Espectroscopas UV-Visible e Infrarroja de molculas poliatmicas.

1. Introduccin. En espectroscopia se estudian las interacciones de la radiacin electromagntica (luz con la materia. Entre los fenmenos !ue producen estas interacciones est"n la absorcin# emisin $ dispersin de luz por la materia. %a ma$ora de nuestra informacin e&perimental sobre los ni'eles de energa de los "tomos $ molculas pro'iene de la espectroscopia. ( ni'el molecular# las diferentes tcnicas espectroscpicas tambin nos permiten conocer las estructuras moleculares (conformaciones# longitudes $ "ngulos de enlace # las frecuencias moleculares de 'ibracin# descubrir la composicin de una muestra# seguir la concentracin de especies reacti'as en funcin del tiempo en una reaccin !umica# determinar intermedios de reaccin $ un largo etc. En este blo!ue utilizaremos tres tcnicas diferentes) absorcin ultra'ioleta-'isible (UV'isible # emisin de fluorescencia $ absorcin infrarroja (I* para caracterizar la fotofisico!umica de un alcaloide denominado nor+armano de gran inters farmacolgico cu$a presencia se +a detectado en diferentes tipos de plantas e incluso en el cuerpo +umano. %a estructura de este compuesto se muestra en la figura 1. Est" compuesta de un anillo piridnico deficiente en electrones , unido a otro anillo indlico con e&ceso de electrones ,. %as interesantes propiedades fotofsica !ue este deri'ado presenta son debidas a cambios fotoinducidos en la distribucin electrnica !ue originan un fuerte incremento en la basicidad del n-cleo piridnico en el primer estado electrnico e&citado $ !ue# consecuentemente# modifican la reacti'idad de esta molcula.

.ig. 1.- Estructura del /or+armano %a tcnicas de absorcin $ emisin de luz en la regin UV-'isible se encuadran dentro de la espectroscopia electrnica $ la tcnica de absorcin I* se encuadra dentro de la espectroscopa de 'ibracin. 0ediante la absorcin $ la emisin de radiacin en la regin UV-'isible caracterizaremos los espectros de absorcin $ fluorescencia de las dos formas !ue pueden e&istir (neutra $ catinica en disolucin acuosa en el inter'alo de p1 entre 1 $ 12. 3btendremos el rendimiento cu"ntico de fluorescencia de la forma catinica $ la constante de acidez de este alcaloide una 'ez protonado# tanto en el estado fundamental como en el primer estado e&citado. Utilizando la espectroscopia de absorcin infrarroja obtendremos la constante de formacin de un complejo de tipo /1-, entre este alcaloide $ el deri'ado fenantreno.

Este blo!ue se realizar" en tres sesiones $ consta de un fundamento terico $ de una metodologa e&perimental para cada una de las tcnicas utilizadas# as como# de tres pr"cticas

2 Fundamento Terico 4.1 Espectroscopa Electrnica. El estudio de los espectros electrnicos# adem"s de permitir e&plicar los colores de las sustancias# tambin proporciona importante informacin sobre los estados e&citados de las molculas. %a distribucin electrnica de una molcula determina las propiedades fsicas $ !umicas de sta# de esta manera# puede ocurrir !ue reacciones !ue se producen foto!umicamente (estado e&citado # no lo +agan trmicamente (estado fundamental # $a !ue son el resultado de una distribucin electrnica diferente en la molcula producto de la e&citacin. 4.1.1 Espectros de absorcin UV-'isible. %a energa total de una molcula es el resultado de las interacciones atracti'as entre el n-cleo $ los electrones# repulsi'as electrn-electrn $ n-cleo-n-cleo# 'ibraciones de los n-cleos# rotacin nuclear e interacciones magnticas resultantes de los spines de los electrones $ n-cleos. *esol'iendo la ecuacin de ondas podramos conocer el 'alor de esta energa# sin embargo# en la pr"ctica# esto es imposible $ es necesario recurrir a apro&imaciones. 5i suponemos !ue los n-cleos $ electrones son masas puntuales $ despreciamos las interacciones spin-rbita $ otras interacciones relati'istas# mediante la apro&imacin de 6orn-3ppen+eimer podemos separar la funcin de onda molecular como un producto de funciones de onda electrnica $ nuclear. Esta apro&imacin se basa en !ue los electrones se mue'en muc+o m"s r"pidamente !ue los n-cleos $ es una buena apro&imacin# considerar a los n-cleos fijos mientras los electrones realizan sus mo'imientos. 7e esta manera# podemos separar la funcin de onda molecular en un producto de funciones de onda electrnica $ nuclear. 8or otro lado# un tratamiento similar para la funcin de onda del mo'imiento nuclear demuestra !ue sta puede separarse en funciones de onda rotacional# 'ibracional. Esta separacin se basa en !ue la 'ibracin molecular es muc+o m"s r"pida !ue la rotacin molecular# por lo !ue podemos usar una separacin internuclear media para calcular el momento rotacional de inercia. 8or tanto# aun!ue la siguiente ecuacin no es e&acta $a !ue conlle'a las apro&imaciones anteriormente descritas# podemos considerar la energa total de una molcula como la suma de las energas electrnicas# 'ibracional# rotacional $ traslacional. Etotal 9 Eelect : E'ibr : Erot : Etrasl %os 'alores relati'os de estas energas son importantes. %as energas implicadas en los cambios de las distribuciones electrnicas de las molculas son del orden de 'arios electrn-'oltios (1eV e!ui'ale a unos ;222 cm-1 por tanto los espectros electrnicos aparecen en las regiones del 'isible $ ultra'ioleta del espectro electromagntico !ue se e&tienden desde unos 1<222 cm-1 para la luz roja +asta 41222 cm-1 para la luz azul $ unos =2222 cm-1 para la ultra'ioleta. %as transiciones 'ibracionales corresponden a absorciones en la regin del infrarrojo (sobre 122 cm-1 a 1222 cm-1 . %as transiciones rotacionales corresponden a la absorcin en la regin de microondas (sobre 2.2> cm-1 a 12 cm-1 . (s# la separacin entre los ni'eles de energa electrnicos es muc+o ma$or

