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CETEC

Centro

de

Cincias

Exatas

Tecnolgicas Curso de Qumica Licenciatura e Bacharelado Professor Marcelo Paes de Barros Laboratrio de Bioqumica

MTODO DE BRADFORD PARA IDENTIFICAO DE PROTENAS

2014

CETEC - Centro de Cincias Exatas e Tecnolgicas


RGM Nome Assinatura

2014

NDICE
1. 1.1. 1.2. 2. 2.1. DE 3. 4. 4.1. 5. 6. 6.1. 6.2. 6.2.1. 6.2.2. 6.2.3. 6.3. 6.3.1. 6.3.2. 6.3.3. 6.4. 6.4.1. 6.4.2. 6.4.3. 7. 8. INTRODUO .................................................................................................................... 4 A SEQUNCIA DE AMINOCIDOS DA PROTENA .............................................. 4 A ESTRUTURA DAS PROTENAS ............................................................................ 5 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 6 DETERMINAO DA CONCENTRAO DE PROTENAS PELO MTODO 6 MATERIAIS E REAGENTES ........................................................................................... 6 PROCEDIMENTO .............................................................................................................. 6 OBSERVAES: .......................................................................................................... 7 RESULTADOS E DISCUSSES .................................................................................... 7 CONCLUSES................................................................................................................... 8 MTODOS ESPECTROFOTOMTRICOS MAIS UTILIZADOS PARA A ........... 8 O MTODO DE BIURETO ........................................................................................... 8 PRINCPIO .................................................................................................................. 8 APLICAES ............................................................................................................. 9 INTERFERENTES...................................................................................................... 9 O MTODO DE LOWRY .............................................................................................. 9 PRINCPIO .................................................................................................................. 9 APLICAES ........................................................................................................... 10 INTERFERENTES.................................................................................................... 10 O MTODO DE BRADFORD .................................................................................... 11 PRINCPIO ................................................................................................................ 11 APLICAES ........................................................................................................... 11 INTERFERENTES.................................................................................................... 11

CONCLUSO FINAL ...................................................................................................... 12 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ............................................................................. 12

1. INTRODUO
As protenas so macromolculas orgnicas formadas pela sequncia de vrios aminocidos, unidos por ligaes peptdicas (cadeia polipeptdica). Desempenha diversas funes no organismo, sendo: estrutural, hormonal, enzimtica, imunolgica, nutritiva e de transporte citoplasmtico. Dependendo da capacidade metablica, alguns seres vivos, como por exemplo, os vegetais (seres autotrficos), conseguem sintetizar todos os polipeptdeos necessrios ao equilibrado funcionamento do organismo. No entanto, os animais (seres heterotrficos), requerem os nutrientes essenciais atravs do hbito alimentar, suprindo as restries metablicas.

1.1. A SEQUNCIA DE AMINOCIDOS DA PROTENA


Uma protena pode conter milhares de aminocidos, com sequncia dessas unidades determinada pela informao gentica contida no gene, um seguimento da molcula cromossmica. Portanto, todo o funcionamento de um organismo conduzido pelo controle das molculas de DNA. A partir do DNA ocorrem as transcries, com a fabricao de RNAs: transportadores, ribossmicos e mensageiros. Esses elementos, cada um com incumbncia peculiar no auxlio do processo de traduo, proporcionam a produo de uma ou vrias protenas. Portanto, as protenas sintetizadas possuem caractersticas prprias, desempenhando funes especficas no organismo. Qualquer anormalidade gentica, transcricional ou traducional (mutaes ou eventuais erros), incidem diretamente sobre a protena, comprometendo a forma e o funcionamento desta. Problemas assim podem ser desencadeados por trs formas: deleo de um aminocido decorrente de uma sndrome gentica transmitida ao mecanismo de transcrio; ou uma simples troca de aminocidos (substituio errnea), pela colocao de outro aminocido que no deveria ser introduzido em tal posio na cadeia peptdica; ou pela inverso da posio modificando a ordem sequencial dos aminocidos, as duas ltimas relacionadas transcrio ou tambm traduo. Essas alteraes normalmente podem resultar na inativao da protena.

