inferior ( purificao por destilao do produto 3 em temperatura de 100-110C em presso reduzida) do ponto de ebulio do mercrio. Nesta etapa, o produto N-( 2-Metox isobutil) formamida foi obtido com um rendimento mdio de 48%, de acordo com a literatura ^'^'^\ que relata Como na etapa II, a adequao na vidraria e melhorou o rendimento que foi

rendimentos entre 32 - 47%.

equipamentos, na repetio das etapas,

adequado para prosseguimento da sntese do MIBI. A caracterizao de N-( 2-Metoxi isobutil) formamida no infravermelho mostrou as bandas de absoro dos grupamentos caractersticos ao produto conforme relatado em literatura Na quarta etapa da sntese o produto resultante MIBI teve como base o mtodo modificado de Hofmann-Gautier, que emprega uma amina primria para a obteno de uma isonitrila com baixo ponto de ebulio
R-NH
CHX

-R-N"^C

BASE

O produto [4], 2- metoxi isobutil isonitrila, de formula


C6H12NO

molecular

e peso molecular de 113,16 g sob forma de um leo viscoso incolor,

com odor caracterstico das isonitrilas altamente voltil ^^^'^^^

74

A sntese de carbilaminas de Hoffmann um dos dois mtodos clssicos para a preparao de isonitrilas^^'^^ difcilmente empregada por causa dos baixos rendimentos e dificuldades experimentais. Alguns mtodos propostos com alto rendimento e menor dificuldade experimental no so reprodutveis A sntese de isonitrilas a partir de formamidas N-monosubstitudas

usando oxicloreto de fsforo como um agente desidratante trabalhosa, segura (algumas utilizam reagentes mais crticos) e a mais utilizada para obteno de maiores quantidades de isonitrilas

2R-NHCH0+

P O C I 3 + 4 Piridina

2 R-N + Piridina.HPOa + 3 Piridina. HCI

mtodo

pode produzir rendimentos de 58-95% em

isonitnias

alifticas em geral As isonitrilas so especialmente importantes devido sua reatividade bifuncional, nucleoflica e eletroflica durante a reao. So relatados numerosos mtodos para a sntese de isonitrilas, com diferentes rendimentos e teor de pureza o^, 9 6 , 9 7 , 9 8 ) _ Uma das dificuldades nesta etapa de sntese do MIBI a reao com oxicloreto de fsforo porque forma-se HCI e o cido excedente livre pode

dificultar a formao do complexo, pois os cidos so incompatveis com as isonitrilas convertendo-as em aminas em determinadas condies. Nesta etapa, a fase mais crtica foi durante a ltima purificao, por destilao fracionada para separar o produto dos demais reagentes como piridina e benzeno pois, por ser extremamente voltil, o produto deve ser recolhido em meio anidro, gelado, em atmosfera de nitrognio e presso reduzida. A piridina uma base mais fraca do que aminas alifticas, tem um par de eltrons que pode compartilhar com cidos e tem propriedades nucleoflicas o ponto de

ebulio da piridina bastante prximo do MIBI e com o benzeno forma uma mistura azeotrpica tornando a etapa final de purificao bastante crtica e

decisiva para o sucesso da sntese Aps alguns insucessos na purificao final do MIBI, foi feita uma destilao teste somente com a piridina para verificar as condies, adequando

75

os equipamentos e vidrarias disponveis, para observar ponto de ebulio e vcuo MIBI. corretos de modo a diferenciar das condies de destilao do produto Da destilao final do produto MIBI, que foi recolhido em oito fraes, analisadas

apenas as 4 ltimas foram aproveitadas, todas as amostras foram para constatar a sua pureza.

