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Universidade Federal do Rio de Janeiro

PRODUÇÃO DE LIPASE PELO FUNGO Penicillium simplicissimum: CARACTERIZAÇÃO DO PROCESSO FERMENTATIVO E DO PRODUTO E DESENVOLVIMENTO DE BIORREATOR PARA FERMENTAÇÃO NO ESTADO SÓLIDO

Melissa Limoeiro Estrada Gutarra

2007

PRODUÇÃO DE LIPASE PELO FUNGO Penicillium simplicissimum: CARACTERIZAÇÃO DO PROCESSO FERMENTATIVO E DO PRODUTO E DESENVOLVIMENTO DE BIORREATOR PARA FERMENTAÇÃO NO ESTADO SÓLIDO

Melissa Limoeiro Estrada Gutarra

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências de Alimentos, Instituto de Química, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências. Orientadores: Denise Maria Guimarães Freire Leda dos Reis Castilho

Rio de Janeiro Agosto de 2007

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PRODUÇÃO DE LIPASE PELO FUNGO Penicillium simplicissimum: CARACTERIZAÇÃO DO PROCESSO FERMENTATIVO E DO PRODUTO E DESENVOLVIMENTO DE BIORREATOR PARA FERMENTAÇÃO NO ESTADO SÓLIDO

Melissa Limoeiro Estrada Gutarra Orientadores: Denise Maria Guimarães Freire Leda dos Reis Castilho Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências de Alimentos, Instituto de Química, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências. Aprovada por: _______________________________________________ Profa. Denise Maria Guimarães Freire, D.Sc. (Orientadora) _______________________________________________ Profa. Leda dos Reis Castilho, Dr.-Ing. (Orientadora) _______________________________________________ Profa. Selma Gomes Ferreira Leite, D.Sc. _______________________________________________ Prof. David Alexander Mitchell, Ph.D. _______________________________________________ Profa. Maria Isabel Rodrigues, D.Sc. ______________________________________________ Prof. Rodrigo Volcan Almeida, D.Sc.

Rio de Janeiro Agosto de 2007

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Melissa Limoeiro Estrada Produção de lipase pelo fungo penicillium simplicissimum: caracterização do processo fermentativo e do produto e desenvolvimento de biorreator para fermentação no estado sólido/ Melissa Limoeiro Estrada Gutarra. 2007 Referencias Bibliográfica: f. iv . II. Fermentação no estado sólido 3. Produção de lipase pelo fungo penicillium simplicissimum: caracterização do processo fermentativo e do produto e desenvolvimento de biorreator para fermentação no estado sólido. Biorreator. Rio de Janeiro: UFRJ/ Instituto de Química. III. Penicillium simplicissimum 4. 155f Orientadores: Denise Maria Guimarães Freire Leda dos Reis Castilho Tese (doutorado) – UFRJ/Instituto de Química/Programa de PósGraduação em Ciências dos Alimentos. I Gutarra. Morfologia 5. X. Fisiologia. 2007. Melissa Limoeiro Estrada. Instituto de Química/Programa de Pós-graduação em Ciências de Alimentos. Lipase 2.Gutarra. Universidade Federal do Rio de Janeiro. 141-155. 1. 6.

por me ajudarem diretamente neste trabalho. Laila. Laina. pela confiança. Aos meus pais. Pessoas muito especiais que me ensinaram todas as coisas que são realmente essenciais. Aos alunos e amigos. que de um jeito inesperado preencheu a minha vida e me deu força em todos os sentidos para fazer este trabalho. Às minhas orientadoras. Lu. Bernardo e Daniel por me acolherem no tempo que fiquei lá e principalmente por nunca me esquecerem. Única pessoa capaz de me fazer rir nos momentos mais difíceis. Isabel Rodrigues por me receberem no laboratório e na casa deles como se fosse uma filha e aos seus filhos Leo e Marina pelo carinho. Ao Prof. Bernardo. Rodrigo Volcan Almeida.AGRADECIMENTOS A Deus. Alessandra. Ao professor Ulysses Lins e a aluna Iamê Guedes do laboratório de Biologia e Ultraestrutura de Procariontes do Instituto de Microbiologia/UFRJ. Mateusito. Roberta. e principalmente por me ensinarem a ensinar. amizade e capacidade de me dar asas na medida e na hora certa. Ao professor Reginaldo Menezes. Gui. Luciano. Aos amigos do laboratório na UNICAMP. Val. Jaque. Dani e Angélica. Cláudia e Tânia pelo carinho e por tornarem o ambiente sempre alegre. Aos meus amigos inseparáveis Pop´s. meus grandes amigos. Rodrigo Coelho. meu amor. Luiz Fernando. Herval. v . Jaque e Marcus. Fred. Rodrigo Mineiro. Ao Ulysses. Mateusito. Aos amigos do LaBiM e Bioprocessos: Carol. por estarem sempre do meu lado não me deixando nem por um minuto desistir dos meus sonhos. Denise Freire e Leda Castilho. por estar sempre pronto para ajudar. Aline. Aos professores Francisco Maugeri. Antônio. Du.. pelo carinho e pela ajuda.. Joab. por saber que posso contar com eles sempre seja para o que for. pela ajuda com as microscopias.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela bolsa e a Petrobrás pelo financiamento do projeto.E a todas as outras pessoas que contribuíram de forma direta ou indireta para a realização deste trabalho. vi .

em um meio de cultivo composto de um rejeito da agroindústria. A ampliação de escala para produção da enzima em biorreator de leito fixo apresentou. biorreator. Rio de Janeiro Agosto de 2007 vii . morfologia.5 vezes utilizando 10 vezes menos esporos comparativamente a inoculação direta de esporos. Estes resultados.0. Instituto de Química.RESUMO PRODUÇÃO DE LIPASE PELO FUNGO Penicillium simplicissimum: CARACTERIZAÇÃO DO PROCESSO FERMENTATIVO E DO PRODUTO E DESENVOLVIMENTO DE BIORREATOR PARA FERMENTAÇÃO NO ESTADO SÓLIDO Melissa Limoeiro Estrada Gutarra Orientadores: Denise Maria Guimarães Freire Leda dos Reis Castilho Resumo da Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências de Alimentos. O extrato bruto contendo lipases de P. fisiologia. em maiores taxas de aeração. produzidas por fermentação no estado sólido (FES) em torta de babaçu em biorreator de bandeja.8 e 2 vezes maiores em FES. a 50°C em pHs 5.0 e meia vida de 5.1. os estudos relativos a diferentes estratégias de inóculo revelaram que o pré-inoculo sólido com 10% de sólidos fermentados (36h de fermentação). demonstram o potencial biotecnológico da FES para a produção de enzimas industriais. Palavras-chave: lipase. a alta produção de uma lipase ácida e termoestável. Quando comparada à fermentação submersa (FS).0 e 6. um aumento na atividade e antecipação o pico máximo de produção. aumentou a produção em 1. gerando atividades e produtividades comparáveis as obtidas em biorreator de bandeja. Por outro lado. Assim.0 h a 50°C e pH 5. 1. como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências. apresentou atividade lipásica máxima em substratos de cadeia média. Os efeitos de diminuição na produção de lipase pela presença de substratos de fácil assimilação foram menos significativos em FES do que em FS. da Universidade Federal do Rio de Janeiro. fermentação no estado sólido. Penicillium simplicissimum. de grande interesse no escalonamento futuro do processo de FES. podendo ser uma das razões para a maior produtividade em FES. atividade específica e produção de esporos foram 6. o Yp/x. simplicissimum. estão provavelmente relacionados a morfologia fúngica e a maior adaptação deste quando propagado em meio sólido.

showed the biotechnological potential of SSF for industrial enzymes production. Rio de Janeiro August 2007 viii . Instituto de Química. morphology. When compared to submerged fermentation (SmF).5-fold more lipase using 10-fold fewer spores when compared with spore suspensions. 1. Penicillium simplicissimum. Key-words: lipase. and this could be one reason for the higher productivity in SSF. bioreactor. the reduction effects of lipase production by addition of easily assimilable carbon sources were less pronounced than in SmF. a study of alternative inoculation strategies showed that a 10% (m/m) solid pre-inoculum fermented for 36 h produced 1.0 with highest activities in medium-chain substrates. Thus the high production of an acid and thermo stable lipase.1. physiology.ABSTRACT LIPASE PRODUCTION BY Penicillium simplicissimum: CHARACTERIZATION OF THE FERMENTATION PROCESS AND OF THE PRODUCT AND DEVELOPMENT OF A BIOREACTOR FOR SOLID-STATE FERMENTATION Melissa Limoeiro Estrada Gutarra Supervisors: Denise Maria Guimarães Freire Leda dos Reis Castilho Abstract of Thesis presented to Programa de Pós-Graduação em Ciências de Alimentos. are probably due to the fungus morphology and to a better adaptation in this kind of inoculum. The scale-up of lipase production in a packed-bed bioreactor promoted an increase in lipase production with higher aeration rates. showing the half-life of 5 h at 50°C and pH 5.Sc.0. This results is of great interest for future process scale-up.8 and 2-fold higher in SSF. parameters such as Yp/x. Universidade Federal do Rio de Janeiro. specific activity and spore production were 6. solid-state fermentation.) The crude extract containing lipases produced by solid-state fermentation (SSF) of Penicillium simplicissimum in tray bioreactors using babassu cake as culture medium showed maximum activity at 50°C and pH 5. as a partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Science (D. On the other hand.0 and 6. using an agroindustrial residue as culture medium. showing lipase activities and productivities comparable to those produced in the tray-type bioreactor. In SSF.

............................ 5...2............................................................................ 44 Propagação de esporos para obtenção da suspensão de esporos........................................................1........... MÉTODOS ...................5............................ 3 2.........................6......... 27 Tipos de biorreatores .................................................. 11 Aplicações de lipases .................1. Reagentes e produtos químicos ...5..............1......... 2............................. 4 Mecanismo Catalítico .....1.....................3................................ 2...............1..................................... MORFOLOGIA DE FUNGOS FILAMENTOS ...................... 5.. 33 2. JUSTIFICATIVA.............2... 16 2............................................................... OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................. INTRODUÇÃO .2............................................... 46 Fermentação submersa ................................4....3.............. BIORREATORES PARA FES ....... 42 5............................................................................................. 45 Preparo da torta de babaçu ...... 42 Equipamentos ............ 5................................ PRODUÇÃO DE LIPASES POR FES ........ 35 2................................... 2.2... 37 3...1...... 40 5..............................1........................ 28 2...............................1............ 9 Caracterização de lipases ..... 3 Estrutura das Lipases ................................. 4......................................................................2......1.............. 44 ix .......... 5....................... 2....1........ 46 Amostragem e obtenção do extrato enzimático bruto ....................................4....................................................6........................... 2........................................2................... 2.................................................................................................... VANTAGENS DA FERMENTAÇÃO NO ESTADO SÓLIDO SOBRE FERMENTAÇÃO SUBMERSA.................................. 2........1.................................. 2................................................................................................................................................... 2................................................ÍNDICE 1.......3... 45 Fermentação no estado sólido em biorreator do tipo bandeja ....................................1..................4......................................... 5....7................ 40 4................... MATERIAIS ........................................ 43 Microrganismos .................................................................2..............................6...................... 12 Características da fermentação no estado sólido ...............................1.........3.................................. 5....................................................................................2................................3........................................................................ OBJETIVOS GERAIS..................... 2....................5.....................................2...3..........................2............1....3................................2........2...................................... 2......................................... 2......... 2................ FERMENTAÇÃO NO ESTADO SÓLIDO .........................................................2.2..............................39 OBJETIVOS...............................4....................2.... 1 REVISÃO BIBLIOGRAFICA . 47 5............................................1........................... 3 Definição ......................... 2.....1.................................................................2...................3.... 42 5................................... 21 Medida e controle das variáveis do processo ........................................................................................................................ 25 Ampliação de escala............... LIPASES ...................... 2........................................40 4....................3.... 17 Microrganismos empregados em processos de FES .............. 5. 7 Fontes de Lipases ..... 6 Métodos de determinação de atividade lipásica .. 21 2.....................................1.................................................................................... MATERIAIS E MÉTODOS. 18 Aplicações da fermentação no estado sólido ...............2........................................... 18 Fatores que afetam o crescimento microbiano na FES.......................................

.......... 5...... Monitoramento da fermentação submersa e no estado sólido .......1............. 97 Emprego de pré-inóculo sólido para a produção de lipase ............................. 6...... 6.......... 140 REFERÊNCIAS.....11.........2..... 6.............. 6..8.......................... 70 simplicissimum em FS e FES ........... 79 Morfologia do fungo P........... SIMPLICISSIMUM .................... Estudo do efeito da granulometria da torta de babaçu na produção de lipase .. .. simplicissimum em diferentes temperaturas e níveis de Especificidade das lipases de P.......... 75 Morfologia do fungo P.... 60 Estabilidade das lipases de P.................. simplicissimum em FES ..........5..3..........................3........... 6......................................5................ 113 6...................................2.......... fisiologia e morfologia do fungo P............ EMPREGO DE BIORREATORES DE LEITO FIXO E AGITADO PARA A PRODUÇÃO DE LIPASE POR FES.....141 x ....130 6....... 9. 51 Estudo comparativo da produção de lipase..............3.....................................3............. 56 6.................................................................................................. 101 6...............2....................... 6................... simplicissimum em FS ...... MORFOLÓGICAS E PRODUTIVAS DO Produção de lipase e fisiologia do fungo P...... 6...............................1.........................1.................................................................. 60 6.......................................5..................................... EFEITO DA CONCENTRAÇÃO E DO TIPO DE INÓCULO NA PRODUÇÃO DE LIPASE POR FERMENTAÇÃO NO ESTADO SÓLIDO .........2..............1...............5........................................ 87 Comparação da produção de lipase............ 6................... da fisiologia e da morfologia do fungo P....................... 69 COMPARAÇÃO DE CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS................................... simplicissimum ..... 6.........................10........................................5......... 53 5................ 48 Estudo das propriedades catalíticas da lipase de Penicillim simplissinum ............ 99 Estudo das condições de pré-inóculo sólido para a produção de lipase .... 6.......................... SIMPLICISSIMUM EM FERMENTAÇÃO SUBMERSA E NO ESTADO SÓLIDO ........................... 138 PERSPECTIVAS ......................................5......................3...........1.. FIXO EFEITO DA TAXA DE AERAÇÃO NA ATIVIDADE LIPÁSICA EM BIORREATOR DE LEITO EMPREGO DE PRÉ-INÓCULO SÓLIDO NA PRODUÇÃO DE LIPASE EM BIORREATOR DE LEITO FIXO..2.. PRODUÇÃO DE LIPASE EM BIORREATOR DE LEITO AGITADO....4....................................................3.................. 5............... simplicissimum em FS . 111 6...... 6. PROPRIEDADES DAS LIPASES DE P.............................................................................2..... ...1................................ RESULTADOS E DISCUSSÃO...................4.................................. 55 5.............................................................. 54 5...............3......2............... 96 6......... 6......... simplicissimum em FES ............114 ........................... Estudo de diferentes estratégias de inoculação ... 92 6..........3............2...................................... 65 FUNGO P.. simplicissimum em FES e FS .5.....................4. 98 Comparação das estratégias de inóculo empregadas ........2..........2..............2...12...2....... 8..... CONCLUSÕES ....... Efeito da concentração de esporos no perfil de produção de lipase ................2................................................. 70 Produção de lipase e fisiologia do fungo P.........134 7.............................. 96 Emprego de pré-inóculo líquido para a produção de lipase ...........................2...... 6..............3.............7......... EFEITO DA GRANULOMETRIA DA TORTA DE BABAÇU NA PRODUÇÃO DE LIPASE ..........9.....................1..........2......... 6...................................................1...........2.................. Emprego de biorreator de leito fixo e agitado para a produção de lipase por FES .................. pH. 60 Efeito da temperatura e do pH na atividade lipásica ....3...............

como enzimas.1.1. o que acarreta dificuldades na ampliação de escala. A FES é um processo que ocorre na ausência ou quase ausência de água livre (Mitchell et al. alcoólise. 2002). O interesse pelo estudo e desenvolvimento de biorreatores para produção em larga escala vem aumentando ao longo dos anos devido às diversas aplicações da FES e das vantagens que pode apresentar em relação à fermentação submersa (FS). As lipases são enzimas com elevado potencial biotecnológico devido principalmente aos consideráveis níveis de atividade e estabilidade enzimática que apresentam em meio aquoso e não aquoso. esterificação e transesterificação. Além da possibilidade de redução de custos de produção. a FES vem sendo bastante utilizada para obtenção de diversos produtos. aromas e biopesticidas (Soccol e Vandenberghe. 1999). Embora muitas lipases já tenham sido descritas. enâncio-seletividade. mono e diacilgliceróis e glicerol (Jaeger et al. As lipases também podem apresentar alta regio. existe um forte interesse em reduzir os custos de obtenção destes biocatalisadores.. como acidólise. possibilitando a catálise de diversas reações.. Hoje em dia. pH e temperatura de atuação. As lipases utilizadas para cada aplicação são selecionadas de acordo com suas propriedades catalíticas. Devido a estas características.3) são carboxilesterases que catalisam a hidrólise de acilgliceróis contendo ácidos graxos de cadeia superior a 10 átomos de carbono.e enâncio-seletividade. aminólise. Desta forma. a busca por novas lipases com elevada estabilidade e especificidade por diferentes substratos ainda é um importante campo de pesquisa. outras vantagens da 1 . principalmente em aplicações que demandam grandes quantidades de enzima e quando o produto final tem baixo valor agregado. INTRODUÇÃO As lipases (E. Os avanços no desenvolvimento de biorreatores. principalmente porque permite o emprego de rejeitos agroindustriais como meio de cultivo. gerando ácidos graxos livres. O emprego da fermentação no estado sólido (FES) como sistema de produção representa uma alternativa para a redução dos custos de obtenção de enzimas. Este processo é empregado no Oriente há muitos séculos para a obtenção de bebidas e alimentos fermentados utilizando equipamentos rudimentares. monitoramento e controle do processo em FES são ainda muito recentes. A aplicação industrial das lipases ainda é limitada devido aos custos das enzimas comerciais. 3.1.C. como especificidade por substrato. as lipases podem ser empregadas em diversos ramos da indústria. 2003). assim como estabilidade em solventes orgânicos e termoestabilidade.

as diferenças morfológicas de fungos filamentosos em FES e FS e sua relação com a produtividade não foram até hoje explorados. torna-se importante a busca por lipases com características interessantes. 2 .. diferenças fisiológicas significativas foram observadas entre os dois sistemas quando se utilizaram fontes de carbono simples (ácido oléico e glicose) e complexas (óleo de oliva e amido). demonstraram que maiores produtividades foram obtidas por FES associando-se essa vantagem a uma maior geração de biomassa. assim como a redução do seu custo de produção.. para o desenvolvimento de um bioprocesso. estudos de escalonamento empregando diferentes biorreatores e estratégias de inoculação. existem poucos estudos morfológicos sobre o crescimento de fungos filamentosos em FES. O emprego da fermentação no estado sólido e de rejeitos agroindustriais como meio de cultivo podem permitir a obtenção destes biocatalisadores a custos reduzidos. observando-se em FES uma diminuição dos efeitos de repressão catabólica (Azeredo et al. Além disso. bem como um maior conhecimento da morfologia e da fisiologia do microrganismo neste sistema são necessários. possibilitando o emprego destes em diversos ramos da indústria. Além disso. pH e temperatura ótimos mais elevados em FES (AcuñaArguelles et al. 1995). Em estudos de produção de lipase pelo fungo Penicillium restrictum em FES e FS. Estudos comparando a produção de enzimas por FES e FS.. 2003). uma menor degradação por proteases e menor efeito de repressão catabólica em FES (Viniegra-González et al. Devido às diferenças na produtividade e às diferenças entre as enzimas produzidas pelos dois sistemas terem sido apontadas em diversos estudos. 2007).produção de enzimas por FES vêm sendo apontadas. Desta forma. No entanto. Contudo. as enzimas produzidas pelos dois sistemas podem apresentar características distintas. os mecanismos fisiológicos responsáveis por tais diferenças têm sido objeto de muitos estudos. pela mesma cepa microbiana. apresentando estabilidade.

Freire e Castilho. Lipases 2. em sua grande maioria. tipicamente triglicerídeos compostos de ácidos graxos de cadeia longa com mais de 10 átomos de carbono.. onde os mecanismos catalíticos dependem da organização dos lipídeos na interface (Aloulou et al.1. possibilitando diversas reações de bioconversão. 1999). as lipases apresentam grande potencial de aplicação industrial devido principalmente à estabilidade em solvente orgânico. acidólises e aminólises.1... 2000). esterificações.. A hidrólise é uma reação controlada pela quantidade de água no meio reacional. As lipases possuem maior atividade em substratos insolúveis.1. 2001. 2006. e por poderem apresentar enâncio-seletividade. As lipases podem apresentar elevada regio e/ou enâncio seletividade. Desta forma. Definição As lipases (triacilglicerol acil hidrolases EC 3.. 2000. Esse fenômeno interfacial é uma das características que as distinguem das esterases. Pandey et al. Cajal et al. Jaeger et al. 1999). enquanto as lipases necessitam de uma mínima concentração de substrato para que atividades elevadas sejam obtidas (Bornscheuer.1. de cofatores. enquanto as esterases atuam em substratos solúveis.2. modificando-se as condições da reação. tais como o acetato de etila e triglicerídeos compostos de ácidos graxos de cadeia curta com menos de 6 carbonos.. A maioria das lipases é caracterizada por atuar em interfaces orgânico-aquosas. ao fato de possuírem diversificada especificidade por substrato. 3 . mostradas na Figura 2. alcoólises.1.3) são carboxil esterases que catalisam a hidrólise e a síntese de acilgliceróis com ácidos graxos de cadeia maior ou igual a dez átomos de carbono. As esterases obedecem a cinética de Michaelis-Menten. 2002). Assim. sendo o trioleoilglicerol o substrato padrão (Jaeger et al. tais como interesterificações.1. 2002. pode ocorrer a reação reversa de síntese. ao fato de não necessitarem. REVISÃO BIBLIOGRAFICA 2. em ambientes aquorestritos. principalmente ésteres simples. podendo ser utilizada na síntese de compostos quirais na indústria farmacêutica (Ferrer et al.

responsável pela catálise. 2006). 4 . caracterizada por um deslocamento da tampa em volta de sua região dobradiça.. 1998. semelhante ao observado em serino-proteases (Jaeger e Reetz.Figura 2. deixando-o inacessível ao substrato. sob determinadas condições. Aloulou et al.1: Principais reações catalisadas por lipases. o acesso ao sítio ativo é controlado por uma estrutura helicoidal chamada de tampa que. Em muitas lipases.1. é responsável por recobrir o centro ativo da enzima. A principal hipótese para explicar a ativação interfacial envolve uma mudança conformacional da estrutura da tampa quando em contato com uma interface. 2. expondo o sítio ativo e uma grande superfície hidrofóbica provavelmente responsável pela interação com a interface lipídeo-água (Cajal et al. O centro ativo é composto por uma tríade catalítica que possui um resíduo serina. possuindo uma estrutura de dobramento do tipo α/β hidrolase. porém possuem alta similaridade em sua estrutura tridimensional.2.. Estrutura das Lipases As lipases possuem baixa homologia na seqüência de aminoácidos.

2006) 5 . Além de regular o acesso ao sítio ativo das lipases. 1993). visto que todas as mudanças na estrutura da tampa afetaram o comportamento da enzima. A estrutura tridimensional das lipases de Rhizomucor miehei. Rhizomucor miehei Pseudomonas sp. da lipase pancreática humana e da lipase gástrica mostra a conformação aberta e fechada da tampa e o sítio catalítico escondido abaixo da estrutura da tampa (Figura 2. alterando a especificidade e estabilidade das enzimas (Secundo et al.2.. van Tilbeurgh et al. mostrando o sítio ativo (em vermelho) e a conformação aberta (em amarelo) e fechada (em azul) da tampa (Aloulou et al. de Candida rugosa. da lipase pancreática humana e da lipase gástrica. de Pseudomonas sp..2000. A estrutura tridimensional das lipases de Rhizomucor miehei. estudos mostraram que a tampa parece modular as propriedades funcionais das lipases. 2007).2). de Thermomyces lanuginosa. Lipase gástrica Lipase pancreática humana Candida rugosa Figura 2. de Candida rugosa...

3 são: 1 Ativação do resíduo nucleofílico serina da tríade catalítica da lipase pela histidina através da presença do lipídeo. Na Figura 2. esterificação. A reação inicia-se com o ataque nucleofílico ao carbono da ligação éster do lipídeo susceptível pelo átomo de oxigênio do grupo hidroxila do resíduo serina do sítio ativo.. formando um complexo enzimático tetraédrico e havendo a liberação de álcool do lipídeo. na qual o componente ácido do substrato encontra-se esterificado com o resíduo serina. estão representadas as etapas da reação catalisada pela lipase e seus intermediários.).3. regenerando a lipase. etc.1. 4 Doação de um próton da histidina para o oxigênio do resíduo serina. Doação de um próton da histidina para o álcool que está sendo liberado do substrato. A ligação éster entre a serina e o componente acila é quebrada e a enzima é regenerada. 6 . Ativação de uma molécula de água pela histidina e ataque nucleofílico do íon hidroxila resultante ao carbono do grupo carbonila do intermediário. Ataque nucleofílico do carbono do grupo carboxílico pelo oxigênio da hidroxila do resíduo serina. 2 Formação de um intermediário tetraédrico através da ligação de quatro átomos ao carbono do grupo carbonila.3. As etapas representadas na Figura 2. acidólise. formando o intermediário acilenzima. 1999). Mecanismo Catalítico Devido à semelhança da tríade catalítica encontrada nas lipases com as observadas em serino-proteases. a hipótese mais aceita sugere que a catálise por lipases ocorra de forma similar à catálise por serino-proteases (Jaeger et al. Estabilização do intermediário pela interação com grupos NH do peptídeo. Acredita-se que o mecanismo cinético das lipases não dependa do tipo de reação catalisada (hidrólise. 3 Formação da enzima acilada.2. ocorre a hidrólise do complexo enzimático. Posteriormente.

Métodos de determinação de atividade lipásica A utilização de lipases em aplicações biotecnológicas necessita de técnicas que determinem não só a atividade enzimática. a seleção de microrganismos produtores de lipase é frequentemente realizada através da utilização de tributirina e óleo de oliva como substrato. Métodos Qualitativos Os métodos qualitativos são freqüentemente utilizados na pré-seleção de microrganismos produtores de lipase. 2001).. 2. não existe um método universal que permita a determinação simultânea destas propriedades. onde 7 . onde a formação de uma zona opaca em volta da colônia indica a produção de lipase pelo microrganismo. Sierra (1957) descreveu um método simples para a detecção de microrganismos produtores de lipase. mas também sua seletividade ao substrato e enâncio-seletividade.1. emulsionado mecanicamente em meios de cultura sólidos (Cardenas et al..1. No entanto.4.Figura 2.4.1. Essa técnica utiliza o surfactante Tween 80 em meio sólido para identificar atividade lipásica. Atualmente. 1999). 2.3: Mecanismo de reação das lipases (Jaeger et al.

que absorve na região do visível a 410 nm.1. formados em decorrência da ação de lipases (Gupta et al. Ésteres do composto fluorescente 4-metilumbeliferona também têm sido utilizado para determinação da atividade lipásica..a presença de halos transparentes em torno da colônia indica quebra da emulsão provocada pela ação da lipase. Além disso.4. sendo assim mais utilizado em pH neutro ou alcalino observando-se diferentes coeficientes de absorção para valores distintos de pH (Gupta et al. 1999). o p-nitrofenilester pode ser hidrolisado em temperaturas elevadas. 1996). por titulação. 2. tais como a Rodamina B. dos ácidos graxos liberados a partir de um triglicerídeo. uma vez que as últimas também são capazes de hidrolisar. A principal limitação deste método é relativa ao pH. também foram descritos (Wang et al. 2005). porém o p-nitrofenil palmitato tem sido frequentemente utilizado para dosar atividade lipásica. muitas vezes mais eficientemente. visíveis sob irradiação UV a 350 nm... 2003).. que ocasiona a liberação de p-nitrofenol de coloração amarela. 1995). Métodos Quantitativos A atividade lipásica é freqüentemente determinada através da hidrólise de pnitrofenil ésteres de ácidos graxos de diferentes tamanhos de cadeia. Este método é o mais antigo e permite a quantificação de lipases “verdadeiras” (Jaeger et al. pois o p-nitrofenol não absorve na região de visível (amarelo) em pHs ácidos. porém muitas esterases são capazes de catalisar a hidrólise destes triacilgliceróis de cadeia curta. os ésteres do p-nitrofenol (Freire. Este método pode não distinguir lipases de esterases. a triacetina e a tripropionina podem ser utilizados na detecção da atividade lipásica. Desta forma.2. A utilização desta substância permite a observação de halos fluorescentes laranja-avermelhados. 2003). Muitos triglicerídeos como a tributirina. 2003).. A adição de substratos opticamente puros ao p-nitrofenol ou umbeliferona tem sido realizada para a seleção de lipases enâncio-seletivas (Schimidt e Bornscheuer. decorrente da formação de complexos fluorescentes entre a rodamina e ácidos graxos livres. os substratos mais indicados para detecção da atividade lipásica são os triglicerídeos que tem na sua 8 . Outro método para detecção de lipases consiste na determinação. Este método tem a vantagem de ser bastante sensível e utilizar um substrato estável a temperaturas altas e a uma ampla faixa de pH (Gupta et al. Métodos utilizando compostos cromogênicos.