1.2. A ESTRUTURA DAS PROTENAS


A sequncia dos aminocidos em uma protena representa a estrutura primria, responsvel pelas propriedades da molcula. Em decorrncia existncia de pontes de hidrognio entre o hidrognio (carga positiva +) de um aminocido com o oxignio ou nitrognio (carga negativa -) de um outro aminocido no adjacente, proporcionada uma toro na cadeia filamentosa, assumindo a protena uma forma de helicoidal. Uma protena no apresenta necessariamente aspecto linear helicoidal. As propriedades qumicas dos aminocidos podem ter efeitos de atrao ou repulso uns para com os outros, principalmente pelo estabelecimento de pontes bissulfeto (ligao envolvendo dois tomos de enxofre de aminocidos cisteina), causando flexes (dobras) sobre si mesma, chamada de estrutura terciria. O agrupamento de duas ou mais estruturas tercirias combinadas a outras substncias, vitaminas ou minerais: ferro, magnsio, iodo, forma a estrutura quaternria. Configurao espacial observada na molcula de hemoglobina, protena conjugada a on ferro, compondo os glbulos vermelhos (hemcias ou eritrcitos do sangue), permitindo o transporte de oxignio.

O Mtodo de Bradford simples, preciso e rpido por isso mais indicado para a deteco e quantificao de protenas solubilizadas em meios sem detergentes. O mtodo requer poucas etapas de misturas, no necessita de aquecimento e possui uma grande estabilidade colorimtrica, com pouca ou nenhuma interferncia de ctions como sdio ou potssio. O reagente de Bradford contm como seu principal componente o corante Coomassie Brilliant Blue G-250 em soluo cida, este ao ligar-se s protenas, tem a sua absorbncia alterada de 465nm para 595nm. Esta interao entre o corante Coomassie com a protena, estabiliza a forma aninica do corante, causando uma visvel mudana de colorao inicialmente castanho para tons de azul, de acordo com a concentrao da protena.

A absorbncia pode ser medida em um espectrofotmetro ou leitor de microplacas utilizando o comprimento de onda de 595nm. A comparao dos resultados com uma curva padro, com valores de concentraes conhecidos, permite a determinao da concentrao da protena em estudo.

2. OBJETIVOS 2.1. DETERMINAO DA CONCENTRAO DE PROTENAS PELO MTODO DE BRADFORD


Determinar a curva padro de protenas presentes na amostra da Albumina do Soro Bovino (BSA). Determinar a concentrao de uma amostra desconhecida.

3. MATERIAIS E REAGENTES
Tubos de ensaio; Pipeta graduada de 1 mL; Pipeta graduada de 5 mL; Espectrofotmetro; gua destilada; Albumina do Soro Bovino (BSA).

4. PROCEDIMENTO
5 tubos de ensaio foram numerados e adicionamos as seguintes solues descritas na tabela abaixo: Tubos H2O (mL) Albumina BSA (mL) 1 1 5 0,9 0,1 2 0,8 0,2 3 0,6 0,4 4 0,2 0,8

Aps o cumprimento dessa etapa, foi adicionado em todos os tubos a quantidade de 2,5 mL do reagente de Bradford e aguardamos 5 minutos para que houvesse a reao. Foi observado um leve degrade azulado entre os tubos de ensaio. Decorrido o tempo, os tubos de ensaio preparados foram levados para o espectrofotmetro para anlise de absorbncia. Em outro tubo de ensaio, foi adicionado 1 mL da soluo problema, identificada como Soluo X e acrescentado 2,5 mL do reagente de Bradford, aps isso, aguardou-se novamente os 5 minutos necessrios para ocorrer a reao.

