Seccin Microbiologa de Alimentos

Fecha emisin: PROCEDIMIENTO RECUENTO DE 20-09-2000 MICROORGANISMOS HETEROTROFOS EN Revisin: 2 PLACA. METODO STANDARD METHODS FOR EXAMINATION OF WATER AND Fecha revisin: WASTEWATER 02-07-2008 Pgina 1 de 15 PRT- 712.02-072

1. OBJETIVO Conocer el nmero de microorganismos heterotrficos viables que contiene una muestra de agua de dilisis para verificar la calidad bacteriolgica especificada en el Decreto Supremo N 2357/94 del MINSAL. 2. CAMPO DE APLICACIN Y ALCANCE Aplicar este procedimiento a todas las aguas de dilisis que sean recepcionadas para anlisis microbiolgico. 3. FUNDAMENTO

Este es un mtodo de recuento en placa y siembra en profundidad. Los resultados de este anlisis permiten: Verificar efectividad de los procedimientos de limpieza y desinfeccin. Determinar el origen de la contaminacin durante el proceso de dilisis. Verificar condiciones ptimas de almacenamiento y transporte del agua utilizada para alimentar el sistema de dilisis.

El Decreto Supremo N 2357/94 especifica que la calidad bacteriolgica del agua a usar en dilisis " cada centro de dilisis debe realizar un cultivo semestral del agua teniendo como recuentos mximos aceptables 200 UFC/mL en agua tratada y 2000 UFC/mL del lquido de dilisis post dializador. 4. 4.1 REFERENCIAS Standard Methods for Examination of Water and Wastewater 21th Ed 2005 pag. 9-34 a 938.

Seccin Microbiologa de Alimentos 5. 5.1 6. 6.1

Fecha emisin: PROCEDIMIENTO RECUENTO DE 20-09-2000 MICROORGANISMOS HETEROTROFOS EN Revisin: 2 PLACA. METODO STANDARD METHODS FOR EXAMINATION OF WATER AND Fecha revisin: WASTEWATER 02-07-2008 Pgina 2 de 15 PRT- 712.02-072

TERMINOLOGA Heterotroficos: Organismos que se alimentan de sustancias orgnicas. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS MATERIALES Y EQUIPOS

6.1.1 Placas Petri estriles de vidrio o de plstico de 90 -100 mm de dimetro. 6.1.2 Tubos de 16 x 160 mm marcados en 9 y 10 ml, que contengan 9 mL de solucin diluyente estril. 6.1.3 Pipetas bacteriolgicas estriles de 1 mL. 6.1.4 Incubadora regulada a 25 1C (rango 20C a 28C) o incubadora a 35C 1C) 6.1.5 Bao de agua termorregulado a 47 C 2 C. 6.1.6 Agitador de tubos 6.1.7 Contador de colonias, tipo Quebec de campo oscuro o equivalente. 6.2 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS Para preparar medios de cultivo, reactivos y blancos de dilucin slo se debe usar agua que ha sido tratada por desionizador, para dejar libre de trazas de metales disueltos y componentes bactericidas e inhibitorios. 6.2.2 DILUYENTE: Agua peptonada estril 0.1 %, (Straka and Stokes, 1957) pH 7 0.1 o agua buffer fosfato, distribuida en volmenes de 9 0,2 ml en tubo tapa rosca marcado en 9 y 10 mL o en frascos con 99 2 mL. 6.2.3 AGAR PARA RECUENTO EN PLACA: Es recomendable usar un agar pobre en nutrientes como el agar R2A pH 7.2 con el cual se obtienen recuentos mas altos que con agar Plate Count. En caso de no contar con este agar se puede usar Agar Plate Count Agar o Standard Methods Agar estril, pH 70.1, distribuido en frasco Schott con 200 mL. La formulacin de Merck cdigo 1.00416 es idntica a la descrita en Standard Methods for Examination of Water and Wastewater 21th Ed 2005. (Frmula agar R2A: extracto de levadura 0,5 g, proteosa peptona 0,5 g, casamino cido 0,5 g, glucosa 0,5 g, almidn soluble 0,5 g, dipotasio hidrgeno fosfato 0,3 g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,05 g, piruvato de sodio 0,3 g, agar 15 g, agua 1 L pH 7.2, esterilizar a 121 C por 15 minutos).