!ue la separacin entre ni'eles 'ibracionales# $ sta# a su 'ez es muc+o ma$or !ue la separacin entre ni'eles rotacionales (figura 4 . 7e esta manera# a ni'el molecular# una transicin electrnica siempre ir" acompa?ada de transiciones 'ibracionales !ue a su 'ez 'an acompa?adas de rotacionales. @omo la energa traslacional no +ace mas !ue sumar una cantidad constante a la energa total# las frecuencias de una transicin 'ienen dadas por +A 9 (EBelec- EBBelec :(EB'ib- EBB'ib : (EBrot- EBBrot donde cada trmino entre parntesis es sustancialmente menor !ue el trmino precedente.

.ig.4.- Es!uema energtico de separacin de ni'eles. Tipos de transiciones electrnicas en molculas poliatmicas. %a solucin de la parte electrnica de la ecuacin de ondas da los ni'eles de energa (orbitales $ las distribuciones electrnicas apro&imadas para unas determinadas coordenadas nucleares. Es costumbre# aun!ue no es rigurosamente cierto# situar los electrones en orbitales moleculares $ considerar la absorcin de luz como una transicin uni-electrnica entre orbitales. 8odemos +acer una clasificacin de las transiciones electrnicas en trminos de orbitales (enlazante # *(antienlazante , (enlazante # *(antienlazante $ par solitario (no enlazante# designado por n . En la figura ># mostramos los ni'eles de energia de los orbitales moleculares del formalde+doC$ algunas posibles transiciones electrnicas !ue pueden ocurrir entre estos orbitales# tales como *, n *, *, n *. %as energas de estas transiciones electrnicas sigue# generalmente# el siguiente orden) n *< *< n *< *< * 3tros dos importantes tipos de orbitales !ue se consideran en estas transiciones son el orbital molecular ocupado de ma$or energa denominado 1303 ( 1ig+est 3ccupied 0olecular 3rbital $ el orbital molecular desocupado de menor energa denominado %U03 (%oDest Unoccupied 0olecular 3rbital . (mbos orbitales se refieren al estado fundamental de la molcula.

>

.ig.>.- 7iagrama de energa de los orbitales moleculares de l .ormalde+do $ posibles transiciones electrnicas. En las cuatro transiciones !ue se muestran en la figura ># el electrn !ue promociona no 'aria su spin $ por tanto el n-mero cu"ntico de spin total permanece igual a cero (59si# con si9 :1C4 -1C4 . %a multiplicidad de spin (0945:1 en ambos estados# tanto fundamental como e&citado# es igual a 1# por tanto todos estos estado son estados singlete ( usualmente se denota como 52 el estado fundamental $ 51# 54# 5>#E para los siguiente estados e&citados . Fodas las transiciones mostradas en la figura > son # por tanto# transiciones singlete-singlete. 5i por lo contrario# el electrn promocionado cambia su spin# el momento angular total de spin es 1 $ su multiplicidad >. El estado e&citado !ue produce la transicin es un estado triplete. 7e acuerdo con la regla de 1und# para una misma configuracin electrnica# el estado triplete tiene menor energa !ue el correspondiente singlete (figura < .