Sharma et al. 1994).. 2001). para dosagem dos ácidos graxos formados. Balashev et al. método do “oil-drop” ou utilizando microscopia de força atômica (Gupta et al.5. 2005). uma vez que estes possuem menor tempo de geração. a melhor alternativa é a utilização. permitindo que estes microrganismos utilizem lipídeos de origem animal e vegetal como fonte de carbono e energia para o seu crescimento (Hadeball. de diferentes microrganismos e com distintas propriedades catalíticas. HPLC e TLC.1. 1991). ou através de métodos imunológicos baseados na técnica de ELISA (“enzyme linked immuno sorbent assay”). o qual contém 70% de ácido oléico em sua composição. no que tange à especificidade em relação aos substratos e também às faixas ótimas de pH e temperatura. para a produção industrial não só de lipases. Fontes de Lipases As lipases são amplamente encontradas na natureza em microrganismos e eucariotos superiores. tal como o óleo de oliva.. A tabela 2. 2001).1 apresenta lipases comerciais produzidas pelas empresas Amano Enzymes e Novozymes.. 2007. as lipases estão presentes em plantas superiores como a mamona (Ricinus communis) e canola (Brassica napus). grande versatilidade e maior simplicidade na manipulação genética de sua capacidade produtiva e das condições de cultivo (Illanes.. Assim. Além disso. os microrganismos produzem diferentes tipos de lipases. 2003. As lipases são produzidas por bactérias. tais como a cromatografia gasosa. 2. os microrganismos são a fonte preferida. como o método da monocamada. sendo também encontradas nos tecidos de reserva de energia de diversas plantas (Cavalcanti et al. como da maioria das enzimas industriais. Em plantas. No entanto. Nesses organismos. a quantificação de atividade lipásica poder ser realizada utilizando-se métodos cromatográficos. Em animais.composição ácidos graxos de cadeia longa e média. a trioleína (trioleilglicerol) ou uma alternativa mais barata. fungos filamentosos e leveduras. elas estão envolvidas em vários estágios do metabolismo de lipídeos. Adicionalmente. como substrato da reação enzimática. as lipases obtidas do pâncreas de porcos e de seres humanos são as mais conhecidas e investigadas dentre todas as lipases (Thomas et al.. 9 . a atividade lipásica também pode ser medida utilizando métodos que se baseiam na atividade na interface. Devido à multiplicidade de habitats.

50°C. pH 7. LIPASES COMERCIAIS NOVOZYMES (Dinamarca) Lipozyme RM IM Lipozyme TL 100L Lipozyme TL 1M Novozym 388 Rhizomucor miehei Thermomyces lanuginosus Thermomyces lanuginosus Rhizomucor miehei Lipase B de Candida antartica Lipase A de Candida antartica Imobilizada. pH 8.3) Imobilizada. termoestável.1: Lipases comerciais de diferentes microorganismos e propriedades catalíticas. estável em solvente orgânico. reações: esterificações e transesterificações Solúvel. 55°C. reações: esterificações e transesterificações Solúvel. atividade em diferentes substratos.0 10 . regioseletiva (posição 1. pH 7. pH 6.Tabela 2.0 (solúvel e imobilizada) Hidrólise e síntese. enâncio-seletiva FONTE CARACTERÍSTICAS Novozym 435 Novozym 735 AMANO Enzymes (Japão) Lipase AS Lipase AYS Lipase PS Lipase AK Aspergillus niger Candida rugosa Burkholderia cepacia Pseudomonas fluorescens Hidrólise e síntese. reações de hidrólise Imobilizada.0 Hidrólise e síntese. reações de hidrólise. enâncio-seletiva especificidade por substrato.0 Hidrólise e síntese. elevada termoestabilidade. . atividade máxima a 45°C. 45°C.

2001). estabilidade térmica ou a solventes orgânicos e outras substâncias. Mucor (Abbas et al.2. 2003. pois as enzimas empregadas em diferentes aplicações nos ramos da indústria são selecionadas em função de algumas características. tais como seletividade ao substrato. Streptomyces (Abramic et al.. Muitos processos industriais são conduzidos a temperaturas elevadas. Rhizopus (Hiol et al. 1992) foram estudadas e apresentaram diferentes propriedades moleculares e catalíticas. Lipases obtidas de Pseudomonas (Jinwal et al. 2000). 2003). 2002).. A determinação das propriedades das lipases isoladas de diferentes microrganismos é de suma importância. Esta lipase apresentou temperatura ótima de atuação a 37°C em pH 5.1. Observa-se também. Candida rugosa (Pernas et al. Aspergillus (Saxena et al.. Caracterização de lipases Diversos trabalhos de caracterização de lipases de diferentes fontes têm sido reportados.6. pH e temperatura de atuação. nestas condições de cultivo. Na Tabela 2. (1992) purificou e caracterizou a lipase de Penicillium simplicissimum produzida por fermentação submersa. oferecendo várias vantagens para síntese de ésteres. enâncio-seletividade. tais como diminuição do risco de contaminação.0 e estabilidade a 50°C por 15 min. 11 . A termoestabilidade é um requerimento importante para o emprego de enzimas na indústria... produziu uma lipase não específica que apresentou alta estabilidade em solventes orgânicos. a maioria dos íons metálicos testados não apresentou efeito inibitório sobre a atividade lipásica. Sztajer et al.. Sharma et al. 2000). aumento da solubilidade do substrato e aumento da velocidade de reação (Haki e Rakshit. 1999) e Penicillium (Sztajer et al. 2001).. em alguns trabalhos. 2003a). são mostradas as principais características de lipases de fungos filamentosos do gênero Penicillium descritas na literatura. que cepas distintas de uma mesma espécie podem produzir lipases com diferentes características assim como a mesma cepa pode produzir várias isoformas da enzima (Ferrer et al.. visto que o aumento da temperatura pode apresentar algumas vantagens..2.. Este fungo. Além disso.

7. 1992 Stöcklein et al. de cosméticos. permitindo que esta enzima seja utilizada não somente nas indústrias de detergentes. 1999). wortmanii - 7.. de óleos e gorduras.0 8. camembertii P. 1999 Sugihara P. expansum 25 9. Além disso.Tabela 2. as lipases são altamente versáteis.0 37 48 60 7-8 4-8 6-9 45/240 28/30 2.. aurantiogriseum 28 - 7 8.. mas também na indústria alimentícia...1.0 45 6-10 30/60 P..2: Principais características de lipases produzidas por fungos do gênero Penicillium. tais como maior especificidade em relação a catalisadores químicos. menor consumo de energia e diminuição de problemas de separação de subprodutos (Pandey et al. 2004 P. Massa Espécie molar (kDa) P. 1993 Costa e ao pH 5-7 P. Elas possuem muitas características que favorecem seu uso como catalisadores.0 45 - 50/60 Peralta. 1997b Tan et al. simplicissimum 56 pH ótimo 5. de polpa e 12 . 1996 Freire et al. farmacêutica. de química fina. restrictum P. Aplicações de lipases As lipases são uma excelente alternativa às técnicas clássicas na transformação seletiva de moléculas complexas. onde sua aplicação está basicamente relacionada a reações de hidrólise. 2004 Lima et al. diminuição do número de etapas de reação a serem realizadas.. de couros. abeanum 28 7-8 25-30 - - et al.0 Temperatura Estabilidade ótima ( C) 37 o Estabilidade térmica (°C/min) 50/15 Referên cia Sztajer et al.

13 . Kazlauskas e Bornscheuer.7. que são componentes importantes presentes em muitos detergentes (Sharma et al. 2006). e na produção de biodiesel. 2006. tais como sabor.. aroma. Desta forma.. (2) ser termoestáveis e se manter ativas em ambiente alcalino semelhante às condições de uma máquina de lavar. e (3) ser resistentes à ação de surfactantes e outras enzimas (alquil benzeno sulfonatos e proteases). possuindo habilidade de hidrolisar gorduras de várias composições. 2004). Aplicações na indústria de detergentes A principal aplicação comercial das propriedades hidrolíticas das lipases é seu uso como aditivo na formulação de detergentes.1.1.. 2. o uso de lipases permite a modificação das propriedades dos lipídeos.. no tratamento de efluentes industriais. As lipases para uso em detergentes devem possuir as seguintes características: (1) baixa especificidade ao substrato.1. entre outros (Svensson et al. as propriedades organolépticas e as propriedades físicas dos triglicerídeos são bastante influenciados pelo tamanho e grau de insaturação dos ácidos graxos e pela posição dos mesmos no triglicerídeo. 2001). O valor nutricional. pois os produtos gerados apresentam elevado grau de impureza e deterioração (Undurranga et al. Nas indústrias de alimentos. As lipases também podem ser empregadas na produção de emulsificantes com atividade nutracêutica. Aplicações na indústria alimentícia As lipases vêm se transformando em um componente essencial na moderna indústria de alimentos.e régio-seletividade destas enzimas (Sharma et al. produtos de padaria e bebidas. 1998). 2. como monoacilgliceróis contendo ácido linoleico (Watanabe et al. 2001).7.. Muitas destas modificações não podem ser realizadas por interesterificações químicas convencionais. com exploração também das reações de síntese e transesterificação e das características de enâncio. transformando um lipídeo barato e não desejável em um lipídeo de propriedades adequadas e de alto valor agregado (Zhang et al.. 2001). as lipases podem ser empregadas durante o processo ou posteriormente adicionadas para obtenção de propriedades organolépticas características.papel. textura e digestibilidade de queijos.2.

4. Aplicações na indústria de óleos e gorduras A gama de aplicações de lipases na indústria óleoquímica é enorme. como anticolesterolêmicos.3.7.1. uma vez que o emprego destes biocatalisadores proporciona uma diminuição de gastos com energia e minimiza a degradação térmica dos compostos. 14 .1. 1999)..7. 2000). ou a partir da transesterificação de óleos vegetais (Shieh et al.. As lipases podem. por exempo. 2. 2. as características de enâncio e estéreo seletividade das lipases permitem a sua utilização na resolução de misturas racêmicas e na remoção seletiva de certos compostos para a síntese de drogas quirais (Katz et al. Os PUFAs livres e seus mono e diglicerídeos são utilizados na síntese de produtos farmacêuticos.. que são os principais componentes utilizados nestas indústrias (Saxena.7-octadieno-1-ol com lipases produz óxido rosa.5. 2004). 1998). produzindo biossurfactantes que podem ser utilizados na indústria de cosméticos e alimentícia (Soo et al. antiflamatórios e trombolíticos (Jaeger e Reetz.2. 2003)... 2003).7. A transesterificação de 3.1.7dimetil-4. 1994). ser utilizadas para produção de lipídeos estruturados utilizados na alimentação parenteral e enteral em substituição a óleos vegetais (Björkling et al. As lipases podem também catalisar a transacilação de frações do óleo de origem vegetal a aminoácidos. de álcoois presentes no rejeito de destilarias com ácido oléico (Dörmõ et al. Aplicações na indústria farmacêutica e de química fina Na indústria farmacêutica e de química fina. 1991) e também na produção de biolubrificantes a partir de reações de esterificação. quando comparado às vias químicas tradicionais (Vulfson. Aplicações na indústria de cosméticos e perfumes A importância do emprego de lipases na indústria de cosméticos e perfumes reside principalmente na utilização destas enzimas para a produção de biossurfactantes e aromas. Uma aplicação relevante consiste na utilização de lipases na modificação de óleos vegetais contendo um alto teor de ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs). ainda. 1993. Os monoacilgliceróis e diacilgliceróis produzidos através da esterificação de glicerol catalisado por lipase podem ser usados como surfactantes na indústria de cosméticos.. Berglund e Hutt. que é uma importante fragância utilizada na indústria de perfumes (Pandey et al. 1999).

2006). Rosa et al. A empresa Nippon Paper Industries (Japão) desenvolveu um método de controle do “pitch”. 2001. 2006.1. 1994). deste grupo.1. 1999).7. 2001).2. Aplicações no tratamento de efluentes A utilização de enzimas no tratamento de efluentes como alternativa ou complemento aos tratamentos convencionais vem sendo muito estudada pelos Laboratórios de Biotecnologia Microbiana (LaBiM) e Controle de Poluição (LCP) da UFRJ (Cammarota e Freire. Jung et a. com níveis de pH na faixa de 8 a 13 e possivelmente na presença de surfactantes e sequestrantes. 2. tais como os oriundos de abatedouros e de indústrias de laticínios e pescado representa também um campo vasto para aplicação de lipases. Aplicações na indústria de couro O processamento do couro envolve a remoção de gordura subcutânea e de pelos através de etapas de lavagem e de retirada dos pelos em vários banhos. ou conversão de resíduos de poliésteres a produtos úteis como ácidos graxos não esterificados e lactonas (Piras et al.7. O tratamento de efluentes gordurosos. principalmente metanol e etanol. tais como proteases. apontam para o uso de preparados enzimáticos obtidos por fermentação no estado sólido como excelente alternativa para o tratamento de efluentes ricos em gorduras oriundos da indústria alimentícia (Cammarota et al.. provenientes de derramamentos. produzindo alquil ésteres de ácidos graxos (biodiesel) e glicerol em uma única etapa.1. pode melhorar o processamento do couro (Pandey et al. 2006).9.7. O uso de um preparado enzimático contendo lipases e outras enzimas. 2. Diversos trabalhos. 2002.7.l. alcançando uma hidrólise superior a 90% dos triglicerídeos da madeira (Sharma et al. A produção do biodiesel consiste na transesterificação de óleos ou gorduras com álcoois de cadeias curtas. 2.7..6. . Aplicações na indústria de polpa e papel O “pitch” ou conjunto de componentes hidrofóbicos da madeira (principalmente triglicerídeos e ceras) causa um problema severo na indústria de polpa e papel. As lipases também vem sendo utilizadas na degradação de óleos no solo. Apesar da via química de produção de biodiesel a partir de óleos vegetais encontrar-se bem 15 .. Leal et al. o qual utiliza lipase de Candida rugosa.. Aplicação na produção de biodiesel Outra aplicação das lipases que tem gerado grande interesse atualmente é na produção de biodiesel..8.1..

como técnica empregada para a obtenção de molho de soja. 2004.estabelecida industrialmente. 2006). 1999)..C. No Ocidente. nos Estados Unidos. apresenta-se como uma alternativa interessante para redução dos impactos ambientais. Castilho et al. sake. a utilização de uma via enzimática. o desenvolvimento da fermentação submersa (FS) em tanques agitados. produzido através da sacarificação do arroz. uma fábrica de enzimas baseada nesta tecnologia oriental (Sato e Sudo. o emprego da fermentação no estado sólido (FES) como sistema produtivo pode representar uma alternativa interessante para a produção de enzimas industriais a custos reduzidos (Hölker et al. através do crescimento e produção de enzimas hidrolíticas pelo fungo Aspergillus oryzae. que é produzido a partir de arroz. devido principalmente à possibilidade de utilização de resíduos agroindustriais como meio de cultivo... Historicamente. catalisada especificamente por lipases. Atualmente.2. o Ocidente expandiu o desenvolvimento de equipamentos e tecnologias de monitoramento e controle da produção voltados para a FS. Desta forma. 2000b). Apesar de existirem diversas lipases sendo produzidas em larga escala e aplicadas comercialmente. Assim. Hölker e Lenz. e angkak. como tratamento de efluentes e produção de biodiesel (Cammarota e Freire. Fermentação no estado sólido A fermentação no estado sólido (FES) foi documentada pelos chineses já em 1000 a. tais como o koji. arroz vermelho produzido através do crescimento do Monascus purpurea (Mitchell et al. a FES é uma prática empregada no Oriente há muitos séculos para a obtenção de bebidas e alimentos fermentados. teve como conseqüência uma diminuição significativa na atenção dispensada aos processos de FES. essa tecnologia foi introduzida por volta de 1890. 2005). em função do desenvolvimento da indústria de antibióticos na época da II Guerra Mundial. Como conseqüência. quando um japonês de nome Takamine fundou. 2002. 2. a plena utilização industrial destas enzimas passa necessariamente pela redução dos custos de produção. principalmente em aplicações que demandam elevadas concentrações de enzimas e que o produto possua baixo valor agregado. em função de uma série de vantagens 16 .

essa transferência pode ocorrer diretamente da fase gasosa. além de possuir uma fase líquida ao redor do substrato sólido. a transferência de oxigênio geralmente não é um limitante. empregando sólidos umedecidos. 2006. em FS a principal dificuldade operacional é a transferência de oxigênio para os microrganismos. Características da fermentação no estado sólido Os processos fermentativos podem ser divididos em fermentação submersa (FS) e fermentação no estado sólido (FES). principalmente de temperatura. 2000). devido à baixa solubilidade do oxigênio em água. a quantidade de sólidos não ultrapassa 50 g/L. a reologia e os parâmetros como pressão osmótica e atividade de água são diferentes (Gervais e Molin. Além disso. e tamanho e desenho do biorreator (Durand.. os substratos empregados em FES são insolúveis em água.. porém não em proporções iguais. Por outro lado. agitação. A FES. 2005 ). substrato e produto são frequentemente formados em FES. com exceção de alguns desenhos de biorreatores. 2003). onde a quantidade de água é apenas a suficiente para permitir o crescimento do microrganismo. A transferência eficiente é dependente do sistema de aeração utilizado. A principal diferença entre estes processos fermentativos é a quantidade de água livre no meio de cultivo.. três fases (sólida. enquanto na FES o conteúdo de sólidos varia de 20 a 70% da massa total. podendo. emprega substratos naturais que atuam como fonte de carbono e nitrogênio (Pandey et al. gradientes de temperatura. empregar diversos 17 . devido à grande quantidade de água e de agitação que é geralmente utilizada (te Biesebeke et al. 2003).. desta forma. 2003). a geração de gradientes. líquida e gasosa) estão presentes nos dois sistemas fermentativos. 2. tipicamente. 2002).. estando próxima à capacidade máxima de absorção do material sólido (Rahardjo et al. que permite a transferência de oxigênio. Na FS. como no caso de fungos filamentosos (Schutyser et al. Normalmente. Assim.1. 2002). Desta forma. a FES é um processo que ocorre na ausência ou quase ausência de água livre. Mitchell et al. Devido à baixa condutividade dos substratos sólidos utilizados em FES e à reduzida quantidade de água. pois. o Ocidente vem voltando sua atenção para os processos de FES (Hölker e Lenz. enquanto em FS são geralmente solúveis. é um dos maiores problemas da FES. Este problema não ocorre em FS. Em FES.2. de modo que os processos de difusão. umidade.relacionadas aos cultivos submersos tradicionais.

favorecendo assim o seu uso em FES (Rahardjo et al. 2002). No entanto. A penetração de hifas no interior das partículas permite uma maior acessibilidade aos nutrientes do que no caso dos microrganismos unicelulares. principalmente nos estágios finais da fermentação. Essa maior adaptação pode estar relacionada à similaridade da FES com o habitat natural dos fungos (Holker et al. 2. Isso é de grande importância. 2. leveduras e fungos filamentosos crescem em substratos sólidos. porém. Soccol e Vandenberghe. Microrganismos empregados em processos de FES Muitas bactérias.2. Os fungos filamentosos possuem uma grande facilidade de se adaptar à FES.. reduzindo a distância em que os processos de difusão devem ocorrer.rejeitos agroindustriais como meio de cultivo. 2004). 18 .2. dando origem a diversos produtos de interesse. a FES vem sendo empregada com diferentes finalidades. produtos bioativos.. Lareo et al. a maioria dos fungos possuem capacidade de crescer em meios com baixa atividade de água (Aw) e baixo pH. e produzem enzimas extracelulares hidrolíticas para degradar as macromoléculas presentes no substrato sólido. tais como a produção de enzimas. biopesticidas.2. a FES também pode empregar meios sólidos inertes embebidos de uma solução de nutrientes.. Aplicações da fermentação no estado sólido Hoje em dia. como ocorre com meios sólidos que são metabolizados ao longo do processo (Pandey. assim como para a biorremediação e biodegradação de compostos e detoxificação biológica de resíduos agroindustriais (Pandey et al.3. 2006). devido principalmente ao seu crescimento em forma de hifas e às suas características fisiológicas. visto que estas partículas não sofrem mudança na sua estrutura e composição. 2006).. quando os nutrientes da superfície encontram-se exauridos (Mitchell et al. 1992). os fungos filamentosos são os mais adaptados a este sistema (Mitchell e Lonsane. 2000. 2003. 2003). ácidos orgânicos e comidas fermentadas. sendo esta estratégia frequentemente utilizada em estudos de modelagem. dentre os microrganismos estudados.. Adicionalmente. aromas.

Rosa et al. utilizando-se microrganismos geneticamente modificados. c) Ácidos Orgânicos Ácidos orgânicos. Azeredo et al.3.2. endotoxinas bacterianas. amilases (Ramachandran et al. pectinases (Patil e Dayanand. Apesar de serem produzidos principalmente por FS. tais como as lipases (Rodriguez et al.. b) Enzimas A FES possui um grande potencial para produção de enzimas e apresenta a vantagem de possibilitar o emprego do próprio meio fermentado como fonte da enzima. 2000a). 2000).. 1999). 1999). Lima et al. na maioria dos casos.. 2004). xilanases (Wiacek-Zychlinska et al. em escala laboratorial ou semi-piloto (Pandey et al. 2000. 2005. 2004). 2007... 2006. pois estes produtos possuem um alto valor agregado... tornando o produto caro e. 2006). o estágio de desenvolvimento do processo de produção destas enzimas ainda encontra-se. proteases (Praskasham et al.. Robinson et al. como o ácido cítrico. ácido lático.. 2001). A produção de muitas enzimas de importância industrial está sendo estudada por FES. A FES vem se tornando uma alternativa para a produção de enzimas com um menor custo.. de difícil emprego em inúmeras aplicações (Holker et al.. são amplamente utilizados pela indústria. 2006. 2005.. ácido fumárico e o ácido oxálico. 2002). 2006. Gutarra et al.. A maioria das enzimas hoje comercializadas é produzida por FS. fatores de crescimento de plantas. Castilho et al. Park et al. a produção de ácidos orgânicos está historicamente associada 19 .2. Os principais grupos de compostos bioativos produzidos por FES são micotoxinas. Soares et al.... celulases (Xia e Cen. drogas imunossupressoras e alcalóides (Pandey et al. portanto. 2006). antibióticos. fitases (Bogar et al.1. Apesar disso. 2003) e inulinases (Selvakumar e Pandey.Produtos baseados na FES a) Produtos bioativos Muitos estudos demonstraram as vantagens de se produzir metabólitos secundários com atividade biológica por FES.. 1994. 2005). como empregado em tratamento de resíduos com alto teor de gordura ou em reações de esterificação e transesterificação em solventes orgânicos (Fernandes et al.

2.Processos baseados na FES a) Biorremediação e biodegradação de compostos A FES pode ser uma importante ferramenta para a biorremediação e biodegradação de compostos por microrganismos. utilizando resíduos agroindustriais como matéria-prima (Vandenberghe et al.. 2000). 2006). a biossíntese ou bioconversão de compostos flavorizante por fungos e bactérias se tornou uma via alternativa.com o desenvolvimento da FES. 1996) e de pireno por microrganismos do solo (Wiesche et al. 2001). 20 . 1999). 2. Este ácido é utilizado em alimentos e na indústria farmacêutica.. Como a extração de flavorizantes de plantas depende de fatores naturais que podem dificultar a produção em larga escala.2.. 1996). de resíduos cafeinados pelo mesmo fungo (Fan et al. os biopesticidas são produzidos preferencialmente por FES. 1996). d) Biopesticidas Recentemente. sendo produzido principalmente por Aspergillus niger ou Candida sp.3... de carbofurano (Willems et al. e) Aromas A grande maioria dos compostos flavorizantes é produzida por via química ou através da extração de compostos naturais. Diversos estudos demonstraram a degradação microbiana de compostos. visto que a esporulação em meio líquido é reduzida (Hölker et al. O ácido cítrico vem sendo produzido por FES há muitos anos. (Soccol e Vandenberghe. 2003). 2004) e os esporos podem ser menos resistentes à radiação e à dessecação e apresentar menor viabilidade (Vrija et al. tem crescido o interesse em utilizar entomopatógenos e fungos parasitas no controle biológico de insetos e doenças de plantas.. A produção de aromas por FES se mostrou mais promissora devido às baixas produtividades em FS (Couto e Sanromán.. tais como a atrazina por Pleurotus pulmonarius (Masaphy et al. Entretanto. A produção de biopesticidas vem sendo estudada tanto por FS quanto por FES.

que possui ricina e compostos alergênicos. sendo Aw o fator que afeta mais diretamente o crescimento dos microrganismos (Gervais e Molin. A Aw representa. não devem ser despejados no ambiente. Bellon-Maurel et al.3. nas mesmas condições de temperatura (Scott. O conteúdo de água é a porcentagem em massa do material relativo à água presente. a agitação e a concentração de substratos e produtos. tais como casca de mandioca e casca e polpa do café. Na casca e na polpa de café estão presentes compostos tóxicos. O processo de detoxificação permite a utilização deste rejeito para alimentação animal. através do crescimento do fungo P.1. Biorreatores para FES 2. tais como cafeína. 1957).. além de impedir sua utilização para outros fins. a aeração. 2000). Fatores que afetam o crescimento microbiano na FES Na FES. tais como a água disponível. assim como para produção de enzimas. a temperatura. enquanto a Aw é a razão entre a pressão do vapor de água no material e a pressão do vapor da água pura. A FES tem sido uma importante ferramenta para a detoxificação de resíduos. simplicissimum. a fração de moléculas de água do sistema que possui as propriedades da água pura e é a medida da 21 . o pH. A FES foi também utilizada para detoxificação de rejeito de mamona. Água disponível A água disponível em FES pode ser expressa na forma de conteúdo de água ou na forma de atividade de água (Aw).. gerando um problema para as indústrias produtoras. 2003. 2006) 2.1.1. ácidos orgânicos e aromas (Pandey et al. taninos e polifenóis.b) Detoxificação de resíduos agroindustriais Alguns resíduos agroindustriais podem conter compostos tóxicos que. reduzindo essa toxina a teores não detectáveis e simultaneamente produzindo lipases (Godoy. 2.3.3. diversos parâmetros do processo afetam o crescimento microbiano. porém o conteúdo de água pode ser medido de forma mais barata. 2003). portanto.

em relação ao nível ótimo.1. pH O crescimento microbiano pode causar grandes mudanças no pH de um meio sólido. A magnitude destas mudanças vai depender do metabolismo do microrganismo e da capacidade tamponante do meio. mas também estão ligados a alterações nas características do meio. A quantidade de água disponível difere para cada tipo de material. Altos conteúdos de água podem causar aglomeração das partículas de meio. enquanto um aumento do pH pode ser observado quando ocorre a liberação de amônia devido à desaminação da uréia ou de outras aminas (Mitchell et al. 2005) 2. 2002). Adicionalmente. niger (Kamini et al. A obtenção de concentrações elevadas de alguns produtos de interesse industrial em FES tem sido descritos em elevadas atividades de água como na produção de ácido giberélico por Gibberella fujikuroi onde a produção é maior em Aw 0.2. restringindo a difusão de gases entre elas. Esse efeito foi demonstrado na produção de lipase por A. 2002). 2003). Os efeitos da umidade não estão limitados a efeitos diretos sobre o crescimento microbiano. a umidade é um fator crucial para determinar a viabilização do processo. 2002). dependendo do material (Bellon-Maurel et al. O aumento ou diminuição do conteúdo de água no meio sólido. limitando o crescimento (Mitchell et al..3. 2003). pode afetar o crescimento do microrganismo e a produção. Na FES. a quantidade de água adicionada até que haja água livre pode variar entre 30 e 85 %.. Uma queda no pH pode ser observada quando ocorre a produção de ácidos devido à oxidação incompleta dos substratos. 1998). pois são capazes de crescer em uma faixa ampla de pH (de 3 a 4 unidades de pH). dependendo da capacidade do material que compõe o meio sólido de reter água (Gervais e Molin.fração de água que está efetivamente disponível para o microrganismo (Mitchell et al.... 22 . O pH é muito difícil de ser controlado na FES. porém a grande maioria dos microrganismos não é significativamente afetado por variações no pH.99 (Corona et al. Desta forma. que obteve como condição ótima um conteúdo de água de 1:1.. baixos conteúdos de água permitem que subprodutos do metabolismo alcancem concentrações inibitórias mais cedo.5 (material seco:água).

pode limitar o crescimento do microrganismo e a formação de produtos. Mitchell et al. 1995a e b).3.1. Pode-se observar. 1999. 2004). (3) resfriamento da superfície externa do biorreator com uma jaqueta de água. 2002). principalmente porque a grande maioria dos microrganismos utilizados em FES é mesofílica. um dos grandes problemas da FES está relacionado à remoção de calor e ao controle da temperatura durante a fermentação. pois remove calor por evaporação. porém acarreta consumo de grandes quantidades de água. (4) redução da temperatura do ar injetado. porém. A redução da temperatura do ar apresentou melhores resultados em biorreatores em larga escala. assim como desnaturar produtos termolábeis como enzimas (Santos et al. dependendo dos valores alcançados. 2004).2. as temperaturas no interior do leito podem alcançar valores muito superiores à temperatura ótima de crescimento do microrganismo. 1992). O emprego de ar úmido e o aumento da taxa de aeração promovem uma maior dissipação do calor por convecção através do leito. Algumas estratégias de controle da temperatura ao longo da fermentação foram utilizadas em diferentes biorreatores... reduzindo o teor de umidade do meio e requerendo reposição da mesma (Raghavarao et al. sendo esse o principal problema de escalonamento do processo. (2) aeração forçada com ar seco. Desta forma. porém a utilização de temperaturas muito baixas pode restringir o crescimento em alturas do leito próximas à entrada de ar (Mitchell et al. apresentando temperatura ótima de crescimento entre 20 e 40oC (Mitchell et al.. que o método de aeração forçada com ar seco é o mais eficiente.. com 1 metro de diâmetro (Santos et al. em alguns trabalhos. em estudos teóricos.. 2003. Sangsurasak e Mitchell. a estratégia de remoção de calor vai depender do sistema. Temperatura Na FES. em escalas maiores esta estratégia mostrou não ser eficiente em biorreator de leito fixo (Santos et al. 2004)..3. 2000). Desse modo. Em biorreatores em larga escala. tais como: (1) aeração forçada com ar úmido. Mitchell et al. (5) utilização de uma sala com temperatura controlada. O aumento da temperatura durante a fermentação. Combinações destas estratégias também podem ser utilizadas (Santos et al.. o crescimento microbiano gera grande quantidade de calor metabólico e a remoção deste calor geralmente é bastante difícil devido à baixa condutividade dos materiais sólidos e à baixa quantidade de água (Pandey. 23 . 2003)... 2004.