6.2.1 AGUA RECOMENDADA PARA USO EN MICROBIOLOGIA

Seccin Microbiologa de Alimentos 7. 7.1 7.1.1 DESARROLLO PROCEDIMIENTO

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Recibir en el Laboratorio de Recuentos, las muestras enumeradas en el Laboratorio de Recepcin de Muestras de esta seccin. Estas muestras son procesadas segn el PRT712.01-001 de "Procedimiento de Recepcin de las muestras" y el PRT-712.01-002 de "Procedimiento de procesamiento de muestras de alimentos y agua". Anotar en cuaderno de inscripcin, la clave y nmero de las muestras a sembrar. Verificar que el volumen de cada tubo de dilucin marcado, contengan 9 mL. Preparar diluciones decimales de 101, 10, 10 , etc. a partir de la muestra lquida directa. Para ello transferir 1 mL a un tubo con 9 mL de diluyente o 1 mL en 99 mL de diluyente ( dil 10) .Agitar y proceder de igual forma para las diluciones siguientes. Identificar las placas Petri con lpiz azul las que se incubarn a temperatura entre el rango 20 C y 28C. Colocar clave, nmero de la muestra y dilucin a cada una de ellas. Sembrar 1 mL por duplicado de la muestra directa y cada dilucin en placas estriles previamente identificadas. Sembrar como mnimo dos diluciones consecutivas. Tambin se pude sembrar 1 mL en duplicado de la muestra directa y 0,1 mL en duplicado de la muestra directa. A continuacin diluir 10 tomando 1 mL de la muestra directa en 99 mL de diluyente y sembrar de esta dilucin 1 mL en duplicado y 0,1 mL en duplicado.Sembrar como mnimo 2 diluciones consecutivas. Verter en cada placa Petri aproximadamente 15 mL de agar previamente fundido y mantenido en bao de agua a 47 2 C. Mezclar el inculo con el medio fundido, inclinando y girando las placas. La forma adecuada de llevar a cabo esta operacin sera la siguiente:

7.1.2 7.1.3 7.1.4

7.1.5 7.1.6 7.1.7

7.1.8 7.1.9

7.1.9.1 Mover la placa con movimientos de vaivn 5 veces en una direccin, 7.1.9.2 hacerla girar 5 veces en el sentido de las agujas del reloj, 7.1.9.3 mover con movimientos de vaivn en una direccin que forme ngulo recto con la primera y 7.1.9.4 hacerla girar 5 veces en el sentido contrario a las agujas del reloj. 7.1.10 Una vez solidificado el agar, invertir las placas rpidamente para prevenir el crecimiento de colonias invasivas por acumulacin de humedad. Incubar a temperatura entre el rango de 20C a 28C durante 6 das 1 da.

Seccin Microbiologa de Alimentos 7.1.11

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Con el fin de validar los resultados se recomienda realizar controles de ambiente, control de esterilidad del medio de cultivo y diluyente y registrar esta informacin en los registros respectivos.

7.2 7.2.1 7.2.2 7.2.3 7.2.4 7.2.5 7.2.6 7.2.7

LECTURA Luego de cumplir el perodo de incubacin, realizar la lectura de las placas Si no es posible leerlas prontamente, guardarlas a 4C por no ms de 24 horas, pero esto no hay que hacerlo de rutina. Realizar el recuento con un contador de colonias modelo Quebec de campo oscuro. Examinar las muestras dudosas con mayor aumento para distinguir las colonias de materias extraas. Evitar la fatiga ocular que puede causar imprecisiones. Anotar la dilucin usada y el nmero de colonias contadas en cada placa. Registrar los resultados en el registro RG-712.00-068 y los controles realizados en los registros especificados en el punto 8. de este procedimiento RECUENTO DE COLONIAS Y REGISTRO Para el recuento de hetertrofos se sugiere indicar el mtodo usado, tiempo y temperatura de incubacin y el medio de cultivo seleccionado. Para el clculo de recuento de colonias en placa se realiza de acuerdo al siguiente esquema:

7.3

7.3.1 7.3.1.1 7.3.1.2 7.3.1.3 7.3.1.4

Placas normales (30 - 300 colonias): Seleccionar las placas libres de crecimiento invasivo. Contar todas las colonias incluyendo aquellas de tamao muy pequeo. Anotar por dilucin, el nmero de colonias contadas en cada placa. Realizar el clculo para recuento de microorganismos hetertrofos en placa, dividiendo el nmero total de colonias por placa por el volumen de muestra o calcular el promedio (duplicado de palcas de la misma dilucin) multiplicado por el factor de dilucin correspondiente.

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7.3.2

Casos especiales

Si no se tienen placas que cumplan con el requisito anterior, proceder de la siguiente manera: 7.3.2.1 Placas sobrepobladas (mas de 300 colonias) :

7.3.2.1.1 Anotar los recuentos de placas sobrepobladas como muy numerosos para contar (MNPC) cuando disponga de placas normales. 7.3.2.1.2 Si no dispone de placas normales en las diluciones sembradas, contar las colonias en porciones de la placa si su distribucin es homognea y calcular el recuento estimado en placa (RPES) como sigue: 7.3.2.1.2.1 Si hay menos de 10 colonias por cm, contar las colonias en 13 cuadrados, seleccionar 7 cuadrados consecutivos horizontales de la placa y 6 cuadrados consecutivos verticales formando ngulo recto, contar cada cuadrado slo una vez.La suma de las colonias de los 13 cuadrados multiplicar por 5 para calcular el nmero de colonias por placa correspondiente a un rea de 65 cm2 o bien calcular el promedio de los 13 cuadrados y multiplicar por 65, multiplicar el valor final por el factor de dilucin respectivo. Para placas de rea 57 cm2 calcular el promedio, multiplicar por 57 y por el factor de dilucin respectivo. Si hay ms de 10 colonias por cm contar las colonias en cuatro de tales porciones. En ambos casos, multiplicar el nmero promedio de las colonias contadas por cm por el rea de la placa usada para estimar el nmero de colonias por placa. Cada laboratorio debe determinar el rea en cm de las placas usadas. Si hay mas de 100 colonias por cm, registrar como >100 ufc / cm y calcule el valor estimado multiplicado por el factor de dilucin respectivo y por el rea correspondiente a la placa utilizada o bien calcule el valor estimado como > 100 ufc/ cm multiplicado por el rea correspondiente a la placa utilizada y divida por el volumen menor de muestra sembrada.

7.3.2.1.2.2

7.3.2.1.2.3

7.3.2.2

Placas con menos de 30 colonias (< 30 colonias)

7.3.2.2.1 Cuando el nmero de colonias desarrollado en 2,0 mL es inferior a 30 registre el resultado observado e informe como recuento en placa estimado (RPES) < 30 ufc/ mL. Si fuese necesario realizar el clculo, promediar el recuento de la misma

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dilucin de las placas en duplicado e informar como recuento en placa estimado (RPES). 7.3.2.3 Placas sin desarrollo de colonias

7.3.2.3.1 Cuando ninguna de las placas presente desarrollo de colonias, registrar como sin desarrollo en la dilucin correspondiente (SD) e informar como < 1 ufc /mL. 7.3.2.4 Crecimiento invasivo

Las colonias invasivas son generalmente de tres tipos: 7.3.2.4.1 El primer tipo son las colonias en cadenas, que al parecer son causadas por desintegracin de un grupo de bacterias cuando la placa Petri es rotada para mezclar el agar con la alcuota analizada. Si solamente existe una de tales cadenas contar como una colonia. Si una o mas cadenas parecieran originarse de fuentes distintas, contar cada fuente como una colonia. No contar cada crecimiento individual de tal cadena como una colonia. 7.3.2.4.2 El segundo tipo de colonia invasora es la que se desarrolla en una pelcula de agua entre el agar y el fondo de la placa Petri. 7.3.2.4.3 El tercer tipo es la que se forma en una pelcula de agua en el costado o en la superficie del agar. 7.3.2.4.4 Estos dos ltimos tipos revelan una acumulacin de humedad en el punto en el cual se origina el crecimiento invasivo. Cuando la alcuota de siembra es uniformemente distribuda en el medio, las bacterias raramente desarrollan colonias invasivas. 7.3.2.4.5 Si en las placas seleccionadas se presenta invasin, realizar recuento de colonias solamente: 7.3.2.4.5.1 7.3.2.4.5.2 7.3.2.4.5.3 Si el rea invadida no excede la mitad de la placa. Si las colonias estn bien distribuidas fuera del rea invadida. Si no se cumple lo anterior, registrar como crecimiento invasivo o accidente de laboratorio.

