GM Tesephd

GRAA MARIA HENRIQUES MINAS
MICROSSISTEMA LABORATORIAL PARA

ANLISE DE FLUIDOS BIOLGICOS

Tese submetida na Universidade do
Minho para obteno do grau de
Doutor em Electrnica Industrial

Universidade do Minho
2004

Tese realizada sob a orientao cientfica do
Doutor Jos Higino Gomes Correia e co-orientao
do Doutor Jlio Manuel de Sousa Barreiros
Martins, ambos Professores Associados do
Departamento de Electrnica Industrial da
Universidade do Minho.

Este trabalho de Doutoramento foi apoiado financeiramente pela Fundao para
a Cincia e a Tecnologia (FCT) com uma bolsa de Doutoramento (SFRH / BD / 1281 /
2000) no mbito do Programa Operacional Cincia, Tecnologia e Inovao (POCTI
Formar e Qualificar Medida 1.1).

RESUMO
Os mdicos prescrevem anlises a fluidos biolgicos que so realizadas em
laboratrios de anlises clnicas. Todo este processo moroso em termos de tempo, no
permitindo ao mdico um diagnstico fidedigno na hora da consulta. Para alm da
demora, existem ainda problemas de possveis enganos logsticos, tais como a
etiquetagem errada ou a perda de amostras, o que pode atrasar significativamente o
diagnstico. Para analisar fluidos biolgicos existem, em ambiente laboratorial,
equipamentos sofisticados. Contudo, esses equipamentos utilizam grandes quantidades
de reagentes e so economicamente dispendiosos. Fora do ambiente laboratorial
existem, comercialmente disponveis, as chamadas fitas reagentes. Porm, so poucas
as biomolculas que permitem analisar e a leitura manual da cor no precisa.
Esta tese descreve a concepo, fabrico e teste de um microssistema laboratorial,
denominado de Microlab, para aplicao em anlises clnicas, especialmente para
anlises a fluidos biolgicos. Permite medir a concentrao de biomolculas nesses
fluidos. A medio baseia-se na deteco colorimtrica por absoro ptica, usando luz
branca como fonte de luz, evitando assim o recurso a uma fonte de luz monocromtica
especfica. Esta caracterstica torna-o um dispositivo porttil capaz de efectuar a anlise
em tempo real, sem recorrer a sistemas complexos e economicamente dispendiosos.
O Microlab combina numa construo modular o sistema de microfluidos
fabricado em vidro, o sistema de filtragem ptica fabricado pela deposio de uma
estrutura de multicamadas de filmes finos de materiais dielctricos, e o sistema de
deteco e leitura fabricado segundo um processo de microelectrnica standard CMOS.
Para ser utilizado, um feixe de luz branca direccionado para microcanais nos quais se
encontram as amostras a medir. Esse feixe, com vrias componentes espectrais,
filtrado, atravs de filtros pticos, obtendo-se uma banda muito estreita com apenas
algumas componentes espectrais e centrada no comprimento de onda adequado
biomolcula que se pretende analisar. A intensidade da luz associada s diferentes
componentes espectrais proporcional concentrao das biomolculas em anlise.
medida atravs de fotodetectores colocados por baixo dos microcanais e alinhados
verticalmente com os filtros pticos. Um conversor luz - frequncia foi integrado com
os fotodetectores para converter o sinal analgico num sinal digital.
O Microlab foi testado eficazmente na determinao quantitativa de cido rico
na urina.

ABSTRACT
For diagnostic reasons patients in a hospital are often subjected to biochemical
analysis of their biological body fluids. Usually the analyses are carried out in clinical
laboratories and the results become available after several hours, sometimes days. As a
consequence a reliable diagnosis cannot be performed within the consultation time.
Mistakes in the logistics, such as lost samples and mislabeling, may further delay
diagnosis. The automated equipment used in a state-of-the-art laboratory reduces errors,
but use high sample and reagent volumes, making the analysis systems expensive and
does not contribute to patient comfort. Outside the laboratory environment, reagent
strips are commercially available. Such strips are available for a limited set of
biomolecules to be analyzed and the color readout is merely qualitative.
This thesis describes the concept, fabrication and characterization of a
laboratorial microsystem, called Microlab, for application in clinical analysis,
especially in biological fluid analysis. It allows the measurement of the concentration of
biomolecules in those fluids. That measurement is based on colorimetric detection by
optical absorption, using a white light source for illumination, thus avoiding the use of a
wavelength dependent light source and enabling parallel processing for the simultaneous
detection of several biomolecules. This characteristic makes the Microlab portable and
ensures that the analysis can be performed at any location with instantaneous results,
without the use of complex and expensive analysis systems.
The Microlab combines in a multichip module the microfluidic system
fabricated in glass, the optical filtering system fabricated using a dielectric thin-films
multilayer and the detection and readout system fabricated in a CMOS micro-electronic
process. Operation is based on a white light beam guided through the microchannels
containing the samples to analyze. The impinging light is filtered by the optical filters,
to a narrow spectral band centered at the wavelength for which the biomolecule being
analyzed has its absorption maximum. The intensity of the selected spectral component
transmitted through the fluid is measured using underlying photodetectors, vertically
aligned with the optical filters. This optical intensity is proportional to the biomolecule
concentration. A light-to-frequency converter was integrated with the photodetectors to
convert the analog signal into a digital signal. The Microlabs performance was
demonstrated in the quantitative measurement of uric acid concentration in urine.

SAMENVATTING
Om diagnostische redenen worden bij patinten in een ziekenhuis vaak de
biologische vloeistoffen van het lichaam (bloed, urine, etc.) biochemisch onderzocht. In
het algemeen worden deze analyses in klinische laboratoria uitgevoerd en de resultaten
komen pas na geruime tijd beschikbaar. De diagnose kan daardoor niet in de
consultatietijd worden gesteld. Fouten in de logistiek, zoals zoekraken van buisjes en
verwisseling van labels geeft aanleiding tot verdere vertraging. Geautomatiseerde
apparatuur is algemeen beschikbaar en kan deze problemen aanzienlijk reduceren, maar
in het algemeen is een relatief groot volume aan lichaamsvocht en testvloeistof nodig
voor een analyse, wat de kosten van de analyse en het ongemak van de patint doet
toenemen. Buiten de laboratoriumomgeving zijn testkaartjes commercieel beschikbaar.
Deze kaartjes zijn slechts beschikbaar voor een beperkt aantal biomoleculen en het
meetresultaat is kwalitatief.
Dit proefschrift beschrijft het basisprincipe, fabricage en karakterisatie van een
biochemisch microsysteem (microlab) voor klinische analyse van met name biologische
vloeistoffen. De meting van de concentratie van biomoleculen in deze vloeistof blijkt
mogelijk op basis van colorimetrische detectie, via optische absorptie van licht van een
goed gedefinieerde golflengte en bepaald door het soort biomolecuul. De optische filters
in het microlab maken het gebruik van een simpele witte (breedbandige) lichtbron
mogelijk en bieden potentieel voor de parallelle detectie van de concentratie van een
aantal biomoleculen. De afmetingen van het microlab zijn zodanig, dat een portabel
systeem mogelijk is en het resultaat van de analyse direct beschikbaar komt, zonder
tussenkomst van complexe apparatuur.
Het microlab combineert in een multi-chip systeem het "microfluidic" systeem,
gefabriceerd in glas, het optische filter, gefabriceerd met gestapelde dielektrische dunne
films en de detector en uitleesschakeling in CMOS. De microkanalen met vloeistof
worden beschenen met wit licht. Het licht wordt gefilterd door de biomoleculen, de
dielektrische interferentiefilters en de intensiteit wordt gedetecteerd in een
onderliggende fotodetector. Door de doorlaatband van het dielektrische filter gelijk te
kiezen aan de absorptiepiek van een gekozen biomolecuul, kan de concentratie van dat
betreffende biomolecuul worden bepaald. Een lichtintensiteit-naar-frequentie omzetting
wordt in de uitlezing uitgevoerd om op eenvoudige wijze de fotostroom om te zetten
naar een digitaal signaal. De werking van het microlab is aangetoond via de
kwantitatieve meting van de concentratie van "uric acid" in urine.

Agradecimentos
A autora deseja manifestar o seu mais sincero agradecimento a todas as
instituies e pessoas que, com a sua valiosa colaborao, contriburam para que a
realizao deste trabalho fosse possvel.
Ao Doutor Jos Higino Gomes Correia e ao Doutor Jlio Manuel Barreiros de
Sousa Martins, tenho a agradecer a orientao cientfica, o incentivo, as sugestes e
discusses sempre to oportunas, a confiana e o apoio constantes ao longo de todo o
trabalho. Tenho ainda a agradecer-lhe as sugestes feitas durante a escrita da tese e
reviso final.
Ao Doutor Reinoud F. Wolffenbuttel, pelas discusses tcnicas que em muito
contriburam para a execuo do trabalho.
Aos colegas da Delft University of Technology, Fac. ITS Dept.
Microelectronics, que pelas suas competncias tcnicas sugestes e amizade
contriburam significativamente para este trabalho. Especialmente ao Eng. Ger de
Graff, pelas discusses e aspectos prticos sobre a microelectrnica, ao Doutor Davies
William de Lima Monteiro pela valiosa colaborao e disponibilidade na realizao de
algumas experincias em Delft, ao Eng. LuKasz Paluka que disps do seu tempo para
efectuar as fotografias no SEM e ao Eng. Peter Turmezei pela sua disponibilidade na
demonstrao das tcnicas de SU-8.
Agradeo Doutora Susana Freitas do INESC-MN pelo fabrico dos filtros
pticos. Ao Doutor Paulo Freitas e Doutor Joo Pedro Conde pelas condies materiais
postas disposio no fabrico dos filtros pticos. Tenho ainda a agradecer Eng. Filipa
Fixe pela disponibilidade e apoio nas medies dos filtros pticos no INESC-MN.
meu desejo expressar o meu reconhecimento pela valiosa colaborao e ajuda
do Doutor Joo Pedro Alpuim nas deslocaes e trabalhos no INESC-MN.

Doutora Cristina Pereira e Cristvo Lima, agradeo o entusiasmo e empenho
demonstrados nas medies por espectrofotometria. Ao Doutor Mrio Rui agradeo a
utilizao do espectrofotmetro nos ensaios macroscpicos.
Agradeo ao Doutor Jos Carlos Fernandes Teixeira as condies materiais
postas disposio na caracterizao dos fluidos biolgicos e Eng. Amlia Costa pela
ajuda na obteno dessas caractersticas.
Doutora Filomena Oliveira Soares agradeo a colaborao prestada durante a
escrita da tese e reviso crtica da mesma.
Ao Eng. Jos Carlos Ribeiro agradeo a parceria nos trabalhos realizados.
Aos restantes colegas, tcnicos e secretrias do Departamento de Electrnica
Industrial o meu sincero agradecimento pela amizade, pacincia, bom ambiente e trocas
de impresses no decorrer do meu trabalho. Em particular ao Doutor Jos Gerardo
Rocha pela valiosa colaborao na realizao de algumas experincias e pelo apoio
quando da estadia em Delft.
Eng. Isabel Maria Ferreira da Costa Soares de Barros, ao Doutor Joo Luiz
Afonso, Dr. Brbara Joana Henriques e ao Eng. Vtor Arnaldo Freitas Vieira,
agradeo as sugestes, disponibilidade e a palavra amiga que sempre dispensaram.
Ruth Stephanie Berger agradeo o apoio e amizade que em muito contriburam para
superar os momentos de aperto em Delft.
Aos meus pais, agradeo o carinho e o apoio constante que muito contriburam
para a realizao deste trabalho.
A todos aqueles que, de uma forma directa ou indirecta, contriburam para a
realizao deste trabalho, o meu sincero obrigado.

xv
ndice

Lista de figuras.................................................................................................. xxi
Lista de tabelas................................................................................................ xxix
Lista de smbolos ............................................................................................. xxxi
Lista de acrnimos e termos...........................................................................xxxv
1 Introduo ......................................................................................................1
1.1 Anlise de fluidos biolgicos ....................................................................... 1
1.1.1 Conceito de fluido biolgico ................................................................ 1
1.1.2 Biomolculas medidas nos fluidos biolgicos ..................................... 2
1.1.3 Laboratrios de anlises clnicas .......................................................... 3
1.1.4 Microssistemas de anlise de fluidos biolgicos.................................. 6
1.1.5 Microssistemas de anlise de fluidos biolgicos: estado da arte.......... 8
1.2 Motivao e objectivos............................................................................... 21
1.2.1 Conceito de microssistema de fluidos biolgicos .............................. 21
1.2.2 Microssistema laboratorial para anlise de urina: Microlab............... 22
1.3 Organizao da tese ................................................................................... 25
Bibliografia .......................................................................................................... 26
2 Deteco colorimtrica na quantificao de biomolculas na urina.......31
2.1 Urina............................................................................................................ 31
2.1.1 Histria ............................................................................................... 31
2.1.2 Formao da urina .............................................................................. 32

Microssistema laboratorial para anlise de fluidos biolgicos

xvi
2.1.3 Composio da urina........................................................................... 32
2.1.4 Importncia clnica da proteinria e albuminria ............................... 33
2.1.5 Importncia clnica do cido rico na urina........................................ 34
2.2 Biomolculas em pequenos volumes de urina.......................................... 35
2.2.1 Dimenso de uma molcula de albumina ........................................... 35
2.2.2 Dimenso de uma molcula de cido rico ........................................ 36
2.3 Deteco por espectrofotometria............................................................... 36
2.3.1 Espectro electromagntico .................................................................. 36
2.3.2 Anlise quantitativa na gama da luz visvel........................................ 38
2.3.3 Absoro na gama da luz visvel......................................................... 40
2.3.4 Clculo da Concentrao .................................................................... 41
2.4 Concluso .................................................................................................... 42
Bibliografia........................................................................................................... 42
3 Sistema de microfluidos.............................................................................. 45
3.1 Anlise das caractersticas dos sistemas de microfluidos ....................... 45
3.1.1 Propriedades dos fluidos num microssistema e num sistema
macroscpico ...................................................................................... 45
3.1.2 Misturadores ....................................................................................... 46
3.1.3 Cintica qumica ................................................................................. 46
3.1.4 Caracterizao do fluxo ...................................................................... 47
3.1.5 Difuso................................................................................................ 48
3.2 Mtodo dos elementos finitos..................................................................... 48
3.2.1 Rede de elementos finitos ................................................................... 49
3.2.2 Fundamentos do FEM......................................................................... 50
3.2.3 Uso de programas de elementos finitos .............................................. 50
3.3 Modelo computacional da dinmica do fluido......................................... 51
3.3.1 Geometria do misturador .................................................................... 51
3.3.2 Simulao numrica............................................................................ 52
3.3.3 Propriedades dos fluidos ..................................................................... 53
3.4 Resultados da simulao............................................................................ 54
3.4.1 Concentrao de 80 mg/l de cido rico na urina............................... 55
3.4.2 Concentrao de 1200 mg/l de cido rico na urina........................... 57
ndice

xvii
3.4.3 Aumento da velocidade de fluxo........................................................ 59
3.4.4 Diminuio da largura dos canais....................................................... 60
3.5 Concluso.................................................................................................... 61
Bibliografia .......................................................................................................... 61
4 Filtros pticos ..............................................................................................63
4.1 Filtros pticos baseados em filmes finos .................................................. 63
4.2 Fundamentos da propagao da onda ..................................................... 65
4.2.1 Amplitude da onda ............................................................................. 66
4.2.2 Polarizao ......................................................................................... 68
4.2.3 Condies de fronteira........................................................................ 70
4.3 Propriedades das estruturas com filmes finos......................................... 70
4.3.1 Notao............................................................................................... 70
4.3.2 Caminho ptico .................................................................................. 71
4.3.3 Equaes na interface entre dois filmes ............................................. 72
4.3.4 Coeficientes de reflexo e transmisso............................................... 73
4.3.5 Coeficiente de absoro...................................................................... 75
4.4 Aplicao do mtodo a uma interface ...................................................... 76
4.5 Aplicao do mtodo a um nico filme num substrato........................... 78
4.5.1 Filme dielctrico................................................................................. 78
4.5.2 Filme metlico.................................................................................... 80
4.6 Aplicao do mtodo a uma estrutura multicamada de filmes finos
dielctricos .................................................................................................. 82
4.7 Projecto do filtro ptico............................................................................. 84
4.7.1 Selectividade de um filtro passa-banda .............................................. 84
4.7.2 Canal ptico........................................................................................ 85
4.7.3 Requisitos para o espectro de transmisso do filtro ptico ................ 86
4.7.4 Escolha dos materiais ......................................................................... 86
4.7.5 Software de simulao de filmes finos ............................................... 88
4.7.6 Simulaes pticas ............................................................................. 88
4.8 Projecto da matriz de filtros pticos ........................................................ 92
4.8.1 Princpio ............................................................................................. 92

xviii
4.8.2 Requisitos para o projecto da matriz de filtros pticos....................... 93
4.8.3 Simulaes pticas da matriz de filtros pticos.................................. 94
4.9 Concluso .................................................................................................... 99
Bibliografia......................................................................................................... 100
5 Fotodetector e electrnica em tecnologia CMOS.................................... 103
5.1 Tecnologia CMOS standard em silcio.................................................... 103
5.2 Fotodetectores em tecnologia CMOS...................................................... 104
5.2.1 Fotododos em silcio........................................................................ 104
5.2.2 Fototransstor em silcio.................................................................... 109
5.2.3 Fotododos versus fototransstor ....................................................... 110
5.3 Projecto do fotododo em silcio .............................................................. 111
5.3.1 Escolha do fotododo ........................................................................ 111
5.3.2 Estrutura do fotododo ...................................................................... 112
5.3.3 Simulao da resposta espectral do fotododo com as camadas
dielctricas da tecnologia CMOS standard ...................................... 113
5.4 Electrnica de leitura e de converso ..................................................... 114
5.5 Concluso .................................................................................................. 116
Bibliografia......................................................................................................... 116
6 Fabrico do Microlab ................................................................................. 119
6.1 Sistema de microfluidos ........................................................................... 119
6.2 Sistema de filtragem ptica...................................................................... 121
6.2.1 Processo de deposio....................................................................... 121
6.2.2 Configurao das mscaras............................................................... 122
6.2.3 Sequncia de fabrico......................................................................... 123
6.3 Sistema de deteco e leitura................................................................... 126
6.4 Sistema completo ...................................................................................... 129
6.5 Concluso .................................................................................................. 129
Bibliografia......................................................................................................... 130
ndice

xix
7 Resultados experimentais..........................................................................131
7.1 Deteco da concentrao de biomolculas em pequenos volumes
de urina ..................................................................................................... 131
7.1.1 Mtodo utilizado e equipamentos de medida ................................... 132
7.1.2 Teste da protena total ...................................................................... 133
7.1.3 Teste do cido rico.......................................................................... 134
7.1.4 Espectro de absorvncia da protena total ........................................ 136
7.1.5 Espectro de absorvncia do cido rico ........................................... 137
7.2 Instalao experimental........................................................................... 138
7.3 Sistema de filtragem ptica..................................................................... 141
7.4 Sistema de deteco e leitura................................................................... 143
7.4.1 Fotodetectores................................................................................... 143
7.4.2 Electrnica de leitura........................................................................ 148
7.5 O Microlab na determinao da concentrao de protena total e
cido rico na urina................................................................................. 150
7.5.1 Medio da protena total na urina ................................................... 151
7.5.2 Medio do cido rico na urina ...................................................... 153
7.6 Concluso.................................................................................................. 158
Bibliografia ........................................................................................................ 159
8 Concluses e trabalho futuro....................................................................161
8.1 Concluses ................................................................................................ 161
8.2 Trabalho futuro........................................................................................ 163
Bibliografia ........................................................................................................ 165
Anexos
Anexo I - Informaes essenciais e requisitos das anlises por
deteco colorimtrica ............................................................. A - 3
Anexo II - ndices de refraco do SiO2 e do TiO2 ................................. A - 11
Anexo III - Especificaes tcnicas de filtros pticos passa-banda da
Schott ......................................................................................... A - 15

xx
Anexo IV - Principais esquemas da electrnica de leitura ........................A - 21
Anexo V - Sequncia de fabrico da estrutura multicamada da
Tabela 4.6 ..................................................................................A - 25
Anexo VI - Especificaes tcnicas do fotododo comercial
S1336-5BQ da Hamamatsu...................................................... A - 29
Anexo VII - Constantes fsicas, elctricas e prefixos nas unidades de
engenharia .................................................................................A - 35

xxi
Lista de figuras

Figura 1.1: (a) Clinitek Atlas (cortesia da Bayer Diagnostics, Elkhart, In.);
(b) Model 500 Workstation (cortesia da International Remote
Imaging Systems, Chatsworth, CA.) [2]...................................................... 5
Figura 1.2: Uma fita reagente comercial [5]. ................................................................. 6
Figura 1.3: Chip descartvel da Nanogen [17]............................................................. 10
Figura 1.4: Imagem SEM (Secondary Electron Microscopy) das micro cmaras
em silcio para a PCR [19]......................................................................... 10
Figura 1.5: Esquema do conceito de PCR de fluxo contnuo [20]............................... 11
Figura 1.6: Vista de topo de parte do chip para amplificao de DNA utilizando
a tcnica de PCR de fluxo contnuo [21]................................................... 11
Figura 1.7: (a) Esquema dos 96 canais do microssistema para a sequncia do
DNA; (b) vista em corte; (c) vista pormenorizada da parte de
injeco; (d) vista pormenorizada das curvas [22]. ................................... 12
Figura 1.8: Suportes e colunas microfabricados para cromatografia. Os pilares
mais pequenos tm 5 5 10 m, com canais entre pilares de
largura de 1.5 m [23]. .............................................................................. 13
Figura 1.9: (a) Esquema dos canais; (b) Fotografia do ponto de interseco dos 4
canais, a largura dos canais de 30 m [24]. ............................................ 14
Figura 1.10: (a) Esquema do microssistema fabricado em vidro. Os canais tm
30 m de profundidade. O canal de separao tem 120 m de largura
e o de injeco 150 m; (b) mecanismo para separar e identificar
protenas [33]............................................................................................. 14
Figura 1.11: (a) Esquema; (b) vista em corte da rea de reaco e deteco;
(c) fotografia do microssistema e fotografia ampliada das molculas
no microssistema [34]................................................................................ 15
Figura 1.12: Fotografia do microssistema comparada com uma agulha de seringa
[36]. ........................................................................................................... 16

xxii
Figura 1.13: Desenho esquemtico do microssistema em vidro para electroforese
capilar: (a) operao de carregamento das amostras; (b) operao de
electroforese [37]. ...................................................................................... 17
Figura 1.14: Desenho esquemtico do microssistema. Os canais tm uma
profundidade de 12.1 m, e uma largura de 51.0 m. Os elctrodos
de referncia e os auxiliares (no visveis na figura) esto localizados
no reservatrio de deteco [38]. ............................................................... 17
Figura 1.15: Fotografia do dispositivo completo [39]. ................................................... 18
Figura 1.16: (a) Diagrama esquemtico do prottipo do microssistema no qual os
sensores ISFET esto includos; (b) fotografia do microssistema
fabricado [40]. ............................................................................................ 18
Figura 1.17: Configurao do microssistema para electroforese [42]. ........................... 19
Figura 1.18: Esquema ilustrativo dos canais em PMMA no microssistema [43]. ......... 19
Figura 1.19: Fotografia do dispositivo Urisys1100 [44]. ............................................... 21
Figura 1.20: Esquema da estrutura do Microlab para um canal ptico individual,
vista em corte. ............................................................................................ 23
Figura 1.21: Esquema do Microlab. ............................................................................... 24
Figura 1.22: Fotografia do Microlab. ............................................................................. 25
Figura 2.1: Espectro electromagntico [6]. .................................................................. 37
Figura 2.2: Alterao no espectro de absoro: (a) espectro da biomolcula a
quantificar; (b) espectro da mistura da biomolcula A com cromforo
para ser quantificado por colorimetria. ...................................................... 39
Figura 2.3: Alterao no espectro de absoro: (a) espectro da biomolcula a
quantificar; (b) alterao do espectro para desviar o mximo da
absorvncia da biomolcula A para C. ....................................................... 39
Figura 2.4: Diagrama de nveis de energia com algumas das alteraes de
energia que ocorrem durante a absoro, para uma espcie molecular...... 40
Figura 2.5: Atenuao da intensidade da luz devido a uma soluo absorvente. ......... 41
Figura 3.1: Um esboo das actividades em torno da molcula em anlise. A
molcula move-se com uma certa velocidade na amostra enquanto
que o reagente efectua a ligao (governado pela cintica). ...................... 47
Figura 3.2: Rede de elementos finitos. ......................................................................... 49
Figura 3.3: Esquema da mistura de fluidos por acelerao centrpeta.......................... 51
Figura 3.4: Geometria do misturador. .......................................................................... 52
Figura 3.5: Sistema de microfluidos no qual se visualiza a rede de elementos
finitos utilizada........................................................................................... 53
Lista de figuras

xxiii
Figura 3.6: Simulao do fluxo do processo de mistura por difuso para um
padro de urina com 80 mg/l de cido rico. O grfico ilustra o perfil
da viscosidade do modelo.......................................................................... 55
Figura 3.7: Simulao do perfil do vector da velocidade do fluxo. ............................. 56
Figura 3.8: Perfil do vector da velocidade do fluxo na zona de entrada da cmara
de deteco. ............................................................................................... 56
padro de urina com 1200 mg/l de cido rico. O grfico ilustra o
perfil da viscosidade do modelo. ............................................................... 57
Figura 3.10: Vista frontal da simulao do fluxo do processo de mistura por
difuso para um padro de urina com (a) 80 mg/l de cido rico;
(b) 1200 mg/l de cido rico...................................................................... 58
Figura 3.11: Processo de mistura incompleto devido ao aumento da velocidade do
fluxo para 1.5 l/s. O padro de urina tem 80 mg/l de cido rico. .......... 59
padro de urina com 1200 mg/l de cido rico e com uma largura dos
canais de 100 m. O grfico ilustra o perfil da viscosidade do
modelo. ...................................................................................................... 60
Figura 4.1: Esquema de um filme fino......................................................................... 64
Figura 4.2: Estrutura de multicamadas de filmes finos................................................ 65
Figura 4.3: Definio das polarizaes p e s. A luz incide no plano xz com um
ngulo relativamente ao eixo dos zz. Os vrios vectores E esto
representados. ............................................................................................ 68
Figura 4.4: Definies dos parmetros para uma estrutura multicamada de filmes
finos. Por simplicidade, a direco de propagao de cada onda est
simplesmente indicada como para a esquerda ou como para a direita
e nem os ngulos
j
nem a espessura dos filmes esto representados. ...... 71
Figura 4.5: Distncia entre as frentes de onda (x), usada no clculo do caminho
ptico. ........................................................................................................ 72
Figura 4.6: Reflectncia de uma superfcie de vidro em funo do ngulo
incidente, para a polarizao s e p. ............................................................ 77
Figura 4.7: Reflectncia de filmes dielctricos com diferentes ndices de
refraco em funo da espessura do seu caminho ptico. Substrato
de vidro com n
0
= 1.5. Meio incidente ar com n
q
= 1.0. ngulo de
incidncia
q
= 0.. ..................................................................................... 78
Figura 4.8: Reflectncia de uma superfcie de alumnio e prata em funo do
ngulo. ....................................................................................................... 81
Figura 4.9: Reflectncia da prata, do cobre, do ouro e do alumnio, em funo do
comprimento de onda. ............................................................................... 81

xxiv
Figura 4.10: Esquema do clculo da FWHM de um filtro passa-banda. ........................ 85
Figura 4.11: Estrutura do canal ptico do Microlab. ...................................................... 85
Figura 4.12: Requisito para a intensidade da transmisso do pico. ................................ 86
Figura 4.13: Valores da transmitncia e da reflectncia do TiO
2
e SiO
2
em funo
da espessura da camada. Considerou-se cada camada independente e
depositada num substrato de vidro com n = 1.52....................................... 87
Figura 4.14: Simulao do espectro de transmisso, em funo do comprimento
de onda, do filtro passa-banda com a estrutura da Tabela 4.2.
T
max
= 91.4%, FWHM = 5.5 nm. ............................................................... 89
T
max
= 94.2%, FWHM = 7.5 nm. ............................................................... 90
T
max
= 94.7%, FWHM = 3.6 nm. ............................................................... 91
Figura 4.17: Impresso artstica dos 16 filtros pticos. .................................................. 94
Figura 4.18: Simulao da transmitncia, em funo do comprimento de onda,
para a matriz de 16 filtros pticos. A estrutura dos filtros encontra-se
na Tabela 4.5.. ............................................................................................ 95
para uma matriz de 16 filtros pticos com a estrutura da Tabela 4.6.
A variao das espessuras das camadas 5 e 7 fornecem o
deslocamento do pico de transmisso. ....................................................... 98
para a matriz de 16 filtros pticos com a estrutura da Tabela 4.5. Esta
simulao foi realizada considerando como detector o fotododo
fabricado..................................................................................................... 99
Figura 5.1: Vista em corte dos trs tipos de fotododos em silcio disponveis na
tecnologia CMOS standard com n-well: (a) n-well / p-epilayer;
(b) p+ / n-well; (c) n+ / p-epilayer. ......................................................... 105
Figura 5.2: Coeficiente de absoro e profundidade da penetrao da luz no
silcio........................................................................................................ 107
Figura 5.3: Eficincia quntica para os trs tipos de fotododos verticais,
apresentados na Figura 5.1 e fabricados em tecnologia CMOS
standard. (a) n-well / p-epilayer; (b) p+ / n-well; (c) n+ / p-epilayer
[4]. ........................................................................................................... 107
Figura 5.4: Vista em corte do fototransstor bipolar de juno vertical em silcio
disponvel na tecnologia CMOS standard com n-well. ........................... 109
Figura 5.5: Eficincia quntica para o fototransstor pnp, apresentado na
Figura 5.4 e fabricado em tecnologia CMOS standard [4]...................... 110
Lista de figuras

xxv
Figura 5.6: Resposta espectral dos trs tipos de fotododos verticais de acordo
com os parmetros da tecnologia CMOS standard com n-well
utilizada no fabrico. (a) n-well / p-epilayer; (b) p+ / n-well;
(c) n+ / p-epilayer [15]. .......................................................................... 112
Figura 5.7: Estrutura bsica do fotododo quando fabricado em tecnologia
CMOS standard com n-well e duplo metal. ............................................ 113
Figura 5.8: Simulao da resposta espectral das combinaes tpicas das
camadas dielctricas que se encontram por cima do fotododo............... 113
Figura 5.9: Diagrama de blocos do conversor luz frequncia para um canal
ptico. ...................................................................................................... 114
Figura 5.10: Formas de onda da tenso na entrada e na sada do comparador. ........... 115
Figura 5.11: Esquema do conversor luz - frequncia para os quatro canais pticos.... 115
Figura 6.1: Esquema do sistema de microfluidos. ..................................................... 120
Figura 6.2: (a) Fotografia da mquina CNC; (b) berbequim; (c) ampliao da
zona da fresa no berbequim; (d) fresa utilizada para vidro. .................... 120
Figura 6.3: Fotografia do sistema de microfluidos. ................................................... 121
Figura 6.4: Posio de cada filtro ptico na matriz.................................................... 123
Figura 6.5: As 4 mscaras utilizadas no processo de deposio da camada 6 de
SiO
2
para os 16 filtros pticos construdos com multicamadas de
filmes finos. As cruzes so marcas para o alinhamento das mscaras. ... 123
Figura 6.6: Sequncia de fabrico da matriz de 16 filtros pticos construdos com
multicamadas de filmes finos. ................................................................. 125
Figura 6.7: Vista em corte da estrutura bsica do fotodetector da tecnologia
CMOS standard....................................................................................... 126
Figura 6.8: A fotografia tirada no SEM do fotododo CMOS sem o 1 xido
ilustra a rugosidade aleatria da superfcie.............................................. 127
Figura 6.9: Espessura da corroso das 3 camadas dielctricas que se encontram
por cima da juno pn do fotododo, na tecnologia CMOS standard
disponvel no DIMES. ............................................................................. 127
Figura 6.10: Vista em corte da estrutura do fotodetector fabricado. A espessura
efectiva do 1 xido de 650 nm............................................................. 128
Figura 6.11: Fotografia ampliada de um fotododo (A) e do fotododo que fornece
a corrente de fuga (B). Acima dos fotododos encontra-se alguma da
electrnica de leitura................................................................................ 128
Figura 6.12: Fotografia do sistema de deteco e electrnica de leitura...................... 128
Figura 6.13: O Microlab............................................................................................... 129