Agitação Os processos de FES podem ser divididos em três grupos. 2003). tem um papel importante na remoção do calor metabólico.1.1. 2. O nitrogênio é um importante nutriente na FES. com base na agitação: processos estáticos.4. 2006. o uso de bandejas altas pode acarretar redução do teor de oxigênio no centro. 2.1. metabólitos e produtos em FES bem mais altas do que em FS.3.. favorecendo a uniformização da temperatura e do teor de O2 e CO2.. 2002). A razão carbono:nitrogênio (C:N) também é um fator importante na FES (Azeredo et al. Adicionalmente. A fonte de nitrogênio possui grande importância nas mudanças de pH durante a fermentação. No entanto. Em sistemas onde a aeração é forçada. para fungos filamentosos. 2006). Além disso. a transferência de oxigênio não é um fator limitante (Raghavarao et al. Aeração A FES envolve geralmente microrganismos aeróbios.3.5. 2004). sendo então de extrema importância a transferência de O2.. sendo muitas vezes adicionado solubilizado em água ao substrato sólido. porém. em biorreatores de bandeja. 2003. 2007). A aeração.2. A transferência de O2 no filme líquido em volta das partículas de meio depende da área superficial da partícula e da tensão de oxigênio dissolvido (Mitchell et al... Em função disto. a concentração de nutrientes e produtos nas partículas do substrato não é homogênea.. 2003). 1992). a transferência de oxigênio ocorre principalmente pelas hifas aéreas diretamente da fase gasosa (Rahardjo et al. Concentração de substratos e produtos A presença de água em pequenas quantidades no meio sólido torna as concentrações de nutrientes. reduzindo de forma efetiva os problemas de geração de calor. além de prover oxigênio para o crescimento microbiano. periodicamente agitados e continuamente agitados.. a 24 .3.6. Lenz et al. havendo a formação de gradientes de concentração durante a fermentação (Rahardjo et al. produtos de hidrólise e subprodutos do metabolismo se acumulam e podem alcançam níveis inibitórios.. entretanto é preciso observar que a razão C:N total não necessariamente reflete as concentrações reais de carbono e nitrogênio disponíveis para o microrganismo (Mitchell et al. Shutyser et al. A agitação pode facilitar a homogeneização. como discutido anteriormente (Pandey. e a difusão do O2 no interior do meio depende principalmente da porosidade do substrato e se os poros são preenxidos com ar ou não.

sendo necessária a retirada de amostras de diferentes pontos do reator para a realização da medida das variáveis de interesse (Mitchell et al.. Medida e controle das variáveis do processo Em reatores não agitados. porosidade.2.. Por outro lado. 2004. Além disso. no entanto. para um bom desenvolvimento do processo. durante o processo. 1999). além da redução na produção de esporos devido aos danos nas estruturas de reprodução (Lenz et al. Os sistemas periodicamente agitados podem ser utilizados para disponibilizar O2 para os sólidos e para diminuir o calor acumulado em decorrência da atividade metabólica. tamanho. e a necessidade ou não de condições de esterilidade (Durand. 2003). os sistemas em FES não são padronizados e muitos fatores devem ser levados em consideração para o projeto do biorreator e o estabelecimento das estratégias de controle de parâmetros. tais como as características da matriz (composição. Mitchell et al. resistência mecânica e capacidade de absorção de água). 2000. O desenho do reator e o tipo de pá utilizado podem diminuir os efeitos deletérios da agitação.. A quebra de hifas pode ser vantajosa em alguns casos onde o crescimento fúngico ligado às partículas de meio produz uma massa de aglomerados (Schutyser et al. Desta forma. há pouco conhecimento acumulado sobre o desenvolvimento e operação de biorreatores para FES. 2003). a agitação pode ter efeitos distintos.agitação pode ser importante na homogeneização de sistemas onde se faz necessário.. evitando ou promovendo a aglomeração das partículas. ou ácidos e bases para controle do pH (Schutyser et al. interferência na adesão dos microrganismos ao meio ou quebra de hifas e micélios no caso de fungos filamentosos. diferentes tipos de biorreatores devem ser testados antes do escalonamento (Mitchell et al. água para controle da umidade. a adição de nutrientes. Mitchell et al. 1999). O desenvolvimento de reatores e o estabelecimento de modos de operação e controle foram bastante estudados para fermentação submersa. A freqüência de agitação depende do sistema (Ashley et al. 2003). a morfologia do microrganismo e sua resistência à agitação mecânica.3.. Assim. 1992). 25 . pode causar alguns problemas.. dependendo da natureza do meio sólido. como alteração na porosidade do meio de cultura. Comparado com a FS.. 2. 1999). A agitação. o sistema é heterogêneo. as vantagens e desvantagens do uso de agitação dependem do binômio meio-microrganismo. devendo ser avaliado para cada sistema..

A medida de atividade metabólica mais empregada para estudar o crescimento microbiano é a medida de consumo de O2 e produção de CO2 (Mitchell et al. Desta forma. A mesma é acompanhada. principalmente para fungos filamentosos. Determinação de biomassa Na fermentação submersa. visto que o oxigênio tem baixa solubilidade em água. umidade e Aw A medida de muitos parâmetros do processo é difícil de ser realizada em linha. glicosamina e ergosterol. A medida de α-1. Scotti et al.4-N-acetilglicosamina. A temperatura é uma das variáveis mais importantes em FES e deve ser monitorada e controlada para permitir uma boa performance do biorreator. ou da atividade metabólica do microrganismo.. a morfologia e o ambiente em que a cultura cresce (Aidoo et al.2.1. Na fermentação no estado sólido.. pH.. 1981. Medida de temperatura.3. Estes métodos baseiam-se na medida de componentes celulares.. A concentração de oxigênio é frequentemente medida na fase gasosa. 2002). A temperatura pode ser monitorada utilizando termosensores que são inseridos radialmente (Bellon-Maurel et 26 . a medida de glicosamina torna-se uma ferramenta específica para a determinação do crescimento fúngico.. tornase importante a determinação de fatores de conversão de glicosamina por massa seca realizados por fermentação submersa ou por cultura em filtro (Nopharatana et al.2. Desta forma. seguida de secagem e pesagem da biomassa. 2. O principal problema deste método é a variação do conteúdo de quitina nas células com a idade da cultura. monômero que forma a quitina. é uma técnica de estimativa de crescimento muito empregada em FES.2. separação de biomassa por centrifugação ou filtração. 2003). Desta forma. através do monitoramento da produção de CO2 e consumo de O2 (Scotti et al. através da retirada de amostras da fase gasosa ou da medida contínua nas correntes de entrada e saída de gases do biorreator (Bellon-Maurel et al. Mitchell et al. a separação da biomassa do meio de cultivo é geralmente impossível. 2003). 2001). 2001). não causando interferência no resultado..3.2. utilizando-se cromatógrafos gasosos ou analisadores de CO2 e O2. tais como proteínas. Este polímero não é encontrado em plantas verdes e outros microrganismos.. a medida de biomassa é realizada por métodos indiretos. 2002. A quitina é um polímero insolúvel presente na parede de fungos filamentosos e em insetos. a medida de biomassa é geralmente obtida através da retirada de amostra.

sistemas em larga escala geralmente são desenvolvidos a partir de resultados obtidos para sistemas em escala laboratorial ou 27 .. podendo ser incorporado à água adicionada para controle da umidade (Mitchell et al.. porém utiliza equipamentos de custo mais elevado. O ajuste do pH pode ser realizado através da adição de ácido ou base.3. pode ser realizado por utilização de aeração forçada com ar úmido ou ar seco. 2. 2003). Controle das condições operacionais Nos processos baseados na FES. Em biorreatores que empregam aeração forçada. como discutido anteriormente.3. a medida deve ser em linha. Bellon-Maurel et al. O controle da temperatura em reatores industriais muitas vezes está ligado ao controle da umidade (Bellon-Maurel et al. ou por utilização de uma sala com temperatura controlada (Santos et al. pois não ocorre um contato adequado entre o eletrodo e o meio de cultivo. o controle da umidade é realizado através da incubação em câmaras com injeção de ar saturado em água.3. por muitos anos foram utilizadas apenas estratégias simples de controle. Em sistemas agitados. Em escala industrial. 1992. 2003). A medida de Aw pode ser realizada em linha ou off-line (Bellon-Maurel et al. 1999. o controle pode realizado através da adição direta de água (BellonMaurel et al. por diminuição da temperatura do ar injetado. Ampliação de escala Para FES. Neste caso torna-se necessária a remoção periódica de amostras para posterior análise (Bellon-Maurel et al.3. 1995a). visto que elevadas temperaturas podem ser alcançadas ao longo da fermentação.. 2003). porém não permite avaliar a quantidade de água disponível para o microrganismo.. 2003).al. Por isso.. não existem na literatura procedimentos estabelecidos para previsão de desempenho e projeto de biorreatores. Sangsurasak e Mitchell. 2.2.. porém nas últimas décadas tem se obtido avanços nesta direção. A medida em linha do pH é bastante dificultada.. O controle da temperatura. o controle é feito pela injeção de ar umidificado.. de jaqueta de água resfriada. 2003). Em biorreatores do tipo bandeja. A medida de umidade é geralmente realizada off-line por medida de massa seca. 2003).. Mitchell et al. 2004.

plástico ou metal (Mitchell et al.. Desta forma. 2000).3. A temperatura do meio de cultura é controlada pela temperatura da câmara e do ar circulante. 1999. 1992).. Schutyser et al.... Tipos de biorreatores 2. estes modelos podem ser utilizados como ferramentas para o escalonamento. permitindo a aeração também das camadas inferiores do meio de cultivo. onde bandejas contendo uma camada fina de meio (até 15 cm de profundidade) são colocadas em grandes câmaras. 2005). Idealmente. 2002). Mitchell et al..1. assim como a transferência de massa e calor em biorreatores de bandejas (Dalsenter et al.4. 2000.. As bandejas podem ser feitas de madeira. A principal limitação dos reatores de bandeja é a transferência de massa e calor. As bandejas geralmente são abertas no topo e possuem orifícios no fundo.3. porém para processos de FES isto geralmente não ocorre (Mitchell et al..piloto. reator agitado (Santos et al. 2004) e leito fluidizado. Recentemente. a ampliação de escala deve ser realizada utilizando-se bandejas com áreas maiores ou um maior número de bandejas (Mitchell et al. 1999. 2003). a qual depende do estágio da fermentação. Trata-se do tipo de reator mais simples. alguns modelos matemáticos vêm sendo desenvolvidos para descrever a cinética de crescimento do microrganismo para diferentes condições de operação. Desta forma. um sistema em larga escala deve operar da mesma forma e com o mesmo desempenho que em escala laboratorial. nas quais ar úmido é circulado (Figura 2. a qual geralmente é realizada manualmente e apenas uma vez por dia (Mitchell et al. Pode-se utilizar agitação intermitente. 1999. 2000)..4).. Os sistemas de bandejas são simples e ideais para 28 .4. Durand. Biorreator de bandeja A FES realizada em reatores de bandeja é uma prática antiga. do tipo tambor rotativo (Hardin et al.. visto que isso acarreta em problemas de superaquecimento do sistema. de leito fixo (Mitchell et al. Sangsurasak e Mitchell. 2. A remoção do calor metabólico é realizada principalmente por convecção pelo ar que circula ao redor do leito e por condução pelo leito (Mitchell et al. do desenho e do modo de operação do biorreator (Mitchell et al.. Diversos estudos demonstraram que a ampliação de escala deste tipo de reator não pode ser realizada através do aumento da altura da camada de meio. O principal limitante para a ampliação de escala é a transferência de calor.. 1995a e b ). 2000). 2000).

Para operação em larga escala. Mitchell et al. este tipo de biorreator necessita de uma grande área.5). Neste tipo de reator. ocorrendo a evaporação de água na região superior do reator.. 2. Figura 2. 2006). a transferência de calor é um dos principais problemas que afetam o desempenho do reator. ou utilizando-se reatores com jaqueta de água. 2006. por onde aeração forçada é aplicada (Figura 2. Em escala de laboratório.2. além de ser difícil o controle em linha das condições operacionais (Couto e Sanromán. o calor é removido por condução pela parede (eficiente quando o diâmetro do biorreator é pequeno). 1992). é difícil operar este tipo de reator em condições estéreis (Durand et al. Biorreator de leito fixo Os biorreatores de leito fixo apresentam alta relação altura/diâmetro e são caracterizados pela presença de um suporte estático poroso para o substrato. é de difícil automação e intensivo em mão-de-obra. mesmo quando se utiliza ar saturado na aeração.4: Representação esquemática de um biorreator do tipo bandeja (Modificado de Couto e Sanromán. Geralmente injeta-se ar úmido para minimizar perda de água do meio de cultivo e a temperatura do ar é manipulada para regular a temperatura no interior do reator.3. Além disso.4.. onde o reator é submerso. por convecção ou evaporação pela passagem do ar pelo leito (Sangsurasak e Mitchell. 1995b). 2003). A evaporação remove grande parte do calor 29 . o controle da temperatura pode ser realizado utilizando-se um banho. Nesse tipo de biorreator.produção em pequena escala. Observou-se que ocorre a formação de gradientes axiais de temperatura no leito.

a utilização de distâncias pequenas entre as placas pode complicar operações como inóculo. duas outras variáveis são importantes: o espaço entre as placas e a temperatura da água de resfriamento. 2000). assim como a limpeza do reator entre as fermentações (Mitchell et al.5: Representação esquemática dos biorreatores: (a) de leito fixo comum e (b) do tipo Zymotis (Mitchell et al.. que permite maior controle do processo. Neste sistema.. os reatores de leito fixo apresentam várias vantagens devido à utilização de aeração forçada através do leito. placas verticais nas quais água de resfriamento é circulada. (1993) através do desenvolvimento do reator de leito fixo chamado de reator “Zymotis”.metabólico e a dificuldade de reposição de H2O neste sistema pode levar à diminuição do teor de umidade e inibição do crescimento do fungo (Mitchell et al. o espaço entre as placas deve ser pequeno e a temperatura da água deve variar durante a fermentação em função das temperaturas do leito (Mitchell e von Meien.. Por outro lado. através de modelagem matemática. 2002). no interior do leito. 2000). 30 . carga e descarga de substrato. Quando comparado a biorreatores de bandeja. O problema de transferência de calor foi solucionado por Roussos et al. promovendo a transferência de calor por condução (Figura 2. principalmente de temperatura e umidade (Sangsurasak e Mitchell. que para obtenção em larga escala de altas produtividades. 2000). Figura 2. Este reator possui. Observou-se.5). 1995b).

3.4. Os sólidos geralmente ocupam cerca de 1/3 do volume do biorreator. Isso permite que se utilize ar seco na aeração forçada. esse tipo de reator só pode ser utilizado para microrganismos sobre os quais a agitação não apresenta efeitos deletérios. Apesar desta vantagem. Figura 2.. Além disso. Esse tipo de agitação parece causar menos danos aos 31 . tendo sido estabelecidos alguns processos comerciais (Durand et al. 2.6: Representação esquemática de um biorreator agitado (Mitchell et al.. descrito em 1988 por Durand e Chereau. Pode ser empregada agitação intermitente ou contínua.6 está representado o esquema de um biorreator agitado. permite o controle da umidade através da adição de água no sistema. O biorreator de leito agitado INRA com capacidade para 1 tonelada.2.3. 2000). 2002).4. A agitação é leve e obtida através do rolamento do meio dentro do reator. foi utilizado para produção de enzimas. 1996). removendo calor por evaporação (von Meien e Mitchell.3. A utilização de agitação contínua ou intermitente promove maior homogeneidade do meio e maior remoção do calor gerado. biopesticidas e enriquecimento de proteínas. Biorreator agitado Esse tipo de reator já foi utilizado com sucesso em larga escala. Na Figura 2.4. Biorreator de tambor rotativo Os reatores deste tipo são cilíndricos e podem ser inclinados ou horizontais.

o controle da temperatura pode ser dificultado devido à dificuldade de se utilizar jaquetas de água (Mitchell et al.5. Devido ao grande fluxo de ar injetado nestes reatores. e ao longo da fermentação se for operado de forma intermitente. Esses reatores podem possuir um agitador para evitar a formação de aglomerados. 1986. podendo-se injetar ar seco. Este biorreator pode apresentar problemas devido à aglomeração ou atrito das partículas do meio. Tanaka et al. A remoção do calor se dá de forma distinta.. Neste tipo de biorreator. Mitchell et al.. Figura 2. 1992..7: Representação esquemática do biorreator de tambor rotativo (Mitchell et al. 32 . 2. dependendo do modo de operação. 2002). A homogeneização do leito fluidizado permite a adição de água durante a fermentação para facilitar o controle da umidade..4..3. pode haver ou não aeração forçada. Neste sistema. 2000).7). Além disso. Mitchell et al.8). a remoção de calor se dá por convecção e por evaporação.microrganismos e à estrutura do meio sólido (Figura 2. o controle da temperatura não é um problema. Leito fluidizado Os biorreatores de leito fluidizado são caracterizados por operar com aeração forçada com um fluxo de ar suficientemente alto para fluidizar o leito e movimentar os sólidos (Figura 2. mesmo em escalas maiores (Akao e Okamoto. 1983. 2000).

2. o que 33 . visto que estes são encontrados principalmente em ambientes terrestres.. A FES apresenta condições de cultivo mais próximas às condições do habitat natural dos microrganismos.. Além disso. 2004). maior produtividade e melhor qualidade dos produtos em FES para processos específicos. são utilizados majoritariamente meios de cultura simples. Vantagens da fermentação no estado sólido sobre fermentação submersa Uma comparação direta entre a fermentação no estado sólido e a fermentação submersa é difícil de ser realizada. esta é uma possível explicação para a obtenção de grandes quantidades de produto em FES (Hölker et al. principalmente de fungos filamentosos. 2003).8: Representação esquemática de um biorreator de leito fluidizado (Mitchell et al.Figura 2. compostos de materiais de origem vegetal. muitos trabalhos têm apontado vantagens da FES sobre a FS como: menores custos de produção. visto que os dois sistemas são muito diferentes. No entanto..4. Em FES. Desta forma. podendo-se empregar resíduos agroindustriais. 2000). sendo menos de 1% dos fungos conhecidos isolados de ambientes marinhos. alguns trabalhos têm apontado diferenças fisiológicas no crescimento de microrganismos nos dois sistemas produtivos e apontado que a maior produtividade em FES estaria relacionada a estas diferenças fisiológicas (Viniegra-González et al.

restrictum em meios contendo glicose foi bem mais acentuada em FS. Ishida et al. matéria-prima abundante e de baixo custo. uma redução de 100 vezes nos custos de produção foi obtida utilizando a FES (Tengerdy. tendo apresentado um custo de produção 68% menor e um tempo de retorno de 1.. Para produção de celulase de Trichoderma sp. em FES o efeito de repressão catabólica da tanase foi minimizado. Além disso. (2003) demonstraram que maiores produtividades foram obtidas em FES para as enzimas invertase. pois em FS a produção destas foi 8 vezes maior e a adição de inibidores de protease permitiu um aumento da produção da enzima em FS (Aguilar et al.representa. 2001a). (2000) demonstrou que a produção de lipase de Penicillium restrictum por FES apresenta maior viabilidade econômica do que por FS. sugerindo que em FES os efeitos de repressão catabólica são reduzidos e mostrando que. em algumas aplicações. nos dois sistemas. 2001. na produção de invertase....5 anos. Em FES. 1996). a utilização de equipamentos mais simples e a maior produtividade podem resultar em redução dos custos de produção..5 vezes maior e esse resultado foi associado à menor atuação de proteases. devido à menor quantidade de água presente em FES. O emprego freqüente destes materiais. Viniegra-González et al. onde o produto não precisa ser purificado. 2007).. 2000). observou-se uma produtividade da enzima tanase 5. como glicoamilase B e esporos de fungos para biocontrole (Vrije et al. quando comparado com FS (Aguilar et al. pectinase e tanase produzidas pelo fungo Aspegillus niger utilizando FES. o produto é mais concentrado e. niger que apresentam 34 . Estudos recentes demonstraram que alguns produtos podem ser produzidos apenas por FES. niger em FES parece estar associada a três fatores: maior produção de biomassa. 2001b). A redução na produção de lipase de P. em países como o Brasil. pode-se eliminar a etapa de concentração (Holker e Lenz. As enzimas produzidas pelos dois sistemas podem apresentar características distintas. Além disso. 2001). 2004). A maior produtividade de pectinase de A. ou que produtividades maiores do que em FS podem ser alcançadas na produção de enzimas. Uma análise econômica comparativa realizada por Castilho et al. resistência ao efeito de repressão catabólica e menor efeito de degradação por proteases (DiazGodínez et al.. a maior produtividade pode estar relacionada com a maior produção de biomassa (Romero-Gómez et al.. Observou-se que.. como foi observado para as pectinases de A. 2000). 2005). Maior produtividade em FES também foi observada para a β-Nacetilhexosaminidase de Verticillium lecanii quando comparada com a FS (Matsumoto et al. o fungo apresenta comportamentos fisiológicos distintos (Azeredo et al.

.. A forma vegetativa dos fungos consiste em filamentos tubulares. Para a produção de quitosana de Gongronella butleri. O crescimento das hifas é polarizado e ocorre através da extensão dos ápices. denominados hifas. 2001). 1995). Vriji et al. como maior espessura de parede e maior hidrofobicidade (Munoz et al. 2001). porém os autores sugerem que esse comportamento pode estar relacionado à associação de compostos não protéicos do meio de cultivo ou adquiridos no processo de purificação à enzima.. 2004. (2006) demonstraram que a mesma lipase purificada produzida por FES e FS apresentou diferenças na temperatura ótima de atuação. visto que muitos deles podem ativar a esporulação. apresentando diferentes estruturas ao longo do seu ciclo de vida. 2004). os esporos de Trichoderma harzianum produzidos pelos dois sistemas apresentaram morfologias distintas. Em FS. 2001). A ramificação das hifas gera os micélios. maiores quantidades de metabólitos secundários podem ser produzidos em FES em relação à FS e a produção destes metabólitos está frequentemente associada à esporulação. permitindo uma colonização efetiva das partículas de meio sólido (Papagianni. a produção de esporos para biocontrole ou inoculantes da indústria de alimentos.estabilidade. que são originados da germinação de esporos. na termoestabilidade e na especificidade. é reduzida. Morfologia de fungos filamentos Os fungos filamentosos possuem uma morfologia complexa. tal como ocorre com metabólitos tóxicos (Calvo et al. como menor massa molar. visto que estes fungos esporulam pouco em meio líquido.. como Penicillium roquefortii e P. como foi observado para os esporos de Trichoderma harzianum e Coniothyrium minitans (Holker et al..5. Mateos Diaz et al... Conforme já observado para outros produtos. 2002. A FES. observou-se que em FES o fungo produziu uma quitosana com propriedades melhores. quando comparado com a FS. tendo assim aplicação na indústria farmacêutica e de alimentos. Robinson et al. pH e temperatura ótimos mais elevados em FES (Acuña-Arguelles et al. A secreção de proteínas parece 35 . embora a produção de quitosana tenha sido maior em FS (Nwe et al. além de gerar maior produtividade. ser requeridos para a formação das estruturas de esporulação ou serem produzidos no momento da esporulação. camembert. produz esporos com maior resistência à radiação e à dessecação e maior viabilidade. 1995). 2. Além disso.

da natureza do inóculo. dependendo também das condições de cultivo. 2004). e essas diferenças dependem do patrimônio genético. pois apresentam apenas a fase assexuada em seu ciclo de vida. além de estar vinculado diretamente à produtividade. de modo que o número de ramificações pode ser um fator importante na produção de enzimas extracelulares (Wang et al. sendo necessária a utilização de indutores (Roncal e Ugalde. sendo estes fatores importantes na produtividade (Haack et al. Além disso. os flocos e pellets formados podem variar de tamanho. Vrije et al. liberando os esporos. Os fungos filamentosos geralmente não esporulam muito em fermentação submersa. 2003... Os fungos filamentosos podem apresentar diferentes padrões de crescimento em fermentação submersa ou fermentação no estado sólido. Kossen. Gibbs et al.. Em fermentação submersa. os fungos filamentosos podem exibir formas morfológicas distintas.. A esporulação neste gênero tem sido induzida pela presença de luz. 2001). como quantidade de água e sistema de agitação. muitos trabalhos exploraram a relação entre a morfologia e a produtividade de fungos filamentosos. 2001. neste gênero. O interesse de pesquisadores pela morfologia de fungos filamentosos em fermentação submersa.ocorrer preferencialmente pelos ápices.. ocorre através da diferenciação da estrutura apical em uma estrutura de reprodução especializada referida como fiálide. 2000). 2003). da composição do meio e das condições de cultivo (Papagianni. 2005. 2005). A esporulação. passando de micélios dispersos a massas miceliais densas. pela limitação de fontes de carbono e nitrogênio e pela presença de cálcio (Roncal e Ugalde. Em FS. de densidade e de estrutura. os fungos estão expostos a forças hidrodinâmicas. está também relacionado à mudança nas propriedades 36 . porém uma relação simples entre eles não foi encontrada (Grimm et al. Em FS. Os fungos do gênero Penicillium são pertencentes à divisão Deuteromicota. visto que são sistemas que possuem características bastante distintas. As estruturas de reprodução assexuadas e sexuadas são características dos diferentes grupos de fungos e são fatores importantes na identificação destes. 2000). enquanto em FES o crescimento ocorre sobre uma superfície sólida (Papagianni et al. comprimento e diâmetro das hifas. conhecidos como fungos mitospóricos. que realiza uma série de mitoses. A quantificação de alterações morfológicas é freqüentemente determinada pelo número de ramificações e de ápices.. visto que algumas formas morfológicas características são requeridas para se alcançar maiores produtividades de um determinado produto. 2006).

. No entanto. 2003).. A produção destas lipases por FES foi realizada em escala de bancada.. de Rhizopus rhizopodiformis e Rhizomucor pusillus em torta de oliva e bagaço de cana (Cordova et al. 2005. e de Rhizopus oligosporous em diversas tortas (ul-Haq et al. do material sólido empregado e de suas propriedades. 1993).. O estudo de padrões de crescimento em FES ainda é limitado.6. Em trabalhos do nosso grupo. DiLuccio et al. Além disso.. 2002.físico-químicas do meio de fermentação que estes tipos morfológicos podem causar (Kossen. de Rhizopus homothallicus em bagaço de cana (Rodriguez et al. Nopharatana et al.. Cavalcanti et al. permitindo a obtenção de altas produtividades e a redução dos custos de produção. 2000). 1998). simplicissimum em torta de babaçu.. 2002). Mateos-Díaz et al. Produção de lipases por FES As lipases microbianas são produzidas principalmente por fermentação submersa. lipases de diferentes microrganismos foram produzidas em diversos rejeitos sólidos. Godoy.. 2000). 2004). reduzindo os aglomerados sem prejudicar significativamente o consumo de oxigênio e conseqüentemente o crescimento (Schutyser et al. de P. 2006. 2007. devido à utilização de resíduos agroindustriais como meio de cultivo (Castilho et al. 2005. de Aspergillus niger em farelo de trigo e torta de gergelim (Mahadik et al.. diversas cepas de fungos filamentosos produtores de lipase foram selecionadas por FS (Freire. torta de soja e rejeito de mamona (Gutarra et al. como: a lipase de Penicillium restrictum em torta de babaçu (Azeredo et al.. 2000. 1996) e por FES utilizando torta de babaçu 37 . porém a FES tem sido reportada como uma excelente alternativa para a produção de lipases e outras enzimas. tendo apresentado elevada produtividade.. Kamini et al. deve variar muito dependendo do microrganismo. (2003) estudaram o crescimento do fungo Rhizopus oligosporus no interior de um meio sólido artificial. ainda não se buscou de forma efetiva associar os padrões de crescimento que o fungo pode apresentar com a produtividade em FES... 2004.2006).. Palma et al. Observou-se que o crescimento de hifas aéreas do fungo Aspergillus oryzae promove a aglomeração das partículas sólidas e que a agitação intermitente utilizando um tambor rotatório fragmenta as junções das hifas aéreas.. 2. Em FES. Holker et al. 1998). 2006). de Candida rugosa em farelo de arroz (Rao et al. em sua maioria utilizando biorreatores do tipo bandeja.