7.3.2.4.6 Los laboratorios con un 5 % de placas cubiertas con ms de 1/4 de las placas con crecimiento invasivo, deberan tomar medidas inmediatas, para eliminar este problema (reducir la humedad ambiente en la cmara o estufa de incubacin y mezclar cuidadosamente el agar con la siembra).

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7.3.2.5

Accidente de laboratorio o inhibidores de crecimiento bacteriano:

7.3.2.5.1.1 Cuando una placa presenta contaminacin u otra condicin insatisfactoria registrar como "Accidente de Laboratorio". Especificar. 7.3.2.5.1.2 El analista puede sospechar la presencia de sustancias inhibidoras en las muestras que estn siendo analizadas, cuando las placas no tienen crecimiento o tienen proporcionalmente menos crecimiento en las diluciones mas bajas. Tal resultado no debera ser interpretado como evidencia de inhibidores hasta confirmar la presencia de ellos en el producto. 7.4 7.4.1 7.4.1.1 7.4.1.2 EXPRESION DE RESULTADOS Clculo y registro de resultados Para los clculos del Recuento Standard en placa considerar slo los dos primeros dgitos. Si el tercer dgito es 6, 7, 8 o 9 adicionar una unidad al segundo dgito. Si el tercer dgito es 1, 2, 3 o 4 considerar solamente los dos primeros dgitos. Cuando el tercer dgito es 5, agregar una unidad al segundo dgito si este es impar y mantener el segundo dgito si este es par. Usar ceros para los dems dgitos hacia la derecha. Rto Heterotroficos 13.000 12.000 16.000 14.000 Placas normales Cuando los recuentos de los duplicados de placas de slo una de las diluciones caen dentro del rango 30 a 300 colonias : Utilizar para el clculo los recuentos obtenidos en placas normales. Sacar promedio y multiplicar por el factor de dilucin.

7.4.1.3

Ejemplo: Lectura calculada 12.700 12.400 15.500 14.500 7.4.2 7.4.2.1 7.4.2.1.1 7.4.2.1.2

Seccin Microbiologa de Alimentos 7.4.2.2

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Si los recuentos de las placas de dos diluciones consecutivas caen dentro del rango 30-300 colonias calcular el RAM segn la siguiente frmula: C [ ( 1 x n1 ) + ( 0.1 x n2 ) ] x d

N= donde :

N = nmero de colonias por ml o g de producto C = suma de todas las colonias contadas en todas las placas n1 = nmero de placas contadas de la menor dilucion. n2 = nmero de placas contadas de la dilucin consecutiva. d = dilucin de la cul fue obtenido el primer recuento Ejemplo 1 : 100 232 y 244 1 :1000 33 y 28

N = 232 + 244 + 33 + 28 [( 1 x 2 )+( 0.1 x 2 )] x 0,01 = 537 0.022 = 24.409 7.4.2.3 = 24000

Cuando los recuentos de las placas en duplicado caen tanto dentro como fuera del rango 30-300 colonias, usar slo aquellos recuentos que estn dentro de este rango.