xxvi
Figura 7.1: Curva de calibrao para diferentes concentraes de albumina
depois de reagir com o reagente Microprotein-PR. Valores obtidos
com 1 mm de caminho ptico. ................................................................. 134
Figura 7.2: Curva de calibrao para diferentes concentraes de cido rico
depois de reagir com o reagente de Infinity
TM
uric acid reagent.
Valores obtidos com 1 mm de caminho ptico........................................ 136
Figura 7.3: Espectro de absoro para diferentes concentraes de albumina
depois de reagir com o reagente Microprotein-PR. Da curva
superior para a curva inferior: 100 mg/dl, 50 mg/dl, 30 mg/dl,
15 mg/dl, 7.5 mg/dl, 3 mg/dl.................................................................... 137
Figura 7.4: Espectro de absoro para diferentes concentraes de cido rico
depois de reagir com o reagente Infinity
TM
uric acid reagent. Da
curva superior para a curva inferior: 120 mg/dl, 80 mg/dl, 60 mg/dl,
40 mg/dl, 30 mg/dl, 20 mg/dl, 15 mg/dl, 10 mg/dl, 5 mg/dl.................... 138
Figura 7.5: Fotografia da instalao para as medies experimentais........................ 139
Figura 7.6: Fotografia do interior da caixa para as medies no Microlab e
ampliao da zona de medio do Microlab. ........................................... 139
Figura 7.7: Fotografia da caixa com o fotododo da Hamamatsu e ampliao
deste. ........................................................................................................ 140
Figura 7.8: (a) Irradincia espectral em funo do comprimento de onda para a
lmpada utilizada nas medies (curva com a referncia 6334);
(b) Transmitncia em funo do comprimento de onda para a fibra
ptica utilizada nas medies [8]. ............................................................ 140
Figura 7.9: Interface grfica na medio simultnea de dois fotododos. .................. 141
Figura 7.10: Espectro de transmisso do filtro ptico fabricado. O grfico mostra
os valores medidos em relao a uma lamela de vidro sem filtro.
Ambos foram medidos com o fotododo comercial................................. 142
Figura 7.11: Espectro de transmisso dos dois filtros, nmeros 3 e 8, fabricados
inicialmente. A espessura total de 56% da pretendida. O grfico
mostra os valores medidos em relao a uma lamela de vidro sem
filtro. Ambos foram medidos com o fotododo comercial....................... 142
Figura 7.12: Caractersticas espectrais do fotododo comercial calibrado da
Hamamatsu. ............................................................................................. 144
Figura 7.13: Corrente de cada fotododo em funo do comprimento de onda. Os
valores foram obtidos sem polarizar o fotododo e com um pinhole
de 500 m. ............................................................................................... 145
Figura 7.14: Responsividade de cada fotododo, calculada a partir da corrente
medida e tendo como referncia o fotododo comercial calibrado da
Hamamatsu. ............................................................................................. 145
Figura 7.15: Eficincia quntica de cada fotododo, calculada a partir da
expresso (5.4). ........................................................................................ 145
Lista de figuras

xxvii
Figura 7.16 Corrente, em funo do comprimento de onda, dos fotododos
n+ / p-epilayer com o 1 xido e com as trs camadas dielctricas
por cima da juno pn. Valores medidos sem polarizar os fotododos. .. 147
Figura 7.17: Responsividade dos fotododos medidos na Figura 7.16. ....................... 147
Figura 7.18: Eficincia quntica dos fotododos medidos na Figura 7.16. .................. 147
Figura 7.19: Corrente em funo da tenso inversa dos fotododos
n+ / p-epilayer, medida quando no esto expostos luz....................... 148
Figura 7.20: Tenso no condensador (1) e tenso na sada do comparador (2) do
conversor luz - frequncia, quando iluminado por uma lmpada de
filamento incandescente a cerca de 5 cm do fotododo. .......................... 149
Figura 7.21: Tenso no condensador (1) e tenso na sada do comparador (2) do
conversor luz - frequncia, quando iluminado por uma lmpada de
filamento incandescente a cerca de 50 cm do fotododo. ........................ 149
Figura 7.22: O Microlab (os canais tm 500 m de profundidade e 1 mm de
largura)..................................................................................................... 150
Figura 7.23: Espectro de transmisso para diferentes concentraes de albumina
depois de reagir com o reagente especfico para protena total
(Microprotein-PR). Da curva superior para a inferior: reagente,
3 mg/dl, 7.5 mg/dl, 15 mg/dl, 30 mg/dl, 50 mg/dl e 100 mg/dl. ............. 151
Figura 7.24: Curva calibrao para diferentes concentraes de albumina depois
da sua reaco com o reagente Microprotein-PR................................. 152
Figura 7.25: Espectro de transmisso para diferentes concentraes de cido rico
depois de reagir com o reagente especfico para a sua quantificao
(Infinity
TM
uric acid reagent). .............................................................. 154
depois da sua reaco com o reagente Infinity
TM
uric acid reagent.
A recta de tendncia foi calculada apenas na zona linear........................ 154
Figura 7.27: Espectro de transmisso, obtido com o filtro ptico sobre o Microlab,
para diferentes concentraes de cido rico aps a reaco com o
reagente especfico para a sua determinao. .......................................... 156
Figura 7.28: Curva de calibrao do ensaio demonstrado na Figura 7.27, para
= 480 nm............................................................................................... 156
aps completa a reaco com o reagente especfico para a sua
determinao. Valores obtidos quando o Microlab iluminado com
uma fonte de luz branca convencional..................................................... 157
Figura 8.1: Desenho artstico de um possvel leitor para o Microlab. ....................... 164
Figura 8.2: Desenho artstico, em corte e em perspectiva, do Microlab com o
sistema de microfluidos fabricado atravs de tcnicas de SU-8. ............. 165
Figura I.1: Curva de calibrao ............................................................................. A - 6

xxviii
Figura I.2: Espectros sem sobreposio [2] ...........................................................A - 8
Figura I.3: Espectros do reagente e mistura sobrepostos [2] .................................A - 8
Figura I.4: Espectros da amostra, do reagente e da mistura sobrepostos [2] .........A - 9
Figura IV.1: Esquema detalhado do conversor luz - frequncia...............................A - 23
Figura IV.2: Esquema detalhado do comparador. ....................................................A - 24
Figura V.1: Mscaras e espessuras em nanmetros da matriz de 16 filtros
pticos descrita na Tabela 4.6. .............................................................A - 28
Figura V.2: Posio dos 16 filtros pticos na matriz, utilizando as mscaras
descritas na Figura V.1 e as espessuras apresentadas na Tabela
4.6.........................................................................................................A - 28

xxix
Lista de tabelas

Tabela 1.1: Comparao dos passos necessrios de uma anlise ao sangue
quando realizada num laboratrio e num microssistema de anlises
[7]. .............................................................................................................. 7
Tabela 1.2: Frequncia de amostragem tpica para a monitorizao de vrios
parmetros clnicos [9]. ............................................................................... 8
Tabela 2.1: Composio mdia de alguns compostos da urina numa colecta de 24
horas [2]..................................................................................................... 33
Tabela 3.1: Propriedades do reagente e do padro de urina. ........................................ 54
Tabela 4.1: Material e espessura das camadas do filtro passa-banda. .......................... 89
Tabela 4.2: Material e espessura das camadas do filtro passa-banda com a
estrutura dos filmes: HLHL HH LHLH. .................................................... 90
Tabela 4.3: Material e espessura das camadas do filtro passa-banda com a
estrutura dos filmes: HLHLH LL HLHLH................................................. 91
Tabela 4.4: Dezasseis biomolculas que podem ser analisadas por deteco
colorimtrica. U (Urina), S (Soro sanguneo), P (Plasma sanguneo),
CSF (Fluido cerebrospinal) [15]................................................................ 93
Tabela 4.5: Material e espessura das camadas da matriz de filtros pticos
passa-banda, com a estrutura HLHLH LL HLHLH. .................................. 96
Tabela 4.6: Material e espessura das camadas da matriz de filtros pticos
passa-banda, com um arranjo de camadas dielctricas.............................. 97
Tabela 6.1: Espessura da camada 6 de SiO
2
com o respectivo nmero do filtro
ptico para posterior localizao na matriz e o comprimento de onda
do seu mximo de transmitncia. ............................................................ 122
Tabela 6.2: Materiais, espessura e sequncia de deposio de cada camada da
matriz de 16 filtros pticos. ..................................................................... 124
Tabela 7.1: Valores medidos da corrente e clculo da responsividade e eficincia
quntica dos 3 tipos de fotododos verticais da Figura 5.1 para
= 633 nm e P
incidente
= 5 W e constante. ............................................. 146

xxx
Tabela 7.2: Caractersticas em corrente contnua do comparador com relgio. ......... 150
Tabela 7.3: Coeficiente de absoro para cada concentrao medida para
= 595 nm e com LP = 500 m. ............................................................. 152
Tabela 7.4: Coeficiente de absoro para cada concentrao medida para
= 495 nm e com LP = 500 m. ............................................................. 155
Tabela 7.5: Resumo dos parmetros obtidos do Microlab.......................................... 158
Tabela I.1: Determinao de uma curva de calibrao.............................................A - 6

xxxi
Lista de smbolos

Smbolo Descrio Unidade
A Absorvncia -
B Densidade de fluxo magntico T
BW Largura de Banda Hz
C Concentrao das molculas mol/l ou partculas/m
3

C Condensador F
CR Coeficiente de correlao -
c Velocidade da onda electromagntica m/s
c
0
Velocidade da onda electromagntica no vazio m/s
D Coeficiente de difuso m
2
/s
D Deslocamento elctrico C/m
2

d Espessura de um material m
E Energia J
E Campo elctrico V/m
E Vector campo elctrico V/m
f Frequncia Hz
g Espessura de fase do filme rad
H Campo magntico A/m
H ndice de refraco baixo -
H Vector campo magntico A/m
h Constante de Planck J s
I Intensidade da onda de luz J s/m
I Corrente elctrica A
i Operador complexo -

xxxii
J Fluxo da difuso partculas/m
2
s
j Nmero de filmes finos -
K Vector de propagao rad/m
K Nmero de propagao rad/m
K
a
Constante de associao l/(s mol)
K
d
Constante de dissociao l/(s mol)
k Coeficiente de extino -
L Distncia m
L ndice de refraco baixo -
L
d

Distncia entre a regio do espao de carga
e o contacto hmico num fotododo
m
LP Caminho ptico m
M Matriz -
m
Ordem de interferncia de um
interfermetro de Fabry-Perot
-
N
AV
Nmero de Avogadro mol
-1

n ndice de refraco -
n
Semicondutor tipo n com electres
como portadores maioritrios
-
P Presso Pa
P Fluxo de energia radiante ou potncia ptica W
P Vector de Poyting W/m
2

p
Semicondutor tipo p com lacunas como
portadores maioritrios
-
pn
Juno entre um semicondutor
do tipo p e outro do tipo n
-
Q Carga C
q Nmero de interfaces duma multi-camada -
R Reflectncia -
Re Nmero de Reynolds -
r Coeficiente de reflexo -
r Vector posio m
S Chaves analgicas -
T Transmitncia -
Lista de smbolos

xxxiii
T
D
Tempo de difuso s
t Coeficiente de transmisso -
t Tempo s
u Energia por unidade de volume J/m
3

V Volume m
3

V Volume de lquido l
V Tenso V
V
a
Taxa de reaco da associao s
-1

V
d
Taxa de reaco da dissociao s
-1

Vdd Tenso de alimentao V
Y Admitncia ptica siemens
W
d
Largura da camada de depleco num fotododo m
v Velocidade m/s
Variao -
Coeficiente de absoro m
-1

Ganho em corrente de um transstor -
Permitividade elctrica F/m
0
Permitividade elctrica no vazio F/m
r
Permitividade relativa -
ngulo rad
Eficincia -
Comprimento de onda da luz nm
Permeabilidade magntica H/m
0
Permeabilidade magntica no vazio H/m
r
Permeabilidade relativa -
Viscosidade N s/m
2

ngulo de incidncia da luz num meio rad ou graus
Densidade Kg/m
3

Rudo -
Frequncia angular rad/s
Razo dos ndices de refraco -
Responsividade A/W

xxxv
Lista de acrnimos e termos

Acrnimo / termo Designao
AU Unidades arbitrrias
BPSG Boron Phosphor Silicate Glass
CNC Comando Numrico por Computador
CFD Dinmica Computacional do fluido
Chip Circuito integrado e encapsulado
CMOS Complementary Metal Oxide Semiconductor
DEI Departamento de Electrnica Industrial
Die
Parte de um disco (de um determinado material utilizado como
substrato), normalmente com 10 mm de lado
DIMES Delft Institute for MicroElectronics and Sub-micron Technology
DNA DeoxyriboNucleic Acid (cido desoxirribonucleico)
FEM Mtodos dos Elementos Finitos
FWHM Full-Width-Half-Maximum
GPIB General Purpose Interface Bus
IBD Ion Beam Deposition
INESC-MN
Instituto de Engenharia de Sistemas e Computadores -
Microsistemas e Nanotecnologias
LASER Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation
Mesh
Malha que define a diviso de um elemento em elementos
finitos
Microlab Microlaboratrio
MOSFET Metal Oxide Silicon Field Effect Transistor
NMOS Transstor MOSFET de canal n
PCR Polymerase Chain Reaction

xxxvi
PDMS PolyDiMethylSiloxane
Pinhole Furo de alfinete
PMMA PolyMethylMethAcrylate
PMOS Transstor MOSFET de canal p
PVD Physical Vapor Deposition
RNA RiboNucleic Acid (cido ribonucleico)
SEM Secondary Electron Microscopic
UM Universidade do Minho
VLSI Very Large Scale Integration

1
1

Introduo
Neste captulo faz-se uma breve descrio sobre a anlise aos fluidos biolgicos
realizada nos laboratrios de anlises clnicas e as vantagens de efectuar esta anlise
num microssistema. Apresenta-se tambm uma reviso de microssistemas j
implementados descritos na literatura e estabelece-se a noo, motivao e objectivos
deste projecto. Por ltimo descreve-se a estrutura da tese.
1.1 Anlise de fluidos biolgicos
1.1.1 Conceito de fluido biolgico
Fluido biolgico o termo utilizado para definir a componente lquida de
organismos vivos de origem humana ou animal. No ser humano os fluidos mais
importantes so o sangue (soro e plasma), a urina, o fluido cerebrospinal, o fluido
linftico, o fluido intracelular, o fluido lacrimal, a saliva, a blis e o fluido sinovial.
Estes fluidos contm gua, ies orgnicos, aminocidos, glcidos, lpidos, pptidos,
protenas, cidos nucleicos, etc. Os dois primeiros so compostos simples que
interligados formam as molculas biolgicas (biomolculas). Os restantes so protenas
e cidos nucleicos, denominados de macromolculas, devido sua estrutura ser
formada pelo encadeamento de um grande nmero de molculas de um ou mais tipos,
pelo que, so maiores que as biomolculas anteriores [1].

2
1.1.2 Biomolculas medidas nos fluidos biolgicos
A anlise dos fluidos biolgicos e das biomolculas ou compostos neles
presentes um factor muito importante no diagnstico de doenas. Caractersticas como
a cor, a transparncia e o volume so exemplos de uma anlise inicial aos fluidos
biolgicos. O resultado destas caractersticas qualitativas podem logo partida indicar o
estado de doena de um indivduo (ex.: infeco urinria na anlise da cor da urina ou
meningite na anlise da claridade do fluido cerebrospinal).
Frequentemente necessrio medir quantitativamente vrias biomolculas ou
compostos nos fluidos biolgicos para estabelecer um padro de anormalidades. As
biomolculas ou compostos solicitados mais comummente em exames de rotina
incluem: o pH, a albumina, as protenas totais, a globulina, o cido rico, a bilirrubina
total, o clcio, o sdio, o potssio, o cloro, o colesterol, a creatinina, a glicose, o
asprtato transaminase e o fsforo inorgnico. Os padres de valores anormais obtidos
dessas medies fornecem dados que permitem chegar a um diagnstico definitivo. As
implicaes clnicas so inmeras e podem ser consultadas em [2].
No soro sanguneo, na urina e no fluido cerebrospinal, a separao de protenas,
denominada de electroforese de protenas, fornece um diagnstico sobre a distribuio
e concentrao dos principais componentes presentes em cada fraco de protena. Este
teste pode diagnosticar alguns estados inflamatrios, disfunes imunes e evoluo de
uma doena e seu tratamento. As protenas mais solicitadas em exames de rotina so: a
albumina, as globulinas (
1
,
2
, , ), as hemoglobinas (S, A
1
, F) e as lipoprotenas (,
pr-, ).
A contagem e examinao das clulas presentes num dado fluido biolgico
fornecem informaes teis tanto para o diagnstico como para o prognstico. Em
exames de rotina, o sangue e a urina so os fluidos mais solicitados para este
procedimento laboratorial. No sangue so normalmente contadas as clulas brancas
(leuccitos), as clulas vermelhas (hemcias) e as plaquetas (trombcitos). Na urina,
alm da contagem de clulas, tambm tem interesse identificar e contar bactrias,
cristais e cilindros, pelo que frequentemente utilizada a denominao de exame aos
sedimentos urinrios.
Detectar a presena de anticorpos em fluidos biolgicos a medida utilizada no
diagnstico de doenas infecciosas, distrbios auto-imunes, alergias imunes e doenas
neoplsicas. Este tipo de exames apenas solicitado quando h suspeita de alguma das
Introduo

3
doenas mencionadas. A resposta antignio - anticorpo a defesa natural do organismo
contra agentes invasores como bactrias, vrus, parasitas e fungos. Os antignios so
biomolculas que estimulam e subsequentemente reagem com os produtos da resposta
imune. Os anticorpos so protenas produzidas pelo sistema imune do organismo em
resposta a um antignio, de forma a retirar as possibilidades de sobrevivncia do
antignio criado pelos agentes invasores [2].
Separar, sequenciar, amplificar e determinar a estrutura do DNA (cido
desoxirribonucleico) e do RNA (cido ribonucleico) so exames solicitados no s no
caso de suspeita de doenas, mas tambm na investigao criminal, por exemplo. O
DNA e RNA so macromolculas que determinam a formao e o desenvolvimento de
todas as formas de vida. A sua estrutura contm a informao necessria para a sntese
dos milhares de protenas que regulam todas as funes vitais. Do estudo do DNA
consegue-se produzir biomolculas para combate a doenas (ex.: vacinas e anticorpos).
1.1.3 Laboratrios de anlises clnicas
Os exames aos fluidos biolgicos disponveis nos laboratrios de anlises
clnicas podem ser divididos, de um modo geral, em exames fsicos, qumicos e
microscpicos. Os fsicos examinam as caractersticas fsicas do fludo, devolvendo
uma medida qualitativa da amostra em anlise. A cor, a claridade e o volume so
exemplos desse tipo de exames. Apesar de simples, a informao bsica resultante de
um exame fsico, contm dados preliminares relativamente presena de algumas
doenas. Mais ainda, essas informaes podem ser necessrias para explicar descobertas
obtidas nos exames qumicos e microscpicos.
Os exames qumicos analisam as caractersticas qumicas dos fluidos,
devolvendo uma medida quantitativa da biomolcula ou composto em anlise. A maior
parte destes exames so realizados por espectrofotometria. Espectrofotometria o
estudo da interaco da radiao electromagntica com as biomolculas. A
espectrofotometria por absoro ptica frequentemente utilizada para determinar a
concentrao e/ou quantidade de uma determinada biomolcula numa amostra (por
exemplo, protenas ou glicose). O seu princpio baseado na absoro ptica da luz
pelas biomolculas presentes na amostra. Essas biomolculas tm um mximo de
absoro para um determinado comprimento de onda do espectro electromagntico. O
valor da absoro nesse comprimento de onda est directamente relacionado com a
concentrao dessas biomolculas na amostra. A espectrofotometria com deteco por

4
fluorescncia, tem a vantagem de ser muito sensvel e selectiva, pelo que, utilizada
para determinar muito baixas concentraes de uma determinada biomolcula numa
amostra (ex.: albumina na urina). Embora com menos frequncia que a deteco por
absoro ptica, tambm ela usada em laboratrios clnicos. aplicada a biomolculas
que emitem uma luz fluorescente quando excitadas por uma fonte de luz com um
comprimento de onda especfico. A desvantagem da deteco por fluorescncia reside
no tempo extremamente curto da luz fluorescente emitida pelas biomolculas (< 500 ns)
e pelo facto de ser necessrio encontrar reagentes que contenham compostos
fluorescentes, quando as biomolculas a analisar no os tiverem. A cromatografia e a
electroforese so os mtodos realizados em laboratrios clnicos para separar as
protenas existentes numa amostra de um fluido biolgico. A cromatografia executa a
separao de acordo com o tamanho, carga e afinidade de ligao das biomolculas,
baseando-se nas diferentes velocidades a que cada um dos componentes arrastado por
um determinado solvente, num meio poroso apropriado [3]. Na electroforese a
separao baseada na mobilidade electrocintica das biomolculas numa soluo, sob
influncia de um campo elctrico [4].
Os exames microscpicos detectam, identificam e quantificam os componentes
insolveis presentes na amostra do fluido biolgico. A contagem e examinao de
clulas, de bactrias ou de cristais, so exemplos deste tipo de exames. As tcnicas de
microscopia utilizadas nos laboratrios clnicos so: microscopia de campo brilhante,
microscopia de contraste de fase, microscopia de polarizao e microscopia de contraste
de interferncia. Na primeira os objectos ampliados aparecem escuros contra um fundo
claro. a tcnica mais frequentemente utilizada, uma vez que a usada nos exames de
rotina. A microscopia de contraste de fase converte variaes no ndice de refraco do
objecto em anlise em variaes de intensidade da luz ou contraste. Esta tcnica permite
uma visualizao mais detalhada dos componentes translcidos ou com baixos ndices
de refraco (ex.: cilindros hialinos na urina) e das clulas vivas. A microscopia de
polarizao baseada nos fundamentos de uma luz polarizada. utilizada para analisar
biomolculas com a propriedade de refractar a luz em duas direces a 90 (ex.: cristais
e lpidos). Por fim, a microscopia de contraste de interferncia fornece uma imagem
tridimensional ilustrando detalhes estruturais muito precisos. Esta tcnica a mais
dispendiosa e muitas vezes no utilizada em anlises de rotina [5].
Vrios instrumentos automatizados esto disponveis nos laboratrios de
anlises clnicas, realizando vrios testes simultaneamente para cada fluido biolgico,
com um volume de lquido de 1 ml em cada teste. Exemplos desses equipamentos
Introduo

5
encontram-se nas fotografias da Figura 1.1. Actualmente, esses equipamentos so
bastante sofisticados, precisos e fiveis. Contudo, a no ser que um consultrio mdico
inclua esse tipo de equipamentos, ainda no possvel ao prprio mdico elaborar um
diagnstico fidedigno na hora da consulta (apenas aps o resultado das anlises por ele
requeridas). Pelo que, o paciente necessita de se deslocar a um laboratrio de anlises
clnicas ou, caso o mdico colha as amostras, estas necessitam de ser enviadas para o
laboratrio e o seu resultado apenas estar disponvel aps algumas horas, ou mesmo
passado alguns dias. Alm do atraso no tempo, enganos logsticos, tais como,
etiquetagem errada ou perda de amostras podem atrasar significativamente o
diagnstico.

(a) (b)
Figura 1.1: (a) Clinitek Atlas (cortesia da Bayer Diagnostics, Elkhart, In.); (b) Model 500
Workstation (cortesia da International Remote Imaging Systems, Chatsworth,
CA.) [2].
Para algumas anlises qumicas de rotina urina, encontram-se comercialmente
disponveis, fora do ambiente laboratorial (geralmente em farmcias), as chamadas fitas
reagentes (Figura 1.2). Estas, podem ser usadas e lidas directamente por pacientes e
outros profissionais de sade. O seu aspecto semelhante a pedaos de papel
mata-borro, podendo ser de papel ou plstico. Estas fitas, quimicamente impregnadas
com reagente, permitem uma rpida determinao da concentrao de determinadas
biomolculas ou compostos na urina, atravs de resultados visuais codificados por
cores. O pH, a protena total, a glicose, as cetonas, a bilirrubina, o nitrito e a
hemoglobina, so alguns exemplos das biomolculas ou compostos por elas analisados.
O formato ou a profundidade da colorao produzida est relacionada com a
concentrao da biomolcula na urina. So fornecidos controlos de cor contra os quais
pode ser comparada a cor produzida pela amostra de urina. Os tempos de reaco das

6
biomolculas nas fitas so padronizados para cada categoria de fita. Actualmente, estas
fitas reagentes funcionam como laboratrios em miniatura. Contudo, so poucas as
biomolculas por elas analisadas e a leitura manual da cor, mesmo com controlos, no
precisa.

Figura 1.2: Uma fita reagente comercial [5].
Uma nova abordagem necessria para possibilitar uma ampla monitorizao
dos parmetros de sade na preveno de doenas. A necessidade de medies e
resultados rpidos, no prprio local, a baixas concentraes e utilizando pequenos
volumes de amostras (alguns microlitros, contra 1 ml dos equipamentos actuais) levou a
que, na dcada passada, comeassem a surgir desenvolvimentos na miniaturizao de
sistemas de anlise de fluidos, com a parte dos fluidos, deteco e electrnica de leitura
integrados num nico dispositivo.
1.1.4 Microssistemas de anlise de fluidos biolgicos
As vantagens associadas com os microssistemas de anlise de fluidos, incluem
uma melhorada eficincia no tamanho, na aplicao, no tempo de resposta, no custo, no
desempenho analtico, na integrao, na produtividade, na automao e na segurana no
laboratrio [6]. Uma vez que so usadas quantidades de microlitros, ou mesmo
nanolitros, de solventes orgnicos, os custos associados com a compra de novos
reagentes e com a destruio dos utilizados praticamente desprezvel. A automao
dos procedimentos de preparao de amostras permite que uma pessoa menos
especializada possa, com exactido, realizar uma anlise. Alm disso, derramamentos
de lquidos, exploses e outros acidentes que poderiam ocorrer com as tcnicas
convencionais de preparao das amostras, deixam de ser um problema. Um
microssistema pode tornar-se num laboratrio de anlises clnicas porttil, adequado
para realizar medies em qualquer local. Para alm destas vantagens destaca-se ainda o
Introduo

7
seu baixo custo quando produzido em massa, pelo facto de utilizar os mesmos conceitos
bsicos de fabrico e materiais utilizados na microelectrnica.
A Tabela 1.1 compara os passos que so necessrios para uma anlise ao sangue
quando realizada num laboratrio de anlises clnicas e num microssistema de anlise
de fluidos biolgicos. Neste, uma considervel reduo no manuseamento da amostra e
na logstica resultam numa poupana de tempo e custos.
Tabela 1.1: Comparao dos passos necessrios de uma anlise ao sangue quando realizada
num laboratrio e num microssistema de anlises [7].
Anlise realizada em laboratrio Anlise realizada num microssistema
1. Teste pedido 1. Teste pedido
2. Pedido do teste processado 2. Enfermeira retira amostra de sangue
3. Enfermeira retira amostra de sangue 3. Amostra analisada
4. Amostra transportada para o laboratrio
central
4. Resultados so revistos pela enfermeira
5. Amostra etiquetada e armazenada 5. Mdicos agem de acordo com os
resultados
6. Amostra analisada
7. Resultados so revistos pelo pessoal do
laboratrio

8. Resultados so relatados ao departamento
9. Mdicos agem de acordo com os
resultados

Apesar das vantagens descritas, so questionadas restries quanto ao grau de
miniaturizao necessria ou mesmo desejada, devido natureza de alguns sistemas
biolgicos. Se o nmero de molculas numa amostra com uma concentrao relevante
para diagnstico for muito reduzido, pode ser atingido o ponto em que no so
introduzidas no sistema de anlise nenhumas molculas. Assim, deve ser sempre
calculado o volume de lquido mnimo que se pode utilizar numa anlise. Como
exemplo, para a menor concentrao de macromolculas de albumina na urina, o
volume mnimo a ser utilizado da ordem dos fentolitros. Contudo, no caso do DNA,
da ordem das centenas de microlitros [8].
Um microssistema de anlise de fluidos biolgicos encontra a sua vasta rea de
aplicaes em campos como os diagnsticos clnicos, a anlise de drogas, os exames
imunolgicos, a separao e a anlise de protenas, o doseamento e a transferncia de
medicamentos, a anlise gentica (a amplificao e a sequenciao do DNA), a cultura

8
de clulas e o equipamento de monitorizao e de diagnstico. Pelo seu baixo custo e
portabilidade permite que qualquer pessoa o adquira e realize um correcto diagnstico
preliminar em sua prpria casa. Como exemplo, a Tabela 1.2 refere alguns exemplos das
biomolculas/compostos mais frequentemente medidos em anlises clnicas e o tempo
necessrio para a sua monitorizao, no caso de haver suspeita de alguma doena ou
mesmo no seu tratamento.
Tabela 1.2: Frequncia de amostragem tpica para a monitorizao de vrios parmetros
clnicos [9].
Segundos / Minutos Horas Dias
Oxignio Creatinina Ferro
Dixido de Carbono Bilirrubina Albumina
Io potssio Ureia cido rico
Glicose Sdio Globulina
Lactato Cloreto Colesterol
Cortisona Triglicrido
Neurotransmissores
Aplicaes para fluidos em geral (no biolgicos) podem ser contempladas por
dispositivos com os mesmos princpios bsicos, tais como: anlises ambientais
(qualidade do ar e gua), teste a comida e identificao imediata de drogas.
1.1.5 Microssistemas de anlise de fluidos biolgicos: estado da arte
A evoluo da tecnologia dos microssistemas de anlise de fluidos , de alguma
forma, anloga ao sucedido com o circuito integrado. O desenvolvimento da
microelectrnica que ocorreu nas ltimas dcadas do sculo XX facilitou a
miniaturizao da maior parte dos componentes electrnicos a um nvel tal que,
actualmente, acima de dez milhes de transstores podem ser concentrados num chip
microprocessador standard. Esta escala de integrao (atravs da miniaturizao)
determinou o enorme ganho no desempenho do processador durante os ltimos trinta
anos. Os mesmos materiais e tcnicas de fabrico que fizeram da microelectrnica um
sucesso, combinados com a micromaquinagem, levaram ao enorme desenvolvimento da
miniaturizao dos mtodos e tcnicas analticas das cincias fsicas e biolgicas [10].
Lanado por Manz et al. [11], a primeira designao para um microssistema de
anlise de fluidos (no s biolgicos, mas em geral) foi a de TAS (micro total
analysis system). Conjuntamente com lab-on-a-chip (laboratory on a chip), esse
Introduo

9
termo continua ainda hoje a ser largamente utilizado para sistemas de anlise de fluidos
que desempenhem tratamento da amostra, transporte, deteco e electrnica de leitura e
de controlo num nico dispositivo.
Apenas na ltima dcada as vantagens dos microssistemas de anlise de fluidos
biolgicos despertaram o interesse e o suporte financeiro das indstrias biomdicas e
farmacuticas, que se interessaram em comercializar este tipo de dispositivos. Este
interesse tornou a rea dos microssistemas de anlise de fluidos biolgicos num campo
de pesquisa e desenvolvimento extremamente frtil e compreendendo inmeras
aplicaes.
Em vez de ser apresentada uma exaustiva reviso de todas essas aplicaes, um
resumo sucinto com base em artigos seleccionados e direccionado para aplicaes de
microssistemas na rea de diagnsticos clnicos, ser apresentado. Contudo, pela
elevada importncia nas cincias biomdicas, aplicaes cobrindo as reas de cultura e
manuseamento de clulas, testes imunolgicos, separao de protenas e anlise de
DNA, sero previamente apresentadas exemplificando um microssistema para cada uma
delas. Captulos sobre vrias aplicaes biomdicas podem ser consultados em [12, 13]
e tambm em artigos de reviso [10, 14, 15].
A anlise do DNA, compreendendo a amplificao, separao e sequncia, foi e
ainda a rea mais forte para a investigao e comercializao dos microssistemas de
anlise de fluidos biolgicos. Contudo, os seus dispositivos tm a sua maior aplicao
na investigao gentica, na investigao criminal e no desenvolvimento de
medicamentos.
A separao das molculas do DNA normalmente realizada recorrendo
tcnica da electroforese capilar. Esta tcnica extremamente adequada para ser
implementada num microssistema, uma vez que a separao realizada com uma
eficincia muito elevada (devido elevada tenso aplicada) e num tempo inferior a um
segundo [16]. A Nanogen Inc. desenvolveu um microssistema comercialmente
disponvel para anlise e separao do DNA. Utiliza a tcnica da electroforese capilar
em matriz, isto , os reservatrios das molculas de DNA tm uma estrutura em matriz.
Esse reservatrio, ilustrado na Figura 1.3 e denominado de Nanochip electronic
microarray, o corao do dispositivo. Fabricado em silcio, contm 100 poos de
teste dispostos em matriz e permite determinar as caractersticas de uma amostra
desconhecida de DNA. Cada poo de teste pode ser controlado electronicamente atravs
de um computador conectado ao dispositivo. As molculas do DNA e RNA (que tm

10
cargas naturais positivas e negativas) podem assim ser movidas com grande
flexibilidade, velocidade, preciso e eficincia. As especificaes tcnicas deste
dispositivo podem ser consultadas em [17].
NanoChip
Electronic
Microarray
NanoChip Cartridge

Figura 1.3: Chip descartvel da Nanogen [17].
A tcnica PCR (Polymerase Chain Reaction) est muito vulgarizada na
amplificao do DNA. um procedimento repetitivo que permite replicar, por aco da
enzima DNA-polimerase, em tubo de ensaio e por aco do calor, quantidades
significativas de DNA a partir de um determinado segmento de DNA [18].
Normalmente a reaco PCR realizada numa cmara que aquecida e arrefecida em
ciclos. Os equipamentos convencionais que realizam a PCR geralmente necessitam de
ciclos longos devido s grandes constantes de tempo associadas com o aquecimento e
arrefecimento. Contudo, a PCR em microssistemas permite o uso de volumes de
amostras muito pequenos (nl ou mesmo pl no caso da estrutura da cmara ser em matriz
(Figura 1.4)) e materiais com condutividades trmicas elevadas como o vidro ou o
silcio. Estas duas caractersticas permitiram reduzir drasticamente o tempo dos ciclos.

Figura 1.4: Imagem SEM (Secondary Electron Microscopy) das micro cmaras em silcio para
a PCR [19].
Introduo

11
Uma alternativa tradicional reaco PCR em cmara a chamada PCR de
fluxo contnuo. A soluo para a reaco PCR conduzida dentro de um canal com 3
zonas de temperaturas distintas, fazendo assim o efeito do ciclo trmico. Um esquema
do conceito encontra-se ilustrado na Figura 1.5 [20]. A Figura 1.6 apresenta uma
fotografia de um chip em vidro para a PCR. O dimetro, a profundidade e o
comprimento do canal so de 250 m, 100 m e 1512 m, respectivamente. A
amplificao de protenas do DNA com 700 pares bsicos foi demonstrada num tempo
total de 30 minutos e em 25 ciclos. A velocidade do fluxo foi de 1 l/min. O dispositivo
consome 12 W/hora [21]. Ambas as reaces PCR (em cmara e de fluxo contnuo)
continuam, actualmente, a ser bastante utilizadas.
90 77
1
0

m
m
Produto
Amostra
Soluo
Tampo
60

Figura 1.5: Esquema do conceito de PCR de fluxo contnuo [20].