<

.ig.<.- 7istincin entre estados singletes $ tripletes. Ejemplo del formalde+do. Probabilidad de las transiciones. Ley de Lambert-Beer y Fuerza de Oscilador. E&perimentalmente# la eficiencia de absorcin de luz a una determinada longitud de onda# # por un medio absorbente se caracteriza por la absorbancia a esta , ((), o la transmitancia F( !ue se definen como ((G 9 log (IG2CIG 9 -log F(G siendo F(G 9 IGCIG2# donde IG2 $ IG son las intensidadesde la luz !ue entra $ sale del medio absorbente# respecti'amente. En muc+os casos# la absorbancia de una muestra sigue la le$ de %ambert-6eer ((G 9 log (IG2CIG 9 () l c , donde () es el coeficiente de absorcin molar (com-nmente e&presado en % mol-1 cm-1 # l es la longitud de paso de luz $ c es la concentracin ( mol %-1 . El coeficiente de absorcin molar e&presa la +abilidad de una molcula para absorber la luz a una $ un determinado disol'ente. 5eg-n la teora cl"sica# la absorcin molecular de luz puede ser descrita si consideramos a la molcula como un dipolo oscilando# lo cual nos permite introducir la llamada fuerza de oscilador# la cual est" directamente relacionada con la integral de la banda de absorcin mediante la siguiente ecuacin) f 9 4.>2> mc24C /a, e4n H I( d donde m $ e son la masa $ carga del electrn# respecti'amente $ c2 es la 'elocidad de la luz# n es el ndice de refraccin. f es una cantidad adimensional $ sus 'alores est"n =

normalizados# de tal manera !ue las transiciones m"s eficaces o probables tienen f 1 !ue se corresponde con unos 'alores de 12<-12= 0-1 cm-1 . %a 'entaja de introducir la fuerza de oscilador estriba en !ue tiene una cone&in directa con las funciones de onda de los estados e&citados inicial (i) $ final (f) implicados en la transicin. El tratamiento mecano-cu"ntico de la interaccin entre la radiacin $ la materia demuestra !ue la probabilidad de absorcin o emisin entre dos estados estacionarios es proporcional al cuadrado de la magnitud de la integral llamada momento de transicin. Esta integral se define mediante la siguiente e&presin fi = f* i d, = -er !ue es una medida del momento dipolar asociado con el desplazamiento de carga !ue se produce cuando tiene lugar la redistribucin electrnica. %a fuerza de oscilador se relaciona con este momento por f 9 (;4C> (mAC+ e4 JfiJ4 (s pues# se puede estimar lo probable !ue es una transicin si se conocen las funciones de onda# lo !ue es una relacin importante entre la teora $ la e&perimentacin. En las parejas de estados para los cuales esta integral es cero se dice !ue es una transicin pro+ibida. @uando el 'alor de esta integral es distinto de cero se dice !ue la transicin entre estos estados est" permitida.

4.1.4 Espectros de emisin En la figura = se muestran todos los procesos !ue pueden ocurrir a una 'ez la molcula interacciona con un fotn de una determinada longitud de onda en la regin UV-'isible $ lo absorbe. ( estos procesos se denominan como fotofsicos $ pueden ser definidos como transiciones !ue con'ierten un estado e&citado en otro estado e&citado o en el fundamental.

Vamos empezar

.ig.=.- 8osibles 'as de dese&citacin de una molecula e&citada. Empezaremos describiendo los procesos fotofsicos !ue son unimoleculares. Estos procesos se clasifican en radiati'os $ no-radiati'os# $ para ilustrarlos# nada mejor !ue utilizar el diagrama de 8errin-KablonsLi de la figura M. En esta representacin la direccin 'ertical corresponde a un incremento de energa $ la direccin +orizontal no M

tiene ning-n significado fsico. %os estados electrnicos son representados por los smbolos 52# 51# 54 $ corresponden a los estados singlete fundamental# primero $ segundo e&citado# respecti'amente. F1 $ F4 representan los correspondientes estados tripletes de 51 $ 54# respecti'amente. %os procesos radiati'os est"n dibujados con lneas rectas $ los no-radiati'os con lnea ondulada. Vamos a describir bre'emente estos procesos) Transiciones radiativas (bsorcin 5-5 (52 : +A N 51 # caracterizada e&perimentalmente por el coeficiente de absorcin molar I. Este proceso transcurre en un tiempo de apro&imadamente 12-1=s. (bsorcin 5-F (52 : +A N F1 # transicin pro+ibida $a !ue son estados de diferente multiplicidad de spin $ por tanto la integral momento de transicin se anula. Esta transicin est" caracterizada e&perimentalmente por el coeficiente de absorcin molar I(5-F . Emisin de fluorescencia (51 N 52 : +A # transicin permitida $ caracterizada por una constante de 'elocidad k f con 'alores entre 1212-12O s-1. Emisin de fosforescencia (F1 N 52 : +A transicin pro+ibida $ caracterizada por una constante de 'elocidad kp con 'alores entre 12M P 1 s-1.

