Roteiro de Aula Prática

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida

Para a separação das proteínas, pode ser empregada a técnica de eletroforese

em gel de poliacrilamida a 10 %, vertical, em sistema descontínuo de tampões,
segundo HAMES & RICKWOOD (1990).

1. Preparação das Placas

Placas de vidro medindo 18 Χ 16 cm são lavadas com detergente e enxaguadas

em água corrente, sendo em seguida secas e limpas com álcool 70%. Espaçadores de
plástico com 0,1 cm de espessura e vaselina sólida (colocada entre os espaçadores e as
placas de vidro para a perfeita vedação) são utilizados na montagem das placas.

2. Preparo do Gel de Separação

O gel de separação é preparado utilizando-se as soluções 1, 3, 4, 6 e TEMED

descritas na Tabela 1. Estas soluções devem ser misturadas nas quantidades descritas
na Tabela 2 e em seguida colocadas cuidadosamente nos moldes de vidro. Uma fina
camada de água deve ser colocada sobre esta solução, evitando-se assim a formação
de um menisco côncavo, efeito este provocado pela tensão superficial do gel. O
conjunto deve ser mantido em ambiente escuro até a polimerização do gel.

3. Preparo do Gel de Empilhamento

O gel de empilhamento, preparado com as soluções 1, 2, 5, 6 e TEMED

(Tabela 1) nas devidas quantidades (Tabela 2), deve ser colocado sobre o gel de
separação (já polimerizado), formando uma camada de aproximadamente 1,0 cm de
altura. Um molde de plástico (pente com 10 dentes) deve ser introduzido nesta
camada para a formação dos poços de aplicação, sendo a polimerização efetuada sob
luz fluorescente.

4. Preparação da Cuba Vertical

Após a preparação dos géis, as placas são fixadas em cubas verticais com o
auxílio de prendedores metálicos (Grampomol).
Nos reservatórios das cubas é colocado tampão Tris-Glicina (Tabela 3), pH 8,6,
diluído 1:10. No tanque superior ainda são colocadas aproximadamente 5 gotas de
solução de Azul de Bromofenol (0,05%) como indicador da frente de corrida.

5. Aplicação das Amostras

Para a corrida eletroforética do plasma sangüíneo são aplicados diferentes

volumes das amostras diluídas de cada animal, de maneira que em cada ponto de
aplicação seja colocada uma solução contendo aproximadamente 30 µg de proteína
plasmática total.
No caso das hemoglobinas devem ser aplicados volumes contendo
aproximadamente 20 µg da proteína.
Estas quantias são determinadas previamente, tomando-se uma amostra diluída
e realizando uma corrida eletroforética com diferentes concentrações (150 à 15 µg no
caso do plasma e 50 à 5 µg no caso da hemoglobina), sendo assim possível determinar
a concentração que produz a melhor definição das bandas das proteínas em estudo.

6. Corrida Eletroforética

Após a aplicação das amostras, conecta-se a cuba a uma fonte estabilizadora de

eletroforese ( Pharmacia - EPS 600 ), fixando-se a voltagem em 125 V e a amperagem
em 5 mA. A corrida pode ser realizada overnight, durante aproximadamente 16 horas,
à 40 C.
7. Coloração e Descoloração

Após a corrida eletroforética, os géis são retirados dos moldes de vidro e

imersos em solução fixadora de metanol, ácido acético e água, 400:70:530 (v/v)
durante 40 minutos. Em seguida são colocados em solução corante Coomassie Blue
R250 durante 3 a 4 horas.
Transcorrido o tempo de coloração, o gel é deixado em solução descorante de
álcool etílico, ácido acético e água, 200:50:250 (v/v), até a completa evidenciação das
bandas.

TABELA 1- Soluções estoques utilizadas no preparo do gel de separação e do gel de

empilhamento.
SOLUÇÕES COMPONENTES pH DA SOLUÇÃO

1 Acrilamida 30,0g
Bis-Acrilamida 0,8g
Água q.s.p. 100 mL

2 TRIS 6,0g
HCl 1N 48,0 mL
6,8
Água 40,0 mL

3 TRIS 36,3g
HCl 1M 48,0 mL
8,8
Água q.s.p. 100 mL

4 Perssulfato de Amônio 0,375 mg

Água 25,5 mL

5 Riboflavina 4,0 mg
Água q.s.p. 100 mL

6 Uréia 5M

Onde: Tris: Tris (hidroximetil) aminometano

HCl: Ácido Clorídrico

Bis-Acrilamida: N,N - Metilene Bis-Acrilamida

TABELA 2 - Soluções e quantias utilizadas na preparação do gel de separação

(10%) e gel de empilhamento.

GEL DE SEPARAÇÃO GEL DE EMPILHAMENTO

Solução Quantidade Solução Quantidade

1 6,6 mL 1 5,0 mL

3 2,5 mL 2 5,0 mL

4 1,0 mL 5 2,5 mL

6 9,8 mL 6 7,5 mL

TEMED 0,015 mL TEMED 0,015 mL

TEMED: N,N,N’,N’ - Tetrametiletilenodiamino

TABELA 3 - Composição da solução tampão.

Componentes para 100 mL da solução pH da solução

TRIS 6,0 g

GLICINA 28,8 g 8,6

ÁGUA q.s.p.