Figura 1.6: Vista de topo de parte do chip para amplificao de DNA utilizando a tcnica de
PCR de fluxo contnuo [21].
A sequncia do DNA contm as instrues do funcionamento de uma clula e
uma pequena amostra deste cido nucleico permite o acesso a informaes genticas de
tal forma importantes que a criao de bibliotecas biolgicas com bancos de informao
gentica so hoje uma possibilidade. Com a sequncia do DNA pode determinar-se a
ordem dos trs milhes de pares de bases qumicas que o formam e a partir da

12
possvel identificar os genes, como se codificam e como se regulam [18]. A sequncia
do DNA foi tradicionalmente realizada em gis viscosos. Recentemente, a electroforese
capilar em matriz provou ser um mtodo de alta velocidade e elevada produtividade
para determinar a sequncia do DNA. Esta tcnica, implementada num microssistema,
torna a anlise ainda mais rpida e mais eficiente devido aos curtos canais de separao
e injeco de bandas de amostra pequenas. Paegel et al. apresentaram um dispositivo
microfabricado para realizar a sequncia do DNA com elevada produtividade baseado
na tcnica descrita. Consiste em 96 canais agrupados numa conformao radial
(Figura 1.7). O microssistema apresentou uma taxa de sequncia 10 vezes superior aos
aparelhos comerciais [22].
Aneis
(a)
Amostra
(mm)
0
5
10
Ctodo
Desperdcio
(b)
(d)
(c)

Figura 1.7: (a) Esquema dos 96 canais do microssistema para a sequncia do DNA; (b) vista
em corte; (c) vista pormenorizada da parte de injeco; (d) vista pormenorizada
das curvas [22].
Enquanto a inovao tecnolgica adaptou a anlise de material gentico a um
formato miniaturizado de chips de DNA, tambm a estrutura das protenas levou ao
desenvolvimento de dispositivos anlogos. Os sistemas para protenas, miniaturizados e
combinados com os mtodos de deteco de biomolculas, so uma ferramenta
poderosa.
Os microssistemas para protenas geralmente utilizam a tcnica da cromatografia
ou electroforese para a separao das protenas nas suas biomolculas e compostos
simples. O domnio da tcnica de separao por electroforese face cromatografia foi e
uma tendncia geral nos microssistemas. Do ponto de vista de implementao do
sistema mais fcil aplicar uma tenso nos terminais dos microcanais do que aplicar
Introduo

13
uma diferena de presso. Isto , a miniaturizao dos sistemas de cromatografia
envolve desafios tcnicos, os quais no so normalmente necessrios na electroforese.
Contudo, a cromatografia a tcnica de separao mais utilizada nos sistemas
convencionais pelo que a investigao no sentido de implementar esta tcnica em
microssistemas continua a ser uma tendncia actual. Regnier et al. desenvolveram um
microssistema para cromatografia (Figura 1.8). Dentro dos microcanais foram
implementados pilares para formarem colunas. Estes, fabricados num substrato de
quartzo tm uma profundidade de 10 m. Os canais de fluxo so bastante pequenos e
uniformes. A aplicao deste microssistema foi eficientemente demonstrada na
separao da rodamina 123 [23].
50 m

Figura 1.8: Suportes e colunas microfabricados para cromatografia. Os pilares mais pequenos
tm 5 5 10 m, com canais entre pilares de largura de 1.5 m [23].
Os microssistemas para electroforese capilar surgiram paralelamente proposta
da cromatografia em microssistema. O primeiro microssistema que relatava a separao
de molculas por electroforese capilar foi apresentado pela equipa de Manz em 1992
(Figura 1.9) [24]. Fabricado em vidro, o seu funcionamento foi demonstrado na
separao da fluorescena e da calcena de uma amostra de sangue, em 5 minutos.
Muitas separaes foram subsequentemente realizadas em microssistemas com
desenhos similares, tais como: pequenas molculas de matria corante [25] e
classificao de aminocidos [26-30]. Paralelamente, outros grupos desenvolveram
tcnicas similares [31, 32]. Jin et al. apresentaram um microssistema de electroforese
capilar para separar protenas e que utiliza ainda um processo para as identificar
dinamicamente enquanto esto a ser separadas. O esquema dos canais foi o tradicional

14
esquema em T cruzado (Figura 1.10(a)). A separao de 8 protenas foi demonstrada
eficientemente neste microssistema (Figura 1.10(b)) [33].
Amostra
Canal de separao
Fase movl
Vista em corte

(a) (b)
Figura 1.9: (a) Esquema dos canais; (b) Fotografia do ponto de interseco dos 4 canais, a
largura dos canais de 30 m [24].
1
1
4
4
Ctodo para
injeco da amostra
Anodo para
injeco da amostra
Ctodo para
injeco do padro
Anodo para
injeco do padro
7.5 cm
1 cm
Canal de
separao
2
2
3
3

Injeco da amostra
+ -
+ -
+ -
Tenso aplicada
Protenas
Protenas j ligadas

(a) (b)
Figura 1.10: (a) Esquema do microssistema fabricado em vidro. Os canais tm 30 m de
profundidade. O canal de separao tem 120 m de largura e o de injeco
150 m; (b) mecanismo para separar e identificar protenas [33].
As anlises imunolgicas so extremamente importantes e cruciais na descoberta
de vrus, bactrias e novas doenas. Os sistemas convencionais requerem um tempo de
anlise bastante longo e grandes quantidades de reagentes anticorpos, reagentes estes
bastante dispendiosos. Realizar estas anlises num microssistema vem obviar as
desvantagens descritas. Um exemplo de um microssistema para testes imunolgicos
encontra-se na Figura 1.11. Este dispositivo capaz de processar 4 amostras
simultaneamente com apenas uma unidade de bombeamento e completar a anlise em
50 minutos, em vez dos correspondentes 35 minutos para cada amostra. O limite de
Introduo

15
deteco foi dezenas de vezes menor que os dos sistemas convencionais. A integrao
reduziu o tempo necessrio para a reaco antignio - anticorpo ser efectuada de
45 horas para 35 minutos, para uma amostra [34].
Entrada do
Reagente
Sada
Entrada
das amostras
rea de reaco
70 mm
Deteco
30 mm
Bomba
250 m
500 m
100 m
10 m
(a)
(b)
(c)

Figura 1.11: (a) Esquema; (b) vista em corte da rea de reaco e deteco; (c) fotografia do
microssistema e fotografia ampliada das molculas no microssistema [34].
O posicionamento e manuseamento preciso de clulas requer que os dispositivos
tenham uma dimenso idntica das prprias clulas, dos vrus ou mesmo das
macromolculas. Assim, os microssistemas so mais apropriados que os sistemas
convencionais. Alm disso, tm tempos de resposta rpidos, fcil esterilizao e
permitem a construo de sistemas complexos. Mais ainda, muitas clulas e tecidos so
sensveis ao pH e outros gradientes inicos. Apenas nos microssistemas esses gradientes
podem ser gerados, estabilizados e controlados numa escala micro [35]. Um exemplo de
aplicao de um microssistema nessa rea encontra-se na Figura 1.12. O microssistema,
fabricado em PDMS (PolyDiMethylSiloxane), composto por uma matriz de
microinjectores e por um canal base de fluxo. Foi testado para localizar a aplicao de
drogas na cultura de clulas, usando clulas neuronais [36].

16
Canal base
de fluxo
Local de
injeco
Matriz de
microinjectores
Parte
aberta

Figura 1.12: Fotografia do microssistema comparada com uma agulha de seringa [36].
Um elemento chave na sade pblica moderna a extenso dos equipamentos de
diagnstico clnico para fora do laboratrio central. necessrio melhorar a relao
mdico - paciente e reduzir o nmero de dias de internamento hospitalar. O
desenvolvimento de microssistemas de rastreio de condies mdicas, isto , para
determinar valores anormais de molculas vitais ao funcionamento fisiolgico do corpo
humano, resultou num valor acrescentado em diagnsticos clnicos. Seguidamente,
apresentam-se alguns exemplos, com base em artigos seleccionados, de microssistemas
aplicados na rea de diagnsticos clnicos.
Um sistema baseado na electroforese capilar para a separao de pequenas
molculas do plasma sanguneo e posterior determinao quantitativa encontra-se
ilustrado na Figura 1.13. O dispositivo tem uma espessura de 3 mm, dimenses externas
de 35 mm 65 mm, e composto por duas placas de vidro termicamente coladas. Na
placa superior foram perfurados orifcios para a introduo dos lquidos. O canal para
electroforese capilar tem 20 m (espessura) 60 m (largura) 4.2 cm (comprimento).
A sua aplicao contemplou a separao e quantificao da carnitina, um composto
envolvido no metabolismo dos cidos gordos, em apenas 30 segundos [37].
Introduo

17
4 kV
Reservatrio
da amostra
Reservatrio
do padro
4 kV
6 kV
Reservatrio do
desperdcio
Volume = 0.2 nl
Canal
(a)
(b)

Figura 1.13: Desenho esquemtico do microssistema em vidro para electroforese capilar:
(a) operao de carregamento das amostras; (b) operao de electroforese [37].
A deteco da cistena no plasma sanguneo por electroforese capilar num
microssistema foi apresentada por Pasas et al. A Figura 1.14 apresenta o esquema do
dispositivo. As condies de separao e deteco implementadas no microssistema
foram exactamente as mesmas dos sistemas convencionais para a mesma aplicao. A
separao e deteco foram realizadas em menos de 2 minutos [38].
Reservatrio
de deteco
Elctrodo
Reservatrio
do padro
Reservatrio
do desperdcio
10 cm
5 cm
Reservatrio
da amostra

Figura 1.14: Desenho esquemtico do microssistema. Os canais tm uma profundidade
de 12.1 m, e uma largura de 51.0 m. Os elctrodos de referncia e os auxiliares
(no visveis na figura) esto localizados no reservatrio de deteco [38].
A Figura 1.15 mostra um dispositivo para separar mltiplas bactrias do sangue
por electroforese, sem a utilizao de mltiplos anticorpos. A separao das bactrias foi
conseguida com uma eficincia de 97%. O microssistema tem a vantagem, por exemplo

18
em anlises clnicas, de conseguir detectar antignios antes do corpo comear a produzir
os anticorpos, pelo que pode detectar a doena no seu estado inicial [39].
4
0

m
m
40 mm

Clula de fluxo

(a) (b)
Figura 1.15: Fotografia do dispositivo completo [39].
Um microssistema que permite a deteco de vrias molculas no sangue atravs
de electroosmose encontra-se na Figura 1.16. O microcapilar com 30 30 m
(espessura largura) foi fabricado num substrato de dixido de silcio com dimenses
de 2 2 cm (largura comprimento). No microcapilar foi depositado um polmero
biocompatvel por forma s molculas do sangue aderirem s paredes do capilar [40].

(a)
Entrada dos
lquidos
Elctrodo
para a massa
Bomba
2 cm
2

c
m
Desperdcio
ISFET
Referncia

(b)
Entrada dos
lquidos
Elctrodo
para a massa
1 cm
Bomba
Desperdcio
ISFET ISFET
Referncia

Figura 1.16: (a) Diagrama esquemtico do prottipo do microssistema no qual os sensores
ISFET esto includos; (b) fotografia do microssistema fabricado [40].
Introduo

19
Apesar da maior parte dos microssistemas serem implementados para anlise
sangunea, existem j alguns para anlise de outros fluidos biolgicos. o caso da
anlise de amostras de urina com elevados nveis de aminocidos como um indicativo
de desordem do metabolismo dos aminocidos e mau funcionamento do fgado. Esta
anlise foi realizada, num microssistema (Figura 1.17), utilizando a separao por
electroforese com um mtodo de deteco por fluorescncia. Dezanove dos aminocidos
padro da urina podem ser detectados por este microssistema, com um limite mdio de
deteco de 32.9 M [41, 42].
Deteco
Amostra
Entrada dos
lquidos
Desperdcio
da amostra
Sada dos
lquidos

Figura 1.17: Configurao do microssistema para electroforese [42].
A tcnica de separao por electroforese capilar foi aplicada a uma amostra de
urina para separar o oxalato. O microssistema incorpora ainda o mtodo de deteco do
oxalato por condutividade. A Figura 1.18 ilustra o esquema dos canais fabricados em
PMMA (PolyMethylMethAcrylate). Foi conseguida uma deteco de concentraes de
80 nM em cerca de 280 s, sem necessidade de pr-tratamento da urina [43].
CE
in
CD
1
CD
2
CE
in
S
in
W
out

Figura 1.18: Esquema ilustrativo dos canais em PMMA no microssistema. CE
in
: entrada da
soluo electrlito portador; S
in
: entrada da amostra; W
out
: sada dos desperdcios;
CD
1
e CD
2
: sensores de platina. O canal de injeco da amostra definido por S
in
e
W
out
(12.5 mm de comprimento, 0.2 mm de largura e 0.2 mm de profundidade). O
canal de separao definido por W
out
a CD
2
(90.8 mm de comprimento, 0.5 mm
de largura e 0.2 mm de profundidade) [43].

20
Uma enorme variedade de microssistemas em vrias reas biomdicas mostra
claramente que estes so um campo de pesquisa bastante interessante. No que diz
respeito rea de diagnsticos clnicos um enorme nmero de microssistemas tem sido
desenvolvido. Pode dizer-se que existem uma srie de microssistemas para anlise de
protenas. Contudo, a maior parte deles so baseados em tcnicas de electroforese
capilar. Isto compreensvel uma vez que minimizar a tcnica de electroforese resulta
numa reduo do tempo necessrio separao das protenas de mais de 90%. Contudo,
os sistemas para quantificar e determinar as protenas separadas por electroforese, so
normalmente complexos quando integrados num microssistema. essencial que a sua
deteco seja de elevada sensibilidade, uma vez que necessita de detectar entre 100 a
10
5
molculas de dimenses entre 1 a 10 m.
Microssistemas que sejam fceis de usar, portteis e que tenham um custo
similar aos testes diagnsticos realizados com fita reagente, mas que forneam
resultados quantitativos fiveis, ainda so uma lacuna. Exemplos dessas lacunas so
microssistemas para quantificar protenas e outras biomolculas da urina, do fluido
cerebrospinal e mesmo do plasma sanguneo. Estes devem incluir um sistema de leitura
dos resultados que permita na hora e no local determinar os valores dessas
biomolculas, de forma a obter-se imediatamente um diagnstico definitivo.
Em meados de 2003 surgiu um modelo comercialmente disponvel que de
alguma forma preenche essas lacunas, o Urisys1100 da Roche (Figura 1.19). Este
dispositivo, especfico para anlises de rotina urina, permite analisar um mximo de
10 biomolculas ou compostos da urina simultaneamente [44]. Contudo, o mtodo
utilizado o da fita reagente embebida em urina. Note-se que nos laboratrios de
anlises clnicas os reagentes existem na forma lquida. Uma desvantagem deste mdulo
a possvel contaminao das amostras, uma vez que as fitas reagentes so colocadas
numa rgua, que se no for bem limpa aps cada anlise, pode deixar resduos que
afectem a leitura. Outra desvantagem face aos equipamentos convencionais dos
laboratrios de anlises clnicas que os resultados so quantitativos apenas quando os
valores se encontram fora da gama de valores normais. Caso contrrio, o valor impresso
no papel ser de NEG (negativo) ou NOR (normal), consoante a biomolcula a analisar
(ver Figura 1.19). bvio que num primeiro diagnstico estes resultados qualitativos
servem. Contudo, em alguns casos o valor quantitativo dentro dos padres normais mas
perto dos valores anormais, pode indicar um indcio de doena. Quando o resultado
um valor anormal, esse valor encontra-se dentro de determinadas gamas de
concentraes, no se obtendo uma gama de valores linear. Alm disso, no caso de ser o
Introduo

21
prprio paciente a fazer a anlise, o facto de utilizar fitas reagentes pode ser uma
desvantagem face utilizao de reagentes lquidos. Inconscientemente, existe mais
cuidado no manuseamento de reagentes lquidos.

Figura 1.19: Fotografia do dispositivo Urisys1100 [44].
1.2 Motivao e objectivos
Este projecto contribui para a rea de diagnsticos clnicos atravs do
desenvolvimento e fabrico de um microssistema que satisfaz as lacunas anteriormente
descritas. Pretende construir-se um microssistema para quantificar vrias biomolculas
dos fluidos biolgicos, que funcione de forma anloga aos aparelhos utilizados nos
laboratrios de anlises clnicas (por espectrofotometria, ver seco 1.1.3), que tenha o
mesmo ou melhor desempenho (preciso e fivel), que o local de circulao dos fluidos
seja descartvel, que inclua um sistema de leitura dos resultados e cujo custo, quando
produzido em massa, seja similar ao custo da aquisio das fitas reagentes nas
farmcias. Qualquer tcnico de sade (ou mesmo qualquer pessoa caso o fluido seja a
urina), aps a recolha da amostra do fluido biolgico, deve coloc-la no microssistema e
obter de imediato um resultado quantitativo e fivel.
1.2.1 Conceito de microssistema de fluidos biolgicos
O conceito de um microssistema para anlise de fluidos biolgicos relaciona-se
com um dispositivo capaz de realizar todos os procedimentos necessrios para a anlise
de uma amostra. O seu projecto ditado pela tecnologia disponvel para o fabricar,
sendo necessrio uma procura contnua de novos materiais, novas tcnicas de fabrico,
novas estruturas para o desenho dos canais, novos sistemas de leitura dos resultados e
novas interfaces com o exterior. A integrao destes conceitos num nico chip ainda

22
um desafio. Geralmente, estes chips s so fabricados para aplicaes muito especficas
e quando se prev que o nmero de vendas permite recuperar os enormes investimentos
no desenvolvimento do processo. Deste modo, o microssistema pode permitir que
alguns dos seus componentes sejam montados em vrias e independentes configuraes,
formando um sistema modular completo.
Um microssistema para anlise de fluidos biolgicos por espectrofotometria ,
normalmente, composto por dois mdulos distintos. Um deles contm os canais nos
quais circularo os fluidos. O outro inclui o sistema de deteco e leitura dos resultados
da anlise. O mdulo para a circulao dos fluidos pode ser fabricado em vidro, em
polmero ou mesmo em silcio. Neste ltimo caso, o sistema de deteco no pode ser
baseado em medies pticas, uma vez que o silcio no possui transparncia na regio
visvel do espectro electromagntico. Actualmente, o uso de materiais polimricos est a
ser uma tendncia dominante, principalmente quando se pretende um dispositivo
descartvel. Neste caso, a contaminao entre as diversas anlises deixa de ser um
problema e desaparece o custo inerente aos produtos de limpeza dos locais de circulao
dos fluidos. Note-se que o custo de um dispositivo de polmero, quando produzido em
larga escala, muito baixo. O sistema de deteco e leitura dos resultados inclui um
detector ptico e electrnica de leitura. Esta realiza a converso do sinal do detector para
um sinal digital para posterior aquisio e tratamento dos dados num computador. Todo
este mdulo, incluindo o detector, pode ser fabricado utilizando microelectrnica
standard, o que possibilita a integrao do detector, da electrnica de leitura e adio de
circuitos suplementares num nico chip.
Um microssistema como o descrito abre aos mdicos a possibilidade de fazer
anlises aos fluidos biolgicos (tais como: sangue, urina, saliva, fluido cerebrospinal) na
hora da consulta e permite ser utilizado pelos pacientes na sua prpria casa.
1.2.2 Microssistema laboratorial para anlise de urina: Microlab
A urina foi o fludo biolgico utilizado para testar o Microlab. A sua escolha
deveu-se em primeiro lugar ao facto da amostra retirada da urina poder ser directamente
utilizada nas medies (por exemplo, na maior parte das anlises ao sangue necessrio
separar o plasma e o soro sanguneo). Em segundo lugar, pensando no Microlab, o
fluido biolgico com menos viscosidade e por isso mais fcil de fluir nos canais a
implementar. Contudo, outros fluidos biolgicos podem ser utilizados no mesmo
Microlab desde que a anlise seja realizada da mesma forma. O Microlab permite
Introduo

23
analisar biomolculas para as quais no existem fitas reagentes comercialmente
disponveis.
O Microlab desenvolvido neste trabalho composto por trs mdulos
(Figura 1.20 e Figura 1.21): o sistema de circulao dos fluidos, o sistema de filtragem
ptica e o sistema de deteco e leitura.
Substrato p
n+
p+
Lamela de vidro
2 Lamela (canais)
Fotododo
Sistema de
deteco
Microfluidos
Filtro ptico

Figura 1.20: Esquema da estrutura do Microlab para um canal ptico individual, vista em corte.
O sistema de circulao dos fluidos, ou simplesmente sistema de microfluidos,
fabricado em vidro e composto por duas lamelas cada uma com 1 mm de espessura
(Figura 1.21(b)). A primeira lamela tem os orifcios para a injeco e remoo dos
lquidos e a segunda inclui os canais. O Microlab contm basicamente trs canais. Um
para obter a linha de referncia. Outro para o fluido a analisar. Este tem duas entradas e
uma sada para permitir a mistura do fluido com o reagente de forma automtica. Por
fim, o terceiro canal necessrio para calibrar a concentrao da biomolcula a medir
(com um padro de concentrao conhecida) e para calibrar a fonte de luz.
O sistema de filtragem ptica encontra-se por cima do mdulo anterior (ver
Figura 1.20). composto por uma lamela de vidro de 0.5 mm de espessura na qual so
depositados filmes finos de material dielctrico para formar filtros pticos passa-banda.
Os filtros pticos tm como funo seleccionar o comprimento de onda, dentro do
espectro electromagntico de luz visvel, adequado biomolcula que se pretende
analisar. O uso de filtros pticos no Microlab permite que as medies sejam realizadas
com uma fonte de luz convencional (por exemplo, simples luz branca), evitando assim
as tradicionais e dispendiosas fontes de luz dependentes do comprimento de onda (por
exemplo, fonte monocromtica). O uso de uma fonte de luz branca nas medies faz
com que o sistema seja porttil e adequado para medies em qualquer local. Em vez de
um nico filtro, implementada uma matriz de 16 filtros pticos (Figura 1.21(a)) o que
permite medir 16 biomolculas diferentes com o mesmo Microlab.

24
(a)
(b)
(c)

Figura 1.21: Esquema do Microlab.
O sistema de deteco e leitura encontra-se por baixo dos outros dois (ver
Figura 1.20) e fabricado segundo um processo CMOS (Complementary Metal Oxide
Semiconductor) standard. Contm uma matriz de fotododos para medir a intensidade
do feixe de luz transmitido atravs da mistura. Este feixe, com vrias componentes
espectrais, filtrado pelos filtros pticos obtendo-se apenas uma banda muito estreita
com poucas componentes espectrais. A matriz de fotododos posicionada exactamente
debaixo da matriz dos filtros pticos (Figura 1.21(c)). Para converter o sinal analgico
dos fotodetectores num sinal digital, um conversor luz - frequncia foi implementado e
integrado no mesmo processo de fabrico.
Na Figura 1.22 encontra-se uma fotografia do Microlab. O funcionamento do
Microlab baseia-se na deteco colorimtrica por absoro ptica. A amostra, na qual se
encontra a biomolcula a ser analisada, quando misturada com um determinado reagente
produz uma determinada cor. A intensidade dessa cor directamente proporcional
concentrao da biomolcula em anlise. A deteco colorimtrica consiste na medio
da intensidade dessa cor. Para tal, um feixe de luz direccionado para o canal no qual se
encontra a mistura a analisar. A intensidade da luz transmitida atravs da mistura
medida por um fotodetector colocado por baixo da zona de medio. A intensidade
medida pelo fotodetector proporcional concentrao da biomolcula em anlise.
Introduo

25
Desta forma, consegue quantificar-se a concentrao de biomolculas existentes em
fluidos biolgicos.

Figura 1.22: Fotografia do Microlab.
1.3 Organizao da tese
Este captulo contm uma breve descrio sobre a anlise aos fluidos biolgicos
realizada nos laboratrios de anlises clnicas e as vantagens de fazer esta anlise num
microssistema. Inclui tambm uma reviso de microssistemas j implementados
descritos na literatura e estabelece a noo, motivao e objectivo deste projecto. O
captulo 2 apresenta uma panormica geral sobre a urina, os seus componentes e a
importncia clnica desses componentes. Determina-se ainda o volume mnimo de
amostra a utilizar para que no se invalide o mtodo de anlise. O captulo 3 dedica-se
ao sistema de microfluidos, i. ., estrutura dos microcanais, atravs de simulaes
computacionais de forma a obter-se um modelo dinmico tridimensional de fluidos. No
captulo 4 aborda-se como as estruturas de filmes finos podem ser analisadas,
compreendidas e aplicadas no projecto de filtros pticos baseados em filmes finos. O
captulo 5 apresenta o fotodetector e a electrnica de leitura e de converso do seu sinal
realizada por um conversor luz frequncia. O fabrico do Microlab descrito no
captulo 6. O captulo 7 refere e documenta os resultados prticos obtidos atravs de
vrias experincias, com o objectivo de testar o funcionamento do Microlab. No
captulo 8 so tecidas algumas consideraes globais sobre o trabalho realizado, bem

26
como sugestes que podero ser efectuadas sobre o trabalho j desenvolvido. As figuras,
equaes e tabelas presentes nesta tese so numeradas com dois identificadores
numricos independentes, separados por um ponto. O primeiro identificador indica o
captulo ao qual essa figura, equao ou tabela pertencem. O segundo representa a
numerao sequencial dentro de cada captulo. A notao adoptada ao longo do texto e
o significado dos acrnimos e dos smbolos mais utilizados so descritos numa lista de
smbolos, situada aps o ndice. As referncias bibliogrficas, segundo a norma
portuguesa NP405-1, so indicadas por um nmero dentro de parnteses rectos. A
numerao realizada de forma sequencial e associada a uma referncia bibliogrfica
indicada no final de cada captulo na seco Bibliografia.
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31
2

Deteco colorimtrica na quan-
tificao de biomolculas na urina
Neste captulo ser apresentada uma breve descrio da urina e seus compostos,
assim como as implicaes clnicas de algumas das suas biomolculas. Seguidamente
determinar-se- o volume mnimo de amostra a utilizar, tendo presente que se deve
garantir uma quantidade significativa da biomolcula a analisar. Por fim, descrevem-se
os conceitos gerais, requisitos e mtodos para a anlise quantitativa da concentrao de
biomolculas na urina por absoro ptica na gama da luz visvel: deteco
colorimtrica. Este mtodo de deteco o utilizado nos laboratrios de anlises
clnicas e pretende-se que seja implementado no Microlab.
2.1 Urina
A urina foi o fluido biolgico seleccionado para estudo neste trabalho. Da a
necessidade de dedicar esta seco formao, composio e importncia clnica de
alguns compostos da urina.
2.1.1 Histria
Pode dizer-se que a medicina laboratorial comeou com as anlises de urina.
Referncias ao estudo da urina podem ser encontradas em hieroglficos Egpcios e em
desenhos em cavernas [1]. Apesar dos clnicos desse tempo no disporem dos
sofisticados mecanismos de teste disponveis hoje em dia, eles conseguiam obter

32
informao diagnstica de observaes bsicas como a cor, a turbulncia, o odor, o
volume, a viscosidade e mesmo a doura (notando neste caso que algumas amostras
atraiam formigas). Estas mesmas caractersticas da urina (caractersticas fsicas) so
ainda hoje analisadas em laboratrios e continuam a ter um papel importante numa
anlise de rotina urina. Durante um exame inicial (fsico) urina possvel deduzir a
existncia de algumas doenas com base em biomolculas anormais a presentes.
Contudo, a anlise de urina expandiu as suas metas de modo a incluir no apenas o
exame fsico, mas tambm a anlise qumica e o exame microscpico dos sedimentos da
urina (conforme referido na seco 1.1.3).
2.1.2 Formao da urina
A urina, um lquido muito complexo, composta por 95% de gua e 5% de
slidos. o produto final do metabolismo realizado por bilies de clulas no sistema
renal e urinrio e resulta numa eliminao mdia de 1 a 1.5 litros de urina por dia,
dependendo da ingesto hdrica.
A formao da urina ocorre nos rins. Estes, juntamente com a pele e o sistema
respiratrio, so os principais rgos excretores do corpo. A importncia da formao e
excreo da urina como funo reguladora profundamente enfatizada ao lidar-se com
situaes nas quais a funo do rim subitamente perdida. Nestas circunstncias, pode
ocorrer a morte dentro de poucos dias. Uma grande quantidade de sangue circulante flui
atravs dos rins: 25% do sangue do lado esquerdo do corao atravessam os rins. Um
litro de urina o produto final de mais de 1000 ml de sangue circulante que atravessa os
rins. O rim possui a importante capacidade de diluir ou concentrar urina, de acordo com
as necessidades do indivduo, e regular a excreo do sdio. A bioqumica sangunea, a
presso sangunea, o equilbrio hdrico, a ingesto de nutrientes, juntamente com o
estado geral de sade, so elementos fundamentais em todo este processo metablico.
2.1.3 Composio da urina
A urina contm milhares de biomolculas e compostos dissolvidos e o fluido
que excreta mais slidos do organismo. A Tabela 2.1 compara as quantidades e os pesos
dos principais compostos da urina. Note-se que a quantidade de um composto em
milimoles relativa ao nmero de partculas/molculas presentes, enquanto o peso do
composto refere-se sua massa. Estas quantidades so necessrias para o clculo do
volume mnimo de urina a utilizar no Microlab, de modo a garantir pelo menos uma
Deteco colorimtrica na quantificao de biomolculas na urina

33
molcula de uma determinada biomolcula ou composto. Na seco 2.2 abordar-se-
esta questo.
Tabela 2.1: Composio mdia de alguns compostos da urina numa colecta de 24 horas [2].
Composto Quantidade mdia (mmol) Peso mdio (mg)
gua (1.2 litros
1
) 67000.00 1200000
Ureia 400.00 24000
Cloreto 185.00 6570
Sdio 130.00 2990
Potssio 70.00 2730
Amnia 40.00 720
Fosfato inorgnico 30.00 2850
Sulfato inorgnico 20.00 1920
Creatinina 11.80 1335
cido rico 3.00 505
Glicose 0.72 130
Albumina 0.001 90
Protena total 0.003 150
1
A mdia de urina colectada em 24 horas, com uma razo de filtrao glomerular de 125 mmol/min.
Dos compostos existentes na urina que so analisados por deteco
colorimtrica, apenas a importncia clnica da protena total e do cido rico ser
descrita. Esta escolha foi baseada em informao retirada de laboratrios de anlises
clnicas, os quais reportaram as biomolculas analisadas normalmente em testes de
rotina urina. Dessas biomolculas escolheram-se as duas acima referidas - protena
total e cido rico - para verificar o correcto funcionamento do Microlab.
2.1.4 Importncia clnica da proteinria e albuminria
A quantidade de protena na urina (proteinria) o indicativo mais relevante de
doena renal. Em indivduos saudveis existem apenas vestgios de protena que pode ir
at cerca de 150 mg/l [1]. A medio da quantidade de protena total existente numa
pessoa uma forma de averiguar o seu estado de sade, no s no diagnstico de
doenas relacionadas com o mau funcionamento dos rins, como tambm pelo facto de
quantidades anormais de protena total na urina poderem significar cancro, por exemplo.
J na dcada de 70 foi demonstrada a existncia de mais de 200 protenas urinrias [3].
Atravs do mtodo colorimtrico apenas se consegue determinar a concentrao das
protenas da urina (total ou especfica). A discriminao/separao dessas protenas

34
poder ser feita atravs de electroforese, por exemplo. Sabe-se porm que essas
protenas consistem em albumina (um tero da proteinria albumina) e globulinas do
plasma. Contudo, existem reagentes especficos para quantificar determinadas protenas
na urina atravs do mtodo colorimtrico. o caso da albumina, bilirrubina, entre
outras [4].
A razo entre a albumina e a protena total presente na urina de pessoas doentes,
pode ajudar a distinguir qual o tipo de doena que est a afectar o rim. Por isso, pode ser
vantajoso utilizar simultaneamente um teste de quantificao de protena total e um teste
de quantificao de protena especfico para a albumina. Alm disso, a medida da
albumina na urina, separada das outras protenas a existentes, normalmente chamada de
albuminria, muito til na previso de diagnsticos precoces de doenas renais e sua
progresso. Mais ainda, a albuminria um indicador chave da necessidade de
tratamento intensificado em pacientes com diabetes. Contudo, a concentrao de
albumina na urina baixa (de 50 a 150 mg/l), pelo que para a sua determinao precisa
so necessrios mtodos de elevada sensibilidade.
2.1.5 Importncia clnica do cido rico na urina
O cido rico representa o principal produto final do metabolismo das purinas,
sendo excretado na urina. Depois da hidrlise dos cidos nucleicos, as bases pricas
livres, so convertidas, principalmente a nvel do fgado, em uratos. A quantidade de
cido rico excretado na urina dependente da alimentao (ingesto de carnes, fgado,
rim, certos vinhos, etc.). A quantidade mdia excretada na urina por um adulto de
aproximadamente 0.4 a 0.8 g de cido rico por dia. Numa dieta pobre em purinas essa
quantidade poder descer at 0.12 g/dia e numa dieta rica em purinas poder atingir
1 g/dia. Se uma pessoa, em mdia, excreta 1.5 litros de urina por dia, as quantidades
referidas sero de 267 mg/l a 533 mg/l (dieta normal), 80 mg/l (dieta pobre em purinas)
e 667 mg/l (dieta rica em purinas).
O cido rico pouco solvel, pelo que quando os seus valores so superiores
aos valores normais poder haver precipitao dessa biomolcula no organismo, o que
determina o aparecimento de fenmenos dolorosos nas articulaes (h deposio de
cido rico nas articulaes). Nveis elevados de cido rico ocorrem em doenas como
a gota, leucemia mielide crnica, policitemia vera, sndrome de Lesch-Nyhan, doena
de Wilson, hepatite viral, anemia falciforme, gravidez com subcarga de sal, drogas

35
citotxicas para tratar linfoma e leucemia, etc. Nveis baixos so encontrados em doena
renal crnica, deficincia de cido flico e intoxicao por chumbo [1].
2.2 Biomolculas em pequenos volumes de urina
O volume de ensaio para a anlise de urina utilizado nos laboratrios de anlises
clnicas de 1 ml. No Microlab pretende-se que seja da ordem dos 10 l. Assim,
necessrio provar que a reduo do volume de lquido ensaiado no impea a existncia
de pelo menos uma quantidade significativa de molculas a analisar. Por isso,
necessrio saber at que ponto se pode reduzir o volume da amostra de forma a garantir
um nmero significativo de molculas da biomolcula a analisar. A relao entre o
volume da amostra, V (l), e a concentrao da biomolcula a analisar, C (mol/l), dada
por [5],

C N
V
AV

=
1
(2.1)
onde a eficincia do sensor (0 1) e N
AV
= 6.02310
23
o nmero de Avogadro.
Esta equao demonstra que o volume da amostra determinado pela concentrao da
biomolcula que se pretende analisar. Mais ainda, a concentrao de uma determinada
biomolcula determina a quantidade de molculas presentes para um determinado
volume de amostra. Geralmente, os ensaios para quantificar biomolculas, requerem
concentraes dessa biomolcula na amostra que tenham entre 10
14
e 10
21
molculas por
mililitro [5].
2.2.1 Dimenso de uma molcula de albumina
Para determinar a ordem de grandeza do volume mnimo a utilizar quando se
pretende quantificar a protena total na urina utilizou-se uma protena muito
representativa, a albumina (recorde-se que esta representa 1/3 das protenas totais da
urina). O problema resolver-se- na situao mais delicada, ou seja, com a concentrao
de albumina mais baixa existente na urina (50 mg/l). Note-se que quanto maior a
concentrao mais molculas de albumina se encontram num determinado volume da
amostra. O menor volume da amostra para garantir que esta contenha pelo menos uma
molcula de albumina pode ser calculado pelo mtodo que se apresenta a seguir.