Transiciones no-radiativas @on'ersin interna (@I . Fransiciones entre estados e&citados de la misma multiplicidad de spin (ej. 51 52 : Q caracterizadas por una constante kic con 'alores entre 1211-12R s-1. @uanto menor sea la diferencia entre los estados e&citados# ma$or es la eficiencia de @I. @ruce entre sistemas (@I5 . Fransiciones pro+ibidas entre dos ni'eles 'ibracionales isoenergticos de estados electrnicos e&citados de diferente multiplicidad de spin (ej. 51 F1 : Q o bien F1 52 : Q caracterizadas por una constante kcis con 'alores comprendidos entre 1212-12; s-1. %a presencia de "tomos pesados incrementa el acoplamiento spin-rbita $ por tanto fa'orece !ue se produzca con m"s probabilidad este tipo de transicin. E&iste un tipo de transicin no-radiati'a !ue ocurre entre estados 'ibracionales de un mismo estado electrnico. Este proceso se denomina relajacin 'ibracional $ a temperatura ambiente# esta disipacin de energa# se produce en un tiempo de alrededor 12-14s. Este proceso es lento con respecto a la absorcin# sin embargo es mu$ r"pido con respecto a la fluorescencia# @I $ @I5. Esto e&plica !ue las propiedades fluorescentes de una molcula sean independientes del estado 'ibrnico# dentro de la banda de absorcin 52 51# al !ue la molcula es e&citada.

.ig.M.- 7iagrama de 8errin-KablonsLi. 8osicin relati'a de las bandas de absorcin# fluorescencia $ fosforescencia. Estos procesos no-radiati'os son los responsables de !ue no fluorezcan el 122S de las molculas e&citadas# !ue la fluorescencia se origine siempre desde el estado 51# !ue su perfil no 'are con la longitud de onda de e&citacin $ !ue el m"&imo de emisin siempre se sit-e a ma$ores longitudes de onda (menor energa !ue el m"&imo de absorcin. Este gap entre el m"&imo de la primera banda de absorcin $ el m"&imo de fluorescencia se denomina desplazamiento de 5toLes. En general# las diferencias entre los ni'eles 'ibracionales son similares en el primer estado e&citado $ en el fundamental de a!u !ue los perfiles de la primera banda de absorcin $ la fluorescencia sean im"genes especulares (figura O . %a transicin 2-2 es usualmente la misma en absorcin $ fluorescencia# por tanto podemos obtener la longitud de onda de esta transicin del punto de corte de ambos perfiles. (un!ue no entraremos en m"s detalles# mencionaremos !ue todos los procesos anteriormente descritos son espont"neos.

.ig.O.6andas 'ibracionales en el espectro de absorcin $ fluorescencia de un +idrocarburo arom"tico. (dem"s de kf# +a$ otros par"metros !ue caracterizan la emisin fluorescente# uno de stos es el rendimiento cu"ntico de fluorescencia (Tf !ue se define como el cociente entre el n-mero de fotones emitidos $ el n-mero de molculas e&citadas. 5i no e&istieran canales de desacti'acin# el rendimiento cu"ntico de la molcula sera igual a uno. 5i slo consideramos procesos de desacti'acin unimoleculares# Tf 'endr" dado por ) Uf 9 kfC (kf : V ki 5iendo ki la constante de desacti'acin de cada uno de los procesos no-radiati'os unimoleculares. Efecto de los procesos fotoinducidos intermoleculares sobre la emisin fluorescente. Transferencia protnica fotoinducida. %as propiedades "cidas $ b"sicas de una molcula pueden diferir significati'amente del estado fundamental al e&citado. Una de las causas posibles de esta obser'acin es la diferencia en la densidad de distribucin electrnica entre ambos estado $ la ocurrencia de la transferencia protnica durante el tiempo de 'ida del estado e&citado depender" de las 'elocidades relati'as entre los procesos de dese&citacin unimoleculares $ el proceso de transferencia protnica. 7eterminacin del pWa en el estado e&citado mediante el ciclo de .Xster. El pWa de un "cido dbil puede determinarse tericamente utilizando el ciclo de .oster junto con medidas espectroscpicas. 7e acuerdo con este ciclo !ue mostramos en la figura ; /a +A(1 : Y12Z 9 /a +A(- : Y12 donde Y12 $ Y12Z son las entalpias molar de ionizacin est"ndar# +A(1 $ +A(- son las diferencias de energa( correspondiente a la transicin 2-2 entre el estado e&citado $

fundamental de (1 $ (-# respecti'amente $ /a es el n-mero de ('ogrado. Esta ecuacin puede ser escrita como /a (+A(- - +A(1 9 Y12Z - Y12