Esta separao do MIBI e da piridina fundamental para a quelao do MIBI com o aduto de cobre, tetrafluorborato de cobre (I) tetra( acetonitrila), para a preparao de tetrafluoroborato de cobre (I) tetracis (2-metoxi isobutil isonitrila), pois a presena da piridina como contaminante, na etapa 5B, impede a formao do complexo desejado. Por estas condies delicadas e necessrias obteno do MIBI, a ltima purificao foi executada imediatamente aps a

obteno do aduto tetrafluorborato de cobre (I) tetra( acetonitrila), etapa 5 A. Existem vrios relatos sobre diversas modificaes para esta

etapa , com indicao de outros solventes de menor toxicidade em substituio piridina e benzeno como o diclorometano e trietilamina, embora com citaes de rendimentos prximos aos da rota da piridina/benzeno (em torno de 31-58%). Neste sentido foi feita uma tentativa de sntese, utilizando-se diclorometano e

trietilamina, que foi sem sucesso pois no foi obtido qualquer produto final, embora a sntese tenha transcorrido de acordo com o descrito na rota

Outra

condio

bastante

citada

para

obteno

de

pequenas

quantidades de isonitrilas o tratamento de formamidas com cloreto de p-tolueno sulfonila e piridina que apresenta rendimento razovel e com boa pureza
(^3,94,95)^

mas os rendimentos experimentais apresentados em literatura indicam valores mais baixo (de 7-20%) do que a rota utilizando-se piridina/benzeno A

manipulao e purificao nesta reao problemtica devido reatividade das isonitrilas. No emprego desta rota, recentemente relatou-se o uso de polmeros

filtrantes que permitem a passagem de p-tolueno sulfonila para remover a piridina, como um mtodo mais eficiente de purificao demonstrando superiores na obteno da isonitrila As diversas modificaes e variaes desta etapas descritas em literatura, indicam as dificuldades representadas na obteno do produto [4], 2rendimentos

76

metoxi isobutil isonitrila (MIBI), substrato para produo do Tetrafluoroborato de cobre (I) tetracis (2-metoxi isobutil isonitrila). No nosso caso foi obtido com um rendimento mdio de 35%, dentro dos valores informados em literatura, para a rota, utilizando os reagentes piridina, benzeno e oxicloreto de fsforo, que relata rendimentos entre 32 - 47%

^^^-^^K
e de odor extremamente forte caracterstico

O MIBI foi analisado apenas pela tcnica de CLAE por se tratar de um produto txico, altamente voltil

das isonitrilas, utilizando como padro comparativo uma amostra do produto obtido comercialmente da empresa ABX (Advanced Biochemical CompoundsAlemanha) com teor de pureza de 97%. Os resultados foram comparados revelando valores similares de tempos de reteno para ambos , tornando o

produto adequado para prosseguimento da sntese. Iqbal e col.^^^^ descrevem o preparo do aduto de cobre e isonitrila usando o nion BF4" , para obteno de um sal estvel para armazenamento. Adutos metlicos solveis, que usam metais como o cobre , so obtidos pela mistura com um complexo de metal deslocvel para formar um complexo de

coordenao com um ligante que ser posteriormente substitudo pela isonitrila em meio e temperatura adequados. Na primeira parte da quinta etapa foi preparado o aduto de cobre (I) solvel utilizando como ligante a acetonitrila, conforme literatura ^^^''"^^

CHOCN CU2O

HBF

[Cu (CH

3CN)4]BF4

O complexo de MIBI com o sal tetrafluorborato de cobre (I) a forma mais estvel e adequada para a formulao de reagentes liofilizados de MIBI para uso mdico Existem diversas literaturas^'*'^^''''^^ sobre formao do complexo

utilizando o cobre sob forma de cloreto, facilmente preparado em condies simples e rpidas, porm geralmente utilizado para pesquisas, porque sob esta forma o sal no estvel para armazenamento ou estoque. O aduto de cobre extremamente sensvel ao ar, tomando uma colorao verde , resultado da oxidao do cobre I para II. Desta forma, imediatamente aps obteno foi colocado com o prprio filtro dentro de