36
Da Tabela 2.1, conclui-se que 1 mol de albumina pesa 90 mg e contm
6.02310
17
molculas (1 mol = 6.02310
23
partculas). Na concentrao mais baixa,
50 mg/l, existem 3.3510
17
molculas de albumina. Pelo que, em 1 pl de amostra de
urina com a albumina concentrao de 50 mg/l (50 fg/pl) existem 3.3510
5
molculas
de albumina. Com estes valores conclui-se que a anlise de albumina e
consequentemente de protena total na urina (esta ltima alm de albumina ainda
contm mais protenas o que aumenta a quantidade de molculas), pode ser realizada
num microssistema. No Microlab, com 10 l de urina, existem 3.3510
12
molculas de
albumina, para a concentrao referida.
2.2.2 Dimenso de uma molcula de cido rico
No caso do cido rico, considere-se de igual modo o pior cenrio para a sua
concentrao, ou seja, como foi referido em 2.1.5, o valor mais baixo que um doente
pode ter de cido rico na urina, que de 80 mg/l. Da Tabela 2.1 conclui-se que 3 mmol
de cido rico pesam 505 mg e contm 1.806910
21
molculas. concentrao de
80 mg/l existem 2.8610
20
molculas de cido rico. Pelo que, em 1 pl de uma amostra
de urina com cido rico concentrao de 80 mg/l (80 fg/pl) tem-se 2.8610
8
molcu-
las de cido rico. Tal como no caso anterior, tambm neste se conclui que a anlise de
cido rico pode ser implementada com sucesso no microssistema. No Microlab, com
10 l de urina, existem 2.8610
15
molculas de cido rico, para a concentrao
referida.
2.3 Deteco por espectrofotometria
A espectrofotometria (o estudo da interaco da radiao electromagntica com
as biomolculas) , de entre as vrias tcnicas analticas disponveis em laboratrios de
anlises clnicas, a mais utilizada. A espectrofotometria pode ser utilizada para
identificar uma biomolcula especfica, determinar a sua estrutura, determinar a sua
concentrao e/ou quantidade (ex.: protenas, aminocidos) e determinar a actividade de
uma enzima especfica.
2.3.1 Espectro electromagntico
A gama do espectro electromagntico estende-se desde os raios csmicos at s
ondas de radiofrequncia, com comprimentos de onda de 10
-15
m a 10
3
m,

37
respectivamente (Figura 2.1). As molculas biolgicas interagem com diferentes partes
desse espectro.
10
-14
10
-12
10
-10
10
-8
10
-6
10
-4
10
-2
10
0
10
2
10
4
Raios
gama
Raios
ultravioleta
Raios
infravermelhos
Comprimento de onda (metros)
Ondas de
radiofrequncia
Micro-ondas
Luz visvel
780 nm
390 nm
Raios X
Violeta Verde Laranja Azul Amarelo Vermelho

Figura 2.1: Espectro electromagntico [6].
A regio visvel do espectro electromagntico foi, e ainda , a mais utilizada
para medidas bioqumicas quantitativas em sistemas biolgicos, provavelmente por
conter radiao que pode ser vista pelo olho humano. Contudo, tambm outras regies
do espectro electromagntico so utilizadas para analisar molculas de interesse
biolgico. Os raios X, por exemplo, so usados para determinar a localizao precisa de
tomos dentro de uma estrutura (cristalografia de raios X). A espectroscopia de
infravermelhos usada para identificar estruturas orgnicas a partir das suas
caractersticas de vibrao e rotao molecular. A radiao micro-ondas usada em
tcnicas que investigam o movimento nuclear e electrnico (por exemplo, ressonncia
magntica) [7].
A radiao electromagntica comporta-se como ondas electromagnticas e como
partculas (fotes). A distncia entre dois picos adjacentes da onda definida como
comprimento de onda () da luz. A unidade do comprimento de onda o metro (m). A
frequncia de uma onda electromagntica (f) o nmero de oscilaes que ocorrem num
segundo. A sua unidade s
-1
ou Hz. O comprimento de onda e a frequncia esto
reciprocamente relacionados,

f
c
= (2.2)

38
onde, c a velocidade da luz em m s
-1
. A energia de um foto inversamente
proporcional ao comprimento de onda da luz,

f
c
h E = (2.3)
onde, E a energia de um foto em Joules e h a constante de Planck (6.62610
-34
J s).
A cor das solues e da luz reflectida determinada pelos comprimentos de
onda da luz que no so absorvidos pela soluo ou pelas biomolculas que reflectem a
luz. Por exemplo, muitas plantas so verdes porque a clorofila absorve luz fora da
regio verde.
2.3.2 Anlise quantitativa na gama da luz visvel
Um grande nmero de biomolculas com interesse para anlise no tm
cromforos
1
que absorvam luz na gama visvel. Assim, a espectrofotometria no pode
ser directamente utilizada para determinar a concentrao dessas biomolculas numa
dada amostra. Contudo, existem uma srie de reaces qumicas especficas que
transformam essas biomolculas em produtos coloridos as reaces colorimtricas
cuja absorvncia se encontra dentro da gama de luz visvel. Essas reaces devem ser
especficas, rpidas, reprodutveis e terem um valor de absorvncia estvel (durante um
determinado perodo de tempo). Este o princpio da deteco colorimtrica. A
Figura 2.2 traduz a alterao espectrofotomtrica ocorrida devido reaco qumica que
transformou a biomolcula A num composto C (normalmente denominada de mistura)
com cromforos na gama da luz visvel. Na anlise colorimtrica ideal, o valor da
absorvncia da mistura proporcional concentrao da biomolcula. Por mistura
entenda-se o produto colorido obtido aps misturar um determinado reagente na amostra
que contm a biomolcula a analisar. O termo colorimetria derivou do facto de,
antigamente, as medies no domnio espectral serem feitas sem nenhum instrumento
ptico. Era realizada uma comparao visual da cor da amostra com uma soluo de
referncia de concentrao conhecida.

1
Grupo de tomos num composto orgnico capaz de originar a absoro de radiao, qualquer que seja a
natureza do resto do composto.

39
A
b
s
o
r
v
n
c
i
a

(
A
U
)
Comprimento de onda
C
(a)
(b)
A
500 400 600 (nm)

Figura 2.2: Alterao no espectro de absoro: (a) espectro da biomolcula a quantificar;
(b) espectro da mistura da biomolcula A com cromforo para ser quantificado por
colorimetria.
Pode ocorrer uma situao em que a mistura tenha duas biomolculas A e B que
absorvam na mesma gama espectral. Neste caso, uma medio directa da absorvncia
no revela o valor quantitativo da biomolcula A mas sim das duas (Figura 2.3,
curva (a)). necessrio transformar a biomolcula A atravs de uma reaco qumica
num composto C com uma banda de absoro retirada da banda de absoro da
biomolcula B (Figura 2.3, curva (b)).
A
b
s
o
r
v
n
c
i
a

(
A
U
)
Comprimento de onda
A B +
(a)
(b)
B
C
500 400 600 (nm)

Figura 2.3: Alterao no espectro de absoro: (a) espectro da biomolcula a quantificar;
(b) alterao do espectro para desviar o mximo da absorvncia da biomolcula A
para C.
Na deteco colorimtrica existem uma srie de requisitos que tm que ser
cumpridos para uma correcta leitura das absorvncias das biomolculas. Esses requisitos
so normalmente inerentes s biomolculas e reagentes utilizados e so descritos nos
protocolos dessas biomolculas. No anexo I citam-se alguns desses requisitos.

40
2.3.3 Absoro na gama da luz visvel
A absoro o efeito da atenuao do sinal ptico devido interaco com os
tomos e molculas da amostra, para certas frequncias. Na regio visvel a absoro da
luz ocorre quando os fotes absorvidos excitam um electro de um estado de energia
para um estado de energia superior. A Figura 2.4 ilustra alguns desses nveis de
energia [8].
E
0
E
1
E
2

Figura 2.4: Diagrama de nveis de energia com algumas das alteraes de energia que ocorrem
durante a absoro, para uma espcie molecular.
A energia de um foto determina qual a transio que pode ocorrer. Dentro de
um nvel de energia, podem existir vrios subnveis (linhas horizontais na Figura 2.4). A
diferena de energia entre os nveis de energia de uma determinada molcula
dependente da sua estrutura, pelo que a absoro da luz por uma molcula ser funo
tanto da sua estrutura como do comprimento de onda da luz. Alteraes qumicas que
alterem a estrutura de uma molcula alteraro o seu espectro de absoro.
Na espectrofotometria por absoro, dois termos so geralmente utilizados como
medidas quantitativas da atenuao do sinal ptico: a transmitncia e a absorvncia
(Figura 2.5). A transmitncia (T) a fraco da intensidade da luz incidente numa
amostra que transmitida atravs dessa mesma amostra,

inicial
final
I
I
T = (2.4)
onde, I
final
e I
inicial
so a intensidade inicial e final da luz, respectivamente. A intensidade
da radiao I
inicial
diminui medida que atravessa a amostra de espessura d e coeficiente
de absoro, . A intensidade da luz transmitida atravs dessa amostra dada por [9],
) exp(
inicial final
d I I = (2.5)

41
Note-se que a alterao do valor da transmitncia no uma funo da intensidade
inicial da luz, pelo que medidas em absoro podem ser feitas com uma variedade de
intensidades de luz. A absorvncia (A) pode ser representada por,
T A log = (2.6)

I
inicial I
final
Amostra
d
d Comprimento do
caminho percorrido
pela luz na amostra
(caminho ptico)

Figura 2.5: Atenuao da intensidade da luz devido a uma soluo absorvente.
A absorvncia da luz para um determinado comprimento de onda directamente
proporcional ao nmero de molculas capazes de absorver nesse comprimento de onda e
que se encontram no caminho percorrido pela luz. Como o nmero dessas molculas
uma funo directa da concentrao da biomolcula e do comprimento do caminho
ptico, a absorvncia da luz por uma determinada soluo directamente proporcional a
essas variveis. A lei de Lamber-Beer define que,
dC A
mol
= (2.7)
onde A a absorvncia, um parmetro ptico sem unidades, medida com um
espectrofotmetro; d o comprimento do caminho ptico em metros; C a
concentrao molar em moles/l; e
mol
o coeficiente de absoro molar (ou
absortividade molar) em l/(molm) para um determinado comprimento de onda. A
absortividade molar uma funo da estrutura da molcula e do comprimento de onda
da luz que atravessa a soluo. Geralmente, o seu valor conhecido para o comprimento
de onda na qual a absoro mxima [7].
2.3.4 Clculo da Concentrao
Se, para uma determinada biomolcula, a absortividade molar para um
comprimento de onda especfico conhecida, ento, o clculo da concentrao dessa
biomolcula pode ser determinado atravs do valor da absorvncia nesse comprimento
de onda pela lei de Lamber-Beer:

42

d
A
C
mol
= (2.8)
Nos casos que a absortividade molar desconhecida, ela pode ser determinada atravs
da regio linear da curva de calibrao (absorvncia = f(concentrao)) obtida para o
mesmo comprimento de onda. O declive dessa regio linear a absortividade molar.
O clculo da concentrao para biomolculas que absorvem radiao na gama da
luz visvel usando a lei Lamber-Beer a base do mtodo colorimtrico.
2.4 Concluso
Este captulo estudou a urina, sua formao e os seus principais compostos.
Foram referidas as implicaes clnicas dos valores anormais das duas biomolculas que
sero as primeiras candidatas para as anlises no Microlab: protena total e cido rico.
Seguidamente, calculou-se o nmero de molculas dessas duas biomolculas existentes
num volume de 10 l de urina, para a menor concentrao existente num ser humano.
Esse volume ser aproximadamente o utilizado no Microlab. Conclui-se que em 10 l
de urina existem 3.3510
12
molculas de albumina (concentrao de 50 mg/l) e
2.8610
15
molculas de cido rico (concentrao de 80 mg/l). Ficou assim provado que
a anlise dessas duas biomolculas pode ser realizada no Microlab. Por fim, dedicou-se
uma seco aos conceitos gerais, aos requisitos e ao mtodo colorimtrico para a anlise
quantitativa da concentrao das biomolculas da urina. Esse mtodo baseia-se no
aumento da absorvncia mxima, para um determinado comprimento de onda, que
ocorre aps a ligao de um reagente com a biomolcula a analisar. Esse aumento
directamente proporcional concentrao da biomolcula, e traduz-se no aumento da
intensidade da cor produzida pela mistura. O clculo da concentrao da biomolcula
em anlise efectuado com base na lei de Lamber-Beer.
Bibliografia
[1] STRASINGER, S. K; Di LORENZO, M. S. - Urinalysis and body fluids. 4
th
ed.
F. A. Davis Company, Philadelphia, 2001.
[2] BRUNZEL, N. A. - Fundamental of urine and body fluids analysis. W. B.
Saunders Company, USA, 1994.

43
[3] Todd, J. C.; Sanford, A. H.; Davidsohn I. - Clinical diagnosis and management.
17
th
ed. W. B. Saunders Company, USA, 1984.
[4] Biochemistry and Organic Reagents: for bioscience investigation. Sigma-Aldrich
Diagnostics
, 2002.
[5] MANZ, A.; GRABER, N.; WIDMER, H. M. - Miniaturized total chemical
systems: a novel concept for chemical sensing. Sensors and Actuators, Vol. B1
(1990) p. 244-248.
[6] HECHT, E. - ptica, Fundao Calouste Gulbenkian, Lisboa, 1991.
[7] STEWART, K. K.; EBEL, R. E. - Chemical measurement in biological systems.
John Wiley & Sons, USA, 2000.
[8] SKOOG, D. A.; EST, D. M.; - Fundamentals of analytical chemistry. 5
th
ed.
Saunders College Publishing, Philadelphia, 1987.
[9] ROUESSAC, F.; ROUESSAC, A. - Chemical analysis, modern instrumental
methods and techniques. John Wiley & Sons, USA.

45
3

Sistema de microfluidos
Este captulo descreve a estrutura dos canais nos quais circularo os fluidos
biolgicos. Para a definir necessrio ter em conta o formato e a geometria dos canais,
o tipo de movimento do fluxo (laminar ou turbulento), o tempo e o processo de reaco
dos fluidos, as propriedades dos fluidos que circulam nesses canais e o possvel
aparecimento de bolhas de ar nesses canais devido s suas pequenas dimenses.
Recorreu-se a simulaes computacionais, de forma a obter-se um modelo dinmico
tridimensional de fluidos que fosse adequado para realizar o processo de mistura do
fluido biolgico com um determinado reagente. Neste captulo far-se- uma breve
introduo teoria da mecnica de fluidos. Uma explicao detalhada pode consultar-se
em [1]. Captulos sobre microfluidos podem ser consultados em [2, 3] e em artigos de
reviso [4].
3.1 Anlise das caractersticas dos sistemas de microfluidos
O factor tempo um requisito essencial num sistema de mistura de microfluidos.
Devido falta de mecanismos de mistura convencionais miniaturizados, a mistura de
fluidos num microcanal acarreta algumas dificuldades.
3.1.1 Propriedades dos fluidos num microssistema e num sistema
macroscpico
Os sistemas de microfluidos tm propriedades distintas que resultam das suas
pequenas dimenses. Em primeiro lugar, o fluxo , normalmente, laminar e no

46
turbulento. Em segundo lugar, nos microcanais a difuso praticamente o nico
processo para misturar os fluidos. Para uma mistura eficaz de dois ou mais fluidos
necessrio manipul-los ou orient-los de tal modo que a rea de contacto entre eles
aumente. de igual modo necessrio que a distncia na qual a difuso deve actuar seja a
menor possvel para que o processo de mistura fique completo num tempo aceitvel.
Nos dispositivos macroscpicos a mistura , normalmente, realizada usando turbulncia
atravs de estruturas de fluxo tridimensional ou actuadores mecnicos. Contudo, quando
se pretende que o fabrico do sistema de microfluidos seja realizado utilizando tcnicas
de fotolitografia, actuadores mecnicos ou estruturas tridimensionais complexas devem
ser evitadas.
3.1.2 Misturadores
Os mecanismos para realizar a mistura de fluidos, denominados de misturadores,
desenvolvidos para microssistemas podem ser classificados em duas categorias: activos
ou passivos. Os primeiros conduzem o processo de mistura pela aplicao de uma fora
exterior em conjunto com a fora que est a transportar o fluido (por exemplo, uma
parede a mover-se, um campo elctrico ou um campo magntico). Os segundos no
utilizam essa fora adicional: a mistura causada por difuso devido ao longo tempo de
circulao do fluxo nos canais. Estes devem ter um comprimento suficiente para
assegurar a mistura uniforme no tempo desejado. Contudo, esta abordagem pode levar a
canais extremamente compridos medida que a velocidade de circulao do fluxo
aumenta, e quando as molculas a misturar so grandes e com baixos coeficientes de
difuso (< 10 m
2
/s) [5].
3.1.3 Cintica qumica
A reaco entre o reagente e a amostra a ser analisada envolve tipicamente a
ligao, em soluo aquosa, das partculas do reagente com as molculas da substncia
em anlise. Denominando o reagente por A, a substncia a analisar por C e o complexo
das partculas do reagente com as molculas da substncia em anlise por AC, a reaco
qumica define-se do seguinte modo,
AC C A
b
a
K
K

+ (3.1)

47
onde K
a
e K
d
so as constantes de associao e dissociao em l/(mol s). As taxas da
reaco so definidas por,
[ ][ ] [ ] AC K V C A K V
d a
= =
d a
, (3.2)
onde V
a
a taxa da reaco para a associao de A e C e V
d
a taxa da reaco para a
dissociao de AC. As letras entre parnteses rectos simbolizam a concentrao das
molculas em mol/l. Este processo pode ser esboado na Figura 3.1 [6].
Reagente
Cintica Movimento
da molcula
Difuso

Figura 3.1: Um esboo das actividades em torno da molcula em anlise. A molcula move-se
com uma certa velocidade na amostra enquanto que o reagente efectua a ligao
(governado pela cintica).
3.1.4 Caracterizao do fluxo
O manuseamento de fluidos em quantidades de microlitros resulta num nmero
de Reynolds pequeno indicando tipicamente um fluxo laminar. O nmero de Reynolds
definido como,

vL
Re = (3.3)
onde a densidade em Kg/m
3
, v a velocidade em m/s, a viscosidade em N s/m
2
e L a
distncia caracterstica interior do sistema em metros. Tipicamente, num canal o L
representa a profundidade do canal. O nmero de Reynolds, parmetro adimensional,
usado para caracterizar o movimento do fluxo, de forma a determinar se o fluido est na
zona de fluxo laminar, turbulento ou na zona de transio. Um nmero de Reynolds
inferior a 1500 indica que o fluxo laminar. Num sistema de microfluidos a varivel L
ser em geral inferior ou igual a 500 m. Assumindo a maior velocidade de fluxo como
sendo da ordem do tamanho de um die por segundo (die = 10 mm, ento v = 10 mm/s) e

48
considerando o fluido gua ( = 10
3
kg/m
3
e = 10
-3
N s/m
2
), pode dizer-se que um
limite superior do nmero de Reynolds ser de Re = 5. Como a turbulncia ocorre
quando Re > 1500 obter-se-o fluxos laminares nos microcanais. Assim, considerar a
turbulncia como um mecanismo para a mistura dos fluidos no ser aplicvel. Isto
exclui o uso de geometrias complexas e limita a utilidade de actuadores mecnicos.

3.1.5 Difuso
O tamanho e a forma dos microssistemas para fluidos limitam a utilidade da
difuso como o nico mecanismo para a mistura dos fluidos. Num dispositivo planar, o
comprimento no qual a difuso deve actuar ser dentro da dimenso do canal de
circulao do fluido. A razo para a difuso o elevado gradiente da concentrao das
molculas do fluido, que existe quando dois lquidos diferentes tm uma interface
comum. A difuso portanto a chave para a mistura de fluidos e modelizada pela lei
de Fick, a qual determina o fluxo de difuso de uma determinada molcula em funo
da variao da concentrao com a distncia x,

x
C
D J
= (3.4)
onde J o fluxo da molcula em partculas/(m
2
s), D o coeficiente de difuso em m
2
/s
e C a concentrao das molculas em partculas/m
3
. O tempo mdio para a difuso de
uma partcula numa determinada distncia pode ser dado por [7],

D
L
T
D
2
= (3.5)
onde L o comprimento relevante para a mistura. Esta equao prediz que utilizando
apenas a difuso para o processo de mistura, pode, em alguns casos, resultar em tempos
de mistura elevados. Como exemplo, para misturar o sal na gua usando um L = 1 mm
resulta num T
D
= 10
3
s (D do sal na gua = 103 m
2
/s).
3.2 Mtodo dos elementos finitos
As tcnicas de modelizao so muito importantes para se obter a geometria
apropriada dos canais. Os problemas de fluidos so frequentemente expressos atravs de
equaes diferenciais que na maior parte dos casos so extremamente difceis de
resolver analiticamente. Por vezes, no possvel descrever um sistema de fluidos

49
utilizando uma nica equao diferencial, e um sistema de equaes de derivadas
parciais pode ser muito complexo dependendo da complexidade da geometria do
sistema. Nestes casos usual recorrer diviso do sistema num nmero finito de
pequenas regies denominadas de elementos finitos.
3.2.1 Rede de elementos finitos
O mtodo dos elementos finitos (FEM) prev a diviso do sistema em elementos
finitos, transformando o meio contnuo em discreto, como se mostra na Figura 3.2. A
essa diviso d-se o nome de rede de elementos finitos. A malha (mesh) dessa rede
pode ser aumentada ou diminuda variando o tamanho dos elementos finitos. Os pontos
de interseco das linhas dessa rede so chamados de ns. Assim, em vez de existir uma
funo que satisfaa as condies de contorno para todo o elemento, no FEM as funes
so definidas no domnio de cada elemento finito [8].
Elemento
finito

Figura 3.2: Rede de elementos finitos.
Uma das fases mais importantes na modelizao por elementos finitos a
criao da malha, definindo a estrutura de toda a anlise. A quantidade de elementos
finitos deve ser suficiente para possibilitar a identificao da natureza dos fenmenos.
Na maior parte dos casos mesmo necessrio refinar a malha em zonas onde h
alterao do formato da geometria. Caso a malha seja demasiado grosseira, a rede
original de elementos finitos pode no conseguir capturar os efeitos significantes que
ocorrem ao longo dos vrios passos das iteraes.

50
3.2.2 Fundamentos do FEM
O integral sobre um domnio complexo (de volume V), pode ser substitudo por
um somatrio de integrais estendidos a sub domnios de geometria simples (de
volume V
i
). Esta tcnica ilustrada com o seguinte exemplo, que corresponde ao
integral de volume de uma funo f,

=
=
=
n i
i
V V
V f V f
1

i
d d (3.6)
onde

=
=
=
n i
i
V V
1
i
(3.7)
O somatrio do clculo de todos os integrais dos sub domnios V
i
(segundo
membro da equao (3.6)) corresponde ao integral estendido a todo o domnio. Cada
sub domnio V
i
corresponde a um elemento finito de geometria simples (e.g., segmento
de recta, tringulo, quadriltero, tetraedro, paraleleppedo). O somatrio indicado pela
equao (3.6) d origem operao designada de montagem ou juno. Contudo, o
mtodo dos elementos finitos s tem utilidade prtica se se dispuser de um computador
com uma razovel capacidade de processamento. Este requisito devido elevada
quantidade de clculos que necessrio realizar, nomeadamente na resoluo de
grandes sistemas de equaes lineares [9].
3.2.3 Uso de programas de elementos finitos
Com os programas comerciais de elementos finitos no necessrio o utilizador
estabelecer os sistemas de equaes para um determinado problema. suficiente
introduzir-se a geometria, as propriedades fsicas dos materiais e escolher o mtodo de
resoluo das equaes do sistema. Contudo, ainda necessrio entender as bases do
mtodo de elementos finitos para interpretar os resultados correctamente.
Os principais passos bsicos para o desenvolvimento correcto e para a anlise de
um problema de elementos finitos so: (1) a criao da malha; (2) definir o formato e
tipo de elementos; (3) definir as propriedades do elemento; (4) a juno das
propriedades de cada elemento (normalmente realizado automaticamente pelo
programa); (5) a aplicao das condies de fronteira; (6) a resoluo das equaes do
sistema; (7) efectuar a computao adicional necessria (baseado na soluo obtida).

51
3.3 Modelo computacional da dinmica do fluido
O principal objectivo do presente estudo o de desenvolver um misturador em
tecnologia planar para mistura e manipulao de fluidos. Para implementar um
misturador, deve ser proposta uma estrutura que tenha a habilidade de misturar dois
fluidos por difuso. Alguns formatos do canal de mistura podem encorajar a turbulncia
e assim acelerar o processo de mistura. Um exemplo forar o fluxo volta de uma
curva com um raio de curvatura pequeno, o que induz um fluxo secundrio rotacional
devido acelerao centrpeta (Figura 3.3). Aps a curva o fluxo torna-se novamente
laminar para pequenos valores do Re.
Fluxo secundrio
rotacional

Figura 3.3: Esquema da mistura de fluidos por acelerao centrpeta.
3.3.1 Geometria do misturador
Um modelo computacional da dinmica de fluidos foi estabelecido e utilizado
para estudar e prever a distribuio e a difuso do fluxo. A aplicao desse modelo foi a
quantificao do cido rico na urina. Nesta aplicao so utilizados dois fluidos: o
reagente especfico para a deteco do cido rico e a urina. Relembre-se que a medio
da concentrao de cido rico na urina realizada aps a ligao do reagente s
molculas de cido rico, pelo que necessrio a mistura destes dois fluidos.
A geometria bsica dos canais para a mistura e circulao dos fluidos
encontra-se na Figura 3.4. O formato dos canais rectangular, face aos redondos ou
cnicos, o mais apropriado para o processo de medio atravs de absoro ptica,
devido reflexo da luz. O reagente e a urina so introduzidos no canal em forma de U
atravs das entradas 1 e 2, respectivamente. Eles so injectados por intermdio de uma
seringa de forma a minimizar o aparecimento de bolhas de ar. Este fenmeno
desprezvel quando o misturador descartvel, mas pode acontecer quando este
necessita de ser reutilizado, pelo que o processo de suco do lquido de limpeza dos
canais deve ser bastante eficiente. O processo de difuso dos lquidos comea na juno

52
do U com o canal principal e continua ao longo de todo o canal at cmara de
deteco. Os canais tm 500 m de largura e 500 m de profundidade. O canal principal
tem 70 mm de comprimento e 6 curvas em U. A cmara de deteco tem 2 mm de lado.
A deteco colorimtrica efectuada quando a mistura se encontra na cmara de
deteco. Por baixo desta encontram-se os fotodetectores que medem a intensidade da
luz transmitida atravs da mistura. A rea da cmara de deteco dependente da rea
dos fotodetectores e vice-versa.
Entrada 2
Entrada 1
Sada
Cmara
de deteco
Canal principal

Figura 3.4: Geometria do misturador.
3.3.2 Simulao numrica
Para modelizar o misturador usando o FEM deve definir-se a malha, o tipo de
elementos que constri o modelo, as propriedades dos materiais, o regime do fluxo, as
condies de fronteira, as cargas e o tipo de soluo a resolver (parmetros da anlise).
A anlise numrica deste trabalho foi realizada utilizando o software Ansys

Flotran
TM
com a opo Flotran CFD (Dinmica Computacional de Fluidos), a qual
possibilita o projecto de dispositivos de microfluidos complexos atravs da modelizao
do fluxo dos fluidos [10]. Na Figura 3.5 apresenta-se a malha utilizada no projecto do
misturador. O misturador foi modelizado por um elemento fluido tridimensional
(Fluid142). Utilizou-se uma malha com elementos poliedros de 6 faces, sendo mais
fina nas junes do U com o canal principal, nas curvas e nas paredes do canal, de forma
a melhorar a preciso das simulaes. Com base nestes pressupostos o nmero total de
elementos foi de 33152, o que originou um bom compromisso entre os tempos de
computao e o rigor da soluo.

53
Entrada 1
Cmara
de deteco
Sada
Entrada 2

Figura 3.5: Sistema de microfluidos no qual se visualiza a rede de elementos finitos utilizada.
As equaes de continuidade e de Navier-Stokes, para a velocidade e a presso
(includas no software), foram utilizadas para modelizar o misturador,
) .( v
t

(3.8)
v P
t
v
2
d
d
+ = (3.9)
onde e so a viscosidade e a densidade do fluido, respectivamente. P a presso e v
o vector velocidade. Derivaes e detalhes das equaes podem ser consultadas em
[1, 11]. O vector velocidade foi subsequentemente utilizado para resolver as equaes
de transporte de espcies (por espcie entenda-se o reagente e a urina). Ambas as
espcies tm um peso molecular baixo e um coeficiente de difuso elevado. As
equaes (3.8) e (3.9) foram resolvidas usando um modelo CFD baseado em elementos
finitos. O modelo de regime do fluxo foi definido como laminar. As simulaes foram
implementadas no estado transitrio. Uma condio de velocidade constante foi
atribuda s condies de fronteira nas entradas. As condies de fronteira na sada do
canal foram estabelecidas para uma presso constante.
3.3.3 Propriedades dos fluidos
A avaliao do processo de mistura foi simulado utilizando o kit de diagnstico
da Sigma-Aldrich Diagnostics
(Infinity
TM
uric acid reagent) e padres de urina com

54
vrias concentraes de cido rico. O procedimento descrito no manual do reagente
para determinar a concentrao do cido rico na urina informa que a mistura do
reagente com a urina realizada apenas com uma ligeira inverso da cuvete que contm
essa mistura. Isto suficiente para misturar completamente os dois lquidos, devido ao
elevado coeficiente de difuso e baixo peso molecular das molculas envolvidas. Estas
duas caractersticas revelam que estes dois fluidos tm boas condies para a mistura
por difuso.
Da equao (3.5) determina-se que o tempo mdio para a difuso do cido rico
na urina de T
D
= 30 s, com L = 70 mm e D = 163 m
2
/s [12]. Este processo, embora
lento apesar de tudo adequado, tendo em ateno que o tempo de incubao para a
reaco se completar , aproximadamente, 5 minutos. Relembre-se que, normalmente,
as reaces colorimtricas possuem um tempo de incubao de mais de um minuto. As
propriedades dos dois fluidos que necessrio conhecer para correr as simulaes so: o
peso molecular, a densidade, a viscosidade, a condutividade trmica e o coeficiente de
difuso. Estes parmetros foram obtidos atravs das especificaes tcnicas que
acompanham os dois lquidos ou atravs de medies realizadas no Departamento de
Engenharia Mecnica da Universidade do Minho (UM). Os seus valores encontram-se
na Tabela 3.1.
Tabela 3.1: Propriedades do reagente e do padro de urina.
Propriedade (SI) Reagente Padro de urina com 80 mg/l de cido rico
Peso molecular (kg/kmol) 160 168
Densidade (kg/m
3
) 10
3
1.8910
3

Viscosidade (N s/m
2
) 0.910
-3
1.110
-3

Condutividade trmica
(W/m k)
0.7 0.7
Coeficiente de difuso (m
2
/s) ------ 163
3.4 Resultados da simulao
O processo de mistura foi simulado para dois valores diferentes da concentrao
de cido rico na urina: 80 mg/l e 1200 mg/l. Estes valores so, respectivamente,
inferiores e superiores ao valor mnimo e mximo anormais no ser humano.