.ig.;.- @iclo de .oster para la determinacin del pW del estado e&citado. (sumiendo !ue las entropas de ionizacin Y52 $ Y52Z son iguales# las diferencias de entalpa puede ser reemplazada por la diferencia de energas libres Y[2Z- Y[2. Y[2 est" relacionada con la constante de e!uilibrio mediante Y[2 9 - *F ln W 9 4.> *F pW de la misma forma# Y[2Z 9 - *F ln WZ 9 4.> *F pWZ donde * es la constante de los gases $ F la temperatura absoluta. Usando estas ecuaciones $ con'irtiendo las frecuencias a n-meros de onda# la ecuacin puede e&presarse como pWZ-pW 9 4.1 12-> ((- - (1 Esta ecuacin muestra !ue si la banda de emisin de la forma b"sica est" localizada a ma$or longitud de onda !ue la forma "cida# pWZ es menor !ue el pW del fundamental. 8or el contrario# si la emisin de la forma b"sica est" desplazada +acia el azul (menor landa con respecto a la banda de emisin de la "cida# el "cido en el estado e&citado es m"s dbil !ue en el fundamental. En la pr"ctica# la diferencia entre (- $ (1 corresponde con la diferencia entre las transiciones 2-2 de (- $ (1 # las cuales no son f"ciles de determinar . /ormalmente se estiman promediando los n-meros de onda de los m"&imos de absorcin $ fluorescencia

22 9 ( absmax: em max C4
5in embargo la mejor apro&imacin se encuentra utilizando el punto de interseccin de los espectros normalizados de absorcin $ fluorescencia. En el caso !ue el desplazamiento de 5toLes sea mu$ grande# ser" difcil encontrar este punto de interseccin $ ser" preferible tomar absmax como el promedio de los n-meros de onda de la mitad superior de la banda de absorcin (52N51 $ realizar la misma operacin para obtener emmax pero# en este caso# con la banda de emisin fluorescente.

1 2

%a determinacin de la energa de esta transicin 2-2 es el ma$or factor de error en la estimacin del pWZ. %a 'entaja de este mtodo es su sencillez $ !ue puede usarse incluso cuando no se establece el e!uilibrio en el tiempo de 'ida del estado e&citado.

1 1

4. Espectroscopia de Vibracin. Espectros de absorcin I*. %a espectroscopa de absorcin infrarroja (I* es una tcnica analtica de gran importancia para los !umicos. Est" basada en las 'ibraciones de los "tomos de las molculas. Un espectro de infrarrojo consiste en un espectro de absorcin !ue implica transiciones entre ni'eles 'ibracionales diferentes dentro del mismo estado electrnico. 7ado !ue una molcula poliatmica tiene >/-M ( >/-= si es lineal grados de libertad 'ibracionales# su espectro de infrarrojo puede presentar dic+o n-mero de bandas de absorcin# cu$as energas corresponder"n a la frecuencia de cada modo 'ibracional. 8ara !ue una 'ibracin d lugar a una absorcin de infrarrojo# debe causar un cambio en el momento dipolar de la molcula. (s# la intensidad de una banda de infrarrojo ser" ma$or cuanto ma$or sea el cambio en el momento dipolar con la 'ibracin. %a principal utilidad de la espectroscopa de infrarrojo deri'a del +ec+o de !ue los grupos funcionales mantienen cierta indi'idualidad dentro de las molculas# afectando sus 'ibraciones fundamentalmente al enlace considerado. 5eg-n el modelo cl"sico del oscilador armnico# la frecuencia 'ibracional de dos "tomos unidos por un enlace 'iene dada por la e&presin
= 1 2 c

donde W es la constante de fuerza del enlace $ \ la masa reducida del sistema. @omo resultado# se encuentra !ue los diferentes grupos funcionales se caracterizan por diferentes frecuencias 'ibracionales# !ue naturalmente 'an asociadas a bandas distintas en el espectro de infrarrojo. 5iempre !ue obtengamos un espectro I*# en condiciones !ue no sean de 'aco# la radiacin infrarroja 'a atra'esar el aire $ ser" ine'itable !ue parte de esta radiacin sea absorbida por algunas de las molculas !ue lo componen. Esta absorcin# junto con la correspondiente a las 'entanas !ue utilicemos como soporte# constituir" el fondo del espectro. (nalizaremos bre'emente la absorcin por parte del aire. nterpretacin del espectro de infrarro!o del aire" entre los componentes ma$oritarios de la atmsfera terrestre# los gases de /4 $ 34 no producen absorcin de radiacin infrarroja# $a !ue son molculas diatmicas apolares. En cambio# el 'apor de agua $ el di&ido de carbono absorben radiacin infrarroja $ por tanto ser"n obser'ados siempre !ue se realicen medidas de absorcin de infrarrojo en presencia de aire# $ deben corregirse (espectro de referencia a la +ora de estudiar una muestra problema.