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7.4.3 7.4.3.1 Ejemplo 1 : 100 18 0 7.4.4 7.4.4.1

Todas las placas con menos de 30 colonias Cuando las placas de ambas diluciones tienen menos de 30 colonias cada una, informar el recuento como menor de 30 por el recproco del factor de dilucin menor. 1 : 1.000 2 0 Rto ( mL o g ) < 3.000 < 3.000

Todas las placas con mas de 300 colonias Cuando las placas de ambas diluciones tienen ms de 300 colonias cada una (pero menos de 100 por cm) contar las placas ms cercanas a 300, sacar promedio y multiplicar por el recproco de la dilucin. 1 : 1.000 640 Rto ( mL o g ) 640.000 estimado ( RPES )

Ejemplo 1 :100 MNPC

( MNPC = Muy numeroso para contar ) 7.4.5 7.4.5.1 Ejemplo 1 : 100 TNPC TNPC * 1 : 1.000 7.150* 6.490** R A M ( mL o g ) > 6.500.000 * ( RPES ) >5.700.000 **( RPES ) Todas las placas con mas de 100 colonias promedio por cm Estimar que el Rto es mayor de 100 veces la mayor dilucin sembrada, por el rea de placa utilizada y por el recproco de la dilucin.

basado en un rea de placa de 65 cm ( 9 cm )

** basado en un rea de placa de 57 cm ( 8,5 cm )

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7.4.6 7.4.6.1 7.5 7.5.1 7.5.2

Todas las placas con crecimiento invasivo, presencia de inhibidores o accidente de laboratorio. Informar segn corresponda.

INFORME DE RESULTADOS Informar el recuento de heterotrficos en unidades formadoras de colonias (UFC) por mililitro (UFC/mL). Expresar el Resultado con slo un nmero entero y un decimal multiplicado por 10 elevado a la potencia correspondiente. Ej 2.400 2,4 x 103 UFC/mL. REPRODUCIBILIDAD Y ERROR PERSONAL El resultado obtenido al contar por segunda vez las colonias de una placa determinada debe presentar: Una diferencia mxima del 5% en el caso de que este recuento lo realice la misma persona. Una diferencia mxima del 10% en el caso de que este recuento lo haya realizado otra u otras personas. Cuando la diferencia entre ambos es superior a estos lmites, puede deberse a defectos visuales, a la dificultad de reconocer las colonias muy pequeas o lo que es mas frecuente, a la incapacidad para diferenciar las colonias de las partculas ms pequeas.

7.6 7.6.1

7.6.1.1 7.6.1.2 7.6.1.3

7.7 7.7.1

CONTROLES Chequear esterilidad de: Agua de dilucin Agar para recuento en placa ( Plate Count o agar Standard Methods) Pipetas Placas Petri

7.7.1.1 7.7.1.2 7.7.1.3 7.7.1.4

Seccin Microbiologa de Alimentos 7.7.2 7.7.2.1 7.7.2.2 7.7.3 7.7.3.1 7.7.3.2

Fecha emisin: PROCEDIMIENTO RECUENTO DE 20-09-2000 MICROORGANISMOS HETEROTROFOS EN Revisin: 2 PLACA. METODO STANDARD METHODS FOR EXAMINATION OF WATER AND Fecha revisin: WASTEWATER 02-07-2008 Pgina 11 de 15 PRT- 712.02-072

Control de ambiente por mtodo de sedimentacin en placa: Mesn de siembra Flujo laminar Control de temperatura Control de temperatura de incubadora diariamente a 1 hora de la maana y a ltima hora en la tarde. Control de temperatura del bao termorregulado para mantener agar cada da que se siembren muestras.

8.

REGISTROS Almacenamiento Recuperacin Tiempo retencin y disposicin Acceso Papel 5 aos y restringido a disposicin en basura normal personal Seccin partidos en trozos. Microbiologa. 5 aos y disposicin en basura normal partidos en trozos. Proteccin

Identificacin del registro

Registro control Archivador verde ambiente cdigo Registros Laboratorio RG-712.00-009. N346 Seccin Microbiologia Alimentos y Agua. Registro control Archivador verde Acceso Papel esterilidad medios Registros Laboratorio restringido a de cultivo N346 personal Seccin utilizados en el Seccin Microbiologa Microbiologa. anlisis Laboratorio Alimentos y Agua. de recuentos cdigo RG-712.00-010. Registro anlisis de recuento de hetertrofos, recuento de mohos y levaduras en agua de dilisis cdigo RG-712.00-068. Archivador azul Registros de Lecturas e informes de resultados Laboratorio Recuento aerobios mesfilos, S.aureus, Mohos y levaduras Seccin Microbiologa Alimentos Acceso Papel restringido a personal Seccin Microbiologa.