55
3.4.1 Concentrao de 80 mg/l de cido rico na urina
A Figura 3.6 ilustra o processo de mistura para a concentrao de 80 mg/l e com
uma velocidade de fluxo de 0.43 l/s. Um volume de reagente de 20 l introduzido no
misturador atravs da entrada 1 e um volume de 0.4 l de urina atravs da entrada 2.
Estas quantidades asseguram a existncia de molculas suficientes para uma anlise
precisa (uma molcula de cido rico ocupa 3.510
-9
pl de soluo, para a concentrao
de 80 mg/l, ver seco 2.2.2).
0.90E-6 0.99E-6 0.94E-6 1.03E-6 1.08E-6 0.92E-6 1.01E-6 0.96E-6 1.06E-6 1.10E-6
Entrada 1
Sada
Entrada 2
5 curva
Cmara
de deteco

Figura 3.6: Simulao do fluxo do processo de mistura por difuso para um padro de urina
com 80 mg/l de cido rico. O grfico ilustra o perfil da viscosidade do modelo.
Os fluidos so injectados para o misturador atravs de uma seringa e flem
desde as entradas 1 e 2 at sada, guiados pela presso do lquido. Cruzam-se na
interseco em forma de U e a comeam o processo de mistura por difuso. Na
Figura 3.6 pode ver-se zonas onde a mistura est incompleta. Contudo, antes de atingir a
zona da cmara de deteco, mais precisamente aps a quinta curva, o processo de
mistura est completo e homogneo.
Devido baixa velocidade (0.43 l/s) o fluxo laminar. Contudo, um fluxo
secundrio e presumivelmente uma turbulncia local foi gerada nas zonas curvas do
misturador, conforme ilustrado pelo vector velocidade na Figura 3.7. A Figura 3.8
ilustra o perfil do fluxo do fluido no canal principal, na zona de entrada da cmara de

56
deteco (Figura 3.7). O traado resultante mostra que se estabeleceu um fluxo laminar.
A curva relativamente simtrica e parablica.
0 1.44 0.72 2.16 2.88 0.36 1.80 1.081 2.52 3.24
Entrada 1
Entrada 2
Sada
Cmara
de deteco
Perfil do fluxo

Figura 3.7: Simulao do perfil do vector da velocidade do fluxo.
V
y

(
m
m
/
s
)
Distncia (mm)
1.70
1.53
0.00
0.34
0.17
0.51
0.85
0.68
1.02
1.36
1.19
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.00

Figura 3.8: Perfil do vector da velocidade do fluxo na zona de entrada da cmara de deteco.

57
3.4.2 Concentrao de 1200 mg/l de cido rico na urina
A simulao do processo de mistura para a concentrao de 1200 mg/l
apresenta-se na Figura 3.9. O resultado da simulao muito similar ao observado na
Figura 3.6, na qual foi simulado o processo de mistura para a concentrao de 80 mg/l.
Este resultado o esperado uma vez que na medio das propriedades do padro de
urina com 1200 mg/l de cido rico observaram-se sensivelmente os mesmos valores
(ver Tabela 3.1), excepo do valor da densidade que passou de 1.8910
3
kg/m
3
para
1.9010
3
kg/m
3
. Um plano frontal da simulao do fluxo do processo de mistura para as
duas concentraes de cido rico referidas ilustrado pela Figura 3.10(a) e
Figura 3.10(b). Em ambos os casos, a velocidade do fluxo de 0.43 l/s. No caso da
concentrao de cido rico de 1200 mg/l (Figura 3.10(b)), a mistura completa dos dois
fluidos demora mais 90 milsimos de segundo relativamente ao processo de mistura
com uma concentrao de cido rico de 80 mg/l (Figura 3.10(a)). Conforme se observa
na zona da 5 curva na Figura 3.10, a diferena para uma concentrao de cido rico
elevada e para uma concentrao de cido rico baixa mnima. Na simulao de
concentraes intermdias o ponto no qual atingida a mistura completa encontrar-se-
entre os pontos das concentraes anteriormente simuladas e representadas na
Figura 3.10.
0.90E-6 0.99E-6 0.94E-6 1.03E-6 1.08E-6 0.92E-6 1.01E-6 0.96E-6 1.06E-6 1.10E-6
Entrada 1
Entrada 2
5 curva
Sada
Cmara
de deteco

com 1200 mg/l de cido rico. O grfico ilustra o perfil da viscosidade do modelo.

58

(a)
0.90E-6 0.99E-6 0.94E-6 1.03E-6 1.08E-6 0.92E-6 1.01E-6 0.96E-6 1.06E-6 1.10E-6
Entrada 1 Entrada 2
5 curva
Cmara
de deteco

(b)
0.90E-6 0.99E-6 0.94E-6 1.03E-6 1.08E-6 0.92E-6 1.01E-6 0.96E-6 1.06E-6 1.10E-6
Entrada 1 Entrada 2
5 curva
Cmara
de deteco

Figura 3.10: Vista frontal da simulao do fluxo do processo de mistura por difuso para um
padro de urina com (a) 80 mg/l de cido rico; (b) 1200 mg/l de cido rico.

59
Com este modelo pode concluir-se que para uma velocidade de fluxo inferior a
0.43 l/s, uma mistura homognea obtida aps ser percorrido cerca de 75% do
percurso do canal principal. A estrutura do modelo com canais com uma profundidade
de 500 m fornece uma larga rea de contacto entre os dois fluidos facilitando o
processo de difuso ao longo do canal principal.
3.4.3 Aumento da velocidade de fluxo
Aumentando a velocidade de fluxo de 0.43 l/s para 1.5 l/s (injectado por
intermdio de uma seringa), resulta num processo de mistura incompleto at ao fim do
canal principal (ver Figura 3.11). Nesta simulao foi utilizado o padro de urina com
uma concentrao de 80 mg/l de cido rico. O tempo de circulao dos fluidos
claramente insuficiente para uma mistura eficaz e completa por difuso. Esta velocidade
de fluxo resulta num tempo de circulao de 11.7 s, menor que o tempo mnimo
necessrio de 30 s (ver seco 3.3.3).
0.90E-6 0.99E-6 0.94E-6 1.03E-6 1.08E-6 0.92E-6 1.01E-6 0.96E-6 1.06E-6 1.10E-6
Entrada 1
Entrada 2
5 curva
Sada
Cmara
de deteco

Figura 3.11: Processo de mistura incompleto devido ao aumento da velocidade do fluxo para
1.5 l/s. O padro de urina tem 80 mg/l de cido rico.

60
3.4.4 Diminuio da largura dos canais
As simulaes efectuadas revelam que a geometria do misturador adequada
para o processo de mistura pretendido. Contudo, pode dizer-se que uma largura e
profundidade dos canais de 500 m so valores elevados quando se pensa no fabrico
atravs de tcnicas de micromaquinagem. De facto, conforme se verificar nos captulos
seguintes, a profundidade de 500 m necessria devido ao processo de medio,
colorimtrico atravs de absoro ptica, exigir um caminho ptico de 500 m.
Com o objectivo de diminuir a largura dos canais, foi realizada uma simulao
com canais de largura de 100 m, mantendo a restante geometria do modelo e as
condies do ensaio da Figura 3.6. Neste caso, o volume de reagente de 5 l para
0.1 l de padro de urina. A Figura 3.12 apresenta o resultado da simulao para uma
concentrao de 1200 mg/l de cido rico na urina. Observa-se que o ponto no qual a
mistura dos dois fluidos est completa alcanado com uma antecedncia de cerca de
5 mm relativamente ao mesmo ponto para a estrutura da Figura 3.6. Esta situao
deve-se menor velocidade de fluxo obtida (0.09 l/s). Conclui-se, assim, que a
geometria proposta para o misturador adequada.
0.90E-6 0.99E-6 0.94E-6 1.03E-6 1.08E-6 0.92E-6 1.01E-6 0.96E-6 1.06E-6 1.10E-6
Entrada 1
Entrada 2
5 curva
Sada
Cmara
de deteco

com 1200 mg/l de cido rico e com uma largura dos canais de 100 m. O grfico
ilustra o perfil da viscosidade do modelo.

61
3.5 Concluso
Com o objectivo de misturar as biomolculas de cido rico presentes numa
amostra de urina com o reagente que possibilita a deteco colorimtrica do cido rico,
desenvolveu-se um modelo dinmico tridimensional de fluidos para simular esse
processo de mistura. As simulaes demonstraram que se atingiu uma mistura completa
e homognea, realizada por difuso, com baixas velocidades de fluxo (inferior a
0.43 l/s), fornecendo um tempo de circulao do fluxo nos canais de pelo menos 30 s.
Esta abordagem e modelo geomtrico permitem o fabrico do misturador utilizando
apenas tcnicas de fotolitografia, como as usadas no fabrico de dispositivos
semicondutores.
Bibliografia
[1] WHITE, F. M. - Fluid mechanics. 3 ed. McGraw-Hill, New York, 1994.
[2] KARNIADAKIS, G.; BESKOK, A. - Microflows: fundamentals and simulation.
Springer, New York, USA, 2002.
[3] KOCH, M.; EVANS, A.; BRUNNSCHWEILER, A. - Microfluidic technology
and applications. Research studies press Ltd., England, 2000.
[4] GRAVESEN, P. [et al.] - Microfluidics: a review. Journal of Micromechanics
and Microengineering. Vol. 3 (1993), p. 168-182.
[5] CHIEM, N. H.; HARRISON, D. J. - Microchip systems for immunoassay: an
integrated immunoreactor with electrophoretic separation for serum theiphylline
determination. Clinical Chemistry, Vol. 44, n 3 (1998), p. 591-598.
[6] OSTERGAARD, S. - Micro systems for bio/chemical analysis: automation by
convection-free particle manipulation. Mikroelektronik Centret, Technical
University of Denmark, 1999. Tese de Doutoramento.
[7] KOVACS, G. T. A. - Micromachined transducers sourcebook. McGraw-Hill,
New York, USA, 1998, p. 807.
[8] ASSAN, A. E. - Mtodo dos elementos finitos: primeiros passos. Editora da
UNICAMP, Campinas, SP, Brasil, 1999.
[9] AZEVEDO, A. F. M. - Mtodo dos elementos finitos. FEUP, Portugal, 2003.
[10] http://www.ansys.com

62
[11] BIRD, R. B.; STEWART, W. E.; LIGHTFOOT, E. N. - Transport Phenomena.
John Wiley & Sons, New York, USA, 1960.
[12] Biochemistry and Organic Reagents: for bioscience investigation. Sigma-Aldrich
Diagnostics
, 2002.

63
4

Filtros pticos
Neste captulo aborda-se como as estruturas de filmes finos podem ser
analisadas, compreendidas e aplicadas no projecto de filtros pticos baseados em filmes
finos.
As cinco primeiras seces descrevem, de uma forma condensada, a teoria
bsica necessria para o clculo do comportamento de filtros pticos, projectados com
uma estrutura de multicamadas de filmes finos. Uma anlise rigorosa pode ser
consultada em [1-7]. As restantes seces apresentam o projecto, a simulao e o
desempenho de filtros pticos passa-banda baseados em filmes finos. Com o objectivo
do mesmo Microlab analisar vrias biomolculas na urina, pretende-se construir no
apenas um filtro ptico, mas uma matriz de filtros pticos. A estrutura de cada filtro
deve ser projectada para maximizar a selectividade e a intensidade do coeficiente de
transmisso de cada filtro ptico, minimizando o nmero de camadas de filmes finos, de
deposies e de mscaras a utilizar no posterior fabrico.
4.1 Filtros pticos baseados em filmes finos
O assunto dos filtros pticos com filmes finos comeou como uma curiosidade,
quando se reparou que algumas lentes de vidro sujas transmitiam ligeiramente mais luz
que as limpas. Actualmente, um assunto com vrias aplicaes no campo da ptica.
Geralmente, define-se um filme fino como sendo uma camada com uma
espessura at 1 m. Um filme fino realizado atravs da deposio de uma camada do
material pretendido num substrato adequado, tal como o vidro ou o quartzo e pode ser

64
representado esquematicamente pela Figura 4.1. O ndice de refraco, n, definido
como a razo entre as velocidades da onda electromagntica no vazio e no meio em
questo. Na maior parte dos casos, os filmes finos so completamente transparentes,
pelo que nenhuma energia absorvida. Nestes casos, a caracterstica do filtro em
reflexo o complemento da caracterstica em transmisso. Assim, da luz incidente no
filme, parte reflectida e a restante transmitida para o substrato.
Ar
n
0
n
1
n
2
Filme fino
Luz incidente
Luz reflectida
(combinao
dos 2 feixes)
Substrato
Luz transmitida

Figura 4.1: Esquema de um filme fino.
Para se compreender o desempenho de um dispositivo ptico de filmes finos de
uma maneira qualitativa necessrio aceitarem-se vrias afirmaes. A primeira que a
amplitude da reflexo da luz em qualquer fronteira entre dois meios dada por,

1
1
(4.1)
onde a razo dos ndices de refraco. A reflectncia (razo da irradiao) o
quadrado desta quantidade. A segunda que existe um desvio de fase de 180 quando a
reflectncia produzida por um meio que tem um ndice de refraco baixo em relao
ao meio adjacente. Em oposio, quando o meio tem um ndice de refraco elevado em
relao ao meio adjacente, o desvio de fase de 0. A terceira que, se a luz dividida
em duas componentes pela reflexo das superfcies no topo e no fundo de um filme fino,
ento os feixes sero combinados de tal forma que a amplitude resultante ser a
diferena ou a soma dessas duas componentes, se o desvio de fase relativo de 180 ou
de 0, respectivamente. No primeiro caso diz-se que os feixes interferem
destrutivamente e no segundo caso construtivamente.
Uma estrutura de multicamadas de filmes finos pode ser realizada com uma srie
de camadas depositadas num substrato (representada na Figura 4.2). Se as camadas
tiverem um ndice de refraco elevado e baixo, alternadamente, as vrias componentes
da luz incidente produzidas pela reflexo das sucessivas superfcies so combinadas
Filtros pticos

65
construtivamente, uma vez que aparecem todas em fase na superfcie da estrutura. Isto
implica que a reflexo efectiva desta estrutura pode ser projectada para ser elevada
aumentando apenas o nmero de camadas. Esta a forma bsica dos revestimentos de
reflectncia elevada. Quando tal revestimento construdo descobre-se que a
reflectncia se mantm elevada apenas dentro de uma gama limitada de comprimentos
de onda. Fora desta zona a reflectncia muda abruptamente para um valor baixo.
Ar n
0
n
1
n
2
n
3
n
4
n
5
Luz incidente
Luz reflectida
(combinao
dos 6 feixes)
Luz transmitida
Substrato
n elevado
n elevado
n elevado
n baixo
n baixo
Multicamada
de filmes finos

Figura 4.2: Estrutura de multicamadas de filmes finos.
O projecto de uma estrutura de multicamadas de filmes finos com um
determinado desempenho requer no apenas o clculo analtico mas tambm a
experincia, o uso de blocos conhecidos, as simulaes computacionais e os
refinamentos das solues simuladas.
Exemplos de dispositivos com filmes finos usados no dia a dia so as lentes das
mquinas fotogrficas. Algumas delas so revestidas com um determinado filme de
forma a reduzir a nebulosidade provocada pela luz difundida internamente (provocada
pela interface vidro/ar). Alm disso, aumentam ainda o contraste da imagem [2].
4.2 Fundamentos da propagao da onda
Nesta seco, em vez de se fazer uma extensa descrio da teoria ptica de
filmes finos, faz-se um resumo dos principais resultados, vlidos para meios lineares.
Este resumo baseia-se na bibliografia descrita em [1, 5, 8, 9].

66
4.2.1 Amplitude da onda
A luz uma onda electromagntica, pelo que, deve comear-se com as equaes
de Maxwell de forma a estudar-se a sua propagao nos filmes finos. Uma onda de luz
pode ser representada por expresses da forma,

) i(
0
e
r K

=
n t
(4.2)

) i(
0
e
r K

=
n t
(4.3)
onde E e H so o campo elctrico e magntico, respectivamente e E
0
e H
0
as suas
amplitudes, a frequncia angular, n o ndice de refraco, K o vector de
propagao cujo mdulo define-se como nmero de propagao, K (K = 2/) e r o
vector posio. Se o meio de propagao for absorvente, o n deve ser substitudo por
n-ik, onde k o coeficiente de extino do meio de propagao. A frequncia, f, e o
comprimento da onda, , so dados por,

2
= f (4.4)

K
2
= (4.5)
e f = /K = c, onde c a velocidade da onda. Esta ltima est relacionada com as
propriedades electromagnticas do meio no qual a onda se propaga, atravs da
relao [4],

1
= c (4.6)
onde a permitividade elctrica do meio e a permeabilidade magntica. Esta
expresso pode tambm ser descrita na seguinte forma,

0 r 0 r
1

= c (4.7)
onde
r
e
r
so os factores da permitividade e permeabilidade do meio e
0
e
0
so a
permitividade elctrica e permeabilidade magntica do vazio, respectivamente. O
deslocamento elctrico, D, e a densidade de fluxo magntico, B, so definidos [7],
E D = (4.8)
Filtros pticos

67
H B = (4.9)
Pode ento escrever-se,

r r
0

c
c = (4.10)
onde c
0
a velocidade da onda electromagntica no vazio, c
0
= 2.998 10
8
m/s.
Nos materiais dielctricos
r
1 e
r
> 1. A equao anterior pode ser escrita,

r
0
c
c (4.11)
e note-se que c < c
0
. A razo c
0
/c , por definio, o ndice de refraco n de um meio,
pelo que,

r
n (4.12)
r
a medida da facilidade com que o meio pode ser polarizado electricamente pela
aco de um campo elctrico externo. Esta polarizao depende da mobilidade dos
electres dentro da molcula perante a resistncia das foras moleculares. Ento
r

depender da frequncia do campo elctrico aplicado uma vez que ele depender da
rapidez de resposta dessas foras. Ento a equao anterior ser verdadeira apenas se n e
r
se referirem mesma frequncia da onda (note-se que n dependente da frequncia).
Considere-se agora o contedo energtico da onda. Para um campo elctrico, a
energia por unidade de volume dada por [10],

2
E
2
1
E u = (4.13)
e para um campo magntico,

2
H
2
1
H u = (4.14)
Considere-se um meio isotrpico
2
. Das equaes de Maxwell, para uma
determinada onda, a relao entre E e H fixa [3],

2
Um meio isotrpico um meio com propriedades fsicas uniformes, no qual o ndice de refraco no
varia com a direco de propagao no material.

68
E H n
= (4.15)
Tambm E, H e o vector de propagao K, so todos mutuamente perpendiculares. O
sentido da propagao dado pela regra da mo direita. O fluxo de energia na direco
da propagao da onda dado pelo vector de Poynting,
P = (4.16)
Uma vez que se est a trabalhar com a razo de campos, omitiu-se a constante /
da equao (4.15). Fazendo a mdia num perodo da onda e desprezando o factor 1/2
das equaes (4.13 e 4.14), obtm-se,
E H n = (4.17)

2
E H E P n = = (4.18)
Estas so as equaes fundamentais sobre as quais se ir trabalhar.
4.2.2 Polarizao
Considere-se uma onda plana monocromtica incidente na superfcie plana de
separao entre dois meios isotrpicos. Tanto o campo elctrico como o campo
magntico podem decompor-se em duas componentes ortogonais entre si: uma paralela
ao plano de incidncia (polarizao p) e outra perpendicular (polarizao s) [2]. Estas
duas polarizaes esto representadas na Figura 4.3 para o vector E.
y
E
s
E
p
E
p
E
s
E
z
x

Figura 4.3: Definio das polarizaes p e s. A luz incide no plano xz com um ngulo
relativamente ao eixo dos zz. Os vrios vectores E esto representados.
Filtros pticos

69
Em geral, uma luz polarizada linearmente ter o seu vector E com um certo
ngulo relativamente ao plano de incidncia (plano xz). Neste caso, pode-se decompor
o vector E em duas componentes:
cos ' o polariza E E p
p
= (4.19)
sen ' o polariza E E s
s
= (4.20)
Como se ver mais adiante nesta seco, conveniente trabalhar em termos das
componentes destes vectores paralelos ao plano de incidncia. Assim, definem-se as
novas quantidade E
p
e E
s
:
cos cos cos ' E E E
p p
= = (4.21)
sen ' E E E
s s
= = (4.22)
Similarmente, define-se H
p
e H
s
:
cos ' H H H
p p
= = (4.23)
cos sen cos ' H H H
s s
= = (4.24)
Para uma onda que se propaga para a esquerda, o sinal de H o inverso. O ndice
de refraco normal n igual a H/E (da equao (4.17)). Da mesma forma, define-se o
ndice de refraco generalizado para as duas polarizaes, u
p
e u
s
, tal que:

cos cos
n
E
H
E
H
u
p
p
p
= = = (4.25)

cos
cos
n
E
H
E
H
u
p
s
s
= = = (4.26)
Das equaes (4.17) e (4.18), o fluxo de energia total ser,

2
p p p
E u P = (4.27)

2
s s s
E u P = (4.28)

70
Note-se que todos os estados de polarizao podem ser decompostos nas
componentes p e s, com uma possvel deslocao de fase entre eles. Assim, a anlise
que se seguir pode ser usada para todos os estados de polarizao. Em geral as
propriedades de uma estrutura multicamada de filmes finos so diferentes para as duas
polarizaes, excepto quando a luz incidente normal superfcie. Neste caso as
polarizaes p e s so equivalentes [1].
4.2.3 Condies de fronteira
As condies de fronteira em cada interface possibilitam a ligao entre os
campos electromagnticos de um lado da interface e os do outro lado. Estas condies
advm da teoria electromagntica. Referem que as componentes de E e H paralelas
interface devem ser as mesmas em ambos os lados da interface. por este motivo que
se lida com E e H e no com D ou B, pois as condies de fronteira seriam bem mais
complexas.
4.3 Propriedades das estruturas com filmes finos
4.3.1 Notao
Uma estrutura multicamada de filmes finos, esquematicamente ilustrada na
Figura 4.4, composta por q interfaces, isto , 1 q filmes. No filme j
th
observa-se a
propagao de uma onda para a direita (
+
j
E ) e de uma onda para a esquerda (

j
E ). Estas
esto inclinadas com um ngulo
j
em relao normal da interface. O filme tem um
ndice de refraco n
j
e uma espessura d
j
. Classificou-se o substrato, ou meio de sada,
( direita) como sendo o filme 0. Os filmes finos foram classificados de 1 a 1 q . A
varivel q refere-se ao meio incidente ( esquerda) que, normalmente, o ar. O feixe
incidente
+
q
E , o reflectido
q
E e o transmitido
+
0
E . Neste caso 0
0
=
E , uma vez
que no existe feixe incidente na estrutura multicamada vindo do substrato. Pretende-se
estudar as relaes entre essas trs quantidades referidas,
+
q
E ,
q
E e
+
0
E .
Filtros pticos

71
1 q
E
+
1 q
E
1 q
n
q
E
q
n
+
q
E
q
E
1 j+
n
-
1 j+
E
+
+1 j
E
1 j+
E
-
j
E
-
1 - j
E
-
1
E
+
0
E
1
E
j
E
+
j
E
j
n
+
1 - j
E
1 - j
n
+
1
E
1
n
[ ]
1 j

+
[ ]
1 q

[ ]
q
[ ]
j
[ ]
1 - j
[ ]
1

1 q
E
+
1 q
E
1 q
n
q
E
q
n
+
q
E
q
E
1 j+
n
-
1 j+
E
+
+1 j
E
1 j+
E
-
j
E
-
1 - j
E
-
1
E
+
0
E
1
E
j
E
+
j
E
j
n
+
1 - j
E
1 - j
n
+
1
E
1
n
1 j

+
1 q

q

j

1 - j

1

Figura 4.4: Definies dos parmetros para uma estrutura multicamada de filmes finos. Por
simplicidade, a direco de propagao de cada onda est simplesmente indicada
como para a esquerda ou como para a direita e nem os ngulos
j
nem a espessura
dos filmes esto representados.
4.3.2 Caminho ptico
O caminho ptico no filme j dado pela distncia x entre as frentes de onda,
marcadas no diagrama esquemtico da Figura 4.5, vezes o ndice de refraco. As
frentes de onda so linhas de igual fase. Ento, o caminho ptico pode ser definido,

j j j j
cos d n x n LP = = (4.29)
A espessura de fase do filme ,

j j j j
cos d Kn g = (4.30)
Relembre-se que / 2 = K . Um filme de quarto de onda (/4), por exemplo, tem
2 /
j
= g (no caso da luz ter incidncia normal).
Os ngulos
j
so determinados pela lei de Snell [2],

0 0 j j q q
sen sen sen n n n = = (4.31)
onde
q
o ngulo de incidncia e
0
o ngulo de reflexo da luz da estrutura
multicamada.

72
j
d
j
[ ] j [ ] 1 + j [ ] 1 j
j
d
j
[ ] j [ ] 1 + j [ ] 1 j
j
d
j
j 1 j 1 j
x
j
d
Frentes
de onda
j
j 1 j 1 j

Figura 4.5: Distncia entre as frentes de onda (x), usada no clculo do caminho ptico.
4.3.3 Equaes na interface entre dois filmes
Adopta-se a conveno de que a fase da onda do filme j
th
zero na interface com
o filme (j-1)
th
, isto no lado direito do filme (Figura 4.4). Ento, na interface (j+1)/j
tem-se,
esquerda:
+
+1 j
E ,
+1 j
E
direita:
j i
j
e
g
E
+
,
j i
j
e
g
E

onde os vectores de fase,
j
i
e
g
e
j
i
e
g
, representam o desvio de fase sofrido pela onda ao
longo do filme j [4].
Usando as condies de fronteira, pode escrever-se,

j j i
j
i
j 1 j 1 j
e e
g g
E E E E
+
+
+
+
+ = + (4.32)
na interface (j+1)/j, com uma equao similar para H.
Agora, conveniente definir,

+
+ =
j j j
E E E (4.33)

+
+ =
j j j
H H H (4.34)
onde E
j
e H
j
so os campos totais na interface j/(j-1). Usando

=
j j j
E u H , obtm-se,
Filtros pticos

73

) / (
2
1
) / (
2
1
j j j j
j j j j
u H E E
u H E E
=
+ =
+
(4.35)
A equao (4.32) torna-se,

j j
j
j j 1 j
sen
i
cos H g
u
E g E + =
+
(4.36)
e similarmente para H
j+1
,

j j j j j 1 j
cos sen i H g E g u H + =
+
(4.37)
Estas duas ltimas equaes podem ser escritas na forma matricial,

|
|
.
|
\
|
|
|
|
.
|
\
|
=
|
|
.
|
\
|
+
+
j
j
j j j
j
j
j
1 j
1 j
cos sen i
sen
i
cos
H
E
g g u
g
u
g
H
E
(4.38)
Estas equaes mostram que em geral E
j
e H
j
so complexos.
A matriz 2 2, denominada de M
j
, contm todos os detalhes para o filme j
th
e
relaciona os valores de E e H de um lado do filme com os do outro lado. Note-se que
pode, igualmente, escrever-se,

|
|
.
|
\
|
=
|
|
.
|
\
|
=
|
|
.
|
\
|
+
+
+
+
+
+
j
j
j 1 j
1 j
1 j
1 j
2 j
2 j
H
E
M M
H
E
M
H
E
(4.39)
deste modo, pode relacionar-se os valores de E e H no substrato com os do meio
incidente, onde g
0
= 0, e consequentemente M
0
a matriz identidade:

|
|
.
|
\
|
=
|
|
.
|
\
|

0
0
1 2 2 q 1 q
q
q
...
H
E
M M M M
H
E
(4.40)
4.3.4 Coeficientes de reflexo e transmisso
A relao de E
q
, H
q
e E
0
, H
0
com as ondas incidente, reflectida e transmitida
pode ser escrita na forma matricial (usando a equao (4.35)),

74

|
|
.
|
\
|
|
|
.
|
\
|
=
|
|
.
|
\
|
+
q
q
q
q
q
q
/ 1 1
/ 1 1
2
1
H
E
u
u
E
E
(4.41)
e

+
|
|
.
|
\
|
=
|
|
.
|
\
|
0
0
0
0
1
E
u H
E
(4.42)
com 0
0
=
E . Combinando as equaes (4.40), (4.41) e (4.42),

+
+
|
|
.
|
\
|
|
|
.
|
\
|
=
|
|
.
|
\
|
0
0
1 1 q
q
q
q
q
1
...
/ 1 1
/ 1 1
2
1
E
u
M M
u
u
E
E
(4.43)
Desta equao pode obter-se as expresses para a amplitude dos coeficientes de reflexo
e transmisso,

+
=
q q
/ E E r (4.44)

+ +
=
q 0
/ E E t (4.45)
e a intensidade dos coeficientes de reflexo e transmisso, denominada de reflectncia e
transmitncia,

2
q q
2
/
+
= = E E r R (4.46)

2
q 0
q
0
/
+ +
= E E
u
u
T (4.47)
til aqui definir-se a admitncia ptica Y. igual razo entre H
q
e E
q
, e
portanto um ndice de refraco efectivo para toda a estrutura do filme fino. Assim, Y ,
em geral, um nmero complexo [5],

B
C
Y = (4.48)
onde,

|
|
.
|
\
|
=
|
|
.
|
\
|
0
1 1 q
1
...
u
M M
C
B
(4.49)
Filtros pticos

75
Substituindo esta equao nas equaes (4.43), (4.46) e (4.47):

2
q
q
Y u
Y u
R
+
= (4.50)

2
q
q
) Re( ) Re( 4
Y u
Y u
T
+
= (4.51)
Estas equaes sero usadas para estudar as propriedades de uma determinada estrutura
de filmes finos. Note-se que as equaes (4.29) a (4.50) aplicam-se igualmente
polarizao s e p com a expresso apropriada para u dada pelas equaes (4.25) e (4.26).
A nica excepo no caso em que existe absoro pelos filmes (ndice de refraco
complexo). Nestes casos 1 + R T e a expresso para T definida pela equao (4.51)
no pode ser usada. Contudo, pode ser deduzia de (4.43) e (4.47). Para uma incidncia
normal u
s
, u
p
e n so iguais, equaes (4.25) e (4.26).
4.3.5 Coeficiente de absoro
O fenmeno da absoro traduz-se quando a luz incidente num filme
convertida para outra forma de energia, normalmente calor, dentro do prprio filme. A
absorvncia est ligada a R e a T atravs de,
A T R + + = 1 (4.52)
Normalmente, o meio incidente no absorvente, ou pelo menos, no o
suficiente a tal ponto que, se for considerado sem absoro no ser uma perda grave da
generalidade do problema. Assim, considere-se que o meio incidente q na Figura 4.4
transparente, pelo que u
q
apenas tem parte real. Combinando a equao (4.48) e (4.50)
pode-se reescrever a reflectncia de uma estrutura multicamada de filmes finos:

|
|
.
|
\
|
+
|
|
.
|
\
|
+
=
C B u
C B u
C B u
C B u
R
q
q
q
q
(4.53)
No caso em que existe absoro pelos filmes, a transmitncia dada por [1],

+ +
=
=
) )( (
) Re( 4
) Re(
) Re( ) 1 (
q q
0 q 0
C B u C B u
u u
BC
u R
T (4.54)

76
Relembre-se que o ndice 0 representa o meio substrato/sada. Da equao (4.52), a
absorvncia da estrutura multicamada ser,

(
) Re(
) Re(
1 ) 1 (
0
BC
u
R A (4.55)
onde,

+ +
+
=
) )( (
) ( 2
1
q q
q
C B u C B u
C B BC u
R (4.56)
4.4 Aplicao do mtodo a uma interface
Pode parecer estranho derivar uma teoria para uma situao complexa e aplic-la
agora a uma situao simples. Contudo, o melhor exemplo para ilustrar como o
mtodo pode ser aplicado. Seguidamente tentar-se- saber quanta luz reflectida da
superfcie de um meio de ndice de refraco n
0
. Neste caso no existe filme fino, mas a
teoria da seco 4.3 pode ser aplicada fazendo q = 1. Assim, Y = u
0
e em consequncia,

( )
( )
0 q
0 q
u u
u u
r
+
= (4.57)

( )
0 q
q
2
u u
u
t
+
= (4.58)
nas quais se assume que u
0
e u
q
so reais. Estas equaes so conhecidas como as
equaes de Fresnel. Podem ser escritas em termos dos campos elctricos totais
q
' E e
0
' E . Para isso, usam-se as equaes (4.21) e (4.22) e substitui-se o u das equaes
anteriores pelas equaes (4.25) e (4.26), obtendo-se,
polarizao s:

) sen(
) sen(
cos cos
cos cos
'
'
'
q 0
q 0
0 0 q q
0 0 q q q

+
=
+
= =
+
n n
n n
E
E
r
q
(4.59)

) sen(
cos sen 2
cos cos
cos 2
'
'
'
q 0
q 0
0 0 q q
q q
q
0

+
=
+
= =
+
+
n n
n
E
E
t (4.60)
Filtros pticos

77
polarizao p:

) tan(
) tan(
cos cos
cos cos
'
'
'
q 0
q 0
q 0 0 q
q 0 0 q
q
q

+
=
+
= =
+
n n
n n
E
E
r (4.61)

) cos( ) sen(
cos sen 2
cos cos
cos 2
'
'
'
0 q 0 q
q 0
q 0 0 q
q q
q
0

+
=
+
= =
+
+
n n
n
E
E
t (4.62)
No caso da luz ter uma incidncia normal obtm-se para ambas as polarizaes,

( )
( )
0 q
0 q
'
n n
n n
r r
+
= = (4.63)

( )
0 q
q
2
'
n n
n
t t
+
= = (4.64)
Na Figura 4.6 representa-se a reflectncia do vidro (n = 1.52) em funo do
ngulo da luz incidente. Note-se que para a polarizao p, a reflectncia anula-se (ver
equao (4.61)) quando,
2
q 0
= + (4.65)
O valor de
q
chamado de ngulo de Brewster e dado por [1],
n
B
1
tan
= (4.66)
Para o vidro o ngulo de Brewster aproximadamente 56. incidncia normal, tanto a
polarizao p como a s tm uma reflexo de 4%.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
ngulo (graus)
R
e
f
l
e
c
t
n
c
i
a

(
%
)
Polarizao
Polarizao
s
p
B

Figura 4.6: Reflectncia de uma superfcie de vidro em funo do ngulo incidente, para a
polarizao s e p.