Além disso.3% (m/m) (Gutarra.8 L/min (Cavalcanti et al. 2005).25% (m/m) melaço (Gutarra et al. teor de umidade inicial de 70% (m/m) e suplementação com 6. somadas ao baixo custo de produção. Através do uso da técnica de planejamento experimental. dentre as quais uma cepa de Penicillium simplicissimum mostrou-se excelente produtora de lipase por FES apesar das baixas atividades lipásicas obtidas por FS em meios de cultivo com diferentes composições. 2007).5. elevadas atividades foram obtidas a 27°C e taxa de aeração maior que 0. além de ter sido capaz tanto de reduzir o teor de ricina a valores não detectáveis quanto reduzir o potencial alergênico do rejeito de mamona. Em rejeito de mamona. 38 . as lipases deste fungo produzidas por FES em torta de babaçu apresentaram atividade de esterificação e enâncio-seletividade (Cunha. 2006). através do emprego de temperatura de incubação de 29ºC. Tais características. foi possível determinar condições que permitiram aumentar ainda mais a produção desta enzima por FES em torta de babaçu em biorreator do tipo bandeja.como meio basal suplementado com óleo de oliva 3. esta cepa também foi capaz de produzir elevada atividade lipásica. 2003). indicam o grande potencial para aplicação biotecnológica da enzima produzida. através da hidrólise de albumina 2S em aproximadamente 50% (Godoy. 2005).. Em biorreator de leito fixo termostatizado (4 cm de diâmetro e 14 cm de altura).. As lipases deste fungo produzidas por FES e imobilizadas em diferentes suportes apresentaram elevada estabilidade a 55°C em pH 5. comparado com outras lipases de fungos mesofilicos.

39 . Entretanto. Além disso. Desta forma. microrganismos e biorreatores nos diferentes sistemas. a maioria das enzimas comerciais. uma vez que permite a redução de custos através da utilização de rejeitos agroindustriais como meio de cultivo e do emprego de equipamentos mais simples. Além disso. JUSTIFICATIVA As lipases são enzimas que possuem muitas aplicações industriais e são. assim como outros produtos biotecnológicos. Alguns estudos indicaram que a concentração do inóculo e o estado fisiológico das células são fatores importantes para o crescimento e produção de metabólitos e devem ser levados em consideração no estudo de estratégias alternativas de inóculo que permitam a diminuição da demanda por esporos. a fermentação no estado sólido (FES) pode ser uma alternativa interessante. Além disso. buscou-se investigar as propriedades catalíticas das lipases presentes no extrato bruto para identificar suas possíveis aplicações. ainda é obtida por FS. Além disso. a produtividade obtida por FES.3. além de investigar aspectos importantes e pouco estudados na literatura a respeito do comportamento fisiológico e morfológico de fungos filamentosos em FES e FS. Apesar da FES apresentar diversas vantagens sobre a FS. O principal motivo para isso é a dificuldade do escalonamento em FES. que é a principal forma de produção dessas enzimas para fins comerciais. que está relacionada com os severos problemas de transferência de massa e de calor que ocorrem neste sistema. de modo a contribuir para uma futura ampliação da utilização deste tipo de fermentação em maiores escalas. na sua maioria. pode ser mais elevada e as enzimas produzidas podem apresentar características mais interessantes conforme tem sido descrito na literatura. principalmente em escala industrial. o presente trabalho buscou investigar novas alternativas de inóculo e de biorreatores para FES. produzidas por fermentação submersa (FS). a FES é um sistema bastante heterogêneo e a comparação e padronização é muito difícil devido à utilização de diferentes meios. a dificuldade de geração de grandes quantidades de esporos geralmente requeridas para o inóculo em escala industrial é vista como outro entrave ao escalonamento deste modo de fermentação. quando comparada com a FS.

Determinar a estabilidade do preparado lipásico em diferentes pHs e temperaturas e o tempo de meia vida na condição ótima de atuação. simplicissimum presentes no extrato bruto produzido por fermentação no estado sólido. investigando aspectos fisiológicos e morfológicos observados em fermentação no estado sólido (biorreatores do tipo bandeja) e fermentação submersa (frascos agitados). OBJETIVOS 4. Investigar a produção de lipase em biorreator de leito fixo e agitado. Objetivos específicos Determinar a temperatura e o pH ótimos de atuação do preparado enzimático. utilizando torta de babaçu como meio basal sem suplementação e suplementada com fontes de carbono complexas e fontes de carbono de fácil assimilação.2. Estudar o perfil de produção de lipases pelo fungo P. Realizar um estudo comparativo da produção de lipases pelo fungo P. simplicissimum. Os objetivos específicos do presente trabalho foram os seguintes: • • • • • • • 40 . Investigar novas estratégias de inóculo na produção de lipase por fermentação no estado sólido. Os objetivos gerais do presente trabalho foram os seguintes: • • • 4. simplicissimum crescendo em FES e FS.4. Comparar a produtividade lipásica em FES e FS. Determinar a especificidade por substratos. Identificar diferenças na morfologia do fungo P.1. Determinar a melhor concentração de esporos como inóculo para a produção de lipase por FES utilizando torta de babaçu como meio de cultivo. avaliando ácidos graxos com diferentes tamanhos de cadeia. simplicissimum em FES e em FS e identificar diferenças nos dois sistemas. • Objetivos gerais Estudar as propriedades das lipases de P.

Avaliar o emprego de pré-inóculo sólido na produção de lipase em biorreator de leito fixo. Avaliar a produção de lipase em biorreator agitado. visando a redução da concentração de esporos utilizada. Investigar melhores condições de pré-inóculo sólido (tempo de propagação e concentração de inóculo) para a produção de lipase por FES. como alternativa de inóculo para produção de lipase por FES.• Avaliar o emprego de pré-inóculo líquido ou sólido. • • • • • 41 . Estudar o perfil de produção de lipase por FES utilizando reatores de leito fixo. Estudar o efeito da granulometria da torta de babaçu na produção de lipase em biorreatores do tipo bandeja. utilizando aeração forçada com diferentes vazões de ar.

Reagentes e produtos químicos A matéria-prima empregada nos meios de fermentação foi a torta de babaçu.1. gentilmente fornecida pela empresa Tocantins Babaçu S. MATERIAIS E MÉTODOS 5.1: Componentes dos meios de cultura. Produtos Amido solúvel MgSO47H2O (NH4)2SO4 KH2PO4 CaCO3 Extrato de lêvedo NaCl Peptona de carne Agar Fornecedor Vetec Reagen Reagen Reagen Reagen Difco Vetec Vetec Reagen Os principais reagentes utilizados nos ensaios analíticos e seus respectivos fornecedores encontram-se listados na Tabela 5. rejeito da produção de óleo de babaçu.5. 42 . Materiais 5. Os nutrientes utilizados na formulação dos meios de cultura e seus respectivos fornecedores encontram-se listados na Tabela 5.1. um rejeito da produção de açúcar cristalizado.A. O óleo de oliva utilizado foi o produto comercial de marca Gallo e o melaço de cana utilizado.2.1.1. Tabela 5.

1. Produto Acetona Etanol NaOH KHSO4 Goma arábica N-acetilglicosamina Na2CO3 Reativo de Erlich (p-DAB) p-nitrofenil ester Triacilgliceróis Fenolftaleína Glutaraldeído Tetróxido de ósmio Acetil acetona 5.2.2: Lista de reagentes utilizados de grau analítico. Tabela 5.3. Equipamentos Os equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela 5.Tabela 5. Equipamento Câmara de fluxo laminar Estufa para incubação Estufa para secagem Balança analítica Placas de agitação Potenciômetro Agitador rotatório Banho com agitação Banho de recirculação Espectrofotômetro UV/VIS Fabricante Elzividros Fabbe-Primar Quimis Mettler Corning pH meter Mettler Toledo New Brunswick Nova Ética Corola Shimadzu Modelo 115-003 216 AE260 PC 420 320 Bioflo II e III DUBNOFF MultiSpec.1501 Fornecedor Vetec Vetec Vetec Vetec Vetec Sigma Vetec Neoprov Sigma /Fluka Sigma Vetec Polisciences EUA Polisciences EUA Merck 43 .3: Equipamentos utilizados.

quanto por FES em meio composto por torta de babaçu (Gutarra.Titulador automático Dispersor de partículas Agitador Rotâmetro Termopar Microscópio de luz Aparelho de ponto crítico Metalizador Microscópio eletrônico de varredura Peneirador e peneiras Moinho de faca Mettler IKA IKA AAlborg Cole Parmer Zeiss Balzers Balzers JEOL GranuTest - DL 21 e 50 DI18 RW20 08500-40 Axioplan2 CPD030 MED010 JSM035 - 5. A cepa foi mantida em glicerol (100%) e estocada a –20°C e em nitrogênio líquido.1.1. utilizando meios de cultivo semi-sintéticos com diferentes composições (Freire. Microrganismos A cepa de Penicillium simplicissimum utilizada neste trabalho foi isolada da fermentação natural de rejeitos do processamento da amêndoa de babaçu e selecionada como produtora de lipase tanto por fermentação submersa.2. A micrografia de luz de uma estrutura de reprodução desta espécie está ilustrada na Figura 5. 44 . 2003).2. Figura 5. Métodos 5.1: Micrografia de luz da estrutura de reprodução do fungo Penicillium simplicissimum. 1996).

Propagação de esporos para obtenção da suspensão de esporos A obtenção de esporos foi realizada através do crescimento do fungo a 30°C por 7 dias em meio com a seguinte composição (% m/v): amido solúvel 2. A composição da torta encontra-se na Tabela 5. pH 7.7.6 7.2.3. A concentração de esporos foi determinada através de contagem ao microscópio óptico em câmara de Neubauer.2. MgSO4*7H2O 0. extrato de lêvedo 0.05. 5. A distribuição granulométrica da torta de babaçu após moagem previamente padronizada está apresentada na Tabela 5.5 11.0 9. formando a suspensão de esporos. KH2PO4 0. Preparo da torta de babaçu Foi utilizada como meio basal para fermentação no estado sólido a torta de babaçu.4 7.025. Faixas granulométricas < 210 µm 210 – 420 µm 420 – 600 µm 600 – 850 µm 850 – 1180 µm 1180 – 1700 µm 1700 – 2000 µm 2000 – 2360 µm 2360 – 2800 µm > 2800 µm Fração (%) 4.1.5. Tabela 5.4 45 .5.0.5. Os esporos foram raspados e suspensos em tampão fosfato (50 mM.6 12.0. CaCO3 0.2.0 5.6: Distribuição granulométrica da torta de babaçu.0 11.0 11.6.0. e agar 1. A torta foi moída e peneirada de forma a se obter diferentes tamanhos de partículas. (NH4)2SO4 0.6 19. óleo de oliva 1.0) estéril.

8 61. Foram utilizados com 10 g de torta de babaçu.2.2.9. utilizou-se suspensão de esporos ou pré-inóculo propagado em meio líquido ou em meio sólido. em concentrações distintas. 46 . As fermentações foram conduzidas a 30°C com diferentes teores de umidade inicial. 3) estudo de estratégias alternativas de inoculação. Para avaliar diferentes estratégias de inoculação. Fermentação submersa As fermentações foram conduzidas em erlenmeyers de 1 L contendo 240 mL de diferentes meios de cultivo descritos no item 5.2. Fermentação no estado sólido em biorreator do tipo bandeja Esse tipo de biorreator foi empregado em 4 etapas do trabalho: 1) produção de lipase para estudo de suas propriedades catalíticas. suplementada com óleo de oliva.1. A torta de babaçu foi utilizada em diferentes faixas granulométricas.8 4. 1996). 1999).7: Composição da torta de babaçu (Gombert et al.3 5. melaço ou glicose a 6. e 4) estudo do efeito da granulometria na produção de lipase. Composição Umidade Proteínas Carboidratos Lipídeos Cinzas Concentração (%) 6. 2) estudo comparativo da produção de lipase em FES e FS. Os meios foram inoculados com 2 x 104 esporos/mL e incubados em agitador rotatório a 30oC e 170 rpm (Freire.Tabela 5. em estufas com injeção de ar úmido com 95% de saturação.5.5 4. Foram empregados biorreatores do tipo bandeja cilíndricos com 10 cm de diâmetro e 15 cm de altura..6 22. 5.25% (m/m). perfazendo uma altura de leito de 1 cm.4. Como meio de cultivo foi empregada torta de babaçu sem suplementação.

3: Fluxograma da amostragem em FS 47 .1. respectivamente.5.5g de torta fermentada Extração das enzimas pH 0.6.6. conforme mostrado nas Figuras 5.3.2 e 5.2: Fluxograma da amostragem em FES Amostra FS (a cada 24h) Peso seco Teor de Glicosamina Obtenção do extrato enzimático (livre de células) Determinação de atividade lipásica Determinação de proteínas totais Medida de pH Figura 5. a amostragem foi realizada utilizando todo o meio fermentado de cada biorreator. Amostragem As amostras de FES e FS foram retiradas para posterior avaliação da produção e monitoramento dos parâmetros.5g de torta fermentada Teor de glicosamina 0. empregando-se biorreatores do tipo bandeja. Amostragem e obtenção do extrato enzimático bruto 5.5g de torta ermentada Determinação de atividade lipásica Determinação de proteínas totais Figura 5.2. Amostragem FES (a cada 24h) Teor de umidade 0.2. Para FES.

foi realizada de forma indireta através da dosagem de glicosamina (Aidoo et al. Para isto. Em seguida. sendo a neutralização efetuada com solução de 48 .2. pH 7. Posteriormente.5.7.5 g de material fermentado foi retirado e foram adicionados 5 mL de água destilada. 5.7. 1999). o pH do sobrenadante foi medido em potenciômetro. após 10 minutos. Em FS.1.3.1) 5. 5. A extração do preparado enzimático foi realizada em agitador rotatório a 35°C e velocidade de agitação de 200 rpm por 20 minutos.1 M. colocando-se a mistura em banho de água fervente por 2 horas. em FES e FS.0) por grama de torta de babaçu inicial. Obtenção do extrato enzimático bruto Em FES. Medida do teor de umidade em FES Amostras de 0. Quantificação do crescimento celular A quantificação do crescimento celular. Monitoramento da fermentação submersa e no estado sólido 5.2. 1981).7. a torta foi prensada para a obtenção do extrato enzimático bruto. adicionou-se 5 mL de HCl 6N a 0. adicionando-se 1 gota de solução alcoólica de fenolftaleína 0. Foram transferidos 2 mL do sobrenadante para um balão de 10 mL. foram adicionados 5 mL de tampão fosfato (0.6.5 g de material fermentado foram colocadas em placas de Petri e incubadas em estufa a 60°C até atingir massa constante.5 g de amostra.2. Medida de pH O pH das amostras retiradas das fermentações submersas foi medido diretamente em potenciômetro. o qual foi centrifugado a 2000 g por 2 minutos para remoção de sólidos mais finos (Gombert et al. 0.7.5% (m/v). o extrato enzimático bruto foi obtido após remoção da biomassa fúngica por centrifugação a 2000 g por 2 minutos. O teor de umidade da amostra foi calculado de acordo com a Equação 5.2.2.. A mistura foi vigorosamente agitada e. Teor de Umidade (% ) = (massa úmida − massa seca) × 100 massa úmida (5.2.. Para medida de pH em FES. ao final da fermentação.1. a amostra foi resfriada e filtrada a vácuo.2.

até que esta coloração desaparecesse. pH 5. A reação foi interrompida pela adição de uma solução de acetona-etanol (1:1 v/v). Os brancos reacionais foram obtidos adicionando-se o preparado enzimático após a solução acetona-etanol. a quantificação do crescimento celular também foi realizada por medida de massa seca.7. 5. até que a coloração atingisse tonalidade rosa. Os ácidos graxos foram titulados com solução 0. Amostras de 2 mL de material fermentado foram filtradas a vácuo em papel de filtro e incubadas em estufa a 60°C até atingir massa constante. A concentração de biomassa foi expressa em mg de massa seca por mL de meio. colocando a mistura em banho de água fervente por 20 minutos. tomou-se 1 mL da solução acima e adicionou-se à mesma 1 mL de solução de acetil acetona em Na2CO3 0. que também promove a extração dos ácidos graxos liberados.2: 49 . Após resfriamento.2. 1997a e b). nas condições do ensaio (Freire et al.04 N de NaOH em titulador automático até um valor de pH final de 11. Em FS. Os tubos foram incubados a 65oC por 10 minutos e a absorbância foi lida a 530 nm contra um branco.2. Uma unidade de atividade enzimática (U) é definida como a quantidade de enzima que produz 1 µmol de ácido graxo por minuto. Após esta etapa. Quantificação da atividade lipásica Método titulométrico A determinação da atividade lipásica foi realizada utilizando-se como substrato o óleo de oliva (5% m/v) emulsionado por 3 minutos com goma arábica (5% m/v) em tampão fosfato de sódio (100 mM.0) ou tampão citrato fosfato (100 mM. em seguida. de modo que o cálculo da atividade enzimática foi feito pela Equação 5. (1951).NaOH 3 N. então. O volume do balão foi.0.5 N (1:50).7. foram adicionados 6 mL de etanol e. 5. no qual foi adicionada água ao invés de amostra. completado com água destilada. O extrato enzimático (1 mL) foi adicionado a 19 mL de emulsão e incubado por 15 minutos a 35°C (em pH 7. Posteriormente.0) ou 50°C (em pH 5.5. 1 mL de pdimetilaminobenzaldeido (reagente de Erlich). foi realizada a titulação reversa com KHSO4 1%.0).0) em banho com agitação a 200 rpm.. pH 7. Determinação de proteínas totais A quantificação de proteínas totais presentes no extrato bruto oriundo de FES e FS foi realizada pelo método de Lowry et al.4.

3 e expressa em (U/g). A atividade lipásica foi expressa em U/mL em FS e U/g de massa seca inicial em FES.4: 50 .0. Uma unidade de atividade lipásica (U) é definida como a quantidade de enzima necessária para hidrolisar 1. A solução do substrato foi preparada utilizando-se 0. Em FES. A= Onde: AL .2 mL de tampão fosfato de sódio 25 mM.Vext Mi (5. pH 7.0 µmol de p-nitrofenil laurato por minuto nas condições de ensaio.3) A = atividade lipásica (U/g) AL = atividade lipásica (U/mL) Vext = volume de extração enzimática (mL) Mi = massa seca de torta inicial (g) Método espectrofotométrico A atividade lipásica foi medida também pelo método espectrofotométrico.AL = Onde: (V − Vb ) ⋅ M ⋅ 1000 t ⋅ Va (5. a atividade lipásica foi calculada conforme a Equação 5.25 mL de p-nitrofenil laurato 2.5 mM em 2. a atividade lipásica foi expressa em U/mL. que se baseia na formação de um produto cromóforo (p-nitrofenol) a partir da reação de hidrólise do p-nitrofenil laurato catalisada por lipases.2) AL = atividade lipásica (U/mL) V = volume de solução de NaOH gasto para a titulação da amostra (mL) Vb = volume de solução de NaOH gasto para a titulação do branco (mL) M = molaridade da solução de NaOH (milimoles/mL) t = tempo de reação (min) Va = volume de amostra (mL) Em FS. O cálculo da atividade enzimática foi feito pela Equação 5. A formação do p-nitrofenol foi acompanhada em espectrofotômetro a 412 nm. A reação foi iniciada pela adição de 50 µL do extrato enzimático e conduzida a 30ºC.

AL = Onde:

(α ⋅ F ⋅ Vf ) ⋅ Fd Va

(5.4)

AL = atividade (U/mL)

α = coeficiente angular da reta (Abs x tempo)
F = fator (Abs x concentração de produto) Vf = volume final (mL) Va = volume de amostra (mL) Fd = fator de diluição Rendimento de produto por biomassa (Yp/x) O rendimento (Yp/x) foi calculado pela razão da atividade lipásica (U/g ou U/mL) pelo conteúdo de N-acetilglicosamina (mg/g ou mg/mL), sendo expressa como unidade por mg de N-acetilglicosamina (U/mg). Atividade específica A atividade específica foi calculada pela razão da atividade lipásica (U/g ou U/mL) pela concentração de proteínas totais excretadas, sendo expressa em unidades por mg de proteínas totais (U/mg).

5.2.8. Estudo das propriedades catalíticas da lipase de Penicillim simplissinum 5.2.8.1. Produção do extrato enzimático bruto
Nesta etapa do trabalho, foram empregados biorreatores do tipo bandeja contendo torta de babaçu com tamanho de partícula entre 210 e 420 µm. A torta de babaçu foi suplementada com 6,25% de melaço (m/m) e foi empregada como inóculo suspensão de esporos na concentração de 107 esporos/g de torta. A fermentação foi conduzida a 30°C com teor de umidade de 70% em estufas com injeção de ar úmido (95% de saturação da água).

51

5.2.8.2. Efeito da temperatura e do pH na atividade lipásica
A atividade lipásica foi determinada em diferentes valores de pH (4,0-7,0) e temperaturas (25-70°C), utilizando o método titulométrico descrito no item 5.2.7.5 em tampão citrato fosfato.

5.2.8.3. Estabilidade lipásica
A atividade lipásica residual foi determinada pelo método espectrofotométrico conforme descrito no item 5.2.7.5, após incubação do extrato enzimático bruto por 1 h em temperaturas de 30, 40, 50, 60 e 70oC e pH de 4,0; 5,0; 6,0; e 7,0 para determinação da estabilidade do extrato em diferentes pH e temperaturas. A meia vida das lipases presentes no extrato bruto (t1/2) foi determinada através da medida da atividade residual ao longo do tempo a 50°C e pH 5.0. Os dados experimentais de atividade residual foram ajustados ao modelo mostrado na Equação 5.5 e t1/2 (h) foi calculada baseando-se no tempo necessário para obter 50% da atividade inicial.

Ares = A0 e − kt
Onde:

(5.5)

Ares = atividade lipásica residual (U/g) A0 = atividade lipásica inicial (U/g) k = constante de inativação (h-1) t = tempo de reação (h) 5.2.8.4. Especificidade lipásica
A especificidade das lipases presentes no extrato bruto foi avaliada utilizando substratos contendo ácidos graxos com diferentes tamanhos de cadeia pelo método titulométrico e espectrofotométrico. Pelo método titulométrico, a atividade lipásica foi determinada conforme descrito no item 5.2.7.5 a 50°C, em emulsões contendo diferentes triglicerídeos sintéticos na concentração de 56 mM: tributirina (C4:0), tricaprina (C8:0), tricaprilina (C10:0), tripalmitina (C16:0) e triestearina (C18:0) ou 5% de óleo de oliva como controle e 5% de goma arábica em tampão citrato fosfato (100mM, pH 5,0). Pelo método espectrofotométrico, a atividade lipásica foi determinada utilizando diferentes

p-nitrofenil ésteres (pNP-butirato, C4:0; pNP-caprilato, C8:0; pNP-laurato, C12:0; pNPpalmitato, C16:0) a 30oC e pH 7,0, já que estes ésteres são instáveis a temperatura elevada e apresentam baixa absorbância em pHs ácidos. 52

5.2.9. Estudo comparativo da produção de lipase, fisiologia e morfologia do fungo P. simplicissimum em FES e FS 5.2.9.1.Produção de lipase em FES e FS
Em FES, foram empregados biorreatores do tipo bandeja contendo torta de babaçu com tamanho de partícula entre 210 e 420 µm. A torta de babaçu foi utilizada sem suplementação (C:N 12,3:1); e suplementada com 6,25% (m/m) de óleo de oliva (C:N 13,9:1); 6,25% (m/m) de melaço (C:N 12,8:1); ou 6,25% (m/m) de glicose (C:N 13:1). O inóculo foi realizado com suspensão de esporos na concentração de 107 esporos/g. A fermentação foi conduzida a 30°C com teor de umidade de 70% em estufas com injeção de ar úmido com 95% de saturação. Em FS, foram utilizados como meio de cultivo: (1) um meio semi-sintético com a seguinte composição (% m/v): glicose 1,0; peptona 1,0; extrato de levedura 0,5; MgSO4.7H2O 0,05; KCl 0,05; FeSO4.7H2O 0,001; óleo de oliva 0,3; em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,6 (C:N 8,9:1) ; (2) 2,5% (m/v) de babaçu com tamanho de partícula entre 0,21 e 0,42 mm, suspensa em água destilada (C:N 12,3:1); (3) 2,5% (m/v) de babaçu com 1% (m/v) de melaço (C:N 15,0:1); (4) 2,5% (m/v) de babaçu com 1% (m/v) de glicose (C:N 16,7:1); e (5) 2,5% (m/v) de babaçu com 0,3% (m/v) de óleo de oliva (C:N 15,2:1). As concentrações das fontes de carbono complexas (óleo de oliva) e de fácil assimilação (glicose e melaço) foram adicionadas nas concentrações utilizadas no meio semi-sintético. A atividade lipásica foi medida pelo método espectrofotométrico, utilizando o pnitrofenil laurato como substrato.

5.2.9.2. Morfologia do fungo P. simplicissimum
Amostras foram recolhidas a cada 24 h de fermentação para estudo da morfologia do fungo nos dois sistemas produtivos e foram analisadas por microscopia de luz e microscopia eletrônica de varredura. Microscopia de luz Para a microscopia de luz, amostras de crescimento de P. simplicissimum em FES e FS foram colocadas entre lâmina e lamínula e observadas frescas ao microscópio Axioplan 2 em contraste interferencial diferencial de Nomarski e em campo escuro. 53

em aparelho Balzers CPD030. 54 .2. em diferentes concentrações. secas pelo método de ponto crítico do CO2. O pré-inóculo líquido foi preparado em meio semi-sintético utilizado para o crescimento do fungo P. 70.10.1.2. O perfil de produção de lipase foi avaliado ao longo da fermentação utilizando três concentrações distintas de esporos: 106.5% (v/v) de glutaraldeído em tampão cacodilato 0. 5. com a seguinte composição (% m/v): glicose 1.2 por 72 h a 4oC. 1996). desidratadas em série crescente de etanol (30. A torta de babaçu foi suplementada com 6. as amostras de crescimento do fungo em FES e FS foram fixadas em 2.10.2.Microscopia eletrônica de varredura Para microscopia eletrônica de varredura. pH 7.2. Pré-inóculo líquido O pré-inóculo líquido consistiu em utilizar pellets de fungos crescidos em meio líquido como inóculo. pós-fixadas em 1% de tetróxido de ósmio no mesmo tampão por 30 minutos à temperatura ambiente. a 35°C e pH 7. 50. Suspensão de esporos A suspensão de esporos foi utilizada como método convencional de inoculo conforme descrito no item 5. 3x 100%). A fermentação foi conduzida a 30°C com teor de umidade de 70% em estufas com injeção de ar úmido com 95% de saturação.25% de melaço (m/m) e inoculada com suspensão de esporos. 5. 5.10.2. lavadas no mesmo tampão. conforme descrito a seguir. montadas em suporte de alumínio e metalizadas com ouro em aparelho Balzers MED010.2. As amostras foram lavadas no mesmo tampão. 90. no escuro. Estudo de diferentes estratégias de inoculação Foram empregados biorreatores do tipo bandeja contendo torta de babaçu com tamanho de partícula entre 210 e 420 µm. pré-inóculo líquido. ou pré-inóculo sólido. simplicissimum e produção de lipase em fermentação submersa (Freire.0. utilizando óleo de oliva como substrato. 107 e 108 esporos por grama de torta de babaçu.0. As amostras foram observadas em um microscópio eletrônico de varredura JEOL JSM035 operando em 15kV. A atividade lipásica foi medida pelo método titulométrico.1M.

A fermentação foi conduzida conforme descrito no item 5.05. Foram testadas duas concentrações diferentes. Depois do inóculo. Depois do inóculo. A atividade lipásica foi medida pelo método espectrofotométrico utilizando o pnitrofenil laurato como substrato.2. em tampão fosfato 0. 20 ou 30%. 5.4. MgSO4.peptona 1. Foram empregados diferentes teores de umidade para cada faixa granulométrica devido às diferenças na capacidade de absorção que cada tamanho de partícula apresenta. 20 ou 30%) e diferentes tempos de fermentação (12.6. extrato de levedura 0. óleo de oliva 0. Posteriormente. A fermentação foi conduzida a 30°C em estufas com injeção de ar úmido. empregando-se inóculo com suspensão de esporos na concentração de 107 esporos/g de torta. os sólidos foram misturados para promover uma distribuição homogênea do inóculo. o meio líquido foi filtrado e os pellets de fungo foram inoculados no meio para FES. determinada por peso seco) ou dois erlenmeyers (120 mg de massa seca de fungo).7H2O 0.5. pH 7. FeSO4. Pré-inóculo sólido O pré-inóculo sólido consistiu em utilizar a torta de babaçu fermentada como inóculo e foi preparado utilizando-se uma fermentação no estado sólido em menor escala.3.2.8) foi suplementada com 6. os sólidos foram misturados para promover uma distribuição homogênea do inóculo. O meio (30 mL em erlenmeyers de 125 mL) foi inoculado com 2 x 104 esporos/mL e incubado em agitador rotatório a 30oC e 170 rpm por 24 h. 24 ou 36 h). respectivamente. Estudo do efeito da granulometria da torta de babaçu na produção de lipase Torta de babaçu com diferentes tamanhos de partícula e teores de umidade inicial (Tabela 5.25% de melaço (m/m). 2 ou 3g correspondendo a 10.11.001. 5.10. Foram empregados diferentes concentrações de sólidos fermentados (10. KCl 0.1 M.7H2O 0. porém utilizando uma massa inicial de 1.3.2. 55 . inoculando-se os pellets crescidos em um erlenmeyer com 30 mL de meio líquido crescidos por 24 h (60 mg de massa seca de fungo.05.0.

h4= 5. A coluna de vidro é acoplada a uma peça cônica metálica (peça 4 e 5) onde ocorre a circulação do ar que entra para o reator.6 cm. O biorreator de leito fixo e agitado possui 5 peças de forma a permitir um fácil carregamento e descarregamento do reator (Figura 5.8: Faixas granulométricas e teores de umidade inicial.1.12. h2= 17. H2=14 cm.2.2. O biorreator possui um volume útil de 2355 cm3 com capacidade para processar 400 g de torta de babaçu. Faixa granulométrica (µm) 210 a 420 (controle) < 420 420 a 850 850 a 1700 1700 a 2360 > 2360 Toda faixa Teor de umidade (%) 70 70 65 60 55 50 65 5.6 cm. Essas peças são separadas por uma placa porosa que permite a dispersão homogênea do ar. Emprego de biorreator de leito fixo e agitado para a produção de lipase por FES 5.6 cm).12.4).6 cm. 56 . h3= 11.Tabela: 5. O biorreator (Figura 5. H3= 7 cm) e quatro saídas para medida de temperatura em alturas diferentes (h1= 23.5) possui três amostradores posicionados em três alturas diferentes do leito (H1= 21 cm. Desenho e construção do biorreator O biorreator utilizado neste trabalho foi desenhado e construído para operar como leito fixo ou agitado. O reator possui uma coluna cilíndrica de vidro de 30 cm de altura e 10 cm de diâmetro interno onde o leito é empacotado (peça 3). A parte superior do reator é composta por uma peça metálica cilíndrica com 20 cm de diâmetro (peça 2) e uma tampa (peça 1) com duas saídas de ar e um orifício central onde a haste do agitador é acoplada.