3
1

3
2

3
3

|| (dos ramas)

|| (dos ramas)

(tres ramas)

@
1

@
2

4 3 ,
Degeneradas (tres ramas)

No activa IR

|| (dos ramas)

1 4

%a molcula de agua tiene una estructura no lineal $ por tanto presenta tres modos 'ibracionales) una tensin simtrica ('1 # una fle&in simtrica ('4 $ una tensin asimtrica ('> . [eneralmente se re!uiere menos energa para deformar un "ngulo entre tres "tomos !ue para estirar un enlace# por lo !ue la banda '4 debe aparecer a menores frecuencias !ue '1 $ '>. %as 'ibraciones '1 $ '> cambian el mdulo del momento dipolar ('ibraciones paralelas mientras !ue la 'ibracin '4 cambia la orientacin de dic+o momento ('ibracin perpendicular . @omo consecuencia# estas tres 'ibraciones deben dar lugar a bandas 'ibracionales acti'as en infrarrojo. %a molcula de @34 presenta una estructura lineal $ por tanto sus grados de libertad 'ibracionales son cuatro. 7ado !ue el momento dipolar permanente de la molcula es nulo# la 'ibracin de tensin simtrica no ser" acti'a en el espectro de infrarrojo. En cambio la 'ibracin de tensin asimtrica ('ibracin paralela producir" una banda de absorcin# as como las dos 'ibraciones de fle&in ('ibraciones perpendiculares # !ue son degeneradas en energa $ por tanto aparecen como una sola se?al en el espectro. 8or otra parte# como las molculas de 1 43 $ @34 pueden girar libremente en su estado gaseoso# sus absorciones de infrarrojo implican transiciones entre los distintos ni'eles rotacionales de los estados 'ibracionales implicados. 7e a+ !ue las bandas de infrarrojo de estos compuestos sean bandas de 'ibracin-rotacin# es decir# !ue sus bandas de 'ibracin presentan estructura fina de rotacin. (s una molcula poliatmica como 143 o @34 presenta bandas paralelas con un contorno 8*# mientras !ue sus bandas perpendiculares tienen contornos 8Q*. %os espectros de infrarrojo se pueden utilizar para identificar componentes de muestras compar"ndolos con una coleccin de espectros de sustancias conocidas. (dem"s de la identificacin $ comparacin de componentes se puede obtener informacin estructural. %os grupos funcionales se pueden identificar debido a !ue sus bandas de absorcin se encuentran en zonas relati'amente estrec+as. %os espectros de infrarrojo de los compuestos org"nicos se pueden di'idir en las siguientes regiones generales) %a regin de los grupos funcionales) <222-1>22 cm-1 %a regin de la +uella dactilar) 1>22-R12 cm-1 %a regin de los arom"ticos) R12-M=2 cm-1. %as bandas en la regin de los grupos funcionales indican la presencia de grupos org"nicos funcionales especficos. E&isten tablas donde se indican en !u inter'alo absorben los diferentes grupos. Entre lo grupos funcionales f"cilmente identificables se encuentran el grupo carbonilo# @93# $ el grupo +idro&ilo# -31. %a regin de la +uella dactilar contiene picos !ue aparecen por modos normales complicados !ue conlle'an mo'imientos de fle&in $ no son f"cilmente asignables. 5in embargo# es la regin m"s sensible a la diferencia de estructura de los compuestos# es decir# representa la +uella dactilar para un compuesto especfico. %os picos en la regin de los arom"ticos no indican autom"ticamente la presencia de anillos arom"ticos# debido a !ue aparecen tambin en esta regin las bandas correspondientes a enlaces carbono-+algeno. %as bandas se originan por los mo'imientos de fle&in de los enlaces @-1 fuera del plano del anillo arom"tico. En la realidad# se re!uiere muc+a pr"ctica para interpretar los espectros I* $a !ue aparecen numerosas des'iaciones a la apariencia esperada. En la actualidad los instrumentos con transformadas de .ourier pueden obtener espectros en 'arios segundos# para !ue# posteriormente# utilizando el softDare !ue desarrolle la comparacin entre picos# se pueda identificar cada componente.