78
4.5 Aplicao do mtodo a um nico filme num substrato
4.5.1 Filme dielctrico
Nesta seco investigar-se- as propriedades de um filme fino dielctrico
depositado num substrato. A admitncia ptica para um nico filme depositado sobre
um substrato deduzida das equaes (4.48) e (4.49),

|
|
|
.
|
\
|
+
+
=
|
|
.
|
\
|
|
|
|
.
|
\
|
=
|
|
.
|
\
|
=
g u g u
g
u
u
g
u
g g u
g
u
g
C
B
B
C
Y
cos sen i
sen
i
cos
1
cos sen i
sen
i
cos
onde
0 1
1
0
0
1
1
(4.67)
ento,

g g
u
u
g u g u
Y
cos sen i
sen i cos
1
0
1 0
+ |
.
|
\
|
+
= (4.68)
A Figura 4.7 mostra um grfico da reflectncia R, calculada das equaes (4.50)
e (4.68), em funo de g (equao (4.30)). As curvas foram calculadas para um ngulo
de incidncia normal, = 0.
0
5
10
15
20
25
30
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50
Espessura da camada (x /4 unidades)
R
e
f
l
e
c
t
n
c
i
a

(
%
)
= 2.30
= 1.70
= 1.52
= 1.35
= 1.22
= 1.10
= 1.00
n
n
n
n
n
n
n

Figura 4.7: Reflectncia de filmes dielctricos com diferentes ndices de refraco em funo
da espessura do seu caminho ptico. Substrato de vidro com n
0
= 1.5. Meio
incidente ar com n
q
= 1.0. ngulo de incidncia
q
= 0. x um inteiro. Se
q
= 550 nm, ento a regio visvel do espectro electromagntico estende-se de
q
/ = 0.78 a 1.38.
Filtros pticos

79
Quando 2 / = g , 0 cos = g e 1 sen = g . A matriz M dada por,

|
|
|
.
|
\
|
=
0 i
i
0
1
1
u
u
M
e

0
2
1
u
u
Y = (4.69)
Isto significa que o ndice de refraco efectivo foi alterado de u
0
para
0
2
1
/ u u ,
quando o filme aplicado. Assim, ao aplicar-se o filme, a reflectncia diminui se
u
q
< u
1
< u
0
(usado para fazer revestimentos sem reflexo) e aumenta se u
q
< u
0
< u
1

(usada para fazer revestimentos de elevada reflexo). A estrutura comporta-se como se
tivesse um substrato de ndice de refraco
0
2
1
/ u u para esse comprimento de onda
(/4). Deste modo possvel prever o comportamento de uma estrutura de filmes de
materiais diferentes, em que cada filme tem uma espessura do caminho ptico de /4. A
essa estrutura denomina-se de pilha de quarto de onda. utilizada como um bloco
bsico para a construo de muitos tipos de filtros de filmes finos (por exemplo: filtro
passa-banda larga, filtro passa-banda estreita, filtro rejeita-banda) [5].
Para = g , 1 cos = g e 0 sen = g . A matriz M pode ser escrita,

|
|
.
|
\
|
=
1 0
0 1
M
e

0
u Y = (4.70)
Neste caso, o ndice de refraco efectivo o mesmo que o do substrato (sem camada) e
a estrutura comporta-se como se no substrato no estivesse depositado nenhum filme,
para esse comprimento de onda (/2).
Da equao (4.30) pode definir-se nd LP = , incidncia normal, como sendo a
espessura do caminho ptico, onde d a espessura do filme. Da anlise realizada,
conclui-se que, quando se usa um filme cuja espessura do caminho ptico tem valores
tais como
q
/4, 3
q
/4, 5
q
/4, ., x
q
/4, onde x um inteiro mpar, a reflectncia da
estrutura tem o seu pico mximo ou mnimo, consoante o ndice de refraco do filme

80
maior ou menor que o ndice de refraco do substrato, respectivamente. Para um filme
com espessuras do caminho ptico de
q
/2, 2
q
/2, 3
q
/2, , x
q
/2, onde x um inteiro,
no existe variao na reflectncia da estrutura em relao ao valor da reflectncia do
substrato sem filme.
importante notar que as camadas com espessuras de caminho ptico /4 e /2,
tero propriedades diferentes medida que o comprimento de onda varia. Isto ocorre
porque g depende de , segundo a equao (4.30). Note-se ainda que um filme com uma
espessura de caminho ptico de /4 incidncia normal, no ser mais um filme de /4
se o ngulo de incidncia for diferente (equao (4.30)).
4.5.2 Filme metlico
A principal caracterstica dos meios condutores a presena de cargas elctricas
livres (no sentido em que no esto ligadas e podem circular no interior do metal). Nos
metais estas cargas so electres, e o seu movimento pode dar origem a correntes
elctricas. Quando se aplica um campo E exterior, a corrente que flui atravs da rea
unitria, relaciona-se com a condutividade do meio (um condutor ideal teria uma
condutividade infinita). A absoro da energia radiante por um material portanto
funo da sua condutividade [2].
Uma vez que existe uma elevada taxa de absoro nos filmes metlicos,
utilizam-se normalmente filmes metlicos muito finos, muito menores que a espessura
de um comprimento de onda. A reflectncia de um filme muito fino pode ser calculada
de (4.63) para a incidncia normal, considerando que n
0
complexo. Para o alumnio,
por exemplo, obtm-se R = 92% e para a prata obtm-se R = 96% (Figura 4.8). Neste
caso T = 0% devido absoro do filme.
A Figura 4.9 representa a reflectncia espectral, incidncia normal, para vrios
filmes metlicos (os mais utilizados). O ouro provavelmente o melhor material para
revestimentos reflectores na regio infravermelha do espectro. O alumnio e a prata so
os que tm melhor reflectncia na zona visvel. O alumnio o material mais adequado
em termos de compatibilidade de fabrico, mas infelizmente tem maiores perdas por
absoro do que a prata e mesmo do que o ouro, na regio visvel. Para esta regio do
espectro a prata parece ser o melhor material. Contudo, oxida quando exposta ao ar.
Este problema pode ser contornado se o filtro for selado [1].
Filtros pticos

81
80
85
90
95
100
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
ngulo (graus)
R
e
f
l
e
c
t
n
c
i
a

(
%
)
Al
Ag

Figura 4.8: Reflectncia de uma superfcie de alumnio e prata em funo do ngulo.
0
20
40
60
80
100
100 300 500 700 900
Comprimento de onda (nm)
A
b
s
o
r
v
n
c
i
a

(
%
)
Ag
Au
Al
Cu

Figura 4.9: Reflectncia da prata, do cobre, do ouro e do alumnio, em funo do comprimento
de onda.
Os filmes metlicos so bastante utilizados para revestimentos de elevada
reflexo e so frequentemente revestidos com um filme fino dielctrico de modo a
reduzir as perdas por absoro e a proteger o metal da atmosfera. As suas outras
utilidades comuns so em filmes finos para os interfermetros e polarizadores
birrefringentes [3]. Contudo, fora destas aplicaes, os filmes metlicos no so muito
utilizados devido s suas perdas por absoro. Por este motivo o filtro ptico ser
implementado com materiais dielctricos.

82
4.6 Aplicao do mtodo a uma estrutura multicamada de filmes
finos dielctricos
A combinao de camadas com ndices de refraco elevados e baixos e com
determinadas espessuras resulta, conforme foi referido no estudo terico, num espectro
de reflexo da estrutura multicamada com mximos e mnimos em determinados
comprimentos de onda. Como nos filmes dielctricos a absoro muito pequena, o
espectro da transmisso praticamente o inverso do da reflexo.
Das equaes (4.48) e (4.49), para um par de filmes, uns de baixo (u
L
) e outros
de elevado (u
H
) ndice de refraco, obtm-se (assumindo, por simplicidade de clculo,
camadas de /4 de espessura do caminho ptico),

|
|
.
|
\
|
|
|
|
.
|
\
|
|
|
|
.
|
\
|
=
|
|
.
|
\
|
=
|
|
.
|
\
|
0
L
L
H
H
0
L H
1
0 i
i
0
0 i
i
0
1
u
u
u
u
u
u
M M
C
B
(4.71)
isto ,

0
2
L
2
H
u
u
u
B
C
Y
|
|
.
|
\
|
= = (4.72)
O efeito de serem utilizadas duas camadas o de multiplicar a admitncia do
substrato pelo factor ) / (
2
L
2
H
u u . Se se adicionar mais um par dupla camada j existente,
a admitncia ser multiplicada por mais um factor de ) / (
2
L
2
H
u u . De um modo geral,

0
2
L
H
u
u
u
Y
N
|
|
.
|
\
|
= (4.73)
onde N o nmero de pares de camadas HL. Combinando numa estrutura camadas de
/4 e camadas de /2, consegue-se para determinados comprimentos de onda reduzir a
reflexo e assim implementar filtros passa-banda ou rejeita-banda atravs de determina-
dos arranjos dessas camadas. A Figura 4.7 ilustra esses princpios.
Dois exemplos da combinao de camadas de /4 e de /2 so as estruturas
seguintes,
Ar HLH LL HLH Vidro (4.74)
ou,
Filtros pticos

83
Ar HLHL HH LHLH Vidro (4.75)
onde H e L representam materiais dielctricos com ndice de refraco elevado e baixo,
respectivamente.
A matriz caracterstica do primeiro caso :
M = M
H
M
L
M
H
M
L
M
L
M
H
M
L
M
H
Da equao (4.67), a matriz M pode ser escrita, incidncia normal,

|
|
|
|
.
|
\
|
=
2
1
1
2
0
0
n
n
n
n
M (4.76)
ento,
0 L L
1 0
0 1
M M M =
|
|
.
|
\
|
=
onde M
0
a matriz identidade. A espessura do par central de /2, o que no altera o
valor da reflectncia para o comprimento de onda projectado (ver seco 4.5.1, equao
(4.70)). Se o seu efeito nulo, a matriz caracterstica do sistema equivalente a:
M = -M
H
M
L
M
H
M
H
M
L
M
H
Verifica-se novamente a mesma situao para o novo par central,
0 H H
1 0
0 1
M M M =
|
|
.
|
\
|
=
O resultado final dado por:
0
1 0
0 1
M M =
|
|
.
|
\
|
=
Para a frequncia para a qual o filtro foi projectado, o coeficiente de reflexo
para a incidncia normal , com base na equao (4.50),

0
0
n n
n n
r
q
q
+
= (4.77)

84
O resultado idntico ao de um substrato no revestido (equao (4.63)). Em particular,
para o vidro (n
0
= 1.52) e ar (n
q
= 1), a reflectncia mnima (terica) de
043 . 0
2
= = r R , logo a transmitncia mxima (terica) de T = 95.7% (desprezando as
reflexes na superfcie posterior do substrato e todas as perdas nos filmes). importante
relembrar que as camadas com espessuras de caminho ptico /4 e /2, tero
propriedades diferentes medida que o comprimento de onda varia.
4.7 Projecto do filtro ptico
Na seco 1.2.2 referiu-se que a utilidade dos filtros pticos no Microlab a de
permitir a medio do valor da concentrao de uma determinada biomolcula na urina
utilizando luz branca como fonte emissora de luz, evitando assim o recurso a uma fonte
de luz monocromtica especfica.
Relembre-se que a medio da concentrao baseada na absoro ptica da luz
pelas molculas presentes na amostra, para um comprimento de onda bem definido da
regio visvel do espectro electromagntico. Assim, o filtro ptico deve ser um filtro
passa-banda cuja funo seleccionar o comprimento de onda adequado biomolcula
em anlise. Uma vez que esse comprimento de onda bem definido, o filtro
passa-banda deve ter elevada selectividade (passa-banda estreita). A importncia desta
caracterstica ser abordada na seco 4.8.
4.7.1 Selectividade de um filtro passa-banda
O espectro de transmisso dos filtros passa-banda pode ser representado pela
Figura 4.10. Um parmetro importante para caracterizar a selectividade/largura de banda
do filtro a FWHM (Full-Width-Half-Maximum), ou seja a largura do pico a metade da
sua intensidade mxima,

1 2
FWHM = (4.78)
onde
2
e
1
correspondem ao comprimento de onda a metade da sua intensidade
mxima, direita e esquerda do centro do pico, respectivamente (Figura 4.10). O valor
do FWHM traduz a qualidade do filtro ptico em termos da sua capacidade para
seleccionar uma banda estreita do espectro electromagntico.
Filtros pticos

85
I
max
I
max
2
1
(nm)

Figura 4.10: Esquema do clculo da FWHM de um filtro passa-banda.
4.7.2 Canal ptico
A Figura 4.11 apresenta, esquematicamente, a estrutura do canal ptico do
Microlab (seco em corte). A sua operao baseada na absoro ptica para um
comprimento de onda bem definido do espectro visvel. O feixe emissor de luz branca
incidente no Microlab processado, pelo filtro ptico, de modo a obter-se apenas uma
banda estreita de comprimentos de onda. A intensidade das componentes espectrais
transmitidas atravs do fluido medida usando um fotodetector posicionado por baixo
do filtro ptico. O canal ptico constitudo por:
Ar como meio de incidncia.
Camadas de filmes finos.
Vidro como substrato.
Camada de cerca de 650 nm de SiO
2
(inerente ao processo de fabrico do
fotodetector, ver seco 5.3).
Silcio como meio de sada.
Filtro ptico
de filmes finos
Si
SiO
Vidro
Ar
Luz incidente
Microfluidos
Canal
ptico
Fotodetector
n
1
2
2

Figura 4.11: Estrutura do canal ptico do Microlab.

86
4.7.3 Requisitos para o espectro de transmisso do filtro ptico
O espectro de transmisso do filtro passa-banda deve ter uma selectividade tal
que a sua FWHM seja inferior a 10 nm, quando o Microlab fabricado apenas para
analisar uma biomolcula (este valor obtido das caractersticas espectrais das
biomolculas a utilizar). Os requisitos para a anlise de mais que uma biomolcula sero
apresentados em 4.8.2. O valor do pico do espectro de transmisso deve ser o mais
elevado possvel. Esse valor deve ter no mnimo o dobro do valor de qualquer pico
indesejvel (de rudo) que aparea dentro da gama visvel do espectro electromagntico
(Figura 4.12).

1
2
> 2x
T (%)
x
(nm)

Figura 4.12: Requisito para a intensidade da transmisso do pico.
Pretende-se tambm que o filtro tenha o menor nmero possvel de camadas,
para facilitar o processo de fabrico. Da teoria, viu-se que quanto maior o nmero de
camadas mais selectivo o filtro. Contudo, necessrio encontrar um compromisso
entre o nmero de camadas e os valores pretendidos para a transmitncia e a FWHM.
4.7.4 Escolha dos materiais
O substrato no qual sero depositadas as camadas de vidro (Corning 7059),
com 500 m de espessura e com um ndice de refraco de n = 1.52 [11]. Escolheu-se o
vidro porque um material transparente e tambm porque foi neste material que foi
realizado o prottipo do sistema de microfluidos. Numa soluo totalmente integrada, os
filtros seriam depositados na lamela que contm os orifcios.
Os filmes metlicos tm elevadas perdas por absoro, pelo que, tal como foi
referido, no sero utilizados. Assim, a estrutura multicamada de filmes finos
constituda apenas por filmes dielctricos, que, quando bem projectados, e obviamente
Filtros pticos

87
bem fabricados, produzem elevada transmisso e baixas perdas por absoro. Os
dielctricos escolhidos foram o SiO
2
(dixido de silcio) e o TiO
2
(dixido de titnio).
Esta escolha deveu-se em primeiro lugar ao facto de ambos serem materiais duros pelo
que so extremamente difceis, ou mesmo quase impossveis, de remover do substrato.
Em segundo lugar, a estrutura multicamada deve ser implementada com materiais que
tenham um ndice de refraco baixo e elevado intercaladamente (ver seco 4.5). Em
terceiro lugar, de entre os dielctricos com ndices de refraco baixos, escolheu-se o
SiO
2
porque a sua dependncia do ndice de refraco dentro da gama visvel de
comprimentos de onda praticamente constante (1.47 a 1.45). Por fim, a escolha de um
dielctrico com ndice de refraco elevado recaiu sobre o TiO
2
devido facilidade de
fabrico, uma vez que o processo para a sua deposio encontrava-se bem
caracterizado [12].
Na Figura 4.13 apresenta-se o espectro de transmisso e reflexo destes dois
materiais em funo da espessura do filme. Note-se que ambos os filmes no absorvem
nos comprimentos de onda da gama visvel, uma vez que os seus ndices de refraco
tm apenas componentes reais. Assim, R + T = 100% conforme visualizado na
Figura 4.13. Os valores utilizados para os ndices de refraco dos materiais descritos ao
longo desta tese so os fornecidos pela base de dados da Sopra Company [13]. Caso
contrrio ser referido. As tabelas com os ndices de refraco destes dois materiais
encontram-se no Anexo II.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
Espessura da camada (x /4 unidades)
T
r
a
n
s
m
i
t
n
c
i
a

(
%
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
R
e
f
l
e
c
t
n
c
i
a

(
%
)
T de TiO
T de SiO
R de SiO
R de TiO
2
2
2
2

Figura 4.13: Valores da transmitncia e da reflectncia do TiO
2
e SiO
2
em funo da espessura
da camada. Considerou-se cada camada independente e depositada num substrato
de vidro com n = 1.52.

88
4.7.5 Software de simulao de filmes finos
Da teoria de filmes finos constatou-se que os mtodos matemticos so bastante
teis para o projecto de uma estrutura inicial, que ser apenas uma aproximao
grosseira ao pretendido. Uma vez que existem imensos parmetros a variar, devem ser
utilizadas tcnicas de optimizao computacional que partem dessa estrutura grosseira
em direco a uma estrutura melhorada. Contudo, o resultado final pode ficar aqum da
caracterstica ideal, pelo que devem ser realizados refinamentos para ajuste de alguns
parmetros.
Um software profissional de projecto de filmes finos TFCalc 3.4 (fornecido
pela Software Spectra, Inc.) [14], desenvolvido especialmente para o tipo de clculos
pticos pretendido, foi utilizado em todas as simulaes computacionais dos filtros
pticos. Essas simulaes incluem a dependncia do comprimento de onda das
propriedades pticas dos materiais.
4.7.6 Simulaes pticas
O cido rico foi a primeira biomolcula candidata ao Microlab. Assim, o filtro
ptico foi projectado para ter um mximo de transmitncia a 495 nm. Este comprimento
de onda o valor para o qual as molculas de cido rico, aps reagirem com o reagente
adequado, tm o mximo de absorvncia [15].
A Tabela 4.1 apresenta um arranjo de camadas dielctricas com uma
combinao de espessuras das camadas de forma a obter-se o melhor desempenho
possvel, dentro dos requisitos propostos. A estrutura composta por 11 camadas. A
simulao do espectro de transmisso (Figura 4.14) revela que o desempenho do filtro
satisfaz os requisitos propostos, uma vez que o valor mximo da transmitncia de
91.4% e a FWHM de 5.5 nm. Se se reduzisse o nmero de camadas, a FWHM seria
maior que 10 nm.
Filtros pticos

89
Tabela 4.1: Material e espessura das camadas do filtro passa-banda.
Camada 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Material TiO
2
SiO
2
TiO
2
SiO
2
TiO
2
SiO
2
TiO
2
SiO
2
TiO
2
SiO
2
TiO
2
Espessura (nm) 60 45 45 80 65 75 80 75 45 50 45

Figura 4.14: Simulao do espectro de transmisso, em funo do comprimento de onda, do
filtro passa-banda com a estrutura da Tabela 4.2. T
max
= 91.4%, FWHM = 5.5 nm.
Um arranjo baseado na estrutura referida em (4.75), ou seja, Ar HLHL HH
LHLH Vidro, apresenta-se na Tabela 4.2. A estrutura composta por 9 camadas
dielctricas. A simulao ptica, apresentada pelo espectro de transmisso da
Figura 4.15, revela que esta estrutura a melhor opo para o filtro passa-banda em
termos de caractersticas pticas e praticabilidade. O seu desempenho satisfaz os
requisitos pretendidos, uma vez que o valor mximo da transmitncia de 94.2% e a
FWHM de 7.5 nm. Para alm de satisfazer os requisitos, esta estrutura apresenta
menos duas camadas do que a anterior (ver Tabela 4.1), o que vantajoso em termos de
facilidade de fabrico.

90
Tabela 4.2: Material e espessura das camadas do filtro passa-banda com a estrutura dos filmes:
HLHL HH LHLH.
Camada 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Material TIO
2
SIO
2
TIO
2
SIO
2
TIO
2
SIO
2
TIO
2
SIO
2
TIO
2
Espessura (nm) 41 85 41 85 80 85 41 85 41

max
= 94.2%, FWHM = 7.5 nm.
O desempenho do filtro passa-banda pode ser melhorado aumentando o nmero
de camadas dielctricas (Tabela 4.3, Figura 4.16). Contudo, a complexidade do processo
de fabrico aumenta. Note-se que esta estrutura tem o mesmo nmero de camadas da
apresentada na Tabela 4.1 e um desempenho bastante melhor. Assim, a estrutura com
uma combinao de camadas de /4 e /2, conforme apresentado em (4.74) ou (4.75),
parece ser a mais adequada para o Microlab, em especial a estrutura descrita na
Tabela 4.2.
Filtros pticos

91
Tabela 4.3: Material e espessura das camadas do filtro passa-banda com a estrutura dos filmes:
HLHLH LL HLHLH.
Camada 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Material TiO
2
SiO
2
TiO
2
SiO
2
TiO
2
SiO
2
TiO
2
SiO
2
TiO
2
SiO
2
TiO
2
Espessura (nm) 41 85 41 85 41 170 41 85 41 85 41

max
= 94.7%, FWHM = 3.6 nm.
O software utilizado permite introduzir a eficincia quntica do detector real. Se
os espectros fossem simulados considerando o detector real, o valor de pico da
transmitncia descia para cerca de 60% (para = 495 nm). No final da seco 4.8.3,
ilustra-se uma simulao considerando o dodo real fabricado.
O filtro passa-banda da Figura 4.15 , portanto, adequado e necessrio para, no
Microlab, se medir a concentrao de cido rico na urina. Contudo, para se utilizar
como fonte emissora de luz uma luz branca convencional, necessrio suprimir a regio
no visvel do espectro electromagntico. Uma lmpada convencional de filamento
incandescente, como por exemplo a lmpada de tungstnio, tem um espectro de
emisso, tipicamente, entre 320 nm a 2600 nm [16]. Para suprimir a gama espectral no
visvel, um filtro passa-banda comercialmente disponvel, deve ser colocado no topo do
Microlab. Um exemplo pode ser o filtro com a referncia BG40 ou VG6, da Schott [17].
As especificaes tcnicas destes dois filtros encontram-se no Anexo III.

92
Analisando a estrutura da multicamada do filtro ptico seleccionado para o
Microlab, constata-se que similar estrutura denominada de interfermetro de
Fabry-Perot. Uma descrio completa da sua teoria pode ser consultada em [1, 6, 18].
Sucintamente, a sua estrutura composta por duas superfcies, denominadas de
espelhos, posicionados paralelamente um ao outro, geralmente separados por ar. A
expresso que relaciona a distncia entre os espelhos e o comprimento de onda que
transmitido, dada por,
m nd = 2 (4.79)
onde n o ndice de refraco do meio de espaamento entre os espelhos, d a distncia
entre os espelhos (ou a espessura desse meio de espaamento), o comprimento de
onda da luz incidente e m a ordem de interferncia. No caso da estrutura escolhida
para o filtro ptico, HLHL HH LHLH, pode dizer-se que as quatro primeiras camadas
so o espelho 1, a camada 5 a camada de espaamento e as quatro ltimas camadas so
o espelho 2.
4.8 Projecto da matriz de filtros pticos
4.8.1 Princpio
Da teoria de filmes finos (seco 4.3) sabe-se que as camadas tm propriedades
diferentes medida que o comprimento de onda varia. Esta dependncia pode ser usada
para desviar a banda espectral de transmisso para outros comprimentos de onda,
mexendo na espessura de alguma, ou algumas, camadas. Assim, em vez de se projectar
um nico filtro ptico, porque no projectar mais filtros pticos de tal forma que, com o
mesmo Microlab, se consiga analisar mais biomolculas na urina? Para tal, necessrio
verificar se existem mais biomolculas que possam ser analisadas por deteco
colorimtrica. Na Tabela 4.4 encontram-se 16 biomolculas que preenchem esse
requisito, assim como o valor do comprimento de onda para o qual cada uma delas tem
o mximo de absorvncia (necessrio para projectar os filtros). Uma terceira coluna
informa ainda que algumas dessas biomolculas podem ser analisadas no s na urina
como tambm no plasma, no soro sanguneo e no fluido cerebrospinal. Toda esta
informao foi retirada do manual de diagnstico da Sigma-Aldrich [15], de informao
fornecida por laboratrios de anlises clnicas e de medies por espectrofotometria
realizadas no Departamento de Fsica da UM.
Filtros pticos

93
Tabela 4.4: Dezasseis biomolculas que podem ser analisadas por deteco colorimtrica.
U (Urina), S (Soro sanguneo), P (Plasma sanguneo), CSF (Fluido cerebrospi-
nal) [15].
Biomolcula a analisar
Comprimento de onda do
mximo de absorvncia
Fluido biolgico
17- Cetosterides 480 U
Cloro 488 U, S
cido rico 495 U, CSF
Colesterol 503 U, S
Glicose 512 U, S
Magnsio 520 U, S
Creatinina 528 U, S, P
Ureia 536 U
Hemoglobina 544 U, P
glucuronidase 552 U, S
Bilirrubina 560 U, S
Leucina aminopeptidase 568 U
Clcio 575 U, S
Oxalato 583 U
Protena Total 591 U
Albumina 600 U, S
4.8.2 Requisitos para o projecto da matriz de filtros pticos
Da Tabela 4.4 concluiu-se que os comprimentos de onda para os quais as
biomolculas tm os seus mximos de absorvncia so prximos. Distam, em mdia,
8 nm. pois necessrio que os filtros pticos tenham elevada selectividade. Assim, cada
filtro ptico deve ter uma FWHM menor que 6 nm, de forma a evitar que a medida da
concentrao de uma dada biomolcula no seja afectada pelas biomolculas que se
encontram na sua vizinhana, uma vez que os seus espectros de absorvncia se
sobrepem (ver seco 7.1).
Os 16 filtros pticos podem ser dispostos em forma de uma matriz 4 4. Uma
impresso artstica encontra-se na Figura 4.17. Essa matriz seria colocada por cima da
cmara de deteco. Por baixo desta estariam 16 fotodetectores alinhados com os filtros
pticos. Ter-se-ia assim 16 canais pticos como o da Figura 4.11.

94
Vidro

Figura 4.17: Impresso artstica dos 16 filtros pticos.
Pretende-se que a complexidade do processo de fabrico dos 16 filtros pticos
no aumente 16 vezes. Para tal, necessrio cumprir mais alguns requisitos. Em
primeiro lugar, os filtros devem ter o menor nmero possvel de camadas, cumprindo o
requisito de cada filtro ter uma FWHM < 6 nm. Em segundo lugar, deve arranjar-se uma
combinao de espessuras das camadas que permita que o nmero de deposies de
filmes seja a menor possvel. Caso contrrio, com 16 filtros pticos de 11 camadas
seriam necessrias 1116 = 176 deposies. Isto no vivel (seria um processo de
fabrico muito complexo e demorado). Da teoria de filmes finos, a banda espectral de
transmisso desviada para outros comprimentos de onda, se a espessura de uma
camada for alterada. Esta dependncia, neste caso particular, vantajosa e deve ser bem
trabalhada de tal forma que sejam alteradas as espessuras do menor nmero possvel de
camadas. Em terceiro lugar, pretende-se que os 16 filtros pticos sejam fabricados na
mesma sequncia e processo de fabrico. Para tal so necessrias mscaras para que as
deposies das camadas especficas a um s filtro ptico no afectem os outros filtros
pticos. Aqui de igual modo necessrio encontrar um arranjo para a disposio dos
filtros pticos na matriz que minimize o nmero de mscaras a usar. Em resumo,
necessrio arranjar um compromisso entre as espessuras das camadas, o nmero de
camadas, o nmero de mscaras, o nmero de deposies e o desempenho dos filtros
pticos.
4.8.3 Simulaes pticas da matriz de filtros pticos
Os resultados das simulaes pticas so apresentados atravs dos espectros de
transmisso para os 16 filtros pticos (Figura 4.18). Esses resultados revelam que a
estrutura da Tabela 4.5 a melhor opo em termos de caractersticas pticas, requisitos
propostos e praticabilidade. Cada filtro ptico necessita de 11 camadas para cumprir
uma FWHM < 6 nm. A estrutura dessas camadas ser ento, HLHLH LL HLHLH. A
camada 6 (camada central LL) foi projectada conjuntamente com as outras, de tal
Filtros pticos

95
forma que, variando apenas a sua espessura (mantendo a espessura das restantes)
consegue-se obter os 16 filtros pticos. A sua espessura varia de 140 nm a 230 nm com
incrementos de 6 nm. Essa variao resulta num varrimento do comprimento de onda
em 120 nm (480 nm a 600 nm). Os picos distam entre si de 8 nm, em mdia. Os
12 picos centrais tm uma FWHM 3.5 nm. Os 2 primeiros picos (
1
= 480 nm,
2
= 488 nm) tm uma FWHM = 5 nm e os 2 ltimos picos (
15
= 591 nm e
16
= 600 nm) tm uma FWHM = 6 nm. O valor de pico da transmitncia varia de 86%
a 92%. Os picos indesejados, que no presente caso encontram-se volta dos 425 nm,
tm uma intensidade menor que a metade da transmitncia mxima do seu pico
correspondente. As espessuras das camadas foram optimizadas para obter-se o menor
nmero de mscaras e deposies, conforme se ver na seco 6.2 que descreve o
fabrico dos filtros pticos.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
400 450 500 550 600 650 700
T
r
a
n
s
m
i
t
n
c
i
a

(
%
)
Filtro 1
Filtro 2
Filtro 3
Filtro 4
Filtro 5
Filtro 6
Filtro 7
Filtro 8
Filtro 9
Filtro 10
Filtro 11
Filtro 12
Filtro 13
Filtro 14
Filtro 15
Filtro 16

Figura 4.18: Simulao da transmitncia, em funo do comprimento de onda, para a matriz de
16 filtros pticos. A estrutura dos filtros encontra-se na Tabela 4.5. A camada 6
de SiO
2
e a sua espessura varia de 140 nm a 230 nm com incrementos de 6 nm para
fornecer o deslocamento do pico de transmisso.