77

dessecador em meio nitrogenado e mantido desta forma at o uso para quelao com o MIBI, dificultando a pesagem da massa obtida, que foi estimada em torno de 3 g. O rendimento obtido foi suficiente para a preparao do sal de MIBI, que consome 0,61 g para cada 1 g de MIBI. Na segunda parte da quinta etapa, finalmente, foi executada reao de complexao do aduto de cobre solvel e o MIBI recm preparados para formar um complexo de coordenao tendo como ligante a isonitrila . Ocorrendo a

substituio da acetonitrila no aduto de cobre(l) pela isonitrila, formando o produto final, tetrafluorborato de cobre (I) tetracis (2-metoxi isobutil isonitrila) -

(Cu[MIBI]4BF4).
Em literatura, o rendimento mdio, do produto final sob a forma do sal tetrafluoroborato de cobre (I) tetracis (2-metoxi isobutil isonitrila) -(Cu[MIBI]4BF4) varivel abrangendo valores de 50% 97% (76.77.78.8o.8i) E^^bora o rendimento

tenha sido um pouco abaixo dos valores citados em literatura, foi considerado satisfatrio em funo da pureza, demonstrada IV,CLAE, RMN-H"\ Foram analisados por outras anlises como

os espectros de IV para o produto sob

forma de sal , tetrafluorborato de cobre (I) tetracis (2-metoxi isobutil isonitrila), produzido no IPEN e uma amostra produzida e cedida por Cuba, e ambas demonstraram possuir os grupamentos que caracterizam o

MIBI. O espectro de absoro do infravermelho das isonitrilas caracterizado pela banda 2190-2195 cm"'' (^2,76,78) A dificuldade desta etapa est na obteno do MIBI livre de qualquer resduo de piridina, caso contrrio forma-se um complexo azul de difcil separao do produto principal, Cu[MIBI]4BF4 e o meio em que ocorre a reao que deve ser em atmosfera de nitrognio, anidro e com procedimentos rpido, porque a o MIBI (como algumas isonitrilas) extremamente voltil em temperatura ambiente Com o MIBI puro e a execuo da reao em condies apropriadas descritas, a reao de substituio com a acetonitrila do aduto transcorre de forma adequada com obteno do produto com um rendimento razovel. Para a formulao de um conjunto liofilizado, necessrio que o ligante, que um lquido extremamente voltil, esteja em forma estvel

preservado em forma de um complexo no voltil, que possa liberar a isonitrila sob determinada condies de reao para a complexao com TcO'4

(pertecnetato)(^^'^'^^).

78

A literatura

""o^' descreve o complexo de coordenao de uma partir de uma

isontrila com um metal radioativo (radionucdeo) selecionado a

classe de istopos radioativos como de Te e mtodos que usam para tais complexos. Preferencialmente, os complexos de isonitrilas contm um metal no radioativo em que o local de coordenao ocupado com um ligante isonitrila. O ligante isonitrila pode ser tanto monodentado como polidentado. O conjunto liofilizado contm um ligante isonitrila e um agente redutor capaz de reduzir o metal radioativo para formar o complexo coordenado^^^ Por causa da disponibilidade de suprimento de Tc-99m em

laboratrios clnicos na forma de pertecnetato, que pode ser obtido do gerador ^^Mo-^^'^Tc produzido pelo IPEN, assim como a meia-vida desejvel e energa de raios gama deste radionucldeo, os complexos com este radionuclideo so os preferidos para o uso em "kits". Os composto de isonitrilas so ligantes a doador e n aceptor que

podem ser utilizados no desenvolvimento de complexos metlicos estveis, por sua alterao no comportamento qumico, especialmente nas lipoflicas em complexos formados com Tc-99m Os adutos metais-isonitrilas quando combinados em meios adequados com o metal radioativo escolhido, neste caso o Tc-99m, induzem o deslocamento do metal pelo metal radioativo em uma temperatura apropriada para produzir rapidamente o radiofrmaco para uso clnico O aduto de cobre (I) complexado com o ligante isonitrila MIBI e o nion BF4', ligante urna forma estvel, preservada sob forma de um complexo no propriedades

voltil, para que possa liberar a isonitrila sob determinadas condies de reao para a complexao com TcO'4 (pertecnetato)