Passado o tempo necessrio, levamos a amostra X ao espectrofotmetro para medio de sua Absorbncia.

4.1. OBSERVAES:
O procedimento seria realizado com apenas 4 tubos de ensaio e a soluo problema, mas devido ao resultado apresentado nos dois ltimos tubos (3 e 4), onde mostraram que estavam no limite do nvel de deteco do mtodo, por orientao do professor, incluiu-se outro tubo de ensaio, identificado como tubo 5. A ordem entre os tubos tambm foi alterada para ficar de modo crescente para mais fcil compreenso do grfico.

5. RESULTADOS E DISCUSSES
A anlise no espectrofotmetro nos deu os resultados apresentados abaixo: Tubo 1 0,280 Tubo 5 0,410 Tubo 2 0,508 Tubo 3 0,524 Tubo 4 0,527 Tubo X 0,440

Com esses dados em mos, foi possvel criar o grfico com a curva padro do BSA.

Curva padro do BSA


0,7 0,6

Absorbncia 595nm

0,5 0,4 0,3 0,2 0,28 0,1 0 0 0,1 0,2 0,3 0,41 0,508

0,524

0,527

y = 0,2478x + 0,3755

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

BSA 1mg/mL

Realizado o estudo do grfico, o mesmo no apresentou os resultados de forma crescente e linear, pois como foi orientado pelo professor a Albumina estava com concentraes muito prximas ao seu limite de saturao, logo usamos o recurso matemtico da linha de tendncia do grfico para achar a equao da reta e realizar os clculos a seguir.

Atravs da equao da curva padro foi possivel obter o valor da concentrao da Amostra X. O valor da absorbncia e colocado no lugar do y, e o valor de X, a concentrao que queremos obter, logo: Dados: y = 0,2478x + 0,3755 (equao da reta) y = 0,440 (valor da absorbncia da amostra x encontrada) Resoluo: y = 0,2478x + 0,3755 0,440 = 0,2478x + 0,3755 0,0645 = 0,2478x x = 0,0645 / 0,2478 x = 0,260 mg/mL A concentrao da amostra X de 0,260 mg/mL, pois a concentrao trabalhada com o BSA.

6. CONCLUSES 6.1. MTODOS ESPECTROFOTOMTRICOS MAIS UTILIZADOS PARA A DETERMINAO DE PROTENAS TOTAIS
Muitos mtodos espectrofotomtricos, ao longo dos anos, tm sido propostos para a determinao de protenas totais, mas no existe uma metodologia considerada de uso universal para todos os meios. Os mtodos geralmente mais utilizados so o do biureto, de Lowry, do Coomassie brilliant blue BG-250 ou reagente de Bradford, do BCA ou reagente de Smith, e de absoro de protenas no ultravioleta. A seguir sero discutidas as vantagens e desvantagens de algumas dessas metodologias.

6.2. O MTODO DE BIURETO 6.2.1. PRINCPIO


As origens do mtodo do biureto podem ser traadas desde a proposta inicial de Autenrieth, em 1915; posteriormente diversos autores propuseram modificaes do mesmo, sendo, atualmente, a proposta metodolgica de Gornall e cols. a mais utilizada. O mtodo se baseia na reao do reativo do biureto, que constitudo de

uma mistura de cobre e hidrxido de sdio com um complexante que estabiliza o cobre em soluo, sendo o tartarato de sdio o recomendado por Gornall e cols. O cobre, em meio alcalino, reage com protenas formando um complexo quadrado planar com a ligao peptdica. O produto de reao apresenta duas bandas de absoro, uma em 270 nm e outra em 540 nm. Apesar da banda na regio de 270 nm aumentar em seis vezes a sensibilidade do mtodo do biureto, a banda na regio de 540 nm a mais utilizada para fins analticos, porque diversas substncias, normalmente presentes na maioria dos meios analisados, absorvem na regio de 270 nm causando muita interferncia no mtodo.