96
Tabela 4.5: Material e espessura das camadas da matriz de filtros pticos passa-banda, com a
estrutura HLHLH LL HLHLH.
Filtro 1 Filtro 2 Filtro 3 Filtro 4 Filtro 5
Pico = 480 nm Pico = 488 nm Pico = 495 nm Pico = 503 nm Pico = 512 nm
N. Camada Material Espessura (nm) Espessura (nm) Espessura (nm) Espessura (nm) Espessura (nm)
1 TIO2 45 45 45 45 45
2 SIO2 95 95 95 95 95
3 TIO2 45 45 45 45 45
4 SIO2 95 95 95 95 95
5 TIO2 45 45 45 45 45
6 SIO2 140 146 152 158 164
7 TIO2 45 45 45 45 45
8 SIO2 95 95 95 95 95
9 TIO2 45 45 45 45 45
10 SIO2 95 95 95 95 95
11 TIO2 45 45 45 45 45

1 TIO2 45 45 45 45 45
2 SIO2 95 95 95 95 95
3 TIO2 45 45 45 45 45
4 SIO2 95 95 95 95 95
5 TIO2 45 45 45 45 45
6 SIO2 170 176 182 188 194
7 TIO2 45 45 45 45 45
8 SIO2 95 95 95 95 95
9 TIO2 45 45 45 45 45
10 SIO2 95 95 95 95 95
11 TIO2 45 45 45 45 45

Filtro 11 Filtro 12 Filtro 13 Filtro 14 Filtro 15 Filtro 16
Pico = 560 nm Pico = 568 nm Pico = 575 nm Pico = 583 nm Pico = 591 nm Pico = 600 nm
N. Camada Material Espessura (nm) Espessura (nm) Espessura (nm) Espessura (nm) Espessura (nm) Espessura (nm)
1 TIO2 45 45 45 45 45 45
2 SIO2 95 95 95 95 95 95
3 TIO2 45 45 45 45 45 45
4 SIO2 95 95 95 95 95 95
5 TIO2 45 45 45 45 45 45
6 SIO2 200 206 212 218 224 230
7 TIO2 45 45 45 45 45 45
8 SIO2 95 95 95 95 95 95
9 TIO2 45 45 45 45 45 45
10 SIO2 95 95 95 95 95 95
11 TIO2 45 45 45 45 45 45

Um outro arranjo com 11 camadas dielctricas apresenta-se na Tabela 4.6.
Tentou optimizar-se as camadas e as suas espessuras para o mesmo nmero de camadas,
o mesmo nmero de mscaras e de deposies e a mesma gama de comprimentos de
onda do filtro projectado anteriormente. No arranjo que mais se aproximou dos
objectivos, a variao das espessuras das camadas 5 e 7 resulta na obteno dos
16 filtros pticos. Em qualquer dos casos, a utilizao do software de simulao de
filmes finos fundamental. Contudo, neste caso particular, sem as simulaes seria
extremamente difcil obter-se resultados viveis. O desempenho desta estrutura
ilustrado pela Figura 4.19. Para manter o mesmo nmero de camadas, de mscaras e de
deposies do filtro anterior (Figura 4.18), a gama de comprimentos de onda varrida
menor, 84 nm (496 nm a 580 nm). A FWHM ligeiramente pior. Os 10 picos centrais
tm uma FWHM = 4 nm. Os filtros 3 e 14 tm uma FWHM = 6 nm. Os filtros 1 e 2 tm
Filtros pticos

97
uma FWHM = 10 nm e os filtros 15 e 16 tm uma FWHM = 7 nm. Alm disso os picos
no se encontram espaados uniformemente. O valor da transmitncia, para alguns
filtros, ligeiramente superior relativamente estrutura anterior. Esta estrutura poder
ter vantagens em certos processos de fabrico, uma vez que as camadas tm valores de
espessuras mais aproximados umas das outras que no caso anterior.
Tabela 4.6: Material e espessura das camadas da matriz de filtros pticos passa-banda, com um
arranjo de camadas dielctricas.
1 TIO2 65 65 65 65 65
2 SIO2 60 60 60 60 60
3 TIO2 55 55 55 55 55
4 SIO2 80 80 80 80 80
5 TIO2 60 65 60 65 60
6 SIO2 85 85 85 85 85
7 TIO2 75 75 80 80 85
8 SIO2 70 70 70 70 70
9 TIO2 55 55 55 55 55
10 SIO2 65 65 65 65 65
11 TIO2 55 55 55 55 55

1 TIO2 65 65 65 65 65
2 SIO2 60 60 60 60 60
3 TIO2 55 55 55 55 55
4 SIO2 80 80 80 80 80
5 TIO2 65 60 65 60 65
6 SIO2 85 85 85 85 85
7 TIO2 85 90 90 95 95
8 SIO2 70 70 70 70 70
9 TIO2 55 55 55 55 55
10 SIO2 65 65 65 65 65
11 TIO2 55 55 55 55 55

Filtro 11 Filtro 12 Filtro 13 Filtro 14 Filtro 15 Filtro 16
Pico = 555 nm Pico = 559 nm Pico = 564 nm Pico = 569 nm Pico = 575 nm Pico = 580 nm
N. Camada Material Espessura (nm) Espessura (nm) Espessura (nm) Espessura (nm) Espessura (nm) Espessura (nm)
1 TIO2 65 65 65 65 65 65
2 SIO2 60 60 60 60 60 60
3 TIO2 55 55 55 55 55 55
4 SIO2 80 80 80 80 80 80
5 TIO2 60 65 60 65 60 65
6 SIO2 85 85 85 85 85 85
7 TIO2 100 100 105 105 110 110
8 SIO2 70 70 70 70 70 70
9 TIO2 55 55 55 55 55 55
10 SIO2 65 65 65 65 65 65
11 TIO2 55 55 55 55 55 55

Independentemente da estrutura das camadas, um filtro comercial ter, de igual
modo, que ser utilizado no topo do Microlab. As razes da sua utilizao e tipo de filtro
so as mesmas descritas em 4.7.6.
Analisando o desempenho destas duas estruturas, conclui-se que, se o processo
de fabrico for fivel e preciso, a melhor opo ser a estrutura da Tabela 4.5. A estrutura
apresentada na Tabela 4.6 tem uma transmitncia ligeiramente mais elevada em alguns

98
filtros. Contudo, para as medies pretendidas, esta vantagem no relevante, uma vez
que essas medies so realizadas sempre em relao a um reagente e a um calibrador
de concentrao conhecida. Por isso, mais relevante que a gama de comprimentos de
onda percorrida seja maior, o que se traduz num maior nmero de biomolculas a
analisar.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
400 450 500 550 600 650 700
T
r
a
n
s
m
i
t
n
c
i
a

(
%
)
Filtro 1
Filtro 2
Filtro 3
Filtro 4
Filtro 5
Filtro 6
Filtro 7
Filtro 8
Filtro 9
Filtro 10
Filtro 11
Filtro 12
Filtro 13
Filtro 14
Filtro 15
Filtro 16

Figura 4.19: Simulao da transmitncia, em funo do comprimento de onda, para uma matriz
de 16 filtros pticos com a estrutura da Tabela 4.6. A variao das espessuras das
camadas 5 e 7 fornecem o deslocamento do pico de transmisso.
A Figura 4.20 apresenta os espectros de transmisso, para a estrutura da
Tabela 4.5, simulados com o detector real. Observa-se que o valor mximo dos 16
espectros forma uma envolvente representada pela linha a tracejado na Figura 4.20. Essa
envolvente est relacionada com a camada de SiO
2
de 650 nm de espessura do
fotodetector (ver Figura 4.11). Relembre-se que as medies pretendidas so realizadas
sempre em relao a um reagente e a um calibrador com um padro de concentrao
conhecida. Assim, quer o efeito do fotodetector, quer a flutuao da luz branca, podem
ser desprezados neste tipo de medies relativas.
Duas outras solues para a matriz de filtros pticos encontram-se em [19, 20].
Na primeira, devido ao processo de fabrico, eram necessrias espessuras das camadas
dielctricas maiores que 100 nm. Na segunda, descrito um interfermetro de
Fabry-Perot com espelhos metlicos. Em ambas, o desempenho dos filtros pticos
pior que o apresentado neste documento.
Filtros pticos

99
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
400 450 500 550 600 650 700
T
r
a
n
s
m
i
t
n
c
i
a

(
%
)
Filtro 1
Filtro 2
Filtro 3
Filtro 4
Filtro 5
Filtro 6
Filtro 7
Filtro 8
Filtro 9
Filtro 10
Filtro 11
Filtro 12
Filtro 13
Filtro 14
Filtro 15
Filtro 16
Series17

Figura 4.20: Simulao da transmitncia, em funo do comprimento de onda, para a matriz de
16 filtros pticos com a estrutura da Tabela 4.5. Esta simulao foi realizada
considerando como detector o fotododo fabricado.
4.9 Concluso
A medida, por absoro ptica, da concentrao de 16 biomolculas da urina
com o mesmo Microlab conseguida com uma matriz de 16 filtros pticos. Foi
demonstrado que, para o projecto dos 16 filtros pticos, a estrutura baseada em camadas
dielctricas dispostas tipo HLHLH LL HLHLH a melhor opo em termos de
caractersticas pticas e praticabilidade. Essa estrutura foi optimizada para se obter
elevada selectividade para cada filtro e facilidade no processo de fabrico, ou seja,
minimizando o nmero de camadas, de deposies e de mscaras. Os 16 filtros pticos
varrem comprimentos de onda desde 480 nm a 600 nm em intervalos de aproximada-
mente 8 nm, com FWHM 6 nm. Assim, para as medies, o Microlab necessita
apenas de uma fonte emissora de luz branca convencional, tornando-o num dispositivo
porttil. As oscilaes da luz branca so compensadas pela medio simultnea em cada
anlise de um padro de concentrao conhecida calibrador.

100
Bibliografia
[1] MACLEOD, H. A. - Thin-film optical filters. 3 ed. Institute of Physics
Publishing, Philadelphia, USA, 2001.
[2] HENCHT, E. - ptica. Fundao Calouste Gulbenkian, Lisboa, Portugal, 1991.
[3] BORN, M.; WOLF, E. - Principles of optics: electromagnetic theory of
propagation, interference and diffraction of light. 7 ed. Captulos 1, 2 e 14,
Cambridge University Press, 1999.
[4] YEH, P. - Optical waves in layered media. John Wiley & Sons, 1988.
[5] FLORY, F. R. - Thin films for optical systems. Marcel Dekker, 1995.
[6] FERREIRA, M. - ptica e fotnica. Lidel-edies tcnicas, Lisboa, 2003.
[7] DANKIN, J.; CULSHAW, B. - Optical-fiber sensors: principles and
components. Artech House, Boston, 1988.
[8] THOMPON, R. C. - Thin film optics. Imperial college of Science, Technology
and Medicine, 1999.
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[10] BLEANEY, P. I.; BLEANEY, B. - Electricity and magnetism. Clarendon Press,
Oxford, 1959, p. 243-245.
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[12] RIBEIRO, E. [et al.] - Surf. Coat. Technol. Vol. 515 (2002) p. 151-152.
[13] Optical properties of coating material. SOPRA S.A., Web site:
http://www.sopra-sa.com/indices.htm, 2000.
[14] http://www.sspectra.com.
[15] Biochemistry and Organic Reagents: for bioscience investigation. Sigma, 2002.
[16] JUREK, A. M.; DANDRIDGE, A. - Optical sources. In Optical fiber sensors.
DAKIN, J. P.; CLUSHAW, B. ed. Lit. Norwood, MA: Artech House (1988),
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[17] http://www.schott.com/optics_devices/english/products/filter/glass_filter.html.
[18] CORREIA, J. H. - Optical Microsystems in silicon based on a Fabry-Perot
resonance cavity. Delft University Press, 1999. Tese de Doutoramento.
Filtros pticos

101
[19] MINAS, G. [et al.] - Biosystem with 16 Highly-Selective Optical-Channels for
Biological Fluids Analysis in the Visible Spectrum. Proceedings of
Transducers03, Boston-USA, 8-12 de Junho de 2003, p. 1251-1254.
[20] MINAS, G. [et al] - A 16 Fabry-Perot Optical-Channels Array for Biological
Fluids Analysis using White Light. Proceedings of Eurosensors XVII, Guimares,
Portugal, 21-24 de Setembro de 2003, p. 28-30.

103
5

Fotodetector e electrnica
em tecnologia CMOS
Cada canal ptico tem um fotodetector, alinhado verticalmente com o filtro
ptico, o qual permite medir a intensidade do feixe de luz transmitido atravs da
mistura. O fotodetector, a electrnica de leitura do seu sinal e circuitos suplementares
podem, todos eles, ser integrados num nico chip, constituindo o sistema de deteco e
leitura.
Este captulo apresenta o motivo da escolha da tecnologia CMOS em silcio para
o fabrico do sistema de deteco e leitura. Seguidamente, discutem-se as opes
disponveis em tecnologia CMOS para o fotodetector. O captulo termina com uma
seco dedicada electrnica de leitura e de converso do sinal analgico vindo do
fotodetector num sinal digital.
5.1 Tecnologia CMOS standard em silcio
A tecnologia CMOS , actualmente, a mais utilizada no fabrico de electrnica.
Esta tecnologia ganhou popularidade devido ao seu baixo consumo de energia,
disponibilidade de integrar num chip ambos os transstores NMOS e PMOS e rea de
silcio necessria para um transstor ser normalmente menor, quando comparada, por
exemplo, com a de um transstor bipolar equivalente [1]. O pequeno tamanho dos
transstores favorece a integrao a uma taxa muito elevada (VLSI - Very Large Scale
Integration), na qual, actualmente, podem encontrar-se no fabrico de circuitos digitais

104
cerca de 14 milhes de transstores por centmetro quadrado (caso das memrias
comercializadas pela INTEL).
Os circuitos analgicos em tecnologia CMOS tm tido uma incrvel importncia
e desenvolvimento ao longo dos anos. Actualmente consegue-se integrar desde simples
chaves a circuitos extremamente complexos num nico chip. Mais ainda, esta tecnologia
pode comportar vrias estruturas fotossensveis, nomeadamente fotodetectores. Com
base nos pressupostos descritos a tecnologia CMOS parece ser a escolha mais
apropriada para o fabrico dos fotodetectores integrados com a electrnica de leitura.
5.2 Fotodetectores em tecnologia CMOS
Na tecnologia CMOS standard com n-well so possveis vrias estruturas
fotossensveis para fotododos e fototransstores de juno. Podem ainda ser realizadas
photogates, dependendo das caractersticas do processo escolhido (o material da gate
deve ser altamente transmissivo, i.e., no deve ser um composto de silcio ou
metal) [2, 3]. Adicionalmente podem ainda ser realizados fotododos de avalanche.
Contudo, estes no permitem a implementao no mesmo chip de circuitos electrnicos,
uma vez que, normalmente, so polarizados com tenses de algumas dezenas de
volts [1]. Neste trabalho discutir-se-o apenas os fotododos verticais e o fototransstor
vertical, uma vez que, pela anlise realizada por Moini em [4], constatou-se serem esses
os mais adequados para deteco de luz na gama visvel do espectro electromagntico,
mais precisamente entre 400 e 650 nm.
5.2.1 Fotododos em silcio
Os trs tipos de fotododos verticais so criados usando a juno
n-well / p-epilayer, a juno p+ / n-well, e a juno n+ / p-epilayer (Figura 5.1). O
princpio de operao destes trs tipos de fotododos idntico. Apenas variam na
profundidade da juno. Um fotododo usa o efeito fotoelctrico [5] para converter luz
numa corrente elctrica, ou seja, converte fotes em pares electro-lacuna. Esta
converso d-se quando os fotes incidentes tm uma energia superior largura de
banda entre as bandas de conduo e de valncia (denominada de band gap energy),
que no caso do silcio de 1.14 eV. Esses fotes incidentes so absorvidos por electres
na banda de valncia, que, ao adquirirem energia so excitados para a banda de
conduo, deixando uma lacuna na banda de valncia. Muitos dos electres gerados na
Fotodetector e electrnica em tecnologia CMOS

105
banda de conduo recombinam-se rapidamente com lacunas existentes na banda de
valncia. Por isso, necessrio remover os electres gerados da banda de conduo.
Para tal, utiliza-se uma juno pn polarizada inversamente, dando origem a uma regio
que fica destituda de cargas mveis, conhecida por regio de depleo. Verifica-se a a
existncia de um campo elctrico cujo sentido tal que contraria a movimentao de
cargas adicionais nessa regio [6].
Ctodo nodo
Substrato p
p-epilayer
n-well
n+ p+

Gnd Ctodo nodo
Substrato p
p-epilayer
n-well
n+ p+ p+

Bulk Substrate (GND)
Ctodo nodo
Substrato p
p-epilayer
n+ p+

Ctodo
i
nodo

Vdd Ctodo
i
nodo
Ctodo
i
nodo

(a) (b) (c)
Figura 5.1: Vista em corte dos trs tipos de fotododos em silcio disponveis na tecnologia
CMOS standard com n-well: (a) n-well / p-epilayer; (b) p+ / n-well;
(c) n+ / p-epilayer.
Os electres gerados pela absoro de fotes, prximo ou dentro da regio de
depleo, so deslocados para a zona tipo n, antes que se possam recombinar na zona
tipo p. A situao inversa acontece com as lacunas geradas. Este processo origina uma
corrente elctrica que proporcional intensidade da luz incidente [7],

hc
P q
I
i
p
= (5.1)
onde a eficincia quntica do fotododo, P
i
a potncia ptica incidente, h a
constante de Plank, q o valor da carga do electro, o comprimento de onda da luz e
c a velocidade da luz. A eficincia quntica definida como,

fotes de incidncia de Taxa
electres de gerao de Taxa
= (5.2)
ou seja, a probabilidade dos fotes gerarem pares electro-lacuna que so recolhidos
antes que se possam recombinar. Os fotodetectores so caracterizados pela eficincia
quntica e pela sua responsividade. A primeira indica, basicamente, a capacidade do
fotodetector absorver a luz incidente e, normalmente, expressa em percentagem.
dependente do tipo de semicondutor, da profundidade da juno, da largura da camada

106
de depleo W
d
, da distncia entre a regio do espao de carga e o contacto hmico L
d
,
dos revestimentos dielctricos existentes sobre a superfcie do silcio, e da rea
fotossensvel efectiva. Pode ser descrita por [8],
( )
|
|
.
|
\
|
+
=
1
e
1 1
d Si
d Si
L
R
W
(5.3)
onde R a reflectncia ptica da superfcie do silcio (caso existam camadas dielctricas
sobre o silcio, R a reflectncia total da estrutura) e
Si
o coeficiente de absoro do
silcio. A segunda, a responsividade de um fotododo, (A/W), relaciona a corrente
produzida I
p
e a potncia ptica incidente P
i
,

hc
q
P
I
= =
i
p
(5.4)
Caractersticas espectrais
A resposta espectral dos fotodetectores baseados em silcio afectada pela
transmisso da luz incidente no silcio, pela capacidade de gerao de pares
electro-lacuna e pela capacidade de recolher esses pares antes que se possam
recombinar. As duas ltimas dependncias j foram referidas nesta seco. A primeira,
ser abordada em seguida e depende dos parmetros pticos e da composio do silcio.
A absoro da luz no silcio, na gama visvel do espectro electromagntico,
dependente do comprimento de onda. Radiaes com comprimentos de onda baixos,
i.e., fotes de elevada energia, so rapidamente absorvidos a pequenas profundidades e
radiaes com comprimentos de onda elevados, i.e., fotes de baixa energia, penetram
muito mais profundamente no silcio antes de serem absorvidos. Este efeito deve-se ao
comprimento de onda da luz no silcio ser fortemente dependente do coeficiente de
absoro do silcio, tal como ilustrado na Figura 5.2 [9], de tal forma que a
profundidade de penetrao da luz no silcio d(), seja dependente do comprimento de
onda e expressa por,

) (
1
) (

= d (5.5)

107
0.1
1.0
10
10
7 Vermelho Azul
10
6
10
5
10
4
10
3
10
2
10
1
10
0
0.6
-
1
C
o
e
f
i
c
i
e
n
t
e

d
e

a
b
s
o
r
o

(
c
m

)
P
r
o
f
u
n
d
i
d
a
d
e

d
a

p
e
n
e
t
r
a
o

(
m
)
Energia do foto (eV)

0.8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
T=300 K
Si

Figura 5.2: Coeficiente de absoro e profundidade da penetrao da luz no silcio.
Da Figura 5.2 conclui-se que os fotes incidentes com comprimento de onda de
cerca de 400 nm (azul) so absorvidos dentro de uma camada at 0.1 m abaixo da
superfcie do silcio, enquanto que a luz vermelha a 600 nm penetra cerca de 10 m no
silcio [10]. Este comportamento est relacionado com a probabilidade de fotes com
uma determinada energia, excitarem um portador da banda de valncia para a banda de
conduo. Fotes de elevada energia tm uma elevada probabilidade de excitarem um
portador da banda de valncia para a banda de conduo e fotes de baixa energia tm
uma baixa probabilidade de excitarem um portador da banda de valncia para a banda
de conduo. Desta anlise concluiu-se que os fotodetectores formados a partir de
junes pn com profundidades diferentes tero respostas espectrais diferentes. Em [4]
Moini deduziu a eficincia quntica em funo do comprimento de onda para os trs
tipos de fotododos verticais da Figura 5.1. Na Figura 5.3 apresenta-se o grfico dessa
eficincia.
300 200 400 500 600 700 800 900 1000
10
30
40
50
60
70
80
90
20
(c)
(a) (b)
E
f
i
c
i
n
c
i
a

q
u
n
t
i
c
a

(
%
)

Figura 5.3: Eficincia quntica para os trs tipos de fotododos verticais, apresentados na
Figura 5.1 e fabricados em tecnologia CMOS standard. (a) n-well / p-epilayer;
(b) p+ / n-well; (c) n+ / p-epilayer [4].

108
Corrente de fuga e outras fontes de rudo
Existem uma srie de fontes de rudo inerentes ao processo de deteco de fotes
que limitam a relao sinal/rudo sada do fotododo. O rudo caracterizado pela
varincia das flutuaes da corrente elctrica, em torno de um valor mdio. A varincia
das flutuaes da corrente elctrica sada do fotodetector devido ao rudo a soma das
varincias associadas com cada fonte de rudo. Seguidamente, descreve-se de um modo
sucinto algumas das fontes de rudo mais relevantes para este trabalho.
A corrente de fuga de um fotododo a corrente existente mesmo quando este
no est exposto luz. Esta corrente depende de vrios factores. Um deles da
tecnologia utilizada, i. e., das caractersticas da dopagem da juno. Outro factor a sua
dependncia com a temperatura, que, para os fotododos de silcio, aumenta uma ordem
de grandeza se a temperatura aumenta 30 C. Por fim, a corrente de fuga aumenta com o
aumento da tenso de polarizao inversa, devido ao aumento da largura da camada de
depleo [11].
Outra fonte de rudo de um fotododo o chamado rudo quntico. Este
deve-se ao facto de a corrente elctrica gerada ser constituda por pacotes de cargas
discretos que so gerados aleatoriamente. Mesmo quando um fotododo iluminado por
uma potncia ptica constante, devido ao carcter aleatrio da gerao de pares
electro-lacuna, a corrente flutua em torno de um valor mdio. O rudo quntico
aleatrio com um valor mdio nulo e com uma varincia dada por [12],
BW qI
q s
2
2 = (5.6)
onde q a carga do electro, I
s
a corrente mdia gerada pelo sinal e BW a largura de
banda elctrica do fotododo na qual o rudo detectado. A largura de banda do
fotododo depende do tempo de trnsito dos portadores gerados ao longo da regio de
depleo, dos portadores gerados fora da regio de depleo e da resposta em frequncia
do circuito elctrico, constitudo pela capacidade da juno e pela resistncia de carga
utilizada para polarizar o fotododo. Existe um compromisso entre a resposta em
frequncia e a responsividade do fotododo. Se a espessura da zona de depleo for
pequena, a resposta em frequncia aumenta mas diminui a potncia absorvida e,
consequentemente, tambm a responsividade.
Outra fonte de rudo o chamado rudo de padro fixo e define-se como sendo
a variao da resposta entre fotododos adjacentes. Esta variao dominada pela rea
dos fotododos (inversamente proporcional rea). Numa tecnologia CMOS standard,

109
este rudo controlado pela relao entre as dimenses do fotododo e as dimenses
mnimas do processo litogrfico. Uma vez que essa relao elevada (geralmente
superior a 10), o rudo de padro fixo, normalmente, representa menos de 1% do rudo
total produzido por um fotododo [7].
5.2.2 Fototransstor em silcio
O fototransstor bipolar de juno vertical pode ser criado usando as junes
p+ / n-well / p-epilayer (Figura 5.4). Variantes desta estrutura podem ser consultadas
em [13]. O fototransstor vertical usa, tal como os fotododos, o efeito fotoelctrico para
converter fotes em pares electro-lacuna. Estes pares so separados e reunidos usando
uma juno pn inversamente polarizada muito prxima de uma juno pn directamente
polarizada. Tal como num fotododo, a radiao incidente na juno pn inversamente
polarizada, i.e., a juno colector-base, causa uma corrente elctrica que proporcional
intensidade da luz incidente. medida que essa corrente entra na regio da base do
transstor multiplicada por , o ganho em corrente do transstor. Como tipicamente
muito maior que um, o fototransstor pode ter uma eficincia quntica maior que um [4].
Emissor Colector
Colector
Base
Base
Emissor
Substrato p
p-epilayer
n+ p+ p+
n-well

Figura 5.4: Vista em corte do fototransstor bipolar de juno vertical em silcio disponvel na
tecnologia CMOS standard com n-well.
Caractersticas espectrais
As caractersticas espectrais do fototransstor so dominadas pelos mesmos
efeitos descritos na seco anterior para os fotododos, ou seja, a profundidade da
juno. A eficincia quntica em funo do comprimento de onda para um fototransstor
pnp fabricado em tecnologia CMOS standard, foi descrita em [4] e apresenta-se na
Figura 5.5. Como se pode observar, devido ao ganho em corrente do fototransstor, a
eficincia quntica maior que 100%.

110
300 200 400 500 600 700 800 900 1000
100
150
200
50
E
f
i
c
i
n
c
i
a

q
u
n
t
i
c
a

(
%
)

Figura 5.5: Eficincia quntica para o fototransstor pnp, apresentado na Figura 5.4 e
fabricado em tecnologia CMOS standard [4].
Corrente de fuga e outras fontes de rudo
A corrente de fuga de um fototransstor o resultado da polarizao inversa da
juno base-colector. Esta corrente multiplicada por e a corrente de emissor
resultante a corrente de fuga total do fototransstor. Como tipicamente maior que
um, essa corrente ser maior que a de um fotododo com a mesma rea.
O rudo quntico de um fototransstor traduzido pelo rudo quntico em cada
juno dodo. A sua varincia, no emissor, dada por,
) 1 ( 2
s
2
+ = BW qI
q
(5.7)
Comparando as expresses (5.6) e (5.7), o rudo quntico de um fototransstor maior
( + 1) do que num fotododo com a mesma rea.
Relativamente ao rudo de padro fixo, tambm este superior no fototransstor,
uma vez que o pode variar cerca de 20% de transstor para transstor (ainda que sejam
fabricados na mesma srie de fabrico). Esta variao causada por um deficiente
controlo da largura da base e pelo facto do ser extremamente sensvel a variaes de
temperatura [7].
5.2.3 Fotododos versus fototransstor
Os fotododos apresentam menor corrente de fuga e menor rudo por unidade de
rea do que o fototransstor. Se for necessria uma disposio em matriz, os fotododos
so mais adequados, uma vez que tm menor rudo de padro fixo e so mais facilmente

111
reprodutveis que os fototransstores. A vantagem do fototransstor face aos fotododos
a maior eficincia quntica. Contudo, para nveis de luz baixos, em que a corrente do
emissor do fototransstor baixa ( 100 pA), a sua eficincia quntica torna-se
aproximadamente igual dos fotododos, devido ao ser uma funo decrescente da
corrente do emissor [14].
5.3 Projecto do fotododo em silcio
Da seco anterior conclui-se que os fotododos apresentam menor rudo por
unidade de rea do que os fototransstores. Por isso, neste trabalho, ser utilizado um
dos trs tipos de fotododos verticais apresentados na Figura 5.1. Qualquer um deles tem
uma estrutura que se enquadra dentro da tecnologia CMOS standard com n-well e
podem ser fabricados usando apenas as camadas disponveis desse processo, sem passos
adicionais compatveis.
5.3.1 Escolha do fotododo
Da Figura 5.3 apresentada na seco anterior conclui-se que, para um
determinado comprimento de onda, cada um dos trs fotododos verticais tem uma
eficincia quntica diferente, de acordo com a profundidade das suas junes. Num
processo de fabrico standard, tanto a profundidade da juno como as caractersticas
das dopagens so fixas. Dessa mesma Figura 5.3 conclui-se ainda que o fotododo
n+ / p-epilayer ser o mais adequado para este trabalho, uma vez que se pretende uma
maior eficincia quntica entre 500 nm a 600 nm, de acordo com o projecto dos filtros
pticos. A resposta espectral para os trs tipos de fotododos verticais foi simulada com
os parmetros do processo de fabrico utilizado (esses parmetros so os valores de
energia e doses utilizadas nas dopagens). Para tal, utilizaram-se os programas
SUPREM-IV.GS e PISCES-IIB de Standford. Os resultados dessa simulao
encontram-se descritos em [15] e apresentam-se na Figura 5.6. Conclui-se, mais uma
vez, que o fotododo n+ / p-epilayer o mais adequado. Apesar deste fotododo ter uma
juno superficial, ele apresenta uma melhor resposta espectral na gama de
comprimentos de onda pretendida devido concentrao da dopagem entre o lado n e o
lado p ser bastante diferente, o que estende a zona de depleo mais profundamente do
lado p. A curva do fotododo p+ / n-well apresenta tambm uma boa resposta na gama
espectral do vermelho ( 600 nm) devido influncia da sua outra juno
n-well / p-epilayer [15].

112
400
C
o
r
r
e
n
t
e

(
A
U
)
600 500 700 450 650 550 400
C
o
r
r
e
n
t
e

(
A
U
)
600 500 700 450 650 550 400
C
o
r
r
e
n
t
e

(
A
U
)
600 500 700 450 650 550
(a) (b) (c)
Figura 5.6: Resposta espectral dos trs tipos de fotododos verticais de acordo com os
parmetros da tecnologia CMOS standard com n-well utilizada no fabrico.
(a) n-well / p-epilayer; (b) p+ / n-well; (c) n+ / p-epilayer [15].
5.3.2 Estrutura do fotododo
A resposta espectral de um fotododo ainda afectada pelas camadas dielctricas
da tecnologia CMOS, que podem estar presentes por cima da juno pn do fotododo.
Elas actuam como uma estrutura multicamada de filmes finos e influenciam a
transmitncia ptica para cada comprimento de onda independentemente. Ento, as
espessuras e as propriedades pticas dessas camadas devem ser estveis e bem
conhecidas, uma vez que a resposta espectral do fotododo depender dessas
caractersticas.
Na tecnologia CMOS standard utilizada existem 3 camadas dielctricas que se
encontram por cima da juno pn do fotododo. A Figura 5.7 apresenta a estrutura
bsica do fotododo. A espessura da camada n+ de 350 nm e a profundidade da
epilayer de 12 m, com uma concentrao de dopagem de 10
16
tomos/cm
3
[16]. A
espessura do primeiro xido (BPSG Boron Phosphor Silicate Glass) por cima do
dodo de 700 nm e a do segundo xido (SiO
2
) de 800 nm. A camada de passivao
de nitrato de silcio (Si
3
N
4
), usada para proteco, de 800 nm. Estes so os valores
nominais definidos pela fundio, os quais tm uma tolerncia de 10%. Uma vez que
tm que ser cumpridas as regras da tecnologia do processo CMOS standard, a estrutura
do caminho ptico restrita a combinaes dessas 3 camadas dielctricas. necessrio,
portanto, verificar o efeito dessas camadas.

113
1 xido
2 xido
Nitrato de
silcio
Substrato p
epilayer
n+ p+

Figura 5.7: Estrutura bsica do fotododo quando fabricado em tecnologia CMOS standard
com n-well e duplo metal.
5.3.3 Simulao da resposta espectral do fotododo com as camadas
dielctricas da tecnologia CMOS standard
A simulao da transmisso ptica para as combinaes das 3 camadas
dielctricas que se encontram por cima da juno pn do fotododo ilustra-se na
Figura 5.8. A simulao indica que quando no existe nenhuma camada, a interface
ar-silcio apresenta uma elevada perda em transmisso. Com uma camada de xido de
espessura de 700 nm (1 xido) a transmisso aumenta de 50% para 60% a 550 nm,
mas, por outro lado, introduz-se uma dependncia do comprimento de onda. Com uma
combinao de camadas anti-reflectoras poder-se-ia optimizar a transmitncia. Contudo,
esta soluo obrigaria a um ps-processamento adicional ao processo CMOS standard,
o que prejudicaria economicamente o microssistema. Em concluso, a melhor opo
neste processo de fabrico sem passos adicionais, seria retirar todas as camadas
dielctricas que se encontram por cima do fotododo. Ao nvel do projecto, este
procedimento realizado no desenho das mscaras que definem os contactos para os
dois metais, no sendo portanto necessrios, nem mscaras, nem passos adicionais ao
processo de fabrico standard.
0
20
40
60
80
100
400 450 500 550 600 650 700
T
r
a
n
s
m
i
t
n
c
i
a

(
%
)
Sem as camadas dielctricas
Com a camada do 1 xido
Com as camadas do 1 e 2 xidos
Com todas as camadas dielctricas

Figura 5.8: Simulao da resposta espectral das combinaes tpicas das camadas dielctricas
que se encontram por cima do fotododo.

114
5.4 Electrnica de leitura e de converso
Os fotodetectores produzem uma corrente elctrica proporcional intensidade da
luz por eles absorvida. desejvel integrar com os fotodetectores a electrnica de
leitura e de converso dessa corrente num sinal digital para posterior aquisio e
tratamento de dados. Um conversor luz frequncia produz a partir da corrente dos
fotodetectores um trem de impulsos com uma frequncia proporcional a essa
fotocorrente. A Figura 5.9 ilustra o princpio de funcionamento do conversor, para um
canal ptico (um fotododo).
B
S
1
C
j
C
Vdd
V
ref
I
fotododo V
comp
A
Controlo
-
+
Relgio
V
out

Figura 5.9: Diagrama de blocos do conversor luz frequncia para um canal ptico.
Com a tenso V
comp
menor que a tenso V
ref
a tenso de sada do comparador
V
out
, encontra-se num nvel lgico alto. Aps a sincronizao com um impulso de
relgio a chave S
1
comutada para a posio A o que fora o condensador C a ser
carregado com a tenso Vdd durante um perodo de relgio. Passado este tempo, liga-se
a chave S
1
na posio B, pelo que a tenso de sada do comparador comuta para o nvel
lgico baixo (Vdd > V
ref
). A fotocorrente descarrega ento o condensador C at que o
comparador detecte que a tenso V
comp
menor que a tenso V
ref
, altura em que V
out

regressa ao nvel lgico alto (ver Figura 5.10). O processo repete-se e a frequncia do
trem de impulsos gerado funo da variao da carga do condensador Q, que por sua
vez depende da corrente do fotododo I
fotododo
, sendo definida por,

Q
I
f
fotododo
impulsos de trem
= (5.8)
Na Figura 5.11 apresenta-se o diagrama de blocos do conversor luz frequncia
para os quatro canais pticos. O fotododo 1 mede a intensidade de luz que passa atravs
do reagente (sem biomolculas). O fotododo 2 mede a intensidade da luz que passa
atravs do fluido em anlise. O fotododo 3 fornece o valor da corrente de fuga. Para tal,

115
colocada uma camada de metal por cima da sua rea activa. O valor da corrente de
fuga pode ser subtrado ao valor das correntes dos fotododos de forma a desprezar esta
fonte de rudo. O fotododo 4 mede a intensidade de luz que passa atravs de um
calibrador de concentrao conhecida.
V
ref
Vdd
Vdd
t(s)
t(s)
V
comp
V
out

Figura 5.10: Formas de onda da tenso na entrada e na sada do comparador.
B
S
1
C
j
I
fotododo
I
fotododo
I
fotododo
I
fotododo
S
2a
S
2b
S
2c
S
2d
C
j
C
j
C
j
Fotododo 1
M
u
l
t
i
p
l
e
x
a
d
o
r
a
n
a
l
g
i
c
o
Fotododo 2
Fotododo 4
Fotododo 3
C
Vdd
V
ref
V
comp
V
out
A
Controlo
Lgica
Contador ou
microcontrolador
Dados para
um computador
Trem de
impulsos
-
+
Relgio

Figura 5.11: Esquema do conversor luz - frequncia para os quatro canais pticos.
O multiplexador analgico selecciona qual o fotododo a medir, atravs das
chaves S
2a
-S
2d
. Para o comparador, a melhor opo foi um comparador com relgio de
duas fases de elevada velocidade, com baixo offset e com um estgio de entrada
rail-to-rail. O relgio de duas fases sem sobreposio comum ao comparador e
chave analgica S
1
. possvel utilizar um contador digital que conta os impulsos de
sada do comparador durante um perodo de tempo fixo, produzindo assim os valores
digitais correspondentes s intensidades das fotocorrentes. Em alternativa, pode ser

116
utilizado um microcontrolador que para alm de substituir o contador permitiria gerar
toda a lgica de controlo e executar clculos adicionais. Os esquemas detalhados do
conversor luz frequncia encontram-se no Anexo IV.
5.5 Concluso
Neste captulo descreveu-se o funcionamento e implementao do fotodetector e
da electrnica de leitura e converso necessria para a converter o sinal analgico num
sinal digital para aquisio e processamento de dados. A tecnologia CMOS standard em
silcio foi a escolhida para o fabrico, devido sua disponibilidade e possibilidade de
integrar num nico chip o fotodetector e inmeras funes electrnicas. A escolha da
estrutura do fotodetector dependeu no s dos requisitos da aplicao mas tambm do
tipo especfico de tecnologia de silcio escolhida para o fabricar. De entre os
fotodetectores disponveis na tecnologia CMOS standard com n-well o fotododo
n+ / p-epilayer foi o escolhido pelo facto de possuir maior eficincia quntica nos
comprimentos de onda pretendidos (500 nm a 600 nm) e, face ao fototransstor vertical,
menor rudo por unidade de rea. A electrnica de leitura e de converso realizada
com um conversor luz - frequncia. Este conversor produz a partir da corrente dos
fotodetectores um trem de impulsos cuja frequncia proporcional corrente de
entrada. Esse sinal digital possibilita assim a aquisio e processamento de dados num
microcontrolador ou computador.
Bibliografia
[1] MONTEIRO, D. W. de Lima - CMOS-based integrated wavefront sensor. Delft
University Press, Delft, The Netherlands, 2002. Tese de Doutoramento.
[2] FOSSUM, E. [et al.] - A 256256 active pixel image sensor with motion
detection. ISSCC95 Technical Digest, 1995.
[3] DICKINSON, A. [et al.] - CMOS digital camera with parallel analog-to-digital
conversion architecture. IEEE Workshop on Charge Coupled Devices and
Advanced Image Sensors, April 1995.
[4] MOINI, A. - Vision Chips. Kluwer Academic Publishers, 2000.
[5] HENCHT, E. - ptica. Fundao Calouste Gulbenkian, Lisboa, 1991.