5.3 Formulao e marcao

Os compostos marcados com Tc-99m preparados a partir de "kits" no radioativos e pertecnetato (TcO"4)geralmente dependem da eficincia e

concentrao do agente redutor em quantidade adequada para reduzir o radionucldeo. A forma reduzida de Tc-99m ligada ao agente quelante e

quando a reduo incompleta pode surgir as impureza radioqumicas como TcO-4 ou Tc-99m no reduzido

79

A disponibilidade de SESTAMIBI-^^'^Tc limitada, principalmente em emergncias devido ao tempo de preparo de reconstituio do Kit, que requer 10 min de tempo de ebulio em banho de gua e 30 min. de anlise de pureza radioqumica, em literatura citado o uso de microondas produto marcado e uso de um sistema de mini-papis minimizar este tempo de procedimento de preparo A porcentagem mdia de marcao para o estudo da estabilidade do produto (tabela 1 e 2 , item 5.2) utilizando- se o mtodo cromatogrfico com papel W3MM indicou que a pureza radioqumica em relao ao tempo de para aquecimento do cromatogrficos para

armazenamento e liofilizao e atividade de marcao, durante o perodo de 11 meses, permaneceu na mdia de 98%, considerado dentro dos relatos em literatura (20,79,108,109,110,111) A porcentagem mdia de marcao para o mtodo por extrao com solventes CHCIs/salina mostrou-se baixa, nas primeiras marcaes do produto do lote 1 com o Tc-99m em baixa atividade para o mtodo, que aps adequao da tcnica, mostrou o rendimento disposto na tabela 2, indicando uma pureza radioqumica adequada literatura
<2o,67,iio

) ^ ^ relatado pelo fabricante do

produto comercial Cardiolite que recomenda a pureza mnima aceitvel de 90%


(67)

Os resultados demonstrados nas tabelas 3 e 4 so indicativos de um radiofrmaco qualificado com alto teor de pureza e de real estabilidade e que a concentrao radioativa de tecncio 99m no interferiu na pureza radioqumica de

SESTAMIBI -^^nc.

5.4 Estudos de biodistribuio

Estudos preliminares da distribuio biolgica do reagente recm liofilizado e marcado com tecncio- 99m, administrado intravenosamente em camundongos normais da raa Swiss, demonstraram resultados bastante

encorajadores com resposta indicativa de boa captao cardaca, similares literatura ^^^^^''^^\ assim como a distribuio e clareamento em rgos, que poderia interferir na qualidade de imagens. A administrao distribuio intravenosa biolgica em do complexo SESTAMIBI-^"'Tc apresentou aps a

camundongos

Swiss

depurao

80

sangnea extremamente

rpida

com captao pelo tecido do

miocrdio

persistente, mantendo-se, praticamente estvel durante o perodo experimental, de acordo com os resultados observados na figura 21 e 22 e tabela 5 e 6 no item 4.9. Tais dados corroboram com os estudos citados por diferentes autores
79,111, 112)

Os sistema de excreo do complexo demonstrou ser pela duas rotas, urinria e intestinal, entretanto, devido a sua alta lipofilicidade, a predominncia mostrou ser a rota hepato-intestinal, conforme evidenciado pelo acmulo

gradativo da radioatividade no decorrer do tempo experimental, na regio do intestino. Sabe-se que, a alta concentrao encontrada no fgado um fator indesejvel. Particularmente em camundongos, devido a sua estrutura anatmica, na qual, a vescula biliar encontra-se inserida na parte medial do fgado, consequentemente torna-se uma rota obrigatria da transferncia do

radiofrmaco para o intestino. No estudos em ratos, o valor da captao heptica mostrou-se

bastante reduzido porque essa classe de animais desprovida desse mecanismo por causa da ausncia da vescula biliar (figura 23). A razo corao/fgado determinada a partir dos valores expressos em % dose/rgo de tecido dos ratos e camundongos para o tempo de 60 minutos e coelhos para o tempo de 30 minutos foram respectivamente de 5,6; 1,3 e 1,4 como demonstrado na figura 24 e comparando os fatores para os diferentes