1 >

>. Medidas ex erimenta!es de a"sorcin# emisin $ excitacin de f!uorescencia. 3.1 Espectros de absorcin %as tcnicas e&perimentales para espectroscopia de absorcin en las regiones# UV# 'isible e I* son similares. En ellas se pasa un +az de luz# conteniendo un inter'alo continuo de frecuencias# a tra's de la muestra# la luz !ue sale de sta (luz transmitida se dispersa usando un prisma de difraccin reticulado $# en cada frecuencia# se compara la intensidad de luz transmitida (It con la intensidad del +az de referencia !ue no +a pasado a tra's de la muestra (I2 . %a medida de un espectro de absorcin se basa en dos principios importantes) le$ de %ambert $ la le$ de 6eer . %a le$ de %ambert establece !ue la proporcin de luz absorb ida por un medio es independiente de la intensidad de luz incidente# 0 . %a le$ de 6eer establece !ue la cantidad de luz absorbida es proporcional a la concentracin de cromforo en la muestra. 7e la combinacin de estas dos le$es podemos e&presar) (9bc donde # se define como absorbancia $ 'iene dado por # 9 log (I2CIt # es el coeficiente de molar !ue es una constante de la molcula $ !ue depende de la longitud de onda de la luz incidente. c es la concentracin molar $ b la longitud de paso de luz (anc+ura de la cubeta . %a intensidad de la luz absorbida Ia 'iene dado por) Ia=I0 - It $ a partir de la le le$ de %ambert-6eer Ia $ I0(1-e-2.3bc) @uando A>2, Ia = I0 es decir toda la luz incidente es absorbida. Un espectro de absorcin 'iene descrito por una gr"fica donde se representa la intensidad de absorbancia en la ordenada $ la longitud de onda de la luz absorbida en la abcisa. 5in embargo# en espectroscopia I* es m"s +abitual presentar los espectros como un gr"fico SFransmitancia frente al n-mero de onda (cm-1

3.2 Espectros de fluorescencia %a le$ de %ambert-6eer tambin puede ser e&presada como. It = I0 10
-bc

(1

5i asumimos !ue la intensidad de la luz absorbida 'iene dada por I0 - It% tenemos) Ia = I0 (1-10-bc) %a intensidad de la fluorescencia If 'iene dada por Iaf

1 <

If = I0f (1-10 1aciendo un desarrollo en serie 10

-bc

-bc

If = I0f{1-[1-2.303bc+(2.303bc)2/2!+.....]} 5i bc ] 0.05 todos los trminos del desarrollo despus de -2.303bc pueden ignorarse# de manera !ue If puede e&presarse como) If = 2.303 I0fbc (4

5e +a determinado !ue para una absorbancia de 2.21 se producir" un error del 1S en la intensidad de fluorescencia. 5in embargo# no solamente e&isten errores en la If debido a la rotura de la apro&imacin matem"tica# sino !ue estos errores tambin se debe al efecto de filtro inerte de la disolucin. 6oDen $ ^oLes establecieron !ue para obtener una respuesta lineal# la disolucin debe absorber menos !ue el =S de la luz de la fuente. El 'erdadero espectro de fluorescencia es una representacin de la intensidad de fluorescencia (a una intensidad $ longitud de onda de absorcin fija como una funcin de las frecuencias o longitudes de onda de emisin. %os espectros obtenidos en el fluormetro no son# generalmente# los 'erdaderos espectros debido a la dependencia de la respuesta del sistema instrumental con la longitud de onda. %os par"metros !ue caracterizan la emisin de fluorescencia son) 8erfil ( If frente a # rendimiento cu"ntico (If relati'a a Ia $ tiempo de 'ida ( decaimiento de If con el tiempo de fluorescencia. 3.2.1 %s ectro de excitacin ( la representacin de la intensidad de emisin (a una longitud de onda de emisin fija en funcin de la longitud de onda de e&citacin ( I0 constante se le llama espectro de e&citacin. 5i la molcula cumple la regla de Was+a $ Va'ilo'# f es independiente de la de e&citacin. (s# si fijamos la concentracin de la especie !ue emite (fluorforo # II2 $ b_ If ` . En otras palabras# el espectro de e&citacin obser'ado 'ariar" con . En estos casos# el espectro de e&citacin tendr" el mismo perfil !ue el espectro de absorcin. Una 'entaja de la espectroscopia de e&citacin sobre la absorcin es la ma$or sensibilidad de la tcnica de fluorescencia !ue permite obser'ar el espectro de e&citacin a concentraciones m"s bajas !ue en absorcin $ sobre todo# la gran utilidad de un espectro de e&citacin est" en !ue nos informa de cual es la especie !ue est" produciendo esa emisin.