6.2.2. APLICAES
O mtodo de biureto tem sido aplicado para determinar a concentrao de protenas totais em diversos meios, sendo eles: soro ou plasma sangneo, lquido crebro espinhal, urina, alimentos, saliva, fibrinognio e tecido animal. O mtodo de biureto tem sido, tambm, utilizado em anlise por injeo em fluxo, assim como em alguns mtodos cinticos. Apesar de ser rpido, utilizar reagentes de baixo custo e no apresentar grande variao da absortividade especfica para diferentes protenas, este mtodo no muito sensvel, como foi destacado por diversos autores, colocando-o em grande desvantagem, em relao a outras metodologias, e por isto tem sido, ao longo dos anos, substitudo por mtodos mais sensveis. Mesmo assim, o mtodo de biureto continua sendo recomendado para a determinao da concentrao de protenas totais em plasma sangneo pela Associao Americana de Anlises Clnicas e por diversos autores, bem como para a determinao de protenas totais em saliva e leite, quando comparado com outros mtodos.

6.2.3. INTERFERENTES
Verifica-se que o mtodo de biureto est sujeito interferncia de substncias que possam reagir com os ons cobre (II). Os mtodos para sua eliminao variam conforme o caso, no entanto, recomenda-se a precipitao das protenas com cido tricloroactico e posterior solubilizao para determinao das mesmas.

6.3. O MTODO DE LOWRY 6.3.1. PRINCPIO


O mtodo que atualmente conhecemos como mtodo de Lowry para a determinao de protenas totais, foi originalmente proposto por Wu, em 1922, sendo

esta a metodologia mais utilizada para a determinao de protenas. O princpio do mtodo baseia-se numa mistura contendo molibdato, tungstato e cido fosfrico, (reagente Folin-Ciocalteau), que sofre uma reduo quando reage com protenas, na presena do catalisador cobre (II), e produz um composto com absoro mxima em 750 nm. Chou, Goldstein e Legler estudaram extensivamente o mecanismo de reduo do reagente de Folin-Ciocalteau por protenas, peptdeos ou aminocidos. Estes autores sugerem que esta reduo ocorra diretamente atravs das cadeias laterais de alguns aminocidos (tirosina, triptofano, cistena, asparagina e histidina), que contribuem com quatro eltrons, ou atravs da retirada de dois eltrons de cada unidade tetra-peptdica dos peptdeos e protenas, que facilitada pela formao do quelato entre o cobre (II) e peptdeos/protenas.

6.3.2. APLICAES
A principal vantagem do mtodo de Lowry a sua alta sensibilidade e, por isto, tem sido utilizado para a determinao da concentrao de protenas totais em diversos meios, sendo eles: plasma sangneo, saliva humana, tecido animal, plantas, suco biliar, membranas, leite humano e produtos alimentcios. Sargent props uma modificao no mtodo de Lowry que possibilitou o aumento da sensibilidade em cinqenta vezes. Tal modificao est baseada no fato de que o verde de malaquita reage com o azul de molibdato produzido no mtodo de Lowry e o produto desta reao absorve fortemente em 690 nm aumentando a sensibilidade do mtodo de Lowry. Devido ao seu extenso uso, o mtodo de Lowry tem sido utilizado em diversos tipos de equipamentos automatizados. Em estudos comparativos de mtodos, alguns autores recomendam a utilizao da metodologia proposta por Lowry para determinar protenas totais em: tecido animal e tecido vegetal. Os autores, de maneira geral, recomendam o mtodo de Lowry, pois no estudo comparativo de metodologias o mesmo mostrou-se mais sensvel, com melhor exatido, menor consumo de amostra e, dependendo do caso, menos suscetvel a alguns tipos de interferentes.

6.3.3. INTERFERENTES
Apesar do mtodo de Lowry apresentar uma grande sensibilidade para protenas, o mesmo possui algumas desvantagens, tais como: estar sujeito a muitos interferentes, apresentar longo tempo de anlise, possuir absortividade especfica altamente varivel para diferentes protenas, e seguir a Lei de Beer-Lambert apenas numa pequena faixa de concentrao de protenas.