(b) coluna do leito (peça 3).4: Desenho do biorreator: (a) tampa (peça 1) e espaço para circulação de ar (peça 2). (c) espaço para circulação (peça 4) e entrada do ar (peça 5) 57 .(a) (b) (c) Figura 5.

12.(a) (b) H1 H2 H3 h1 h2 h3 h4 Figura 5. O biorreator foi inoculado com suspensão de esporos (107 esporos/g de torta) e pré-inóculo sólido (10% de sólidos fermentados por 36 h) e a fermentação conduzida à temperatura 58 . sem suplementação. 5.2.6: Pá do biorreator agitado.5: Foto do biorreator de leito fixo (a) e agitado (b) Figura 5. Operação do biorreator Leito Fixo O biorreator cilíndrico foi operado com 400 g de torta de babaçu e altura de leito de 27 cm empregando toda a faixa granulométrica da torta.2.

utilizando o p-nitrofenil laurato como substrato. foram retiradas a cada 24 h em três alturas distintas.6 L/min). Foi empregada teor de umidade inicial de 65% e aeração forçada com diferentes vazões (6. O biorreator foi operado em temperatura ambiente visto que pouca alteração na produção da lipase de P.. simplicissimum neste mesmo rejeito foi observada em temperaturas de 28 a 32°C em biorreatores do tipo bandeja. sem suplementação. utilizando-se um sensor de temperatura.9. e 11. tanto quando operado em leito fixo quanto em leito agitado. Leito agitado Foram empregadas 400 g de torta de babaçu e altura de leito de 27 cm.6 L/min. 2005. empregando toda faixa granulométrica da torta de babaçu.2 µm e umedecido em uma coluna de água de 24 ou 12 cm de altura para evitar o ressecamento do leito. 2005).. A temperatura no interior do leito foi monitorada em quatro alturas distintas.6). 59 . e 11.5 e 5. maiores atividades foram obtidas em temperatura menores que 28°C em biorreator de leito fixo termostatizado com capacidade para 30 g de sólidos (Gutarra et al. O biorreator foi inoculado como inóculo 10% de sólidos fermentados por 36 h e a fermentação conduzida à temperatura ambiente com teor de umidade inicial de 65% com aeração forçada (injeção de ar úmido) à vazão de 11. 9.ambiente com teor de umidade inicial de 65% com aeração forçada (injeção de ar úmido). Amostras do biorreator. Além disso. 9. O ar foi esterilizado utilizando um filtro com membrana de abertura 0.4. Cavalcanti et al. A atividade lipásica foi medida pelo método espectrofotométrico.6 L/min) reguladas por um rotâmetro ligado a linha de ar comprimido.4. Agitação de 30 rpm foi promovida por uma haste contendo seis conjuntos de pás acoplada a um agitador (Figura 5.9. utilizando-se diferentes vazões de ar (6.

0 e a temperatura (T) entre 25 e 45°C.2 mostra as condições experimentais e os valores de atividade lipásica experimentais e preditos pelo modelo gerado e o desvio relativo entre eles. A análise estatística permitiu estimar os efeitos das variáveis testadas.41 Temperatura (°C) pH 25 5.1. simplicissimum 6. respectivamente.1. RESULTADOS E DISCUSSÃO 6. Efeito da temperatura e do pH na atividade lipásica O pH e temperatura ótimos de atuação das lipases. foram utilizados para avaliar a significância dos efeitos das variáveis (Tabela 6.3). e os valores de t e de p. Propriedades das lipases de P. Foi empregado um delineamento composto central rotacional (DCCR).6. A análise dos dados foi realizada utilizando o software Statistica 6.0 -1 28 5.1.0 1 42 6.41 45 7.1: Valores reais e codificados das variáveis testadas (temperatura e pH). que representam os efeitos padronizados das variáveis e a probabilidade de significância do teste. A Tabela 6. assim como da interação entre elas.0 e 7. Tabela 6. presentes no extrato bruto obtidos por FES. foram determinados pelo método titulométrico utilizando a técnica de planejamento experimental.0.3 0 35 6. Valores codificados das variáveis Variáveis -1.0 60 . Os valores reais e codificados das variáveis testadas estão apresentados na Tabela 6. variando o pH entre 5.7 1.1.

05 Erro padrão 3.90 Valor de p 0.4T 2 − 13.97 67.29 67.17 22.4 43.75 65.53 61.41 1.41 1.0030 0.10 25.23 3.40 76.00 48.5 -0. L representa os efeitos lineares e Q os quadráticos.3 2.55 Teste t 7.1).2 4.0005 0.05). Ensaios 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Temperatura (oC) -1 -1 1 1 -1.40 65.1) .7T − 5.70 -5.85 4.63 66.03 70.10 42.41 0 0 0 de atividade lipásica (U/g) * Valores preditos de atividade lipásica (U/g) 50.6 pH − 10.0004 0.40 Desvio relativo (%) -17.3: Efeito das variáveis temperatura e pH sobre a atividade lipásica baseado nos dados do DCCR.3 pH 2 onde: A= Atividade lipásica (U/g) T = Variável temperatura codificada pH = Variável pH codificada 61 (6.85 3.60 23.7 -5.5 1.33 -2.2: Valores experimentais e preditos de atividade lipásica para as diferentes condições experimentais do delineamento composto central rotacional.6 0.55 -10.40 -13.6 12.57 64. A = 65.0377 0.41 -5.23 3.80 36.4092 Foi possível construir um modelo empírico para atividade lipásica em função das variáveis temperatura e pH codificadas (Equação 6.4 + 12.5 -3.40 65. Variáveis Temperatura (L) Temperatura (Q) pH (L) pH (Q) Temperatura * pH Coeficiente 12.88 -2.41 0 0 0 0 0 Valores experimentais pH -1 1 -1 1 0 0 -1.44 78. Tabela 6.Tabela 6.2 -4. incluindo apenas os termos estatisticamente significativos (valor de p < 0.10 25.81 -8.76 72.5 3.03 49.67 * Atividade lipásica determinada pelo método titulométrico tendo óleo de oliva como substrato.37 -0.

3 18.0. Este modelo foi utilizado para a construção das superfícies de resposta e curvas de contorno. Baseado nestes resultados.97 (Tabela 6. mesmo a 70oC em pH 5. mostrando os valores de atividade lipásica preditos para cada condição de pH e temperatura dentro da faixa estudada (Figura 6.8 U/g em pH 4. O erro puro foi consideravelmente baixo.0.0.0 e a temperaturas de 45 a 60°C.4: Análise de variância (ANOVA) do DCCR.6 = 4.A análise de variância (ANOVA) foi realizada para avaliar a adequação do modelo.1).2).9656.05.1 25.0 a 6. obtendo-se uma atividade máxima de 75.0 (Figura 6. F0.7 20.2 3507. O modelo é considerado preditivo se o coeficiente de determinação (R2) é próximo de 1 e se o valor de F calculado for superior ao valor crítico de F. 5. o modelo gerou atividades lipásicas preditas muito similares aos valores obtidos experimentalmente apresentando devios relativos baixos (Tabela 6.4.5 102.1 apresentou um F calculado 9. indicando um bom ajuste do modelo. Observou-se que. e 6.0 e 5.0 e 6.2). 62 .3 vezes maior que o valor crítico de F e o R2 foi 0.3 Graus de liberdade 4 6 4 2 10 2 Média quadrática 846.4).1 - Valor de F 42. indicando uma boa reprodutibilidade dos experimentos.8 120. Fonte de variação Soma quadrática Regressão Resíduo Falta de ajuste Erro puro Total 3386.3 - Coeficiente de determinação: R = 0. Além disso. uma nova série de experimentos foi realizada para determinar a atividade lipásica em temperaturas superiores a 45°C em valores de pH de 4. Tabela 6.0.0 a 50°C. as lipases presentes no extrato bruto apresentaram uma atividade residual de aproximadamente 15 U/g (20% da atividade lipásica máxima).6 9.53 Valor de F = média quadrática da regressão/média quadrática do resíduo Os valores máximos de atividade lipásica foram obtidos em temperaturas de 37 a 45°C e pH de 5. Elevadas atividades lipásicas (acima de 40 U/g) foram obtidas em pH 4.0 a 6. O modelo apresentado na Equação 6.

0 5.1: Superfície de resposta (a) e curva de contorno (b) para atividade lipásica em função das variáveis temperatura e pH.0 25 28 35 42 45 60 40 20 Temperatur a (o C) Figura 6. 63 .0 6.3 5.7 pH 6.(a) (b) 7.

2002). 64 . A atividade lipásica máxima foi obtida em pH 5. produzem lipases com atividades máximas em temperaturas entre 25 e 45°C (Tan et al..8 U/g) e foi considerada como 100%. como as de Pseudomonas aeroginosa (70°C) (Karadzic et al.2: Efeito de temperaturas superiores a 45°C sobre a atividade lipásica em pH na faixa de 4. 1999. as lipases presentes no extrato bruto produzido por FES apresentam características de termofilicidade. Uma exceção é o fungo Penicillium aurantiogriseum. Embora algumas lipases produzidas por bactérias e leveduras apresentem atividades máximas em temperaturas bastante elevadas. Os fungos do gênero Penicillum. 2006) e as da levedura Kurtzmanomyces sp. (75oC) (Kakugawa et al. 2006).0 pH 5. 1999.. As lipases presentes no extrato bruto produzidas por FES apresentaram atividade lipásica máxima em temperatura consideravelmente superior (50°C) à temperatura ótima de atuação da lipase purificada de outra cepa de P.0 pH 6.. 1993). Portanto..0 a 50°C (75. que são microrganismos mesofílicos. as da bactéria termofílica Bacillus sp. Stöcklein et al...0 (Lima et al. Costa e Peralta.. 2004. apenas poucas lipases fúngicas descritas na literatura apresentam características termofílicas. simplicissimum produzida por FS (37°C) (Sztaje et al.0 a 6. quando comparada com a lipase produzida por FS. 1992). (60-70oC) (Nawani e Kaur.0.120 100 Atividade relativa (%) 80 60 40 20 0 40 45 50 55 60 Temperatura (ºC) 65 70 75 pH 4. que produz uma lipase termofílica com ótimo de atuação a 60°C e pH 8. 2004). Jesus et al.0 Figura 6.

A meia vida (t1/2) das lipases foi de 5. 65 .0. Essa alta estabilidade de estocagem das enzimas solúveis é uma característica importante. Observou-se que as lipases de P. respectivamente.1. a estabilidade foi maior em pH 5. Em temperaturas mais brandas (30°C). simplicissimum estocada a -20°C em pH 7. Foi observada.6.0.3).. que possui pH ótimo de atuação e maior estabilidade em pH 8.28 h (17 min) a 50°C em pH 5. A meia vida (t1/2) das lipases no extrato bruto foi determinada através da medida da atividade residual ao longo do tempo a 50°C em pH 5. uma diminuição de 18 vezes no tempo de meia vida quando o pH passou de 5. A elevada estabilidade das lipases de P.5). Um comportamento similar também foi observado para lipases de Penicillium restrictum produzidas por FS (Jesus et al. sendo maior que a atividade inicial mesmo depois de 3 meses de incubação (Figura 6..0-7.0 e 7. mantendo aproximadamente 90% e 65% da atividade inicial após incubação por uma hora. a atividade lipásica residual foi medida pelo método espectrofotométrico utilizando o p-nitrofenil laurato como substrato.8.4.2.0 e 5..0 e 5. simplicissimum em diferentes temperaturas e níveis de pH Para determinação da estabilidade da enzima. 2003).0 a queda foi observada em temperaturas superiores a 40°C.0 e 7. Observou-se que a estabilidade da enzima foi fortemente afetada pelo pH. 2007). 1999). simplicissimum apresentam maior estabilidade nas condições ótimas de atuação.0 e 7. 2003). respectivamente. após uma hora de incubação do extrato bruto produzido por FES a temperaturas de 30-70°C e valores de pH de 4. enquanto em pH 4. a estabilidade das lipases presentes no extrato bruto produzido por FES é maior em pH 4.0 e a maior atividade obtida em pH 4. descrita no item 5.2.4).3.0 e 6.0 e 6.0 conferem uma característica ácida a estas enzimas. A atividade residual da lipase de P.0. simplicissimum em pH 5.02 h (301 min) e 0.0 foi medida ao longo do tempo.0.0.0 (Figura 6. e para a lipase de Aspergillus carneus (Saxena et al.0 para 7. As lipases de Penicillium simplicissimum imobilizadas em suportes com diferentes graus de hidrofobicidade também apresentaram este comportamento (Cunha. portanto.0 (Figura 6. A 50°C. principalmente para etapas de embalagem e comercialização. Uma queda brusca na atividade lipásica foi observada em temperaturas superiores a 50°C em pH 5. Os dados experimentais de atividade residual foram ajustados ao modelo mostrado na Equação 5.0. Estabilidade das lipases de P. Esse comportamento também foi observado para a lipase de Pseudomonas mendocina PK12CS (Jinwal et al.

1992) e meia vida 7 vezes maior que a obtida por uma lipase Rhizopus homothallicus. aurantiogriseum.4 U/g (30oC e pH 5.3: Estabilidade das lipases presentes no extrato bruto após uma hora de incubação em diferentes temperaturas e valores de pH. A termoestabilidade das lipases de P. possui baixa estabilidade em temperaturas superiores a 28°C. a lipase de P. simplicissimum produzida por FES apresentou uma meia vida a 50°C 20 vezes maior que a obtida pela lipase de outra cepa da mesma espécie fúngica produzida por FS (estável a 50°C por 15 min) (Sztajer et al.0 pH 6.120 Atividade residual relativa (%) pH 4.0 100 80 60 40 20 0 20 30 40 50 Temperatura (° C) 60 70 pH 7. apesar de apresentar atividade máxima a 60°C. simplicissimum é similar à descrita para a lipase da archea halofílica Natronococcus sp. ainda. apresentando atividade residual de 32% após incubação a 50°C por 30 minutos (Lima et al. um fungo termotolerante. A maioria das lipase produzidas por fungos mesofílicos descritas na literatura possui baixa estabilidade térmica.. produzida por FES (tempo de meia vida de 43. sendo a atividade inicial de 57. 2006). A lipase de P.0 80 Figura 6.. superior à apresentada pela lipase do fungo P. Apesar disso.. wortmanii. simplicissimum é. sendo instáveis em temperaturas superiores a 40°C.. descrita como uma enzima moderadamente termoestável.. A atividade lipásica residual foi determinada pelo método espectrofotométrico.0 pH 5. que apresenta 55% da atividade inicial após 1 h de incubação a 50oC (Stöcklein et al. 2004). 1993). que apresenta mais de 90% da atividade 66 .2 min) (Mateos Diaz et al. A termoestabilidade das lipases de P.0) considerada como 100%.

(a) Atividade residual relativa (%) 140 120 100 80 60 40 20 0 0 100 200 300 400 y = 112. como por exemplo.28e R2 = 0.. 2006).9087 -0.0 (b).inicial após incubação a 50°C por uma hora (Boutaiba et al.4: Atividade lipásica residual em função do tempo de incubação a 50°C em pH 5. a lipase de Bacillus sp que apresentou meia vida de 170 h a 60°C e 50% da atividade inicial após 45 minutos a 70°C (Nawani e Kaur.932e R2 = 0.0 (a) e 7. Características de termoestabilidade mais elevadas foram descritas para lipases de diferentes bactérias.0023x 500 600 700 Tempo de incubação (min) (b) Atividade residual relativa (%) 120 y = 87. 2006).0412x 100 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Tempo de imcubação (min) Figura 6.9581 -0. 67 .

A diferença nas propriedades catalíticas entre enzimas produzidas por FES e FS vem sendo descrita na literatura por alguns autores. sendo a atividade inicial de 49. como maior termoestabilidade e temperatura ótima de atuação mais alta.25% (m/m) de melaço como meio de cultivo em função do tempo de estocagem a -20°C em pH 7. (2006) demonstraram que a mesma lipase purificada produzida por FES e FS apresentou diferenças na temperatura ótima de atuação. Com base nestes resultados. Além disso.5: Atividade lipásica residual do extrato bruto produzido por FES utilizando torta de babaçu suplementada com 6. conferindo maior temperatura de atuação e maior termoestabilidade quando comparado com a lipase produzida em FS e purificada por Sztaje et al. pode-se dizer que as lipases de P.250 Atividade relativa residual (%) 200 150 100 50 0 0 20 40 60 80 100 Tempo de estocagem (dias) Figura 6.. As lipases de Penicillium simplicissimum produzidas por FES não foram purificadas e a presença de compostos do extrato bruto oriundos do meio de cultivo ou produzidos pelo próprio fungo poderia estar causando um efeito de proteção da enzima. simplicissimum presentes no extrato bruto produzidas por FES apresentaram propriedades catalíticas mais interessantes que a lipase produzida por FS por outra cepa da mesma espécie (Sztaje et al. Acuña-Arguelles et al. na termoestabilidade e na especificidade. A atividade lipásica residual foi determinada pelo método espectrofotométrico. (1992). porém os autores sugerem que esse comportamento pode estar relacionado à associação à enzima de compostos não protéicos do meio de cultivo ou adquiridos no processo de purificação.0. (1995) e Mateos Diaz et al. 1992).0 U/g considerada como 100%. as cepas podem produzir mais de uma lipase com 68 .

As lipases também podem hidrolisar uma variedade de compostos que contêm ésteres e não apenas acilgliceróis (Jaeger et al. 1999). visto que este fungo foi isolado de um rejeito rico em óleo de babaçu que contém 45% de ácido láurico em sua composição. Baseado nesta característica. 1999).características distintas e a expressão de cada uma pode depender do meio de cultivo empregado ou do tipo de fermentação. Observou-se. A especificidade das lipases de P. demonstrando que estas lipases apresentam especificidade por substratos contendo ácidos graxos de cadeia média. Desta forma. A purificação das lipases de P. servindo como um indutor. também isolado deste rejeito (Jesus et al. Esse comportamento também foi observado para o fungo P.1.5). 69 . As lipases de P. podendo-se desta forma classificar estas enzimas como lipases (Jaeger et al.3. 6... a elevada produtividade lipásica obtida em FES em torta de babaçu pode estar relacionada à maior especificidade destas lipases por substratos com ácidos graxos de cadeia média e com a presença de óleo de babaçu na composição da torta empregada. que as lipases de P. o método espectrofotométrico utilizando pnitrofenil ésteres como substrato tem sido amplamente empregado para a determinação de atividade lipásica. 1999). pelo método titulométrico. apresentando maior atividade quando foi utilizado o pnitrofenil laurato (C12:0). restrictum. apresentando maior atividade quando se utilizou a tricaprilina (C10:0) como substrato (Tabela 6. simplicissimum apresentaram baixa atividade em substratos contendo ácidos graxos de cadeia curta (C4:0). simplicissimum produzidas por FES e FS empregando o mesmo meio de cultivo e o posterior estudo das propriedades catalíticas de cada uma devem ser realizados para elucidar esta questão. também. simplicissimum por substratos com ácidos graxos de cadeia média foi um resultado esperado. simplicissimum foram capazes de hidrolisar todos os triglicerídeos testados. simplicissimum As lipases de P. simplicissimum também hidrolisaram todos os pnitrofenil ésteres testados. Especificidade das lipases de P.. demonstrando tratar-se de lipases verdadeiras.

Substrato p-nitrofenil ésteres Butirato (C4:0) Caprilato (C8:0) Laurato (C12:0) Palmitato (C16:0) Triglicerídeos Tributirina (C4:0) Tricaprina (C8:0) Tricaprilina (C10:0) Tripalmitina (C16:0) Tristearina (C18:0) Óleo de oliva 46 183 192 85 16 100 13 113 156 100 Atividade relativa (%) 6. tendo com referência o valor de atividade obtido com o substrato p-nitrofenil-palmitato (29. simplicissimum.6 apresenta o perfil de produção de lipase. A Figura 6. simplicissimum. simplicissimum em fermentação submersa e no estado sólido 6. simplicissimum em FS Diferentes meios de cultivo (meio semi-sintético e meios contendo torta de babaçu sem suplementação ou suplementada com fontes de carbono complexas ou de fácil assimilação) foram utilizados para produção de lipase por FS.Tabela 6. Produção de lipase e fisiologia do fungo P. simplicissimum foi capaz de crescer e produzir lipase em todos os meios de cultivo para FS utilizados.2. apresentando produção de lipase associada ao crescimento. Comparação de características fisiológicas.8 U/g) pelo método titulométrico. Freire (1996) selecionou meios de cultivo semi-sintéticos de diferentes composições para a produção de lipases para diversas cepas de fungos filamentosos.2.1. O fungo P. sendo empregado neste trabalho o que havia se mostrado mais promissor para a produção desta enzima pelo fungo P. de pH e de crescimento (estimado pela medida do conteúdo de N-acetilglicosamina) durante a 70 . morfológicas e produtivas do fungo P.5: Especificidade por substrato das lipases de P.4 U/g) pelo método espectrofotométrico e o óleo de oliva (70.

25 0. Foi obtida uma produção máxima de 3. em pH próximo de 8.fermentação do fungo P.15 0.3 U/mL em 120 h de fermentação. O pico máximo de produção ocorreu no início da fase estacionária de crescimento. 1% de glicose e 0.4 0.05 0 Tempo de fermentação (h) Figura 6. Observa-se que as maiores atividades lipásicas foram obtidas em menores tempos de fermentação no meio semi-sintético e na torta de babaçu sem suplementação.10).1 0. extrato de levedura. Nos meios contendo babaçu suplementado com 1% de melaço. 1.2 4 3 2 1 0 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 0.4 U/mL) no final da fase exponencial de crescimento. utilizando um meio de cultivo semi-sintético contendo peptona. simplicissimum. sais minerais e trioleína como indutor em tampão fosfato com relação C:N 7:1. 9 8 lipase pH N-acetilglicosamina 0.3 0.6: Perfil de produção de lipase e de crescimento do fungo Penicillium simplicissimum em FS em meio de cultivo semi-sintético.0 (Figura 6.8 a 6. 2.7). a atividade lipásica máxima (aproximadamente 2.8 U/mL) foi obtida entre 96 e 144 h de fermentação.3% de óleo de oliva.3 U/mL) foram obtidas em 168 h de fermentação em pH também próximo de 8. atividades lipásicas máximas (1. O valor máximo de atividade lipásica em FS em todos os meios estudados foi obtido durante a fase estacionária do crescimento do fungo. simplicissimum no meio semi-sintético. Observou-se que o pH do meio manteve-se constante durante toda a fermentação devido provavelmente à ação dos sais tamponantes presentes no meio de cultivo. As concentrações de N-acetilglicosamina obtidas em torta de babaçu sem a adição de 71 . (1992).0 (Figuras 6.3. No meio de cultivo contendo 2.35 N-acetilglicosamina (mg/mL) Atividade lipásica (U/mL) pH 7 6 5 0.4.5% de torta de babaçu. utilizando outra cepa de P. Sztajer et al. obtiveram atividade lipásica máxima (2.

3 0.5%).25 0.8: Perfil de produção de lipase e de crescimento do fungo P.15 0.2 N-acetilglicosamina (mg/mL) Atividade lipásica (U/mL) pH 7 6 5 4 3 2 1 0 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 0. 9 8 Atividade lipásica pH N-acetilglicosamina 0.1 0. simplicissimum em FS em meio de cultivo contendo torta de babaçu suplementada com 1% de melaço.05 0 Tempo de fermentação (h) Figura 6. Além disso.35 0. a enzima foi produzida sem a adição de indutores exógenos.05 0 Tempo de fermentação (h) Figura 6.35 N-acetilglicosamina (mg/mL) Atividade lipásica (U/mL) pH 7 6 5 0.15 3 2 1 0 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 0. indicando que este rejeito possui os nutrientes necessários para o crescimento do fungo. 72 .7: Perfil de produção de lipase e de crescimento do fungo Penicillium simplicissimum em FS em meio de cultivo contendo torta de babaçu sem suplementação.4 0.3 0.2 4 0. 9 8 Atividade lipásica pH N-acetilglicosamina 0.suplementos foram comparáveis às obtidas com o meio semi-sintético.4 0.1 0.25 0. provavelmente devido ao efeito de indução promovido pelo óleo de babaçu residual já presente no rejeito utilizado como meio (4.

3 0.05 0 Tempo de fermentação (h) Figura 6. assim como outros óleos vegetais. O óleo de oliva. 2006). Lima et al. 2003.1 0. 9 8 Atividade lipásica pH N-acetilglicosamina 0.9: Perfil de produção de lipase e de crescimento do fungo Penicillium simplicissimum em FS em meio de cultivo contendo torta de babaçu suplementada com 1% de glicose. D’Annidale et al..1 0. tem sido frequentemente descrito como indutor da produção de lipase em FS (Costa e Peralta.2 4 3 2 1 0 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 0.4 0.10: Perfil de produção de lipase e de crescimento do fungo Penicillium simplicissimum em FS em meio de cultivo contendo torta de babaçu suplementada com 0. Tan et al. No meio contendo torta de babaçu suplementada com óleo de oliva. 2004..35 N-acetilglicosamina (mg/mL) Atividade lipasica (U/mL) pH 7 6 5 0. 1999.9 8 Atividade lipasica pH N-acetilglicosamina 0.3% de óleo de oliva.4 0.25 0.2 4 3 2 1 0 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 0.35 N-acetilglicosamina (mg/mL) Atividade lipásica (U/mL) pH 7 6 5 0. observou-se maior produção de lipase em 48 h de 73 ..25 0.15 0.3 0.05 0 Tempo de fermentação (h) Figura 6.15 0.

são adicionadas ao meio de cultivo como fonte de carbono (Azeredo et al. 2000). simplicissimum por FS foi observada em apenas 50 h de fermentação (Sztajer et al. (1992). quando comparada ao meio contendo torta de babaçu não suplementada. Estes autores relataram que maiores atividades lipásicas foram obtidas em relações C:N entre 2. uma diminuição acentuada no pH em 48 h de fermentação. não apresentando efeito de redução na atividade pela presença de açúcares facilmente assimiláveis. Burkert et al. Provavelmente a produção de lipase por esse fungo só se inicia após o consumo total dos açúcares facilmente assimiláveis do meio. o óleo de oliva. No entanto. 2003.. como a glicose. diversos estudos relataram a redução da produção de lipases quando fontes de carbono facilmente assimiláveis. Estudos relataram que a produção de lipase pelos fungos 74 .. Em FS. com exceção do babaçu suplementado com glicose. comparado com o babaçu não suplementado. O meio sintético. respectivamente..2:1) quando comparada com o meio não suplementado. 2007. 2004). pois foram empregadas cepas. Na produção de lipase pelo fungo P. em meio semi-sintético sem a presença de glicose a produção de lipase de P. para fungos. 2003). Para os meios contendo babaçu. observa-se que até 96 e 120 h de fermentação. a atividade lipásica máxima é 2 vezes menor. concentrações elevadas de nitrogênio no meio (C:N baixas) podem favorecer a produção de lipase em relação a outras enzimas (Lima et al.5 e 5 para produção de lipase de Penicillium aurantiogriseum. nos meios contendo babaçu suplementado com glicose e melaço.. 1997). a antecipação do pico de produção não pode ser somente atribuída à ausência de glicose na composição do meio de cultivo utilizado por Sztajer et al. Observou-se também. No entanto. meio de cultivo e relação C:N distintos. nestes dois meios. onde a concentração máxima foi 2 vezes maior. apresentou maior atividade lipásica quando comparado com os outros meios empregados. Este efeito pode estar relacionado com a alta relação C:N deste meio de cultivo (15.. simplicissimum em meio contendo torta de babaçu suplementada com melaço e glicose. No entanto. Além disso. 1992). reduzida ou nenhuma atividade lipásica é observada.fermentação. a concentração máxima de N-acetilglicosamina foi semelhante. visto que. indicando um efeito de indução. observando-se produção da enzima apenas quando a glicose é totalmente consumida (Dalmau et al. apesar de conter 1% de glicose. devido provavelmente à presença do indutor. Freire et al. devido provavelmente ao rápido consumo destes açúcares e à formação de ácidos orgânicos (Galvano e Forchiassin.. observa-se que a atividade lipásica máxima é menor e é alcançada em tempos mais tardios da fermentação no meio contendo babaçu e óleo de oliva.