5 aos y disposicin en basura normal partidos en trozos.

Seccin Microbiologa de Alimentos Identificacin del registro

Fecha emisin: PROCEDIMIENTO RECUENTO DE 20-09-2000 MICROORGANISMOS HETEROTROFOS EN Revisin: 2 PLACA. METODO STANDARD METHODS FOR EXAMINATION OF WATER AND Fecha revisin: WASTEWATER 02-07-2008 Pgina 12 de 15 PRT- 712.02-072 Proteccin Recuperacin Tiempo retencin disposicin

Almacenamiento y Agua.

9.

TABLA DE MODIFICACIONES Pg. Modificada 1 1 a 11 Motivo del cambio Se elimina formato pgina 1 por cambio en formato de documento institucional. Se cambia el formato del encabezado de pgina a todo el documento. Se corrige PRT-702.02-072 por PRT -712.02072 1 1 1 1 1 2 2 2 3 3 Se deja pie de pgina slo en pgina 1 y se actualizan los cargos. Se actualiza edicin referencia 4.1 a 21th Ed 2005 Pg. 9-34 a 9-38 Se eliminaron los puntos 4.2 y 4.3 Se incluye el punto 6.1.1 MATERIALES Y EQUIPOS y sus temes. En el punto 6.4 es cambiado a 6.1.4 y se le agreg a la frase: (rango 20C a 28C) o incubadora a 35C 1C) En el punto 6.5 se cambi a 6.1.5 y se corrigi 46-48 1C por : 47 C 2 C. En el punto 6.2 se enumer los temes respectivos. Al segundo prrafo se le asign el punto 6.2.2. y se agreg: ... o agua buffer fosfato,.... 9 0,2 ml ...9 y 10 mL o en frascos con 99 2 mL. 02/07/2008 02/07/2008 02/07/2008 02/07/2008 02/07/2008 Fecha Aprobacin 02/07/2008 02/07/2008

Revisin N 1 1

1 1

3 3

02/07/2008 02/07/2008

Seccin Microbiologa de Alimentos Revisin N Pg. Modificada

Fecha emisin: PROCEDIMIENTO RECUENTO DE 20-09-2000 MICROORGANISMOS HETEROTROFOS EN Revisin: 2 PLACA. METODO STANDARD METHODS FOR EXAMINATION OF WATER AND Fecha revisin: WASTEWATER 02-07-2008 Pgina 13 de 15 PRT- 712.02-072 Motivo del cambio Al prrafo 3 se le asign en nmero 6.2.3 y se actualiz edicin por: 21th Ed 2005. Fecha Aprobacin

En el punto 7.1.1 se corrigi: PRT-702.01-001 por. PRT-712.01-001. PRT-702.01-002 por : PRT-712.01-002 En el punto 7.1.4 se agreg: ... diluyente o 1 mL en 99 mL de diluyente ( dil 10). En el punto 7.1.5 se agreg: .... temperatura entre el rango 20 C y 28C.... En el punto 7.1.6 se agreg: ... de la muestra directa... Se agreg punto 7.1.7 cambiando el orden al resto de los temes. El punto 7.1.7 pasa a ser el punto 7.1.8 y se corrigi: ...48C por: 47 2 C. El punto 7.1.9 se convirti en el punto 7.1.10 y se agreg: ... temperatura entre el rango de 20C a 28C... En el punto 7.1.10 se convierti en el punto 7.1.11 se cambia ...especificados en el punto 10.0 por : respectivos. El punto 7.1.11 cambi a 7. 2 y sus respectivos temes El prrafo cuarto se cambi RG-702.00-068 por : RG-712.00-068 ... punto 10.0 por punto 8. El punto 7.2 se transform en 7.3 y se agreg: Para el recuento de hetertrofos se sugiere indicar el mtodo usado, tiempo y temperatura de incubacin y el medio de cultivo seleccionado. Para el clculo... El punto 7.2.1 se modific a 7.3.1 y se agreg un subitem. El punto 7.2.2 a) se cambi por 7.3.2.1. a1) se cambi por 7.3.2.1.1