animais observa-se a concentrao na vescula biliar j citados em literatura tambm para outros animais como coelhos gatos e caes^^''^-^^^^ A particularidade essencial do radiofrmaco foi atestada com a baixa captao pulmonar que, associados razo corao/pulmo de 11,7 e 8,4, respectivamente para camundongos e ratos (figura 25), sugere a possibilidade de aquisio de imagens cintilogrficas de boa resoluo. As imagens confirmaram o padro de rpido clareamento sanguneo e heptico. Nas imagens mais tardias identificou-se a persistente captao na regio da vescula biliar. Os resultados dos estudos invasivos so indicativos da aplicabilidade do composto na obteno de imagens cardacas. Para confirmar tal indicao as

81

imagens cintilogrficas foram realizadas em coelhos, inclusive com idades diferentes, para comparar a biodistribuio e foi observado que o clareamento sanguneo foi mais rpido, mas com maior concentrao e mais persistente na vescula biliar para o coelho mais velho (figuras 26, 27, 28, 29), embora dentro do informado em literatura para tal reteno (^^^.na.iu) Alm da eliminao hepatobiliar, o composto tambm excretado na urina atravs dos rins. A captao na glndula tireide, indicativa de presena de pertecnetato livre, foi desprezvel nos estudos Invasivos e no foi detectado nas imagens cintilogrficas. Os estudos de distribuio biolgica realizados nas diferentes espcies animais demonstraram a aplicabilidade do reagente liofilizado preparado, na obteno de imagens cintilogrficas cardacas. Nas imagens cintilogrficas, em humano, no deve existir o reflexo de superposio do conjunto fgado:vescula. O efeito somatrio da radioatividade interagindo com o da classe do msculo cardaco estaria, sabidamente

minimizado, portanto, no foi considerado preocupante a captao heptica elevada em camundongos, dados com os quais foram esquematizados a distribuio biolgica.

5.5 Estudo de custo

Foi feito um levantamento do custo em termos de reagentes e solventes utilizados na sntese do composto Tetrafluorborato de cobre (I) tetracis (2-metoxi isobutil isonitrila), considerando-se o consumo de cada reagente em porcentagem para cada sntese completa do composto, que conforme literatura cita um rendimento final mdio de 1,0 g do composto, tendo o Ipen obtido o rendimento de 0,744 g . Aps liofilizao, cada frasco contm 1 mg do reagente liofilizado. O valor de 1,0 g do composto fornecido pela ABX (Alemanha) de 17.800 Euros . O produto liofilizado comercializado sob o nome de Cardiolite para uso clnico em Medicina nuclear tem um custo de R$1.048,00 reais (em 2004) por frasco contendo 1 mg do composto. Em relao aos valores apresentados, observa-se que elevado o custo comercial deste composto, inclusive como produto final para uso clnico e.

82

embora o rendimento mdio tambm seja baixo vivel para

pequenas

produes do composto, que pode ser adequado e otimizado nas suas etapas para maior produo. As quantidades de reagentes e solventes utilizados em uma sntese completa em valores monetrios fica em torno de R$ 2.500,00, portanto de custo relativamente baixo, sendo maior o tempo gasto nas etapas (mdia de 40 dias), algumas crticas como j citado no texto, mas com boa possibilidade de produo. Apesar de ser uma sntese trabalhosa, a produo do reagente de MIBI pode representar uma economia para o Centro de Radiofarmcia do IPEN, j que o produto importado bastante caro.

6. CONCLUSO

83

6. CONCLUSO

1.

O produto final (Cu[MIBI]4BF4) foi obtido com todas as

propriedades fisico- qumicas exigidas e com alto grau de pureza compatvel com a elaborao de reagentes liofilizados para marcao com tecncio -99m; 2. tecncio -99m A formulao liofilizada do reagente para marcao com indicou bons resultados de rendimento de marcao e

estabilidade, de acordo com a literatura; 3. Os estudos de biodistribuio mostraram a viabilidade do

complexo para aplicao em estudos cardacos.

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