A maior perda de umidade ao longo da fermentação foi observada no meio suplementado com óleo de oliva. o aumento do pH durante a fermentação mostrou-se relacionado à diminuição da produção de lipase de P. O meio em que o fungo apresentou maior conteúdo de N-acetilglicosamina e maior atividade lipásica foi aquele contendo babaçu e óleo de oliva.. 6. restrictum em torta de babaçu (Palma et al. simplicissimum em FES O fungo P.12 e 6. simplicissimum foi capaz de crescer e produzir lipase em todos os meios de cultivo para FES utilizados neste trabalho. onde houve maior crescimento do fungo. ocorreu um atraso do pico para 96 h.13).2 U/g foi obtida (Figura 6. Esse comportamento também foi observado para produção de lipase por este fungo em rejeito de mamona em diferentes condições de cultivo (Godoy. 2003). No meio contendo babaçu suplementado com melaço ou glicose. Considerando o teor de umidade ao final de fermentação. apresentam apenas 50% da atividade inicial quando 75 .. Produção de lipase e fisiologia do fungo P.5 U/g. pH. o pico de atividade lipásica foi obtido em valores de pH mais altos. teor de umidade da torta e crescimento (estimado pela medida do conteúdo de N-acetilglicosamina) durante a fermentação pelo fungo P. 34. apresentaram fortes efeitos de repressão por glicose (Sztajer et al.2. e os autores avaliaram que este efeito estaria relacionado à baixa estabilidade da enzima em ambientes alcalinos..3 U/g de massa seca inicial. No entanto. simplicissimum produzidas em torta de babaçu. em torta de soja. 1997). 27 e 37% nos meios sem suplementação ou suplementados com melaço.14).2. 2000). enquanto para todos os demais meios de cultivo o pico máximo de produção foi obtido em 72 h de fermentação. Na torta de babaçu suplementada com glicose. houve queda de 22. respectivamente (Figuras 6. apresentando atividade máxima de 77. simplicissimum em torta de babaçu sem suplementação.P. 1989. para todos os meios de cultivo.11 apresenta o perfil de produção de lipase. uma atividade máxima de 102. O mesmo foi observado para a produção de lipase de P. Freire et al. No meio suplementado com óleo de oliva. glicose ou óleo de oliva. o fungo produziu atividades lipásicas máximas de 58. Observou-se também que.9 U/g e 70.. respectivamente. 2006). citrinum.. A Figura 6. simplicissimum (DiLuccio et al. provavelmente com maior geração de calor e maior perda de umidade por evaporação (Bellon-Maurel et al. presentes no extrato bruto. restrictum e P. mesmo em meios de cultivo contendo um indutor. 2004). As lipases de P.

76 .25% (m/m. 120 lipase umidade pH glicosamina 3 100 2.0 0.3 0.5 N-acetilglicosamina (mg/g) Atividade lipásica (U/g) Umidade (%) pH 80 2 60 1. 120 lipase umidade pH glicosamina 3 100 2.5 0 0 24 48 72 96 120 0 Tempo de fermentação (h) Figura 6.5 40 1 20 5. provavelmente.5 0 0 24 48 72 96 120 0 Tempo de fermentação (h) Figura 6.11: Perfil de produção de lipase pelo fungo Penicillium simplicissimum em FES em torta de babaçu sem suplementação.7 7. aumentar ainda mais o nível de atividade lipásica obtida. Portanto.3 7.6 6.0 7.2 5. apesar do pico de produção da enzima ocorrer em pH elevado.5 40 1 20 5.12: Perfil de produção de lipase pelo fungo P.5 N-acetilglicosamina (mg/g) Atividade lipásica (U/g) Umidade (%) pH 80 2 60 1.2 6.2 5.incubadas a 30 e 40°C por 1 h em pH 7.7 7. base seca) de melaço. o desenvolvimento de sistemas de fermentação que permitissem o controle do pH em FES poderiam. pode ocorrer simultaneamente uma perda da atividade. simplicissimum em FES em torta de babaçu suplementada com 6.0.3 8. indicando que.5 7.

5 0 0 24 48 72 96 120 0 Tempo de fermentação (h) Figura 6.2 6. 120 ativ lipásica umidade pH glicosamina 3 100 2.5 6.4 0.6 6.14: Perfil de produção de lipase pelo fungo P.5 N-acetilglicosamina (mg/g) Atividade lipásica (U/g) Umidade (%) pH 80 2 60 1.25% (m/m.5 6.1 6. simplicissimum em FES em torta de babaçu suplementada com 6.2 6.5 40 1 20 5.5 40 1 20 5.25% (m/m.3 5.1 6.13: Perfil de produção de lipase pelo fungo P. simplicissimum foi capaz de crescer e produzir lipase na torta de babaçu sem suplementação (C:N 12.2 5. simplicissimum em FES em torta de babaçu suplementada com 6.120 lipase umidade pH glicosamina 3 100 2. base seca) de glicose.0 0. mostrando que este rejeito possui os nutrientes 77 .5 0 0 24 48 72 96 120 0 Tempo de fermentação (h) Figura 6. O fungo P.5 N-acetilglicosamina (mg/g) Atividade lipásica (U/g) Umidade (%) pH 80 2 60 1.6 6.3:1). base seca) de óleo de oliva.

foi capaz de promover a antecipação do pico de produção (DiLuccio et al. 2002). porém.. mantendo a atividade constante (DiLuccio et al. 2004).3 vezes na atividade máxima da enzima quando comparada com a torta de babaçu sem suplementação. 2000). Maiores atividades lipásicas foram obtidas utilizando a torta de babaçu suplementada com óleo de oliva (C:N 13. Estas variações parecem estar mais relacionas ao tipo da fonte de carbono adicional do que à relação C:N do meio. Observou-se que a adição à torta de babaçu de pequenas concentrações de fontes ricas em carbono.. promovendo. Em diferentes tortas. No entanto. Esse efeito observado na torta suplementada com óleo de oliva pode estar relacionado com uma menor produção de proteases ou com o aumento da taxa de produção de lipase pelo fungo na presença do óleo de oliva. provocou variações significativas na atividade lipásica máxima. A adição de óleos também causou um aumento na produção de lipase de Penicillium restrictum em torta de babaçu (Gombert et al.3 vezes menor em comparação ao babaçu não suplementado. a produção de lipase de Rhizopus homothallicus em FES não é afetada pela adição de glicose em meios contendo óleo em sua composição (Rodriguez et al. restrictum (Gombert et al. Apenas no meio contendo babaçu e óleo de oliva. sendo compensada pela taxa de degradação de proteases. Palma et al.. Comportamento semelhante foi observado para produção de lipase de P. Para a produção de lipase de P.9:1). observando-se para os outros meios uma queda brusca da atividade lipásica após o pico de produção.. 1993a)... 1999) e de Candida rugosa em farelo de arroz (Rao et al. não se observa atraso na produção da enzima. Este rejeito também permitiu o crescimento e produção de lipase de P. 2004). No entanto.. simplicissimum em torta de soja. obtendo-se atividades semelhantes até 48 h de fermentação. a produção de lipase manteve-se constante após o pico de produção. causando pequenas variações na relação C:N. restrictum sem adição de nutrientes (Palma et al. em torta de babaçu suplementada com glicose observou-se um atraso no pico de produção e baixas atividades lipásicas foram obtidas em 48 e 72 h de fermentação quando comparado às atividades em torta de babaçu sem adição de suplemento. 1999. a adição de óleo de oliva. um aumento de 1. 2000). apesar da atividade máxima obtida ser 1. No meio contendo babaçu e melaço. A adição de óleo de oliva à torta de babaçu não alterou a produção de lipase até 48 h de fermentação. para a produção de lipase de 78 .. 2006).. Em contraste com estes resultados. além de aumentar a produção. a adição de óleos mostrou-se essencial para a produção de lipase de Aspergillus niger (Mahadik et al.necessários a este fungo.

1. visto que os fungos pertencentes a esse gênero em fermentação submersa produzem esporos em quantidade reduzida (Roncal e Ugalde..Meio semi-sintético O fungo P.3. A ausência de esporulação foi um resultado esperado. Porém uma relação direta entre a morfologia e a produtividade ainda não foi descrita (Grimm et al. e a formação de pellets foi relacionada a um aumento de produtividade (Liao et al. 2005.. o fungo cresceu formando massa micelial sem formação de estrutura de reprodução e sem produção de esporos. Em fermentação submersa.2.3.2. cresceu formando massa micelial entrelaçada. a relação C:N mostrou-se um fator importante. simplicissimum em FS 6. Para a produção de ácidos orgânicos por Rhizopus oryzae. observando-se formação de pellets livres e micélios aderidos ao 79 . muitos trabalhos exploraram a relação entre a morfologia e a produtividade de fungos filamentosos mostrando que algumas formas morfológicas características são requeridas para se alcançar maiores produtividades de um determinado produto. conhecida como pellets.. 6. tendo-se observado a formação de micélios livres.2. não se observou a formação de pellets quando o fungo P.2. Durante toda a fermentação.3. 2004). Vrije et al. a variação da composição do meio de cultivo levou a diferentes morfologias do fungo. Kossen. O emprego de substratos sólidos e complexos em fermentação submersa pode influenciar a morfologia e a cinética de crescimento de fungos filamentosos. flocos e micélios aderidos à superfície dos grânulos de babaçu (Figura 6.. passando de micélios dispersos a massas miceliais densas (Papagianni. Em FS.17). 2000).16. 6. os fungos filamentosos podem exibir formas morfológicas distintas. simplicissimum cresceu em FS..15) apresentaram diâmetro aproximado de 3 mm.Torta de babaçu em suspensão Utilizando babaçu em suspensão como meio de cultivo. Como pode ser observado na Figura 6. simplicissimum em FS. Morfologia do fungo P.Candida rugosa por FES. 2001) ou mesmo nula no caso de alguns fungos filamentosos (Gibbs et al. a morfologia do fungo não sofreu alteração ao longo da fermentação e as hifas apresentaram o mesmo padrão de organização. 2007). 2003. utilizando o meio semi-sintético. obtendo-se maiores atividades em relações C:N menores e maior biomassa em relações C:N maiores (Rao et al. Os pellets observados em 48 h de fermentação (Figura 6. 1993b). 2000).

ao contato com a superfície sólida. os esporos já haviam sido liberados para o meio de cultivo. Observou-se. 2004). Além disso. utilizando a torta de babaçu como meio de cultivo para FS. visto que a torta de babaçu é uma matéria-prima complexa. simplicissimum foi observado para produção de fitase por Aspergillus niger em FS utilizando farelo de trigo no meio de cultivo. estão apresentados os diferentes fragmentos da amêndoa encontrados na torta de babaçu in natura. Na Figura 6. (1998) observaram que a presença de sólidos no meio líquido induz a formação de pellets. A partir de 72 h de fermentação. A relação entre morfologia e produtividade é um assunto difícil de ser estudado devido à influência de vários fatores que afetam os sistemas fermentativos. dependendo da morfologia que o microrganismo apresenta. Comportamento similar ao obtido com P. Na Figura 6. Observou-se que. simplicissimum cultivado em torta de babaçu em suspensão ao longo da fermentação submersa..18. visto que a secreção de proteínas ocorre principalmente nos ápices (Wang et al. observa-se que o substrato não é todo consumido durante a fermentação (Papagianni.8). 2003). no início da fase exponencial de crescimento (Figura 6.. observa-se a morfologia do fungo P. ou à limitação de nutrientes (carbono ou nitrogênio) (Roncal e Ugalde. Em 48 h. desta forma. 2005). Ao contrário do que foi observado para o crescimento de P.substrato. Além disso. neste estágio do crescimento. neste trabalho. O farelo induziu a formação de micélios dispersos sem formação de pellets e. ainda não havia ocorrido a formação de estruturas de reprodução e produção de esporos. simplicissimum em grão de babaçu. Schugerl et al. onde a assimilação de nutrientes é dificultada. alterações drásticas na morfologia do fungo P. Essa indução pode estar relacionada à presença de substâncias indutoras na torta de babaçu. Em FS a relação entre morfologia e produtividade pode estar vinculada às mudanças nas propriedades físico-químicas do meio no fermentador. observou-se a presença de flocos maiores de micélios. além disso. o fungo cresceu formando estruturas reprodutivas e produzindo esporos. ou mesmo pelo número de ápices formados nos micélios em um determinado tipo morfológico. o fungo cresceu aderido aos grãos de babaçu e formando flocos livres.19. 1999). que a torta de babaçu tem um efeito de indução da esporulação. simplicissimum em FS obtidas através da 80 . havendo poucos esporos livres. aumentou a produção de biomassa e a produção da enzima (Papagianni et al. Em 24 h de fermentação. observou-se a formação das estruturas de reprodução e o início da geração de esporos. No presente trabalho. Observou-se.

81 . No entanto. um substrato complexo e sólido. no perfil de produção da enzima e nos valores máximos de atividade (Figuras 6.7 e 6. as diferenças morfológicas observadas não resultaram em alterações significativas na cinética de crescimento.6).substituição do meio semi-sintético pela torta de babaçu.

simplicissimum em fermentação submersa em meio semi-sintético após 48 h de fermentação.Figura 6. (C) e (D) contraste interferencial diferencial de Nomarski 82 . micrografias de luz: (B) microscopia de campo escuro. (A) foto do meio cultivado.15: Morfologia do fungo P.

Figura 6. simplicissimum em fermentação submersa em meio semi-sintético após 24 (A. 83 . e 120 (G. 48 (D). 96 (F). C). 72 (E).H) horas de fermentação. B.16: Microscopia eletrônica de varredura do fungo P.

Figura 6. (A) foto do meio cultivado. simplicissimum em fermentação submersa em torta de babaçu suplementada com 1% (m/v) de melaço após 48 h de fermentação.17: Morfologia do fungo P. (C) e (D) microscopia de luz. (B). 84 .

Figura 6. D. E e F) microscopia eletrônica de varredura.18: Torta de babaçu: (A) microscopia de luz. C. (B. 85 .

72 (F). 48 (C. simplicissimum em fermentação submersa em torta de babaçu suplementada com 1% (m/v) de melaço após 24 (A e B). 120 (H) horas de fermentação. 96 (G).Figura 6.D e E). 86 .19: Microscopia eletrônica de varredura do fungo P.

apresentando diferentes formatos e porosidades. Gervais et al.4. observou-se a formação de um grande número de estruturas de reprodução e a geração de esporos ainda aderidos e estas estruturas. como observado na Figura 6. Esse foi um resultado esperado. principalmente. 2003) e os grãos de babaçu são bastante heterogêneos. 2003). observou-se grande quantidade de esporos dispersos e aderidos ao babaçu e às hifas. Em 72 h de fermentação. como baixa disponibilidade de nutrientes. o fungo cresceu apenas na superfície (Figura 6. 2003.21. Na Figura 6. provavelmente oriundos da parte interna da amêndoa prensada (Figura 6. 87 . os fungos filamentosos são capazes de produzir grandes quantidades de esporos (Gervais e Molin. Em 48 h. simplicissimum em FES Em FES. o fungo colonizou de forma efetiva os grânulos de babaçu.2. para serem aplicados como biopesticidas ou na indústria de alimentos (Hölker et al. 2003). na fase lag de crescimento (Figura 6.20 e 6. pois pode prejudicar a homogeneização dos sólidos em sistemas agitados em FES (Schutyser et al.18. Em FES. o fungo cresceu aderido aos grãos de babaçu e não se observou a formação de estruturas de reprodução e produção de esporos. observa-se a morfologia do fungo P.20). simplicissimum cresceu na superfície e no interior dos grãos mais porosos de babaçu.12). No entanto. simplicissimum em FES em torta de babaçu ao longo da fermentação.. A geração de grandes quantidades de esporos em FES está relacionada às condições ambientais características deste processo produtivo. 2004). Observou-se que o fungo cresceu formando uma rede densa de micélios e hifas aéreas. produzindo esporos (Figura 6. em grãos mais rígidos.22 A e B).. Morfologia do fungo P. provavelmente oriundos da casca da amêndoa. Em 24 h de fermentação. Por isto. este sistema produtivo é frequentemente empregado para a produção esporos fúngicos.. A aglomeração do substrato após o crescimento de fungos tem sido observada em FES e é um aspecto importante.21). crescendo na forma de hifas aéreas aderidas à superfície dos grãos. 2006. visto que em FES os fungos filamentosos crescem na superfície ou no interior dos sólidos em função. 2003). promovendo uma grande aglomeração das partículas sólidas (Figuras 6. da porosidade das partículas sólidas (Rahardjo et al.6.. presença de superfície e baixa quantidade de água. em cujo interior a oxigenação pode ser baixa. Gervais e Molin. características já descritas na literatura como estímulos indutores de esporulação (Roncal e Ulgalde.22 C e D). O fungo P.

.A penetração no substrato pelo microrganismo é um aspecto bastante importante em FES (Nopharatana et al. podendo ser tão rápido quanto o crescimento na superfície. uma maior produtividade. 88 . principalmente. conseqüentemente. A quantificação e avaliação de crescimento no interior dos grânulos têm sido realizadas através da medida de N-acetilglicosamina em diferentes fatias do grão ou utilizando microscopia confocal a laser (Nophratana et al. 2003) e depende.. da disponibilidade de oxigênio e nutrientes no interior do grão e da estrutura e propriedades físico-químicas do material sólido (Lens et al. se as condições forem favoráveis. Além disso. o crescimento do fungo no interior dos sólidos pode significar um maior aproveitamento do substrato e. 2004). além de ser um fator importante a ser considerado em modelos que se baseiam no balanço de massa e energia e descrevem o crescimento em FES.. 2003).

Figura 6.20: Morfologia do fungo P. simplicissimum em fermentação no estado sólido em torta de babaçu suplementada com 6,25% (m/m) de melaço em 48h de fermentação. (A) foto do meio cultivado; (B e C) foto tirada com o auxílio de lupa; (D) microscopia de luz.

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Figura 6.21: Microscopia eletrônica de varredura do fungo P. simplicissimum em fermentação no estado sólido em torta de babaçu suplementada com 6,25% (m/m) de melaço após 24 (A e B), 48 (C, E e G) e 72 (D, F e H) horas de fermentação.

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Figura 6.22: Crescimento do fungo P. simplicissimum na superfície e no interior de grãos de babaçu suplementado com 6,25% (m/m) de melaço após 72 h de fermentação. (A e B) Microscopia eletrônica de varredura de um grão rígido de babaçu fraturado; (C e D) Fotos tiradas de um grão poroso fraturado com o auxílio de lupa.

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o efeito regulatório causado pela adição de melaço e glicose não foi tão acentuado como observado em fermentação submersa em meios com a mesma composição. A redução do efeito regulação da produção por glicose em FES pode estar 92 .3 U/mL e 0.. em FES utilizando babaçu suplementado com melaço e glicose..3 vezes no Yp/x comparado à torta de babaçu sem suplementação (Tabela 6. em FES. Isso foi evidenciado pelas alterações no perfil de produção (Figuras 6. simplicissimum em FS e FES Em FS.h) ou suplementada com óleo de oliva (2. glicose ou melaço. Em FES.9) e pela redução do rendimento de produto por biomassa (Yp/x) em 1.2. Comparação da produção de lipase. ao meio basal (torta de babaçu) promoveu redução da produção da enzima.8 U/mL e 0. não ocorre o consumo rápido dos açúcares facilmente assimiláveis.6). foi observada também para a produção de lipase por Penicillium restrictum (Freire et al.4 U/g. Além disso. 1997 e Azeredo et al. uma redução de 1.01 U/mL.6. A redução ou total eliminação do efeito de regulação por glicose em FES.7 a 6.h.3 e 3. 2007).8 vezes sob suplementação com melaço e glicose. respectivamente. 2003).. nos meios suplementados com melaço e glicose. Observou-se. o fungo apresentou baixas atividades e produtividades lipásicas. A adição de fontes de carbono de fácil assimilação.6). 2007). da fisiologia e da morfologia do fungo P. havendo alterações no perfil de produção apenas para o meio contendo glicose (Figuras 6.3 U/mL e 0.03 U/mL. quando comparado ao meio líquido contendo torta de babaçu sem suplementação (Tabela 6.5. indicando que. Essa redução do efeito de regulação causado por açúcares de fácil assimilação em FES está provavelmente relacionada à baixa transferência de massa característica da FES e à conseqüente baixa disponibilidade dos nutrientes (Raghavarao et al.h) (Tabela 6. respectivamente). apresentando melhores resultados utilizando-se o meio semi-sintético (3. não se observou queda no pH durante a fermentação como observado em FS.03 U/mL.h) e a torta de babaçu sem suplementação (2.6). elevadas atividades e produtividades lipásicas foram obtidas..13).11 a 6. quando comparada à FS. apresentando valores máximos na torta de babaçu suplementada com óleo de oliva (101 U/g e 1. provavelmente devido ao efeito de regulação da produção por fontes de carbono de fácil assimilação (Azeredo et al. no primeiro sistema. Observa-se também que.

846 2..885 0. 2001).89 70.20 58.96 15. exopectinases (Díaz-Gódinez et al. alcançando no meio suplementado com óleo de oliva atividade específica e Yp/x máximos que foram 1. Tabela 6.. atividade específica e Yp/x máximos encontrados nos diferentes ensaios de fermentação submersa e fermentação no estado sólido.36 1.735 2.14 2.34 101.39 27.51 49.67 1. 2000). respectivamente.19 22.014 0.28 2.008 0.8 e 6. apresentou maior Yp/x e atividade específica em FES.006 0.406 0.86 Atividade específica (U/mg de proteína) Rendimento de lipase por glicosamina (U/mg de glicosamina) O fungo Penicillium simplicissimum.026 0.568 61.41 18.75 2. quando comparados aos cultivos submersos realizados com meio de cultivo de mesma composição.10 1. 2003). para todas as combinações de meios empregados.55 1.00 48.80 171.63 4. quando comparado à FS (Viniegra-González et al.00 3.diretamente ligado à maior produtividade neste sistema. e β-N- 93 .1 vezes maiores em FES..27 0.074 1.63 2. Maiores produtividades em FES também foram observadas para produção de invertase (RomeroGómez et al.740 1.6: Produtividade.029 0.857 4. Atividade Produtividade Sistema de lipásica máxima lipásica fermentação e meio (U/mL/h máxima (U/mL de cultivo ou U/g) ou U/g/h) FS meio semi-sintético babaçu babaçu + óleo de oliva babaçu + melaço babaçu + glicose FES Babaçu babaçu + óleo de oliva babaçu + melaço babaçu + glicose 77.27 1.

a maior produção de esporos e a maior produtividade lipásica obtidas em FES podem estar relacionadas à baixa disponibilidade de nutrientes e água ou a outros estímulos induzidos por este tipo de fermentação. Para avaliar a produção de esporos pelos dois sistemas.6 x 1010 esp/g de torta de babaçu) duas vezes superior à encontrada em FS (7. 2004) e os esporos apresentaram maior resistência (Vriji et al. 2001). Contudo. 1992).6 x 109 esp/g de torta de babaçu). maior produtividade é obtida em FES (Holker et al.23. mesmo em meios onde a esporulação em FS é induzida. 1995). Este fenômeno pode estar relacionado à maior hidrofobicidade encontrada em hifas e esporos produzidos por FES (Munoz et al. diferenças ultra-estruturais do fungo nos dois sistemas. Esta maior dispersão dos esporos produzidos em FS está provavelmente relacionada à maior homogeneidade característica deste sistema produtivo. Observou-se. No entanto..acetilhexosaminidase (Matsumoto et al. como esporulação e distribuição das hifas na presença do meio sólido. 2004). poderiam ser fatores adicionais importantes para a produção de lipase. utilizando meios de cultivo com a mesma composição. Observou-se. Diversos trabalhos vêm apontando que. foi observada por microscopia eletrônica de varredura uma maior quantidade de esporos em FS do que em FES (Matsumoto et al. uma concentração de esporos (1. em FES. utilizando a torta de babaçu como meio de cultivo. Observou-se também em FES maior adesão dos esporos às hifas e à torta de babaçu. 2004). em FES o fungo apresentou estruturas de reprodução mais conservadas e com maior número de fiálides do que em FS. além dos aspectos morfológicos estudados. Com estes resultados não foi possível identificar uma relação clara entre a morfologia do fungo nos dois sistemas e a maior produtividade em FES. como espessura de parede e vacuolização. quando comparadas com as produtividades obtidas em fermentação submersa.. No entanto... promovida pela agitação e pela presença de fase líquida com grandes volumes de água (Mitchell e Lonsane. provavelmente por se tratar de um sistema estático. 94 .. No presente trabalho. maior quantidade de esporos aderidos à torta de babaçu em FES do que em FS. Utilizando a torta de babaçu como meio de cultivo. na Figura 6. no caso de Verticillium lecanni. os esporos foram recuperados para a fase líquida e contados em câmara de Neubauer. não foram encontradas diferenças morfológicas significativas no crescimento do fungo em FES e FS.

Figura 6.25% (m/m. base seca) de melaço. (D) FS. (B) FES. em torta de babaçu sem suplementação. 72 h. 72 h. 72 h. 72 h. (C) FS. em torta de babaçu com 6. simplicissimum: (A) FES. em torta de babaçu com 1% (m/v) de melaço. 95 . em torta de babaçu sem suplementação.23: Micrografia eletrônica de varredura do crescimento e produção de esporos pelo fungo P.

Observou-se comportamentos semelhantes para as três concentrações (Figure 6. enquanto concentrações superiores não aumentam significativamente a atividade lipásica. são utilizadas como inóculo elevadas concentrações de esporos em suspensão. Desta forma. 6. 96 .4 U/g em 72 h com 106 esporos/g.1. respectivamente.0 e 35°C como condições reacionais. A atividade lipásica foi determinada pelo método titulométrico.3. (1998). utilizando óleo de oliva como substrato e pH 7. utilizando torta de gergelim como meio de cultivo. com atividade máxima de 20. Em FES empregando-se fungos filamentosos. obtendo como melhor concentração de esporos 1. observaram um comportamento similar. além de não anteciparem o pico máximo de produção. uma concentração de inóculo de 107 esporos/g parece ser a mais adequada.1 U/g em 48 h empregando-se 107 e 108 esporos/g.24). diminuição nos valores de atividade lipásica. avaliou-se o efeito de diferentes concentrações de esporos no perfil de produção de lipase em biorreatores do tipo bandeja. e atividade máxima de 16. Efeito da concentração e do tipo de inóculo na produção de lipase por fermentação no estado sólido O inóculo é um parâmetro muito importante.6. Desta forma. visto que sua concentração pode alterar o perfil de crescimento e produção e. a produtividade de um processo fermentativo.07x107 esporos/g. A obtenção destes em grandes quantidades para aplicação em larga escala torna-se difícil. consequentemente.3. estudando o efeito da concentração do inóculo na produção de lipase de Aspergillus niger em FES. o estudo e o emprego de estratégias alternativas de inóculo torna-se relevante para o escalonamento de processos de FES.2 e 21. estratégia convencionalmente utilizada em FES em escala de bancada. sem aumento na atividade lipásica máxima quando concentrações maiores de inóculo foram utilizadas. Efeito da concentração de esporos no perfil de produção de lipase Empregando-se suspensões de esporos como inóculo. visto que concentrações menores provocam atraso no pico de produção. Kamini et al.

respectivamente. Foi avaliado o efeito do pré-inoculo líquido em duas concentrações diferentes de biomassa crescidas por 24 h (60 e 120 mg de massa seca de fungo/10g de torta de babaçu. baixas atividades lipásicas máximas foram obtidas (Figura 6. Através desta estratégia. correspondendo a 0. simplicissimum por FES em biorreator do tipo bandeja. alcançando aproximadamente 11 U/g. apresentando atividade lipásica máxima 2 vezes menor do que a obtida com suspensão de esporos (107esporos/g).66 e 1. foi avaliado o emprego de um préinóculo líquido (fungo propagado por FS em meio de cultivo semi-sintético) com o objetivo de diminuir a demanda por esporos e possivelmente aumentar a produtividade.2. 6. Emprego de pré-inóculo líquido para a produção de lipase Como estratégia alternativa de inoculação.32 mg de N-acetilglicosamina.25 10^6 esporos/g 10^7 esporos/g 10^8 esporos/g Atividade lipásica (U/g) 20 15 10 5 0 0 24 48 Tempo de fermentação (h) 72 96 Figura 6. do que quando utilizado o inóculo convencional baseado em suspensão de esporos na concentração de 107 esporos/g. para as duas concentrações utilizadas.3. o pico de produção de lipase foi alcançado apenas em 72 h. Apesar de demandar uma concentração de esporos reduzida para gerar grandes quantidades de biomassa (60 e 120 mg de massa 97 . Para as duas concentrações utilizadas. respectivamente).25).24: Emprego de suspensão de esporos como inóculo: efeito da concentração de esporos no perfil de produção de lipase de P. Mesmo utilizando a maior concentração de pré-inóculo líquido. foram empregados 166 e 83 vezes menos esporos.

seca), o emprego de pré-inóculo líquido resultou em baixa atividade e produtividade lipásica devido ao atraso no pico de produção, não constituindo uma estratégia de inóculo adequada. Contrariamente ao obtido neste trabalho, esta estratégia apresentou bons resultados quando foi empregada para produção de biopesticidas (esporos) por FES (Deshpand, 1999). Para avaliar melhor a viabilidade do emprego desta estratégia para produção de lipase de P. simplicissimum por FES, tornar-se-ia necessária a realização de um estudo de viabilidade econômica.
14 12 Atividade lipásica (U/g) 10 8 6 4 2 0 0 24 48 72 Tempo de fermentação (h) 96
Pellets (conc. baixa) Pellets (conc. alta)

Figura 6.25: Efeito do emprego de pré-inóculo líquido (conc. baixa – 60 mg; conc. alta – 120 mg de massa seca de fungo) no perfil de produção de lipase por FES.