3.2.2 Determinacin de! rendimiento cu&ntico

1 =

Factores 'ue afectan a! rendimiento cu&ntico. %a medida del rendimiento cu"ntico de fluorescencia de un compuesto en disolucin est" afectada por una serie de factores !ue +a$ !ue tener en cuenta a la +ora de obtener buenos 'alores de este par"metro. Efectos de autoabsorcin y filtro inerte %a relacin lineal entre concentracin $ fluorescencia slo puede aplicarse a absorciones mu$ bajas. ( altas absorciones los factores de correccin dependen de la geometra del instrumento. 8or otro lado# si +a$ un fuerte solapamiento entre absorcin $ fluorescencia la autoabsorcin es importante $ aumenta con la concentracin. 7e a!u# !ue los 'alores de f se obtengan de disoluciones mu$ diluidas. Efecto de la longitud de onda de excitacin Es mu$ com-n asumir !ue el f es independiente de la de e&citacin. 5in embargo# se +an obser'ado e&cepciones a esta regla# de a!u !ue sea necesario 'erificar el cumplimiento de la le$ de Va'ilo' en el deri'ado cu$o f !ueremos medir. Una correccin del ndice de refraccin entre un est"ndar $ la muestra se re!uiere de manera !ue se compensen las diferencias de la geometra ptica entre la disolucin $ el est"ndar. Efectos de la temperatura. %a fluorescencia es un par"metro !ue puede depender fuertemente de la temperatura por lo !ue la medida del f +a$ !ue realizarlo a una temperatura determinada $ si se realizan 'arias medidas +a$ !ue tener la precaucin de mantener constante la temperatura. Efectos de las impurezas. 8ara e'itar la presencia de posibles desacti'adores de la fluorescencia# es necesario utilizar disol'entes grado u'asol .Dispersin de la luz. Foda la luz incidente no es absorbida o trasmitida por la muestra# sino !ue es tambin dispersada. Esta dispersin se origina por las mismas molculas (dispersin *a$leig+ o por partculas en suspensin coloidal (dispersin F$ndall . (mbos tipos de luz dispersa son recogidas junto con la fluorescencia $ +a$ !ue tomar las debidas precauciones para separarlas. 3tro tipo de dispersin es la llamada dispersin *aman. %as bandas *aman aparecen separadas de la radiacin incidente por la misma diferencia de frecuencias !ue la de e&citacin. 7e esta manera# si la fluorescencia coincide con la banda del disol'ente# la separacin puede efectuarse cambiando la de e&citacin a 'alor m"s bajo. %a dispersin *aman es solamente importante si recogemos la fluorescencia con alta sensibilidad# $a !ue este fenmeno es dbil# no obstante +a$ !ue tenerla siempre en cuenta. 8or consiguiente# antes de medir la fluorescencia# +a$ !ue realizar un ensa$o en blanco. Fodos los disol'entes conteniendo "tomos de +idrgeno ligados a carbono u o&geno# muestran un *aman desplazado >222 cm-1 de la radiacin incidente.

M(todos uti!i)ados ara determinar e! rendimiento cu&ntico de f!uorescencia. 5i analizamos la +istoria de las determinaciones de los rendimientos cu"nticos# obser'amos !ue la ma$or parte de los autores sobreestiman su mtodo $ !ue es mu$ difcil determinar el f con un error menor del =S. El mtodo !ue utilizaremos en esta pr"ctica consistir" en comparar la integral de fluorescencia de nuestro sistema con la integral de un patrn cu$o 'alor de f $a es conocido (est"ndar de fluorescencia . %a e&presin del rendimiento cu"ntico de la muestra 'endr" dada por)

1 M

 fs= fr

r r Ds n 2 s s s Dr n 2 r

7onde los subndices s $ r se refieren a la sustancia problema $ de referencia respecti'amente# f es el rendimiento cu"ntico_ A() es la absorcin de la disolucin a la longitud de onda de e&citacin_ n# el ndice de refraccin_ I() es la intensidad de la l"mpara a la longitud de onda de e&citacin $ D la integral de fluorescencia. 7e la e&presin anterior 'emos !ue el rendimiento cu"ntico relati'o puede ser determinado midiendo el "rea de la banda de fluorescencia de la muestra $ del est"ndar. Fambin comentar !ue para minimizar los errores en la obtencin del rendimiento cu"ntico# es con'eniente e&citar la muestra $ el patrn de fluorescencia a la misma longitud de onda $ as e'itaremos los errores de correccin del perfil de la l"mpara. El principal error de este mtodo est" en la correccin de los espectros de fluorescencia. Este error ser" tanto m"s pe!ue?o cuanto m"s solapen los perfiles de fluorescencia de la muestra $ del est"ndar.

1 O