02/07/2008

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

4 4 4 4 4 4 4 4 5 5

02/07/2008 02/07/2008 02/07/2008 02/07/2008 02/07/2008 02/07/2008 02/07/2008 02/07/2008 02/07/2008 02/07/2008

1 1

5 5

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Seccin Microbiologa de Alimentos Revisin N Pg. Modificada 5 5 5

Fecha emisin: PROCEDIMIENTO RECUENTO DE 20-09-2000 MICROORGANISMOS HETEROTROFOS EN Revisin: 2 PLACA. METODO STANDARD METHODS FOR EXAMINATION OF WATER AND Fecha revisin: WASTEWATER 02-07-2008 Pgina 14 de 15 PRT- 712.02-072 Motivo del cambio a2) se cambi por 7.3.2.1.2 con sus temes desde el 7.3.2.1.2.1 al 7.3.2.1.2.3 . En punto a2) se agreg: ... como sigue: En la primera vieta de la letra a2) se cambi 12 por 13 y 6 por 7. Se agreg prrafo. En la tercera vieta de la letra a2) se agreg:... calcule el valor estimado multiplicado por el factor de dilucin respectivo y por el rea correspondiente a la placa utilizada o bien calcule el valor estimado como > 100 ufc/ cm multiplicado por el rea correspondiente a la placa utilizada y divida por el volumen menor de muestra sembrada. El punto 7.2.2.b) cambi a 7.3.2.2 y su tem 7.3.2.2.1. Se agreg: Cuando el nmero de colonias desarrollado en 2,0 mL es inferior a 30 registre el resultado observado e informe como recuento en placa estimado ( RPES) < 30 ufc/ mL. Si fuese necesario realizar el clculo, promediar el recuento de la misma dilucin de las placas en duplicado e informar como recuento en placa estimado (RPES). El punto 7.2.2.c) cambi a 7.3.2.3 y su tem respectivo: 7.3.2.3.1 al cual se le agreg al final de la frase: e informar como < 1 ufc /mL. El punto 7.2.2.d) se cambi por 7.3.2.4 por cambio de vietas de letras por nmeros. El punto 7.2.2.e) cambi a 7.3.2.5 por cambio de vietas de letras por nmeros. El punto 7.3 se modifica a 7.4. El punto 7.3.2 a) cambi a 7.4.2.1. El punto 7.3.2.b) cambi a 7.4.2.2 Fecha Aprobacin

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Fecha emisin: PROCEDIMIENTO RECUENTO DE 20-09-2000 MICROORGANISMOS HETEROTROFOS EN Revisin: 2 PLACA. METODO STANDARD METHODS FOR EXAMINATION OF WATER AND Fecha revisin: WASTEWATER 02-07-2008 Pgina 15 de 15 PRT- 712.02-072 Motivo del cambio Fecha Aprobacin

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El punto 7.3.2.c) cambi a 7.4.2.3 El prrafo del punto 7.3.4 se le asign el nmero 7.4.5 El prrafo del punto 7.3.5 se le asign el nmero 7.4.5. El prrafo del punto 7.3.6 se le asign el nmero 7.4.6 El punto 7.4 se modifica a 7.5 El punto 7.5 se modifica a 7.6 Al punto 7.6 se modifico a 7.7 y se le asignaron itemes Se cambia el punto 8.0 RESPONSABLES por REGISTROS y se agreg nueva tabla control de Registro por cambio de formato a nivel institucional. Se cambia el punto 9.0 DISTRIBUCIN por TABLA DE MODIFICACIONES por cambio de formato a nivel institucional Se cambia el punto 10.0 REGISTROS por ANEXOS por cambio formato a nivel institucional.

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10. ANEXOS 10.1 Anexo 1 Registro anlisis de recuento de hetertrofos , recuento de mohos y levaduras en agua de dilisis cdigo RG-712.00-068