6.3.3. Emprego de pré-inóculo sólido para a produção de lipase
Foi avaliado, como outra estratégia alternativa de inoculação, o emprego de préinóculo sólido, utilizando inicialmente 20% de sólidos fermentados (2 g de torta de babaçu fermentada por 36 h, correspondendo a 0,88 mg de N-acetilglicosamina, em ensaio de FES com massa total de babaçu igual a 10 g). Com essa estratégia, foram empregados 5 vezes menos esporos, quando comparado ao inóculo convencional utilizando suspensão de esporos na concentração de 107 esporos/g. O emprego desta estratégia de inóculo permitiu antecipar o pico máximo de produção de lipase para 36 h, alcançando atividade máxima de 14,5 U/g (Figura 6.26). Foi possível, portanto, obter atividades lipásicas relativamente elevadas em tempos de

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fermentação menores, demandando uma concentração de esporos inicial 5 vezes menor do que nos ensaios com suspensão de esporos.
18 16 Atividade lipásica (U/g) 14 12 10 8 6 4 2 0 0 24 48 72 Tempo de fermentação (h) 96

Figura 6.26: Efeito do emprego de pré-inóculo sólido (20% m/m) no perfil de produção de lipase por FES.

6.3.4. Comparação das estratégias de inóculo empregadas
Mesmo utilizando uma concentração alta de pré-inóculo líquido, uma baixa produtividade lipásica máxima foi obtida (Tabela 6.7), alcançando aproximadamente 0,15 U/g.h. Este valor representa uma produtividade 2,8 vezes menor do que a obtida com suspensão de esporos (107 esporos/g). Por outro lado, utilizando pré-inóculo sólido, produtividades comparáveis (0,45 U/g.h) às alcançadas utilizando-se suspensão de esporos como inóculo foram obtidas. A quantidade de biomassa inoculada nas duas estratégias empregadas estimada pela determinação do conteúdo de N-acetilglicosamina demonstrou que o pré-inóculo líquido nas duas concentrações empregadas (0,66 e 1,32 mg de N-acetilglicosamina, respectivamente) contém quantidades comparáveis de biomassa fúngica às encontradas no pré-inóculo sólido (0,88 mg de N-acetilglicosamina). Desta forma, a baixa atividade lipásica obtida quando se utilizou pré-inóculo líquido não está relacionada à concentração de biomassa inoculada, mas sim provavelmente ao estado morfo-

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fisiológico das células. O meio utilizado para propagação do pré-inóculo líquido tem uma composição diferente da composição do meio de cultivo para FES (torta de babaçu suplementada com 6,25% de melaço), possuindo glicose como fonte de carbono e outros nutrientes de fácil assimilação. Além disso, as condições de cultivo utilizadas para propagação do fungo em meio líquido permitem maior homogeneidade do meio, maior transferência de massa e consequentemente maior disponibilidade dos nutrientes (Papagianni et al., 2001), sendo posteriormente necessário um tempo maior de adaptação do fungo às condições da FES, aumentando possivelmente a fase lag de crescimento e atrasando a produção da enzima. Tabela 6.7: Produtividades lipásicas obtidas utilizando diferentes estratégias de inóculo para produção de lipase por FES.

Inóculo 24 h
Esporos (10 esp/g) Esporos (107 esp/g) Esporos (108 esp/g)
6

Produtividade lipásica (U/g.h) 36 h
0,02 0,23 0,35 0,07 0,12

48 h
0,28

72 h
0,23 0,22 0,27 0,13 0,15 0,07

96 h
0,11 0,12 0,11 0,11 0,11 0,04

0,03 0,00 0,09 0,02 0,01

0,42 0,44
0,13 0,09 0,25

Pellets (60 mg) Pellets (120 mg)
Sólidos fermentados (20% m/m)

0,45

0,40

No caso do pré-inóculo sólido, pelo fato do fungo ser propagado no mesmo meio de cultivo empregado para FES (torta de babaçu suplementada com 6,25% de melaço), o mesmo já se encontra adaptado ao meio de cultivo e às condições de cultivo, permitindo possivelmente uma redução da fase lag e uma antecipação da produção de lipase. As diferenças no perfil de produção de lipase utilizando pré-inóculo líquido e sólido podem estar relacionadas à morfologia que o fungo apresenta quando propagado nos dois tipos de inóculo. Como apresentado nas Figuras 6.15 e 6.20, o fungo P.

simplicissimum apresenta morfologias bastante distintas em meio líquido semi-sintético
e em FES em torta de babaçu. No meio líquido, o crescimento ocorre formando massa micelial entrelaçada, conhecida como pellets, sem a formação de estruturas de reprodução e sem produção de esporos (Figura 6.16), enquanto em torta de babaçu em 100

permitindo uma rápida propagação do fungo. A Tabela 6. devido à propagação destes no meio coloidal. Os autores observaram um aumento de 65% na produção da enzima utilizando os micélios e sugeriram que este resultado está relacionado a uma maior adaptação dos micélios.. foi utilizado um planejamento estatístico de experimentos para determinar as melhores condições de pré-inóculo sólido (tempo de propagação e concentração do pré-inóculo) utilizado para produção de lipase. 36 e 48 h de fermentação. Matsumoto et al. 6. visto que foram empregados micélios que se encontravam na fase exponencial de crescimento. Na Tabela 6.9 mostra as condições experimentais e os valores de produtividade máxima e atividade lipásica em 24. tanto experimentais quanto preditos pelo modelo gerado. Estudo das condições de pré-inóculo sólido para a produção de lipase Devido aos resultados promissores obtidos com o emprego da estratégia de préinóculo sólido. visto que o estado fisiológico do microrganismo e a concentração do inóculo são fatores que podem afetar significativamente a fermentação e a geração de produtos de interesse (Soares et al.5. 101 . ou ao estado fisiológico das células. Foi empregado um planejamento fatorial 22 variando tempo de propagação do préinóculo (t) na faixa de 12 a 36 h e concentração do pré-inóculo (C) na faixa de 10 a 30% (m/m). 2005). além de uma concentração de esporos provavelmente superior à utilizada no inóculo com suspensão de esporos. visto que.8. Desta forma.FES o fungo cresce formando hifas aéreas e aderidas aos grãos de babaçu com grande geração de esporos (Figura 6. (2004) compararam o emprego de micélios pré-propagados em meio composto de quitina coloidal com esporos como inóculo para FES para produção de β-N-acetilhexosaminidase de Verticillium lecani. estão apresentados os valores reais e codificados das variáveis testadas.3.6 x 1010 esporos/g de torta de babaçu inicial. são gerados 1. após 72 h de fermentação.21). o pré-inóculo sólido consiste no inóculo de hifas previamente adaptadas ao meio e condições de cultivo de FES.

13).9 28. provavelmente devido à redução ou aumento da fase lag de crescimento em função de C.9: Valores de atividade lipásica (A) em 24.33 0.7 ePM 0.8 3. provavelmente devido aos diferentes estágios fisiológicos do fungo P.8 20.Tabela 6.4 5.0 0.46 0.63 0.8 20. resultando. A variável C apresentou efeito estatisticamente significativo apenas nos primeiros estágios da fermentação (atividade lipásica em 24 e 36 h).3 eA36h 5.1 18.10 a 6.45 A análise estatística permitiu estimar os efeitos das variáveis testadas e da interação entre elas.11). 102 .60 0.8 16.49 0. em perfis de produção em FES bem distintos.5 3.40 0.6 18.1 3.8 pPM 0. A variável t apresentou um efeito maior para todas as respostas (Tabelas 6.8 13.41 0.3 12.9 12.10 a 6.40 0.7 3.5 14.45 0.9 pA48h 13. 24 e 36 h).3 30.10 e 6.5 1.0 0. Ensaios 1 2 3 4 5 6 7 t -1 -1 1 1 0 0 0 C -1 1 -1 1 0 0 0 eA24h 0.0 23.7 24.3 17.30 0.9 12.3 0.3 2.6 19. 36 e 48 h de fermentação e produtividade máxima (PM) experimentais (e) e preditas pelo modelo (p) para as diferentes condições experimentais do planejamento fatorial 22.7 3.13).7 pA36h 6.0 22.6 eA48h 15. 36 e 48h e produtividade máxima (Tabelas 6.0 19. Variáveis t: Tempo de propagação do pré-inóculo (h) C: Concentração do pré-inóculo (% m/m) Valores codificados das variáveis -1 12 10 0 24 20 1 36 30 Tabela 6.45 0. alterando a produção nesta fase da fermentação (Tabelas 6. Os valores de t e de p foram utilizados para avaliar a significância dos efeitos das variáveis t e C sobre a atividade lipásica em 24.7 20.8: Valores reais e codificados das variáveis testadas (tempo de propagação do pré-inóculo e concentração do pré-inóculo).50 0.1 18. desta forma.8 20. simplissicinum nos tempos de propagação utilizados (12.7 11.0 22.0 1.0 12.43 pA24h 0.

17 Valor de p 0.19 -3.55 -0.38 0.Tabela 6.76 -1.0212 0.025 Teste t 7.025 0.35 1.39 -4.53 Erro padrão 1. Variáveis t C t*C Coeficiente 3.5).052 Erro padrão 0.098 -0.10: Efeito das variáveis tempo de propagação do pré-inóculo (t) e concentração do pré-inóculo (C) sobre a atividade lipásica em 24 h de fermentação.0163 0.8796 Tabela 6.13 Erro padrão 1.46 Teste t 12.17 Valor de p 0.12: Efeito das variáveis tempo de propagação do pré-inóculo (t) e concentração do pré-inóculo (C) sobre a atividade lipásica em 48 h de fermentação.53 2.0097 0.14 Teste t 5.14 1.35 Teste t 6.43 Valor de p 0.46 1.0826 0.0214 Tabela 6.46 1.14 1.04 -3.75 -1.0588 Tabela 6.0214 0.11: Efeito das variáveis tempo de propagação do pré-inóculo (t) e concentração do pré-inóculo (C) sobre a atividade lipásica em 36 h de fermentação. Variáveis t C t*C Coeficiente 4.017 -0. Variáveis t C t*C Coeficiente 0.0529 Assim.37 2.1). Variáveis t C t*C Coeficiente 8.13: Efeito das variáveis tempo de propagação do pré-inóculo (t) e concentração do pré-inóculo (C) sobre a produtividade lipásica máxima.26 0. 103 .2988 0.80 -2.3564 0.65 Erro padrão 1.35 1.0068 0.91 4. foi possível obter modelos empíricos para as respostas analisadas em função das variáveis t e C codificadas (Equações 6.78 -2.43 4.2 a 6.94 Valor de p 0.025 0. incluindo apenas os termos estatisticamente significativos (valor de p < 0.

5.3.14: Análise de variância (ANOVA) do planejamento fatorial 22 para atividade lipásica em 24 h de fermentação.8 3.96.3 = 5.A24 = 3.8 vezes maior que o valor crítico de F e os R2 foram 0.2.8 1. O erro puro para todas respostas foi consideravelmente baixo.2 1.86 + 8.78 t .92.3) (6.098 t .5) A análise de variância (ANOVA) foi realizada para avaliar a adequação dos modelos.8 Valor de F Coeficiente de determinação: R2 = 0.4) (6.39 104 . e 5. indicando um bom ajuste dos modelos.67 + 3.93.84.53 t.2 a 6. 2. Fonte de variação Soma quadrática Regressão Resíduo Falta de ajuste Erro puro Total 96.37 t + 2. C PM = 0. os modelos geraram atividades lipásicas preditas muito similares aos valores obtidos experimentalmente para todas as respostas analisadas (Tabela 6. mostrando os valores de atividade lipásica preditos em 24. Os modelo apresentados nas Equações 6. Estes modelos foram utilizados para a construção das superfícies de resposta. respectivamente (Tabelas 6.9 0. C A36 = 12. 0.5 apresentaram F calculados 4.2.2) (6. respectivamente) e de produtividade máxima (Figura 6. Além disso. 5.6 3.1.8 + 4.53 C + 2.9612.30) para cada condição de t e C dentro da faixa estudada. C onde: A24 = Atividade lipásica (U/g) em 24h de fermentação A36 = Atividade lipásica (U/g) em 36h de fermentação A48 = Atividade lipásica (U/g) em 48h de fermentação PM = Produtividade lipásica máxima (U/g.1 100.55 t .38 C A48 = 20. F0.052 t.9).3 0.27 a 6. 36 e 48h (Figuras 6.0.45 + 0. Tabela 6.14 a 6.5 Graus de liberdade 3 3 1 2 6 Média quadrática 32.17). 0.29.65 t.6.6. 0.h) t = Variável tempo de propagação do pré-inóculo codificada C = Variável concentração de pré-inóculo codificada (6.6 24. indicando uma boa reprodutibilidade dos experimentos.

15: Análise de variância (ANOVA) do planejamento fatorial 22 para atividade lipásica em 36 h de fermentação.9 8 1.3 Valor de F Coeficiente de determinação: R2 = 0.32 Tabela 6.004 0.025 0.1 - Valor de F 23. Fonte de variação Soma quadrática Regressão Resíduo Falta de ajuste Erro puro Total 330.8 11.4 = 4.0013 0. F0.1.3 6.16: Análise de variância (ANOVA) do planejamento fatorial 22 para atividade lipásica em 48 h de fermentação. Fonte de variação Soma quadrática Regressão Resíduo Falta de ajuste Erro puro Total 110.5 4.6 130.1.053 Graus de liberdade 2 4 2 2 6 Média quadrática 0.1.00065 25 Valor de F Coeficiente de determinação: R2 = 0.9 19.4 4.5 Graus de liberdade 2 4 2 2 6 Média quadrática 55.001 0.32 Tabela 6.4 = 4.0 3.6 27.9 - Coeficiente de determinação: R = 0.32 105 . F0.4 = 4.049 0.2 Graus de liberdade 2 4 2 2 6 2 Média quadrática 165.8498. Fonte de variação Soma quadrática Regressão Resíduo Falta de ajuste Erro puro Total 0.2.9 11.Tabela 6.0027 0.9245.2 358.2.9229.001 0.6 16.2. F0.17: Análise de variância (ANOVA) do planejamento fatorial 22 para produtividade lipásica máxima.6 23.7 2.

27: Superfície de resposta (a) e curva de contorno (b) para atividade lipásica em 24 h de fermentação em função das variáveis tempo de propagação do pré-inóculo e concentração do pré-inóculo. 106 .(a) (b) 30 Concetração de pré-inóculo (%) 20 10 12 24 Tempo de propagação do pré-inóculo (h) 36 12 10 8 6 4 2 Figura 6.

28: Superfície de resposta (a) e curva de contorno (b) para atividade lipásica em 36 h de fermentação em função das variáveis tempo de propagação do pré-inóculo e concentração do pré-inóculo. 107 .(a) (b) 30 Concentração de pré-inóculo (%) 20 10 12 24 Tempo de propagação do pré-inóculo (h) 36 24 20 16 12 8 4 Figura 6.

29: Superfície de resposta (a) e curva de contorno (b) para atividade lipásica em 48 h de fermentação em função das variáveis tempo de propagação do pré-inóculo e concentração do pré-inóculo. 108 .(a) 30 (b) Concentração de pré-inóculo (%) 20 10 12 24 Tempo de propagação de pré-inóculo(h) 36 28 24 20 16 Figura 6.

109 .5 0.30: Superfície de resposta (a) e curva de contorno (b) para produtividade lipásica máxima em função das variáveis tempo de propagação do pré-inóculo e concentração do pré-inóculo.3 Figura 6.(a) (b) 30 Concentração de pré-inóculo (%) 20 10 12 24 Tempo de propagação do pré-inóculo (h) 36 0.4 0.

respectivamente). através da medida de N-acetilglicosamina. Efeito semelhante foi observado para produção de protease de Bacillus subtilis por FES (Soares et al. maiores atividades foram obtidas quando a variável t está no seu nível mais alto (36 h) e C no nível mais baixo (10%).h em 36 h (Figura 6. no caso do pré-inóculo com 12 e 24 h de propagação.26 e Tabela 6. melhores atividades foram obtidas com um pré-inóculo com 36 h de propagação provavelmente por empregar células na fase exponencial de crescimento conforme mostrado na Figura 6.27) maiores atividades lipásicas foram obtidas quando as variáveis tempo de propagação do pré-inóculo (t) e concentração de pré-inóculo (C) estão nos seus níveis mais altos (36 h e 30%. representando um aumento de 100% na atividade e 50% na produtividade. apresentando formação de esporos apenas no tempo de 36 h. Obteve-se uma atividade lipásica máxima de 30 U/g em 48 h de fermentação e produtividade máxima de 0.28 a 6.12). utilizando mesma composição de meio e condições de cultivo (Figura 6. respectivamente). Estes resultados confirmaram a influência dos parâmetros concentração do inóculo e do seu estado fisiológico no desempenho de processos fermentativos. simplicissimum estimado pelo conteúdo de N-acetilglicosamina em FES foi determinado. Apenas para a atividade lipásica em 24 h (Figura 6.31). Além 110 . quando comparada à curva de crescimento do fungo utilizando inóculo com suspensão de esporos (107 esporos/g).28).27).7). que o emprego desta estratégia de inóculo causa uma redução drástica da fase lag de crescimento. Em 36 h de fermentação (Figura 6.. enquanto. Com o objetivo de validar os resultados obtidos no planejamento fatorial. Além disso. uma concentração de pré-inóculo de 10% forneceu os melhores resultados (Figuras 6. Observou-se. 2005). as células ainda estão na fase lag. o perfil de produção de lipase e de crescimento do fungo P. quando comparado aos primeiros resultados obtidos com pré-inóculo sólido (Figura 6. Para a variável de resposta atividade em 48 h e produtividade máxima. Para todas as respostas.30). provavelmente devido à redução da fase lag e antecipação da produção de lipase causada pela alta concentração de inóculo.Em 24 h de fermentação (Figura 6. o fungo nos três tempos de propagação possui morfologia distinta. Para três das respostas avaliadas (atividade lipásica em 36 e 48 h e produtividade máxima). utilizando a estratégia de pré-inóculo sólido nas melhores condições (10% de sólidos fermentados por 36h). maiores atividades lipásicas foram obtidas quando a variável t está no seu nível mais alto (36 h) e C entre os níveis 0 e -1 (20 e 10%.63 U/g. elevadas concentrações de pré-inóculo foram favoráveis.12.

tornou-se relevante investigar o quão influenciado pela ganulometria do meio sólido era a produção de lipase. provavelmente por apresentarem maior área superficial. Efeito da granulometria da torta de babaçu na produção de lipase A torta de babaçu recebida da empresa geradora deste rejeito. 2006). 2002). observou-se a geração de uma concentração de N-acetilglicosamina. Maior crescimento do fungo P.5 0 5 0 0 12 24 36 48 N-acetilglicosamina 60 72 Tempo de fermentação (h) Figura 6. permitindo maior desenvolvimento de hifas aéreas que têm sido descritas como as principais responsáveis pela absorção de oxigênio (Biesebeke et al. em 72 h de fermentação. empregando 10% (m/m) de préinóculo sólido propagado por 36 h.7 mm. simplicissimum foi obtido em partículas menores que 420 µm. ao ser moída em moinho de facas. não apresentando diferença significativa na atividade obtida até essa faixa.. especialmente porque o uso de apenas uma fração das partículas acarretaria na perda de parte da torta de babaçu. Como pode ser observado na Tabela 6. simplicissimum (expresso como conteúdo de N-acetilglicosamina).18. 35 30 Atividade lipásica (U/g) 3 N-acetilglicosamina (mg/g) 2. Desta forma. a atividade aumentou em função do aumento do tamanho de partículas.disso. apresenta ampla distribuição de tamanho de partículas. Para a produção de pectinases de Aspergillus niger. duas vezes maior com o pré-inóculo sólido.5 25 20 15 10 Lipase 1 0.4.31: Perfil de produção de lipase e de crescimento do fungo P. 111 .5 2 1. elevadas atividades lipásicas (aproximadamente 100 U/g) foram obtidas em torta de babaçu com tamanho de partícula de até 1.. 6. obtendo-se maior atividade em partículas com 500 µm (Patil et al.

13 4..4 mm e >2..chegando em alguns casos a serem responsáveis por mais 75% da absorção de oxigênio (Schutyser et al.3 67.9 36.5 e 2. Faixas granulométricas Atividade lipásica (U/g) Glicosamina (mg/g) Yp/x (U/mg) 40.0 67.5 21. com redução da água disponível.10 1.9 111.8 57.0 36.7 104. assim como atividades lipásicas 1.79 2.97 A redução no crescimento do fungo na torta de babaçu e conseqüente redução da produção de lipase.4 Proteínas totais (mg/g) 99. 112 .8 18.5 57. rendimento de produto por biomassa (Yp/x) e atividade específica em 72 h de fermentação. Entretanto.3 88.4 mm. Tabela 6. Observou-se uma redução acentuada no teor de Nacetilglicosamina e na concentração de proteínas totais. 2003).18: Atividade lipásica. podem estar relacionados à maior perda de umidade ocorrida nestas condições.5 22.7 40.42 2. respectivamente).63 3. 2006).5 8. suplementada com 6. uma vez que uma diferença no padrão de ambas as variáveis pode ser observada.19).9 54. em função do aumento do tamanho das partículas.8 2. utilizando torta de babaçu em diferentes faixas granulométricas.9 Atividade específica (U/mg) 1.8 vezes menores. 2003). quando comparadas as menores e maiores granulometrias. e/ou a uma menor taxa de crescimento do fungo no interior dos grãos em relação ao crescimento na superfície (Rahardjo et al.57 3.83 1.6 97. à diminuição da oxigenação pela redução da área superficial (Rasghavarao et al..2360 µm >2360 µm Toda a faixa 108.25% de melaço.4 36. teor de N-acetilglicosamina.66 5. para as maiores granulometrias (1.1 40.06 2.45 1.7-2. nestas condições maiores rendimentos (Yp/x) e atividades específicas foram obtidos. Estes resultados parecem estar relacionados às variações de pH e teor de umidade ao longo da fermentação (Tabela 6.93 2.40 210-420 µm < 420 µm 420-850 µm 850-1700 µm 1700.23 0.

em diferentes faixas granulométricas.7 Perda de umidade (%) 16.0 6. no presente trabalho foi projetado. construído e 113 . por exemplo.6 pH final 7.5. assim como percentual de perda de umidade.6 35. Emprego de biorreatores de leito fixo e agitado para a produção de lipase por FES Em função da importância do desenvolvimento de biorreatores para viabilizar a aplicação da FES em maiores escalas.7 14.5 56.O emprego de toda a faixa granulométrica da torta de babaçu permitiu um crescimento elevado do fungo e a obtenção de valores consideráveis de atividade.1 6.0 6. Faixas granulométricas 210-420 µm < 420 µm 420-850 µm 850-1700 µm 1700. Tabela 6.8 6. utilizando torta de babaçu suplementada com 6.19: Valores iniciais e após 72 h de fermentação de teor de umidade e de pH.4 5.4 37.5 5.6 7.5 5.2 12.25% de melaço.4 36. apresentando uma redução na atividade de apenas 1.0 50.2360 µm > 2360 µm Toda faixa pH inicial 5.1 55.4 5.20-1. quando comparado com a produção com menores tamanhos de partícula (210-420 µm e 420-850 µm).5 5.5 5. o emprego de toda a faixa granulométrica da torta de babaçu permite 100% de aproveitamento do rejeito.0 22.8 37.1 7. mantendo-se as condições ora adotadas para a moagem da torta de babaçu (Tabela 5.7 61.0 22. Além disso.3 7.6).8 Umidade inicial (%) 70 70 65 60 55 50 65 Umidade final (%) 58. enquanto a utilização apenas da faixa de 210 a 420 µm.25 vezes. resulta no uso de apenas 19% do rejeito.

1. que o fungo 114 . Observou-se. após o pico máximo de produção.operado um biorreator de escala de bancada passível de ser operado como biorreator de leito fixo.h em 72 h. inóculo com suspensão de esporos na concentração 107 esporos/g de torta e teor de umidade inicial de 65%. região do reator mais próxima à entrada do ar. tendo-se calculado a vazão a ser empregada com base nas dimensões do biorreator utilizado neste trabalho. do tipo de inoculo e da agitação no crescimento do fungo P. quando comparada à obtida em reator de bandeja.36).35). pode estar relacionada à maior disponibilidade de O2 para o crescimento do fungo com o emprego de aeração forçada. Efeito da taxa de aeração na atividade lipásica em biorreator de leito fixo O efeito da taxa de aeração na produção de lipase em biorreator de leito fixo foi investigado. simplicissimum foi capaz de crescer e produzir lipase (Figura 6. O fungo apresentou um crescimento relativamente homogêneo ao longo do leito e gerou elevadas concentrações de N-acetilglicosamina (aproximadamente 4 mg/g) (Figura 6. proporcionou a maior produção de lipase de P. A maior atividade lipásica (46. uma queda na atividade de cerca de 50%. Esta atividade foi duas vezes menor do que aquela obtida em biorreator do tipo bandeja utilizando torta de babaçu sem suplementação (Figura 6. Avaliou-se o efeito da taxa de aeração. H2 =14 cm e H3 =7 cm) em todo leito do reator de 35. simplicissimum em biorreatores de leito fixo. (2005). Foi empregada aeração forçada com injeção de ar úmido e a escolha da vazão de ar primeiramente avaliada foi baseada na velocidade superficial que. o fungo P. ainda. Utilizando uma vazão de aeração de 6.9 L/min.3 U/g) foi obtida para altura de leito de 7 cm (H3). leito agitado ou leito fluidizado. simplicissimum e na produção de lipase em biorreatores de leito fixo e agitado.. Observou-se.35). através do aumento da transferência de oxigênio para as hifas aéreas (Raghavarao et al. perfil semelhante ao obtido em biorreator de bandeja (Figuras 6. segundo Cavalcanti et al.5 U/g. 6. 2003). respectivamente. empregando toda a faixa granulométrica da torta de babaçu sem suplementação. alcançando atividade e produtividade máximas (média de H1=21 cm. Esta velocidade superficial foi de aproximadamente 90 cm/min.11 e 6.11). Esta maior concentração de biomassa.7 U/g e 0.5.

Mesmo assim. Observou-se. removendo o calor simultaneamente por condução e evaporação (Mitchell et al. 1999). A temperatura é descrita na literatura como um fator crítico que pode afetar o crescimento do fungo. após 72 h de fermentação. 2005). simplicissimum apresenta uma temperatura ótima de crescimento entre 28 e 32°C.39).9 L/min permitiu um bom controle do teor de umidade ao longo da fermentação para H1 e H2.38) e que maiores atividades foram obtidas em valores de pH mais altos. a germinação e a formação do produto (Pandey. decidiu-se avaliar a produção de lipase e a geração de calor empregando taxas de aeração cerca de 35% e 70% superiores à empregada nos primeiros testes do biorreator de leito fixo.37).11 e 6. enquanto em H3. ainda. 2003). na região mais próxima à entrada de ar.. causa agregação e redução da porosidade do leito. diminuindo a dissipação do calor (Schutyser et al. em biorreatores de leito fixo. Além disso.39). Observou-se. O aumento da taxa de aeração é uma estratégia bastante utilizada para melhorar a transferência de massa e de calor. 2003). A injeção de ar úmido na vazão de 6. O emprego da aeração forçada permite.36)..apresentou um crescimento mais lento até 72 h. A geração de calor no interior do leito é função do metabolismo dos microrganismos e o aumento da temperatura ocorre devido à baixa condutividade térmica dos meios sólidos (Raghavarao et al. 115 . a maior atividade lipásica obtida em 72 h foi observada em H3. 2004. 2003). o teor de umidade apresentou. principalmente da temperatura. Observou-se que não houve uma variação significativa do pH ao longo do leito (Figura 6. a esporulação. Desta forma. através da manipulação da vazão e da temperatura do ar injetado. visto que o fungo P. uma redução acentuada (Figura 6. conforme observado para produção desta enzima em bandeja (Figura 6. o crescimento microbiano. principalmente de fungos filamentosos.11). um melhor controle das condições operacionais. quando comparado à curva de crescimento em bandeja. uma temperatura aproximadamente 6°C superior à temperatura ótima de crescimento do fungo e 10°C superior à temperatura dos sólidos no início da fermentação (Figura 6.. Dalsenter et al. Isso pode estar relacionado às baixas temperaturas alcançadas no biorreator no início da fermentação (Figura 6. entre 48 e 72 h. O aumento da temperatura dentro do leito ao longo da fermentação é um dos principais problemas da FES e tem sido frequentemente observado em biorreatores de leito fixo (Santos et al.. um gradiente de temperatura ao longo da direção axial do leito de no máximo 4°C. devido provavelmente ao aumento da fase lag (Figuras 6..