6.4. O MTODO DE BRADFORD 6.4.1. PRINCPIO


O mtodo de Bradford uma tcnica para a determinao de protenas totais que utiliza o corante de Coomassie brilliant blue BG-250. Este mtodo baseado na interao entre o corante BG-250 e macromolculas de protenas que contm aminocidos de cadeias laterais bsicas ou aromticas. No pH de reao, a interao entre a protena de alto peso molecular e o corante BG-250 provoca o deslocamento do equilbrio do corante para a forma aninica, que absorve fortemente em 595 nm76.

6.4.2. APLICAES
O mtodo de Bradford, mais rpido e sensvel que o de Lowry e tem sido utilizado para a determinao de protenas totais em diversos meios: plasma ou soro sangneo, saliva humana, produtos alimentcios, leite humano, tecidos de plantas, suspenses de clulas, avidina e estreptavidina, urina e detergentes. Alguns autores recomendam o mtodo de Bradford para a determinao de protenas totais em leite humano e urina. No entanto, com relao urina, diversos autores destacam dois fatores contra a utilizao desta metodologia, sendo um deles a dependncia entre o nmero de diluies da amostra e o resultado da concentrao de protena obtido e, o outro, a presena de protenas de baixo peso molecular, subestimando a concentrao de protenas totais na urina, principalmente, de pacientes com proteinria.

6.4.3. INTERFERENTES
Apesar do mtodo de Bradford11 ser mais rpido, sensvel e estar sujeito a um nmero bem menor de interferentes que o mtodo de Lowry, o mesmo apresenta algumas desvantagens, tais como a variao da absortividade especfica para diferentes protenas, devido baixa solubilidade ou baixo peso molecular das mesmas, e fornecimento de resultados nem sempre reprodutveis devido ao grau de pureza do corante BG-250 que varia conforme a procedncia, sendo recomendvel a padronizao das condies de reao para cada lote de corante adquirido. Para tentar tornar mais uniforme a absortividade especfica de diferentes protenas, algumas alternativas so sugeridas: aumentar a concentrao do corante; aumentar a solubilizao das protenas que vo reagir com o corante, usando detergentes, hidrxido de sdio ou fenol; ou aquecer com uria e 2-mercaptoetanol. Entretanto, no

caso de amostras com protenas de baixo peso molecular, no recomendamos a utilizao deste mtodo. A falta de linearidade na lei de Beer-Lambert tem sido, tambm, observada devido a uma variao do pH quando da adio da amostra ao reagente BG-250.

7. CONCLUSO FINAL
Diversos fatores devem ser analisados antes da escolha de uma metodologia para a determinao de protenas totais, porm, um deles essencial: o conhecimento, o mais preciso possvel, da natureza dos constituintes da amostra e de suas concentraes aproximadas. Isto facilitar a identificao dos possveis interferentes e conseqentemente ajudar na escolha do mtodo mais apropriado para cada situao. Outros fatores, tambm importantes, so a sensibilidade necessria, que dependente da concentrao de protena na amostra e do volume de amostra disponvel; a rapidez e o custo da metodologia; e, no menos importante, o grau de confiabilidade nos resultados obtidos devido aos interferentes no mtodo escolhido.

8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
1. LEHNINGER, Albert Lester, 1917-1986. Lehninger princpios de bioqumica/ David L. Nelson, Michael M. Cox; traduzido por Arnaldo Antnio Simes, Wilson Roberto Navega Lodi. 3. Ed. So Paulo 2002. 2. PROTENAS/http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/ const_microorg/proteinas.htm. Acessado em 10/04/2014

3. Ganong, W. F.; Review of Medical Physiology; 17 edio, Prentice-Hall

Inc.; San Francisco, 1995.