35: Produção de lipase de P.50 45 H1 H2 H3 Média Atividade lipásica (U/g) 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0 24 48 72 96 120 Tempo de fermentação (h) Figura 6. 116 .9 L/min.36: Crescimento do fungo P. O símbolo x (em verde) representa a média de H1. H2 e H3.9 L/min. simplicissimum em biorreator de leito fixo empregando aeração forçada com vazão de aeração de 6. 5 N-acetilglicosamina (mg/g) 4 3 2 1 H1 H2 H3 0 0 24 48 72 96 120 Tempo de fermentação (h) Figura 6. simplicissimum em biorreator de leito fixo empregando aeração forçada com vazão de aeração de 6.

5 6 H1 H2 H3 5. 117 .9 L/min.5 7 pH 6.5 5 0 24 48 72 96 120 Tempo de fermentação (h) Figura 6.38: pH do meio sólido ao longo da fermentação em biorreator de leito fixo empregando aeração forçada com vazão de aeração de 6.80 70 Teor de umidade (%) 60 50 40 H1 H2 H3 30 0 24 48 72 96 120 Tempo de fermentação (h) Figura 6. 8 7.37: Teor de umidade do meio sólido ao longo da fermentação em biorreator de leito fixo empregando aeração forçada com vazão de aeração de 6.9 L/min.

9 U/g. Além disso. Esse comportamento foi observado para produção de lipase por esse mesmo fungo em torta de soja em biorreator do tipo bandeja (DiLuccio et al. a partir de 72 h de fermentação. simplicissimum alcançou. podendo aumentar a atividade de água e possibilitar o crescimento de bactérias. o aumento da umidade reduz a porosidade do substrato.4 U/g e 0. seguida de uma subida em 120 h. o fungo P.h. Essa contaminação pode estar relacionada com o surgimento de água livre na parte superior do reator oriunda da condensação do ar na região vazia (headspace) do reator. Observou-se. Após o pico de produção. respectivamente. considerando-se a média aritmética dos valores medidos nas três portas de amostragem (Figura 6. atividade e produtividade máximas de 63. porém uma concentração menor 118 .. Utilizando uma vazão de aeração de 9.9 L/min. observou-se um crescimento mais rápido do fungo. facilitando o crescimento bacteriano na superfície (Pandey. dificultando a transferência de oxigênio e causando a morte do fungo nesta região. uma contaminação na região superior do leito.4 L/min.39: Temperatura ao longo da fermentação em biorreator de leito fixo empregando aeração forçada com vazão de aeração de 6. Com o aumento da vazão de ar. em 72 h. onde a atividade lipásica foi mais alta. uma queda de 50% na atividade foi observada. 2004). O aumento da atividade lipásica no final da fermentação pode estar relacionado com a expressão de outra lipase ou pela redução na atividade de proteases.40).40 h1 h2 h3 h4 36 Temperatura (°C) 32 28 24 20 0 24 48 72 96 120 Tempo de fermentação (h) Figura 6. 2003) Observou-se uma variação pequena na produção de lipase e no crescimento do fungo nas diferentes alturas do leito.

80 70 H1 H2 H3 Média Atividade lipásica (U/g) 60 50 40 30 20 10 0 0 24 48 72 96 120 Tempo de fermentação (h) Figura 6. apresentando.41).42). apresentando um rendimento de produto por glicosamina aproximadamente constante ao longo do tempo. Observou-se que o teor de umidade permaneceu aproximadamente constante ao longo do tempo e ao longo da altura do leito até 72 h de fermentação (Figura 6. temperaturas mais baixas do que as obtidas com 6. observou-se que. provavelmente devido ao crescimento de contaminação bacteriana (Figura 6. A produção da enzima foi associada ao crescimento. seguido de um aumento em H1 e H2 em 120 h. observou-se um decréscimo no teor de umidade em todo o leito. simplicissimum em biorreator de leito fixo empregando aeração forçada com vazão de aeração de 9. em 48 e 72 h. portanto.44).4 L/min. Em 96 h de fermentação. 119 .42).40: Produção de lipase de P.4 L/min.de glicosamina no final da fermentação (Figura 6. Com o aumento da vazão de aeração para 9. a temperatura no leito encontrava-se apenas 2°C acima da temperatura ótima de crescimento do fungo e 6°C acima da temperatura observada no início da fermentação (Figura 6.9 L/min.

42: Teor de umidade do meio ao longo da fermentação em biorreator de leito fixo empregando aeração forçada com vazão de aeração de 9.41: Crescimento do fungo P.4 L/min. simplicissimum em biorreator de leito fixo empregando aeração forçada com vazão de aeração de 9.4 L/min. 120 . 70 Teor de umidade (%) 60 50 40 H1 H2 H3 30 0 24 48 72 96 120 Tempo de fermentação (h) Figura 6.4 N-acetilglicosamina (mg/g) 3 2 1 H1 H2 H3 0 0 24 48 72 96 120 Tempo de fermentação (h) Figura 6.

8 7.5 6 H1 H2 H3 5.44: Temperatura ao longo da fermentação em biorreator de leito fixo empregando aeração forçada com vazão de aeração de 9.4 L/min. 121 .43: pH do meio ao longo da fermentação em biorreator de leito fixo empregando aeração forçada com vazão de aeração de 9.5 5 0 24 48 72 96 120 Tempo de fermentação (h) Figura 6. 40 h1 h2 h3 h4 35 Temperatura (°C) 30 25 20 0 24 48 72 96 120 Tempo de fermentação (h) Figura 6.4 L/min.5 7 pH 6.

2004). Observou-se que maiores atividades lipásicas foram obtidas para H3 seguida de H2. A umidade se manteve constante até 48 h de fermentação. 122 . Observou-se pouca variação nos valores de pH ao longo do leito (Figura 6..h. observou-se contaminação na região superior do leito.47). obtendo-se um melhor controle através do ajuste da temperatura do ar de entrada ao longo da fermentação (Santos et al. (1994). Estes resultados podem indicar que um aumento excessivo da taxa de aeração pode não constituir uma boa estratégia para remoção de calor.49). Com esta vazão de aeração. Em 48 h. a redução dos picos de temperatura através do aumento da vazão de ar não tem se mostrado muito eficiente.48). obtendo-se atividades maiores para a altura de 7 cm. Observou-se uma variação grande na atividade ao longo do leito do biorreator. uma queda de cerca de 60% na atividade foi observada. Em escala maior em biorreatores de leito fixo. em 72 h (Figura 6.46). seguida de uma queda brusca em H2 e H3 e de uma variação grande ao longo do leito a partir deste tempo de fermentação (Figura 6.4 U/g e 0. Ghildyal et al. Observou-se um crescimento mais lento até 48 h de fermentação e heterogêneo ao longo do leito (Figura 6.Utilizando uma vazão de aeração cerca de 70% superior à inicialmente usada (11.4 L/min. simplicissimum alcançou atividade e produtividade máximas de 51. temperaturas estas superiores às obtidas com 6. em escala de laboratório. observaram uma maior remoção do calor em função do aumento da taxa de aeração para a produção de amiloglicosidase por Aspergillus niger.9 e 9. onde a umidade chegou a 47% e 50% em 72 h de fermentação. devido provavelmente à condensação do ar também observada nestas condições de cultivo. o aumento da taxa de aeração tem se mostrado uma boa estratégia. No entanto. Após o pico de produção. respectivamente. observou-se em 48 h uma temperatura no leito cerca de 8°C superior à temperatura ótima de crescimento do fungo e cerca de 12°C superior à temperatura obtida no início da fermentação (Figura 6. o fungo P. respectivamente. utilizando um biorreator de leito fixo com diâmetro interno de 15 cm e altura de 35 cm.45).6 L/min).7 U/g.

46: Crescimento do fungo P. simplicissimum em biorreator de leito fixo empregando aeração forçada com vazão de aeração de 11.6 L/min.6 L/min.45: Produção de lipase de P.80 70 H1 H2 H3 Média Atividade lipásica (U/g) 60 50 40 30 20 10 0 0 24 48 72 96 120 Tempo de fermentação (h) Figura 6. simplicissimum em biorreator de leito fixo empregando aeração forçada com vazão de aeração de 11. 4 N-acetilglicosamina (mg/g) 3 2 1 H1 H2 H3 0 0 24 48 72 96 120 Tempo de fermentação (h) Figura 6. 123 .

5 7 pH 6.6 L/min.48: pH do meio ao longo da fermentação em biorreator de leito fixo empregando aeração forçada com vazão de aeração de 11.70 Teor de umidade (%) 60 50 40 H1 H2 H3 30 0 24 48 72 96 120 Tempo de fermentação (h) Figura 6. 8 7.5 5 0 24 48 72 96 120 Tempo de fermentação (h) Figura 6.47: Teor de umidade do meio ao longo da fermentação em biorreator de leito fixo empregando aeração forçada com vazão de aeração de 11. 124 .5 6 H1 H2 H3 5.6 L/min.

6 L/min. 60 H1 H2 H3 Média 50 Atividade lipásica (U/g) 40 30 20 10 0 0 24 48 72 96 120 Tempo de fermentação (h) Figura 6.6 L/min e menor saturação do ar.49: Temperatura ao longo da fermentação em biorreator de leito fixo empregando aeração forçada com vazão de aeração de 11.40 h1 h2 h3 h4 35 Temperatura (° C) 30 25 20 0 24 48 72 96 120 Tempo de fermentação (h) Figura 6.50: Produção de lipase de P. simplicissimum em reator de leito fixo utilizando aeração forçada com vazão de aeração de 11. 125 .

4 U/g e produtividade máxima 0. simplicissimum apresentou um pico de atividade lipásica entre 72 e 96 h de fermentação. obtendo-se atividades maiores para a altura de 7 cm (H3).44. apresentando rendimento de produto por glicosamina constante a partir de 72 h. Nesta nova corrida a 11. Com o objetivo de evitar a contaminação.. Maior variação na atividade lipásica ao longo do leito foi observada com 96 e 120 h. Verificou-se que. 6. a condensação do ar saturado na saída do reator e o conseqüente aumento da umidade na parte superior do leito permitiram a contaminação bacteriana. colocou-se um papel de filtro na parte superior do leito para absorver a água proveniente da condensação e reduziu-se a saturação do ar que entra no reator. alcançando uma atividade máxima de 49.6 L/min. nestas condições.50).11).52). Observou-se. utilizando-se uma coluna de água com altura duas vezes menor (12 cm) do que a coluna de água utilizada nos experimentos anteriores para umedecer o ar injetado.39.49 e 6.51). devido provavelmente à menor produção de proteases nestas condições. alcançando em 48 h de fermentação temperaturas altas para h1 (38°C) e baixas para h4 (28. seguindo-se uma redução acentuada do teor de umidade em todo leito (Figura 6. foi possível evitar a contaminação por bactérias. visto que o emprego de ar seco 126 . 2003). uma vez que.7 U/g).h (Figura 6. A temperatura no interior do leito apresentou um gradiente axial de 10°C. reduzindo-se a saturação do ar injetado e colocando um papel de filtro no topo do reator.6 L/min. semelhante à encontrada em biorreator do tipo bandeja (Figura 6. Isso pode estar relacionado com a redução da saturação do ar injetado através do uso de uma coluna de água de menor altura. pouca variação nos valores de pH ao longo do leito (Figura 6.54). o fungo P.Apesar do aumento da taxa de aeração ter promovido um aumento da atividade lipásica. bastante superior aos observados anteriormente (Figuras 6. 6. O fungo apresentou pouca variação no crescimento ao longo do leito. A produção da enzima foi associada ao crescimento. A umidade manteve-se aproximadamente constante apenas até 24 h de fermentação.8°C). porém gerou concentração mais baixa de glicosamina (Figura 6. a atividade obtida apenas na região não contaminada (H3) havia sido bastante elevada (66. Observou-se que a atividade da enzima não apresentou decréscimo significativo após o pico de produção.53). Isto pode ter proporcionado uma maior remoção do calor por evaporação nas regiões mais próximas à entrada de ar (Raghavarao et al.63 U/g. nova corrida com o biorreator foi realizada utilizando uma vazão de aeração de 11. também. Adotando estas medidas.

o mecanismo de remoção de calor dominante foi a evaporação. 2004). mesmo nestas condições. Mitchell et al. onde o teor de umidade apresentou um decréscimo significativo ao longo do tempo. estes níveis de temperatura não parecem ter afetado o crescimento do fungo. nas condições desta corrida com ar menos úmido. não foi possível avaliar o efeito de desnaturação e se este deve ser considerado. Isso pode estar relacionado à elevada termoestabilidade que estas enzimas possuem.. podendo causar perdas de atividade significativas (Santos et al. Além disso.promove a remoção de calor por evaporação (Raghavarao et al. visto que concentrações de glicosamina maiores que as obtidas em biorreator do tipo bandeja foram alcançadas no final da fermentação. Apesar da temperatura no reator de leito fixo nesta corrida ter alcançado até 38°C. pois em maiores escalas a temperatura do leito poderia alcançar valores muito maiores. porém com o efeito adicional de ressecamento do meio sólido. 1992). 2003.. Desta forma. Estes resultados indicam que a redução da umidade ao longo da fermentação e possivelmente a ocorrência do estresse hídrico podem exercer efeito positivo (ou nulo) sobre a produção de lipase de P. as condições de operação que levaram a este resultado (taxa de aeração de 11. indicando um baixo efeito de desnaturação destas pelo aumento da temperatura no leito. visto que o estresse hídrico pode afetar a extensão das hifas. A umidade e a disponibilidade de água para o crescimento são fatores relevantes em processos de FES. elevadas atividades lipásicas foram obtidas. simplicissimum por FES e a estabilidade destas enzimas ao longo da fermentação.6 L/min e menor saturação do ar injetado) foram adotadas para os testes subseqüentes. com base apenas nestes resultados. Observou-se que... elevadas atividades lipásicas foram obtidas. Os dados de teor de umidade e temperatura indicam que. e não condução e convecção. a esporulação e a produção de metabólitos (Lens et al. 2004). No entanto. 127 .

simplicissimum em reator de leito fixo utilizando aeração forçada com vazão de aeração de 11.51: Crescimento do fungo P. 128 . 70 Teor de umidade (%) 60 50 40 H1 H2 H3 30 0 24 48 72 96 120 Tempo de fermentação (h) Figura 6.52: Teor de umidade do meio ao longo do tempo em reator de leito fixo usando aeração forçada com vazão de aeração de 11.2.5 H1 H2 H3 0 0 24 48 72 96 120 Tempo de fermentação (h) Figura 6.6 L/min e menor saturação do ar.6 L/min e menor saturação do ar.5 1 0.5 N-acetilglicosamina (mg/g) 2 1.

129 .53: pH do meio ao longo da fermentação em reator de leito fixo utilizando aeração forçada com vazão de aeração de 11.5 7 pH 6.8 7. 40 h1 h2 h3 h4 35 Temperatura (° C) 30 25 20 0 24 48 72 96 120 Tempo de fermentação (h) Figura 6.6 L/min e menor saturação do ar.5 5 0 24 48 72 96 120 Tempo de fermentação (h) Figura 6.6 L/min e menor saturação do ar.5 6 H1 H2 H3 5.54: Temperatura ao longo da fermentação em reator de leito fixo utilizando aeração forçada com vazão de aeração de 11.

Além disso. apresentando rendimento de produto por glicosamina constante a partir de 48 h. observando-se uma redução da fase lag e elevadas concentrações de glicosamina já em 24 h de fermentação (Figura 6. O perfil de crescimento e produção de lipase foram semelhantes aos obtidos em biorreator do tipo bandeja inoculados com pré-inóculo sólido (Figura 6. objetivou-se aumentar a produtividade. alcançando temperaturas altas para h1 (35°C) e baixas para h4 (28oC) (Figura 6. 2003). O rápido crescimento do fungo após inoculação da torta de 130 . o teor de umidade apresentou menor decréscimo. mas mesmo assim menores atividades lipásicas foram obtidas. Emprego de pré-inóculo sólido na produção de lipase em biorreator de leito fixo O emprego do pré-inóculo sólido.1°C ao longo do leito.2. visto que a utilização de elevadas quantidades em maiores escalas pode encarecer o processo ou mesmo inviabilizá-lo. simplicissimum apresentou um pico de atividade lipásica em 48 h de fermentação. Foi verificada uma variação na atividade lipásica ao longo do leito durante toda a fermentação.59). A temperatura apresentou um gradiente de 7.6 L/min e injeção de ar com menor saturação. diferentemente dos ensaios anteriores. alcançando uma atividade máxima de 69. conforme tem sido observado para esta enzima (Figura 6. Observou-se uma queda drástica no teor de umidade desde os momentos iniciais da fermentação e a formação de gradiente ao longo do leito (Figura 6.5 U/g. com uma pequena redução da atividade da enzima após o pico de produção.6. O pico de temperatura ocorreu em 24 h. Utilizou-se um pré-inóculo sólido de 10% (m/m) fermentado por 36 h. e reduzir a quantidade de esporos utilizados.h (Figura 6. O fungo P. O crescimento do fungo apresentou pouca variação ao longo do leito. visto que o emprego do pré-inóculo reduziu a fase lag de crescimento do fungo e a geração de calor está diretamente relacionada ao metabolismo do microrganismo (Pandey. coincidindo com o pico máximo de produção.11). Além disso.55). com maior atividade na região mais próxima à entrada de ar (H3).56).57). com taxa de aeração de 11.5. Na região superior do biorreator (H1). a produção da enzima foi associada ao crescimento. foi realizado com o objetivo de avaliar a eficiência desta estratégia em outro tipo de biorreator e em escala maior. Observou-se que o pH alcançou seu valor mais alto em 48 h de fermentação.5 U/g e produtividade máxima 1.58). nas condições otimizadas em reator do tipo bandeja. reduzindo o tempo de fermentação.

3 2. ar com baixa saturação e pré-inóculo sólido.5 N-acetilglicosamina (mg/g) 2 1.babaçu com sólidos fermentados pode ser evidenciado pelas fotos do biorreator de leito fixo em 24.55: Produção de lipase de P.5 1 H1 H2 H3 0. simplicissimum em biorreator de leito fixo empregando aeração forçada com vazão de aeração de 11. 100 H1 H2 H3 Média Atividade lipásica (U/g) 80 60 40 20 0 0 24 48 72 96 Tempo de fermentação (h) Figura 6.60). simplicissimum em biorreator de leito fixo empregando aeração forçada com vazão de aeração de 11.6 L/min. ar com baixa saturação e pré-inóculo sólido. inoculado com suspensão de esporos e com préinóculo sólido (Figura 6.6 L/min. 48 e 72 h de fermentação.56: Crescimento do fungo P.5 0 0 24 48 72 96 Tempo de fermentação (h) Figura 6. 131 .

70 H1 H2 H3 Teor de umidade (%) 60 50 40 30 0 24 48 72 96 Tempo de fermentação (h) Figura 6. ar com baixa saturação e pré-inóculo sólido.6 L/min. 132 . 8 7.6 L/min.57: Teor de umidade do meio sólido ao longo da fermentação em biorreator de leito fixo empregando aeração forçada com vazão de aeração de 11. ar com baixa saturação e pré-inóculo sólido.5 5 0 24 48 72 96 Tempo de fermentação (h) Figura 6.5 7 pH 6.5 6 H1 H2 H3 5.58: pH do meio sólido ao longo da fermentação em biorreator de leito fixo empregando aeração forçada com vazão de aeração de 11.

48 (B) e 72 h (C) de fermentação e pré-inóculo sólido (10% m/m) em 24 (D).6 L/min. injetando-se ar com baixo grau de saturação. Figura 6.6 L/min. simplicissimum em torta de babaçu em biorreator de leito fixo. foi aplicada uma vazão de aeração de 11. empregando suspensão de esporos como inóculo (107 esp/g) em 24 (A). 133 . ar com baixa saturação e pré-inóculo sólido. 48 (E) e 72 h (F) de fermentação.40 h1 h2 h3 h4 35 Temperatura (°C) 30 25 20 0 24 48 72 96 Tempo de fermentação (h) Figura 6.60: Crescimento do fungo P. Nos ensaios com ambos os tipos de inóculo.59: Temperatura ao longo da fermentação em biorreator de leito fixo empregando aeração forçada com vazão de aeração de 11.

próximo à entrada de ar (Figura 6.h (Figura 6. quanto com a formação de aglomerados 134 . Foi verificada pouca variação na atividade lipásica ao longo do leito durante toda a fermentação. visto que o pico máximo de produção foi antecipado para 24 h de fermentação. reduzir a formação de gradientes no leito e melhorar a transferência de calor (Schutyser et al. apresentando um gradiente de cerca de 4°C ao longo do leito e uma variação máxima de aproximadamente 11°C em relação à temperatura no início da fermentação (Figura 6. sob agitação de 30 rpm. apesar de ter gerado baixas atividades lipásicas. No entanto. simplicissimum apresentou um pico de atividade lipásica em 24 h de fermentação.63). O perfil de crescimento do fungo apresentou redução da fase lag. limitando o crescimento e consequentemente a produção (Lenz et al. Além disso. com uma redução drástica da atividade da enzima após o pico de produção.62). O fungo P.5.65). com vazão de aeração de 11.64). 2004).7 U/g e produtividade máxima 0.95 U/g. A baixa homogeneização dos sólidos pode estar relacionada tanto com a estrutura e as propriedades físico-químicas do meio sólido. Utilizou-se um pré-inóculo sólido de 10% (m/m) fermentado por 36 h. O pico de temperatura ocorreu em 24 h. além de ter gerado compactação dos sólidos e dificuldades de aeração (Figura 6.. 2003). com uma maior redução da umidade em H3. alcançando uma atividade máxima de 22.61). as variações nos valores de pH ao longo do leito foram pouco significativas (Figura 6. para fungos filamentosos. alcançando. desta forma. obtendo-se. Um aumento rápido do pH ocorreu nas primeiras 24 h de fermentação. No entanto. atividade lipásica máxima também no pH mais elevado. Observou-se uma queda drástica no teor de umidade a partir de 24 h de fermentação e a formação de gradiente ao longo do leito.66).6. a agitação pode causar fragmentação das hifas aéreas..6 L/min e injeção de ar com menor saturação. concentrações de glicosamina duas vezes superiores à obtida em leito fixo nas mesmas condições (Figura 6. resultou em uma alta produtividade.3. mantendo-se constante ao longo a partir deste momento. o emprego dos agitadores ora utilizados não foi eficiente para a homogeneização dos sólidos. visto que o emprego de agitação pode permitir a adição e melhor distribuição de água durante a fermentação. O emprego do biorreator de leito agitado. em 24 h de fermentação. Produção de lipase em biorreator de leito agitado A produção de lipase em biorreator agitado também foi estudada.

ar com baixa saturação e pré-inóculo sólido. 25 H1 H2 H3 Média Atividade lipásica (U/g) 20 15 10 5 0 0 24 48 72 96 Tempo de fermentação (h) Figura 6.20) (Sthutyser et al. 135 . indicando que a agitação não causou um efeito negativo na integridade do fungo.após o crescimento do fungo (Figura 6. gerando uma concentração de glicosamina comparável à obtida em leito fixo.. 2003).6 L/min.61: Produção de lipase de P. simplicissimum em biorreator de leito agitado empregando aeração forçada com vazão de aeração de 11. e de produzir lipase. Desta forma. o emprego da agitação não resultou na redução dos gradientes nem na dissipação do calor gerado. Por outro lado. o fungo foi capaz de crescer.

5 0 0 24 48 72 96 H1 H2 H3 Tempo de fermentação (h) Figura 6. 136 .5 3 N-acetilglicosamina (mg/g) 2. 70 Teor de umidade (%) 60 50 40 H1 H2 H3 30 0 24 48 72 96 Tempo de fermentação (h) Figura 6.6 L/min.63: Teor de umidade do meio sólido ao longo da fermentação em biorreator de leito agitado empregando aeração forçada com vazão de aeração de 11. ar com baixa saturação e pré-inóculo sólido.3.5 2 1.6 L/min. simplicissimum em biorreator de leito agitado empregando aeração forçada com vazão de aeração de 11.62: Crescimento do fungo P. ar com baixa saturação e pré-inóculo sólido.5 1 0.

5 6 H1 H2 H3 5. 137 . ar com baixa saturação e pré-inóculo sólido.8 7.5 7 pH 6.5 5 0 24 48 72 96 Tempo de fermentação (h) Figura 6.64: pH do meio sólido ao longo da fermentação em biorreator de leito agitado empregando aeração forçada com vazão de aeração de 11.65: Temperatura ao longo da fermentação em biorreator de leito agitado empregando aeração forçada com vazão de aeração de 11.6 L/min. ar com baixa saturação e pré-inóculo sólido. 40 h1 h2 h3 h4 35 Temperatura (° C) 30 25 20 0 24 48 72 96 Tempo de fermentação (h) Figura 6.6 L/min.

Diferenças morfológicas significativas no crescimento do fungo em FES e FS. mostrando a aglomeração dos sólidos. mostrando que a agitação ocorreu apenas na altura das pás.1 e 1. 7. um rejeito abundante e de baixo custo. respectivamente. essa diferença pode estar relacionada ao menor efeito de regulação destes suplementos em FES. A produção de lipase pelo fungo P.8 vezes superior. não foram 138 . utilizando a torta de babaçu como meio de cultivo. simplicissimum em biorreator de leito agitado em 96 h de fermentação: (a) foto do leito.0 e temperatura de 50oC e meia vida de 5h nestas mesmas condições. CONCLUSÕES O fungo Penicillium simplicissimum foi capaz de produzir elevadas atividades (aproximadamente 100 U/g nas condições ótimas) lipásicas em FES utilizando a torta de babaçu como meio de cultivo. apresentando rendimento de produto por glicosamina e atividade específica 6.(b) (a) (c) Figura 6. apresentando atividade máxima em pH 5. No caso de meios compostos por torta de babaçu suplementada com açúcares de fácil assimilação.66: Crescimento do fungo P. simplicissimum foi maior em fermentação no estado sólido. As lipases deste fungo presentes no extrato bruto apresentaram elevado potencial biotecnológico devido às suas características de termofilia e de termoestabilidade. (b) e (c) foto tirada através dos pontos de amostragem. aos obtidos por fermentação submersa utilizando o mesmo meio de cultivo suplementado com óleo de oliva.

Além disso. No entanto. simplicissimum. simplicissimum em torta de babaçu. O estudo de estratégias alternativas de inóculo para FES mostrou que o emprego de pré-inóculo sólido permitiu aumentar a produtividade em 50%. em FES o fungo apresentou produção de esporos duas vezes maior.encontradas. o emprego do biorreator de leito fixo e de leito agitado gerou informações importantes para o futuro escalonamento do processo. que é um aspecto importante para o escalonamento do processo. O emprego do biorreator de leito fixo mostrou ser um sistema simples e de fácil operação.h). O emprego do biorreator operando como leito agitado gerou baixas atividades lipásicas e não promoveu uma dispersão homogênea dos sólidos. Contudo.5 U/g. alcançando produtividades comparáveis às obtidas em bandeja (1. Apesar disso. A correlação entre estes fatos pode possivelmente ser elucidada através de estudos de ultra-estrutura do fungo nos dois sistemas. Estes resultados não indicaram uma relação clara entre a morfologia do fungo nos dois sistemas e a maior produtividade em FES. esses resultados indicam que a agitação não causa um efeito negativo sobre o crescimento do fungo e que o desenvolvimento de pás que melhorem a agitação e diminuam o efeito de compactação poderia gerar bons resultados. Além disso. este estudo permitiu identificar a importância da concentração e do estado fisiológico do inóculo no crescimento e produção de lipase de P. 139 . além de reduzir a demanda por esporos (10 vezes menos). além de ter propiciado elevada produção de lipases de P. a maior produção de esporos e a maior produtividade em FES podem estar relacionadas à baixa disponibilidade de nutrientes e água ou a outros estímulos induzidos por este tipo de fermentação.

Desta forma. visto que todos os estudos prévios foram realizados em biorreator do tipo bandeja. Além disso. Devido às características de termofilia e termoestabilidade das lipases de P. simplicissimum produzida por FES e FS. não foi possível observar relação direta entre a elevada produtividade em FES e a morfologia do fungo. da redução das concentrações de pré-inóculo sólido. Isto pode ser alcançado através da purificação e caracterização das enzimas de P. Estes resultados servem de incentivo para a investigação das lipases produzidas e para a determinação de suas propriedades catalíticas nos dois sistemas produtivos. torna-se interessante buscar o aumento de sua produção através da clonagem e expressão destas enzimas em sistema heterólogo. o aumento da produtividade e um maior entendimento do sistema poderiam ser obtidos através do estudo de outras estratégias de remoção de calor. 140 . PERSPECTIVAS O fungo Penicillium simplicissimum apresentou diferenças na produtividade e em sua fisiologia e morfologia quando se utilizou torta de babaçu como meio de cultivo para FS e FES. do emprego de pás que permitam uma homogeneização efetiva dos sólidos. mesmo sem um controle efetivo da temperatura e remoção do calor gerado. tais como na produção de biodiesel. Desta forma. utilizando outra cepa deste fungo. e sem a otimização das condições de cultivo. na síntese de fármacos e no tratamento de resíduos ricos em gorduras. bem como testar suas possíveis aplicações industriais. No entanto. as lipases produzidas por FES apresentaram características diferentes das obtidas por FS.8. simplicissimum. O fungo P. oriundos de indústrias de alimentos. utilizando microscopia eletrônica de transmissão. o estudo da ultra-estrutura do fungo nos dois sistemas. simplicissimum apresentou elevadas produtividades lipásicas utilizando o biorreator de leito fixo e de leito agitado. e do estudo da morfologia do fungo utilizando o sistema agitado e estático. poderia contribuir para elucidar esta questão. como utilização de ar seco ou ajuste da temperatura do ar de entrada.

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