117
[6] FERREIRA, M. - ptica e fotnica. Lidel-edies tcnicas, Lisboa, 2003.
[7] FOWLER, B. - CMOS area image sensors with pixel level A/D conversion.
Standford University, Outubro, 1995. Tese de Doutoramento.
[8] SZE, S. M. - Physics of semiconductors devices. 2 ed., John Wiley & Sons, New
York (1981) p. 74-79.
[9] PHILIP, H. R.; TAFT, E. A - Optical constants of silicon in the region 1 to
10 eV. Physics Review. Vol. 120 (1960), p. 37-38.
[10] WOLFFENBUTTEL, R. F. - Silicon photodetectors with a selective spectral
response. Sensors Update. Vol. 9. BALTES, H.; HESSE, J.; KORVINK, J.
ed. lit. Wiley-VCH, (2001) p. 69-101.
[11] FUKUDA, M. - Optical Semiconductor Devices. John Wiley & Sons, New York,
1998.
[12] OLSSON, A. A. - Lightwave Systems With Optical Amplifiers. OSA/IEEE
Journal of Lightwave Technology. Vol. 7, n 7 (1989) p. 1071-1082.
[13] SANDAGE, R. W.; CONNELLY, J. - Producing phototransistors in a standard
digital CMOS technology. IEDM Technical Digest (1996), p. 369-372.
[14] MULLER, R. S.; KAMINS, T. I. - Device electronics for integrated circuits.
John Wiley & Sons, New York, 1986.
[15] ROCHA, J. G. - Microdetectores de silcio baseados em cintiladores para
radiografia digital. Universidade do Minho, Guimares (2003), p. 84-86. Tese
de Doutoramento.
[16] SCHOT, K.; WIND, D. - DIMOS01. TUDELFT, DIMES, 1995.

119
6

Fabrico do Microlab
Neste captulo descreve-se o fabrico dos trs mdulos que constituem o
Microlab: o sistema de microfluidos, o sistema de filtragem ptica e o sistema de
deteco e leitura. O fabrico implica uma srie de tarefas e desafios e a necessidade de
fazer escolhas sensatas, baseadas na avaliao das vantagens e desvantagens das
diferentes tecnologias. Incluem-se ainda os esquemas e as fotografias de cada mdulo e
uma fotografia do Microlab.
6.1 Sistema de microfluidos
O sistema de microfluidos composto por duas lamelas de vidro Corning 7059,
cada uma com 500 m de espessura. A primeira lamela tem os orifcios para a injeco
e a remoo dos fluidos dos canais e a segunda inclui os canais (Figura 6.1). O Microlab
contm basicamente trs canais. Um deles permite obter a linha de referncia. Outro
destina-se ao fluido a analisar e possui duas entradas e uma sada para permitir a mistura
do fluido com o reagente de forma automtica. Por fim, o terceiro canal necessrio
para calibrar a concentrao da biomolcula a medir (com um padro de concentrao
conhecida) e para calibrar a fonte de luz. Foi escolhido o vidro devido sua
transparncia ptica na zona visvel do espectro electromagntico e por ser um material
isolador. Esta ltima caracterstica permite usar o princpio da electroforese/electroos-
mose para mover os fluidos, evitando assim a construo de bombas ou vlvulas.
Relembre-se que, no presente trabalho, a mistura realizada por difuso, pelo que no
necessrio aplicar-se esse princpio.

120

Figura 6.1: Esquema do sistema de microfluidos.
Os orifcios e os canais so micromaquinados com uma mquina CNC
(Comando Numrico por Computador) no Departamento de Electrnica Industrial (DEI)
da UM (Figura 6.2) [1]. Foram utilizadas tcnicas de furao para construir os orifcios
e tcnicas de fresagem para construir os canais, com passivao SiO
2
para diminuir a
rugosidade. Seguidamente, as duas lamelas so coladas (Figura 6.3). A utilizao destas
tcnicas de fabrico levou a que o formato do canal misturador fosse em zig-zag e no
com curvas. Alm disso, o tamanho mnimo conseguido da fresa para vidro foi de
1 mm, pelo que a largura dos canais de 1 mm. Se se utilizasse polistireno os canais
apresentariam mais rugosidade o que prejudicaria a medio ptica. Analisando os prs
e contras o vidro parece ser a melhor opo, tendo em conta o processo de fabrico e a
aplicabilidade do Microlab.
(b)
(a)
(c)
(d)

Figura 6.2: (a) Fotografia da mquina CNC; (b) berbequim; (c) ampliao da zona da fresa no
berbequim; (d) fresa utilizada para vidro.
Fabrico do Microlab

121

Figura 6.3: Fotografia do sistema de microfluidos.
6.2 Sistema de filtragem ptica
6.2.1 Processo de deposio
Os filtros pticos baseados em filmes finos podem ser depositados por tcnicas
denominadas de PVD (Physical Vapor Deposition), tais como o sistema de
pulverizao catdica reactiva em magnetro (reactive magnetron sputtering) ou o
sistema de deposio por feixe de ies (IBD Ion Beam Deposition). O processo de
deposio deve ser monitorizado e controlado com bastante cuidado para se obterem
camadas com boa uniformidade e com uma espessura o mais aproximada possvel
pretendida.
Neste trabalho foi utilizado o sistema de deposio por feixe de ies do
INESC-MN, Lisboa, Portugal. O sistema compreende uma fonte de ies integrada com
um sistema de sputtering para pr-limpeza, a limpeza in-situ, o etching e a deposio
assistida. Esta ltima possibilita o fabrico de filmes finos de elevada qualidade. Esta
tcnica apresenta vantagens, nomeadamente: bom controlo das condies de deposio e
das taxas de deposio, o que possibilita uma boa uniformidade dos filmes e uma
espessura precisa; elevada adeso, baixa porosidade e baixos nveis de contaminao;
reduzidas tenses nos filmes (por ser uma tcnica fria). As deposies so realizadas a
partir de alvos de Ti e SiO
2
de elevada pureza (99.90% e 99.99%, respectivamente). A
uniformidade relativa da deposio de 2% numa rea de 10 cm
2
[2]. O equipamento
encontra-se numa sala limpa, juntamente com outros que permitem a caracterizao dos
filmes e que so imprescindveis para a determinao das constantes pticas a introduzir
no software de simulao dos filmes finos.

122
6.2.2 Configurao das mscaras
Na seco 4.8.3 foram descritas as espessuras das camadas para a construo da
matriz de 16 filtros pticos passa-banda com a estrutura de multicamadas de filmes
finos (tabela 4.5, seco 4.8.3). Concluiu-se ento que bastava variar a espessura da
camada 6 para se obterem os 16 filtros pticos. A Tabela 6.1 apresenta os valores das
diferentes espessuras, assim como o nmero do filtro ptico para posterior localizao
na matriz e o comprimento de onda para o qual cada filtro ptico apresenta o valor
mximo de transmitncia (que corresponde ao mximo de absorvncia da biomolcula
em anlise).
Tabela 6.1: Espessura da camada 6 de SiO
2
com o respectivo nmero do filtro ptico para
posterior localizao na matriz e o comprimento de onda do seu mximo de
transmitncia.
Nmero do filtro
ptico
Espessura da camada 6
de SiO
2
(nm)
Comprimento de onda do mximo
de transmitncia do filtro ptico (nm)
1 140 480
2 146 488
3 152 495
4 158 503
5 164 512
6 170 520
7 176 528
8 182 536
9 188 544
10 194 552
11 200 560
12 206 568
13 212 575
14 218 583
15 224 591
16 230 600
Na Figura 6.4 apresenta-se a localizao de cada filtro ptico na matriz. Os
filtros so fabricados com apenas 4 mscaras. A rea de cada filtro ptico depende da
rea dos fotodetectores (neste caso de 500 m 500 m). As espessuras das camadas
e a disposio de cada filtro ptico na matriz foram optimizadas para minimizar o
nmero de mscaras. A Figura 6.5 ilustra o esquema e a configurao das 4 mscaras
utilizadas na deposio da camada 6, assim como o tempo de deposio e a espessura
depositada. Note-se ainda que, se os filtros pticos forem depositados directamente
sobre o sistema de microfluidos, deve existir uma mscara adicional com a configurao
Fabrico do Microlab

123
do esquema da Figura 6.4 na deposio de todas as camadas, excepo da camada 6,
uma vez que esta possui mscaras especficas. As mscaras podem ser fabricadas por
litografia ou podem ser de alumnio. Na deposio por IBD a utilizao de mscaras de
alumnio permite que os 16 filtros pticos sejam fabricados sem a abertura da cmara de
deposio. O sistema possui uma espcie de gancho, de posio controlvel, pelo que
todas as mscaras podem ser realizadas num mesmo substrato de alumnio.
Nmero do filtro
10 9 13
6
14
2 1 5
7 3 4 8
15 11 12 16

Figura 6.4: Posio de cada filtro ptico na matriz.
1 mscara
Tempo =
Deposita 6 nm

t
3 mscara
Tempo = 4
Deposita 24 nm

t
2 mscara
Tempo = 2
Deposita 12 nm

t
4 mscara
Tempo = 8
Deposita 48 nm

t

Figura 6.5: As 4 mscaras utilizadas no processo de deposio da camada 6 de SiO
2
para os 16
filtros pticos construdos com multicamadas de filmes finos. Cada mscara
utilizada com tempos de deposio diferentes, de forma a depositar uma espessura
diferente de SiO
2
. As cruzes so marcas para o alinhamento das mscaras.
6.2.3 Sequncia de fabrico
O fabrico dos filtros pticos comea com a deposio de 45 nm de TiO
2
em toda
a matriz (camada 1). A Tabela 6.2 uma verso simplificada da Tabela 4.5 e especifica
as espessuras e os materiais de cada camada. Seguidamente depositam-se as camadas 2
a 5, novamente em toda a matriz. Posteriormente depositada uma camada com a
espessura de 140 nm de SiO
2
que corresponde espessura mnima da camada 6 (filtro
nmero 1). A Figura 6.6(a) ilustra o processo at esta fase. Em subsequentes passos de
deposio, para cada um dos quais utilizada uma mscara e tempos de deposio
diferentes (ver Figura 6.5), a espessura total da camada 6 de SiO
2
aumenta de 140 nm

124
para 230 nm em passos de 6 nm. Formam-se assim os 16 filtros pticos, cada um com
uma espessura diferente na camada 6.
Tabela 6.2: Materiais, espessura e sequncia de deposio de cada camada da matriz de 16
filtros pticos.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Camada Material
1 TiO
2
2 SiO
2
3 TiO
2
4 SiO
2
5 TiO
2
6 SiO
2
140 146 152 158 164 170 176 182 188 194 200 206 212 218 224 230
7 TiO
2
8 SiO
2
9 TiO
2
10 SiO
2
11
TiO
2
Nmero do Filtro
Espessura das Camadas (nm)
45
95
45
95
45
45
95
45
95
45

A Figura 6.6 ilustra o processo completo, o qual merece uma explicao
detalhada. Uma vez construda a estrutura da Figura 6.6(a), a mscara nmero 1
utilizada durante um intervalo de tempo de deposio t, para se depositar 6 nm e formar
a estrutura da Figura 6.6(b), na qual se observa 2 zonas de espessuras diferentes.
Seguidamente a mscara nmero 2 utilizada durante um intervalo de tempo de
deposio 2t, depositando-se 12 nm e formando a estrutura da Figura 6.6(c), na qual se
observa 4 zonas de espessuras diferentes. Ao aplicar-se a 3 mscara durante um
intervalo de tempo de deposio 4t, deposita-se 24 nm e forma-se a estrutura da
Figura 6.6(d), na qual se observa 8 zonas de espessuras diferentes. Por fim, utiliza-se a
mscara nmero 4 durante um intervalo de tempo de deposio 8t, depositando-se
48 nm, o que resulta na estrutura final da camada 6 dos 16 filtros pticos (Figura 6.6(e)).
Em concluso, com este processo formam-se 2
N
canais em que N o nmero de
mscaras que necessrio utilizar. Aps a total deposio da camada 6, so depositas as
camadas 7 a 11 com os materiais e espessuras referidas na Tabela 6.2 (Figura 6.6(f)).
O fabrico dos 16 filtros pticos requer apenas 4 mscaras e 15 deposies
(11 camadas mais 4 passos com 4 mscaras). Os filtros pticos podem ser afinados para
diferentes bandas espectrais apenas pelo ajuste da camada 6 (neste caso de SiO
2
), sem se
alterar a estrutura do Microlab. Se se pretendesse fabricar a estrutura multicamada
descrita na Tabela 4.6 e Figura 4.19, o processo seria bastante similar, necessitando de
igual modo de 4 mscaras e 15 deposies. No Anexo V descreve-se este processo.
Fabrico do Microlab

125
Da matriz de 16 filtros pticos apenas o nmero 3 (Tabela 6.2) foi fabricado.
Utilizou-se o mtodo IBD numa lamela separada de vidro Corning 7059.

146 nm 140 nm
(a) (b) 1 mscara
146 nm 140 nm
152 nm 158 nm
1
4
6

n
m
1
7
0

n
m
1
8
2

n
m
1
5
8

n
m
1
5
2

n
m
1
7
6

n
m
1
4
0

n
m
1
6
4

n
m

(c) 2 mscara (d) 3 mscara

(e) 4 mscara (f)
Figura 6.6: Sequncia de fabrico da matriz de 16 filtros pticos construdos com multicamadas
de filmes finos; (a) estrutura com as 5 primeiras camadas e a 6 camada com a
espessura mnima; (b) aplicando a 1 mscara, duas espessuras diferentes da
camada 6 so obtidas; (c) aplicando a 2 mscara, quatro espessuras diferentes da
camada 6 so obtidas; (d) aplicando a 3 mscara, oito espessuras diferentes da
camada 6 so obtidas; (e) aplicando a 4 mscara, as dezasseis espessuras
diferentes da camada 6 so obtidas; (f) estrutura global da matriz de 16 filtros
pticos. Por simplicidade, nas figuras b, c, d, e, ilustrou-se apenas a camada 6.

126
Na construo de uma estrutura multicamada de filmes finos, o apuramento das
taxas de deposio de cada material um processo demorado e iterativo. Um dos
problemas que surgiu merece especial destaque. Atravs da deposio de uma
monocamada de TiO
2
e outra de SiO
2
e aps a medio das espessuras e respectivos
ndices de refraco, procedeu-se realizao de duas multicamadas (filtros nmeros 3 e
8). Contudo, constatou-se atravs de medies no profilmetro e medies pticas, que
a espessura total tinha apenas 56% do valor pretendido. Verificou-se que o problema
residia na deposio do TiO
2
que fazia a corroso das camadas j depositadas. Foi por
isso necessrio alterar os parmetros de controlo da deposio e medir a espessura e as
caractersticas pticas da estrutura no final de cada deposio (11 vezes, neste caso),
para se apurarem as novas taxas de deposio. O processo de caracterizao de um
material pois demorado e dispendioso.
6.3 Sistema de deteco e leitura
Os fotodetectores em CMOS e a electrnica de leitura foram fabricados na
fundio do DIMES (Delft Institute for MicroElectronics and Sub-micron Technology),
Delft, Holanda, segundo a tecnologia CMOS standard com n-well, de duplo metal, de
uma camada de polisilcio e de 1.6 m de largura de canal [3]. Cada fotodetector
(fotododo) tem uma rea activa de 500 m 500 m. Neste processo de fabrico
existem 3 camadas dielctricas que se encontram por cima da juno pn do fotododo
(Figura 6.7). Uma vez que tm que ser cumpridas as regras da tecnologia CMOS
standard, a estrutura do caminho ptico restrita a combinaes dessas 3 camadas.
1 xido
2 xido
Nitrato de
silcio
Substrato p
epilayer
n+ p+

Figura 6.7: Vista em corte da estrutura bsica do fotodetector da tecnologia CMOS standard.
Foram fabricados fotododos, na mesma sequncia de fabrico, todos de igual
dimenso e formato, mas com as diferentes combinaes possveis dessas 3 camadas
dielctricas. Verificou-se que a remoo do primeiro xido causa bolhas na rea activa
do fotododo (Figura 6.8). Essa rugosidade aleatria na superfcie interfere, tambm
Fabrico do Microlab

127
aleatoriamente, na fotocorrente do fotododo. Na Figura 6.9 pode observar-se que a
remoo das camadas dielctricas que se encontram sobre o fotododo provoca a
corroso na camada adjacente inferior. No caso da remoo do 1 xido, a juno pn
pode ser afectada. Deste modo, usando a tecnologia CMOS standard disponvel, o
primeiro xido deve ser mantido. Assim, a melhor estrutura para os fotododos
pretendidos a que se apresenta na Figura 6.10. Aps o fabrico do fotododo, mediu-se
no SEM uma espessura de 650 nm para o 1 xido. Foi tambm fabricado mais um
fotododo, com metal sob a rea activa, para fornecer a corrente de fuga. Na Figura 6.11
apresenta-se uma fotografia ampliada desse fotododo e de um dos fotododos do canal
ptico. O sistema de deteco e electrnica de leitura foi encapsulado num chip Dil 40
e apresenta-se na Figura 6.12.

Figura 6.8: A fotografia tirada no SEM do fotododo CMOS sem o 1 xido ilustra a
rugosidade aleatria da superfcie.
Substrato
Si
p
1 xido
BPSG
2 xido
SiO
2
Passivao
Si N
3 4
5 nm
75 nm
125 nm

Figura 6.9: Espessura da corroso das 3 camadas dielctricas que se encontram por cima da
juno pn do fotododo, na tecnologia CMOS standard disponvel no DIMES.

128
Ctodo
1 xido
2 xido
nodo
Nitrato de
silcio
epilayer
n+ p+
Substrato p

Figura 6.10: Vista em corte da estrutura do fotodetector fabricado. A espessura efectiva do 1
xido de 650 nm.
A
Comparador
B

Figura 6.11: Fotografia ampliada de um fotododo (A) e do fotododo que fornece a corrente de
fuga (B). Acima dos fotododos encontra-se alguma da electrnica de leitura.

Figura 6.12: Fotografia do sistema de deteco e electrnica de leitura.
Fabrico do Microlab

129
6.4 Sistema completo
O Microlab um dispositivo modular e apresenta-se na Figura 6.13, onde se
reala a zona de medio. Aps o encapsulamento, num chip, do sistema de deteco e
electrnica de leitura, o sistema de microfluidos foi colado por cima desse chip. Os
canais foram alinhados com os fotodetectores. O filtro ptico encontra-se pousado sobre
o sistema de microfluidos. A lamela na qual foi fabricado tem 2.5 cm de lado e uma
ligeira colorao rosa acastanhada (invisvel na fotografia).

Figura 6.13: O Microlab.
6.5 Concluso
O Microlab um dispositivo composto por trs mdulos: o sistema de
microfluidos, micromaquinado em vidro por tcnicas de fresagem e furao; o sistema
de filtragem ptica construdo por um mtodo de deposio por IBD; o sistema de
deteco e electrnica de leitura, fabricado em tecnologia CMOS standard. Neste
captulo foi descrito o processo, tecnologia e local de fabrico de cada mdulo,
recorrendo a esquemas ilustrativos quando necessrio, assim como as limitaes e
vantagens associadas a cada processo. Foram ainda apresentadas fotografias dos vrios
mdulos e do dispositivo global.

130
Bibliografia
[1] http://www.dei.uminho.pt.
[2] http://www.inesc-mn.pt/list_equip.htm.
[3] SCHOT, K.; WIND, D. - DIMOS01. TUDELFT, DIMES, 1995.

131
7

Resultados experimentais
Neste captulo as experincias e os resultados obtidos atravs de medies
pticas e elctricas, quer nos vrios blocos do Microlab, quer no Microlab completo, so
apresentados e discutidos. tambm descrita a instalao experimental utilizada nas
medies.
Numa fase inicial pretende-se provar, utilizando equipamentos de medida
convencionais, que a utilizao de volumes de ensaio da ordem das dezenas de
microlitros no influenciam a resposta do mtodo de medida, e portanto no invalidaro
a utilizao do Microlab. Em seguida apresenta-se e discute-se os resultados obtidos em
cada bloco do Microlab. Por fim demonstra-se a aplicao do Microlab na determinao
quantitativa de cido rico na urina.
7.1 Deteco da concentrao de biomolculas em pequenos volumes
de urina
Nesta seco pretende-se mostrar que os procedimentos utilizados para a
determinao da concentrao de biomolculas na urina podem ser realizados no
Microlab com o mesmo desempenho, preciso, fiabilidade e sensibilidade dos mtodos
existentes, actualmente, nos laboratrios de anlises clnicas. Para tal, necessrio
verificar se a utilizao de volumes de ensaio da ordem das dezenas de microlitros no
influncia a sensibilidade, a linearidade, a repetitividade e a reprodutibilidade do
mtodo de deteco colorimtrica por absoro ptica. Para alm disso, as medies
apresentadas so tambm necessrias para determinar a relao entre a concentrao da

132
biomolcula a analisar e a intensidade da luz absorvida ou transmitida pela mistura e
para determinar a curva de calibrao para cada biomolcula.
7.1.1 Mtodo utilizado e equipamentos de medida
Existem vrios ensaios por deteco colorimtrica para a quantificao da
protena total e cido rico na urina, comercializados sob a forma de kits. Os kits de
diagnstico escolhidos (contendo padres, reagentes e calibradores) so comercializados
pela Sigma-Aldrich Diagnostics
. Nestes kits so utilizados reagentes para que os

cromforos de cada biomolcula absorvam o mximo da luz na gama visvel (princpio
da deteco colorimtrica). O volume de ensaio especificado nos seus protocolos de
1 ml. O mtodo utilizado baseia-se no aumento da absorvncia mxima para um
determinado comprimento de onda, que ocorre aps a ligao do reagente s
biomolculas a analisar. Esse aumento directamente proporcional concentrao da
biomolcula, e traduz-se no aumento da intensidade da cor produzida pela mistura. A
maior vantagem deste mtodo que os reagentes utilizados permitem que a cor obtida
seja estvel por um perodo de tempo suficiente para uma correcta leitura ptica
(geralmente mais de 1 minuto). Alm disso, interferncias de outras biomolculas
diferentes daquelas para a qual ele foi desenvolvido so praticamente desprezveis, uma
vez que para cada biomolcula a analisar existe um reagente especfico.
Toda a preparao das amostras e as medies efectuadas apresentadas nas duas
prximas seces foram realizadas no laboratrio do Departamento de Biologia da UM.
Utilizaram-se padres da biomolcula a analisar, volumes de soluo de 15 l a 250 l e
lamelas com poos de 1 mm de caminho ptico. Foi estudada a linearidade, a variao
com a temperatura, a repetitividade e a reprodutibilidade, atravs de vrias medies da
absorvncia para o comprimento de onda ao qual a biomolcula a analisar tem o seu
mximo de absorvncia. As medies foram efectuadas num espectrofotmetro da
Molecular Devices modelo SPECTRAmax.
Foi necessrio efectuar, paralelamente, medies espectrofotomtricas por
absoro ptica varrendo a gama de luz visvel, para determinar a relao entre a
concentrao da biomolcula a analisar e a intensidade da luz absorvida ou transmitida
pela mistura nessa gama espectral. Tal relao permite determinar o comprimento de
onda efectivo do mximo de absorvncia, o que importante para o projecto do sistema
de filtragem ptica. Essas medies foram efectuadas no laboratrio do Departamento
de Fsica da UM, utilizando para tal, um espectrofotmetro da SHIMADZU modelo

133
UV-3101PC com uma cuvete de 1 mm de caminho ptico, contendo 100 l de volume
de soluo e utilizando padres da biomolcula a analisar. Para cada concentrao da
biomolcula em anlise foram efectuadas 6 medies sucessivas num mesmo ensaio e 6
ensaios diferentes. O espectro de absorvncia apresentado com os resultados nas seces
7.1.4 e 7.1.5 utiliza o valor mdio dessas medies.
Os dados dos grficos das curvas de calibrao apresentados ao longo deste
captulo, foram analisados atravs de tcnicas analticas de regresso. A expresso da
tendncia desses dados (equao da curva) assim como o quadrado do coeficiente de
correlao (CR) foram colocados nos grficos das curvas de calibrao. O CR reflecte a
extenso de uma relao linear entre dois conjuntos de dados. adimensional, o seu
valor varia entre -1.0 e 1.0 e dado por,

( ) ( )( )
( ) [ ] ( ) [ ]
2 2 2 2
Y Y n X X n
X X XY n
CR

= (7.1)
onde X e Y so o conjunto de dados e n o nmero de dados.
7.1.2 Teste da protena total
O kit de diagnstico utilizado para determinar quantitativamente a protena total
na urina o Microprotein-PR, procedure n. 611 [1]. Este procedimento simples, no
corrosivo e especfico para determinar baixas concentraes de protena (em
particular, protena na urina). O seu funcionamento baseia-se no aumento da
absorvncia a 595 nm que ocorre quando o complexo vermelho de pirogalol - molibdato
ligado aos grupos de aminocidos bsicos das molculas de protena. Este mtodo no
especfico de nenhuma protena em particular. Contudo, o padro de protena total por
ele utilizado constitudo somente por albumina. O aumento na absorvncia a 595 nm
directamente proporcional concentrao de protenas na amostra. No procedimento
recomendado pelo fabricante deve utilizar-se uma razo de 1 de branco/amostra/padro
para 50 de reagente, incubar a mistura durante 3 minutos e ler a absorvncia a 595 nm (o
valor estvel durante 15 minutos). O valor da absorvncia decresce com o aumento da
temperatura dentro do intervalo de 12 C a 25 C, mas no se altera no intervalo de
25 C a 37 C.
O estudo prtico da linearidade, da sensibilidade, da repetitividade e da
reprodutibilidade para concentraes de 1 mg/dl a 300 mg/dl (compreendendo a gama
de valores normais e anormais na urina humana) com volumes de ensaio de 15 l a

134
250 l encontra-se descrito com detalhe em [2]. Do estudo resultam as seguintes
concluses:
1 - O mtodo produz resultados lineares para concentraes entre 1 mg/dl e
200 mg/dl, como se pode constatar atravs do grfico da curva de calibrao da
Figura 7.1 (no Anexo I descreve-se o procedimento para a obteno de uma
curva de calibrao).
2 - Um incremento de 1 mg/dl na concentrao de protena corresponde a uma
alterao no valor da absorvncia de 0.0002.
3 - Os coeficientes de variao da repetitividade e reprodutibilidade para 10
medies e 10 ensaios diferentes so menores que 9.0%.
4 - A reduo do volume de ensaio no influenciou a linearidade da resposta, a
sensibilidade, ou os coeficientes de variao da repetitividade e reprodutibili-
dade, uma vez que todos os valores obtidos experimentalmente encontram-se
dentro dos valores definidos pelo mtodo, (tais valores podem ser consultados
em [1, 3, 4]).
ABS = 0.0002C - 0.0002
CR
2
= 0.9992
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
0.035
0.040
0.045
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Concentrao (mg/dl)
A
b
s
o
r
v
n
c
i
a

a

5
9
5

n
m

(
A
U
)

Figura 7.1: Curva de calibrao para diferentes concentraes de albumina depois de reagir
com o reagente Microprotein-PR. Valores obtidos com 1 mm de caminho ptico.
7.1.3 Teste do cido rico
O kit de diagnstico utilizado para determinar quantitativamente o cido rico na
urina o Infinity
TM
uric acid reagent, procedure n. 684. As reaces envolvidas no
ensaio so as seguintes [1]:
(1) O cido rico oxidado (formando alantona) na presena de uricase para produzir
o perxido de hidrognio (H
2
O
2
):

135

2 2 2
URICASE
2 2
O H CO Alantona O H O rico cido + + + + (7.2)
(2) o perxido de hidrognio gerado reage com a 4-aminoantipirina (4-AAP) e com o
TBHB (cido 2,4,6-tribromo-3-hidroxi benzico) na presena da peroxidase para
produzir a quinoneimina (composto corado):
O H na Quinoneimi TBHB AAP - 4 O H
2
PEROXIDASE
2 2
+ + + (7.3)
O funcionamento deste mtodo colorimtrico baseia-se no aumento da
absorvncia a 495 nm quando o reagente misturado com as molculas de cido rico.
Esse aumento directamente proporcional concentrao de cido rico na amostra. No
procedimento recomendado pelo fabricante deve utilizar-se uma razo de 1 de
branco/amostra/padro para 50 de reagente, incubar a mistura durante 5 minutos a 37 C
(pode ser utilizada a temperatura ambiente mas o tempo de incubao maior, 10
minutos) e ler a absorvncia a 495 nm (este valor estvel durante 15 minutos). Estudos
da influncia de algumas das principais biomolculas encontradas na urina na
determinao do cido rico foram efectuados por Young [5], que publicou uma lista de
biomolculas que interferem com o ensaio. A bilirrubina (livre e conjugada), cistena,
glucose, hemoglobina e sdio no interferem significativamente com o procedimento
analtico. Existe apenas interferncia para elevadas concentraes de hemoglobina
(> 200 mg/dl) e bilirrubina (> 8 mg/dl para a bilirrubina livre e > 12 mg/dl para a
bilirrubina conjugada).
O estudo prtico da linearidade, da sensibilidade, da repetitividade e da
reprodutibilidade para concentraes desde 5 mg/dl a 120 mg/dl (compreendendo a
gama de valores normais e anormais na urina humana) com volumes de ensaio desde
15 l a 250 l pode ser consultado em [2]. Do estudo resultam as seguintes concluses:
1 - O mtodo produz resultados lineares para concentraes de 5 mg/dl a 30 mg/dl;
para concentraes superiores necessrio diluir a amostra e multiplicar o
resultado da anlise pelo factor de diluio, ou utilizar mtodos de regresso no
lineares para o clculo do valor da concentrao (Figura 7.2(a)); o grfico da
curva de calibrao da Figura 7.2(b) ilustra a caracterstica linear.
2 - Um incremento de 1 mg/dl na concentrao de protena corresponde a uma
variao no valor da absorvncia de 0.0037 (zona linear).
3 - Os coeficientes de variao da repetitividade e reprodutibilidade para 10
medies e 10 ensaios diferentes so menores que 6.0%.

136
4 - A reduo do volume de ensaio no influenciou a linearidade da resposta, a
sensibilidade, ou os coeficientes de variao da repetitividade e reprodutibili-
dade, uma vez que todos os valores obtidos experimentalmente encontram-se
dentro dos valores definidos pelo mtodo (tais valores podem ser consultados
em [1, 6]).

(a)
ABS = -7E-06C
2
+ 0.0034C + 0.0064
CR
2
= 0.9976
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0 20 40 60 80 100 120
Concentrao (mg/dl)
A
b
s
o
r
v
n
c
i
a

a

4
9
5

n
m

(
A
U
)

(b)
ABS = 0.0037C + 0.0009
CR
2
= 0.9996
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0 5 10 15 20 25 30
Concentrao (mg/dl)
A
b
s
o
r
v
n
c
i
a

a

4
9
5

n
m

(
A
U
)

Figura 7.2: Curva de calibrao para diferentes concentraes de cido rico depois de reagir
com o reagente de Infinity
TM
uric acid reagent. Valores obtidos com 1 mm de
caminho ptico. (a) concentraes de 5 mg/dl a 120 mg/dl; (b) ampliao da zona
linear, concentraes de 5 mg/dl a 30 mg/dl.
7.1.4 Espectro de absorvncia da protena total
A Figura 7.3 apresenta o espectro de absorvncia para diferentes concentraes
de albumina. Os resultados foram obtidos temperatura de 25 C, com padres de

137
albumina com concentraes de 3 mg/dl a 100 mg/dl, compreendendo os valores
normais e anormais na urina (valor normal 15 mg/dl). Da Figura 7.3 conclui-se que:
1 - medida que a concentrao de albumina decresce o valor da absorvncia
tambm decresce.
2 - O maior desvio na absorvncia entre concentraes consecutivas observa-se a
595 nm.
3 - O espectro de absorvncia tem uma FWHM aproximadamente de 90 nm
(FWHM foi definido em 4.7.1).
A 460 nm o espectro de absorvncia mostra tambm diferentes valores de
absorvncia para as diferentes concentraes de albumina. Contudo, a diferena de
valores da absorvncia entre concentraes sucessivas menor. Mais concretamente, a
sensibilidade metade da obtida a 595 nm.
-0.012
-0.008
-0.004
0.000
0.004
0.008
0.012
0.016
0.020
400 450 500 550 600 650 700
A
b
s
o
r
v
n
c
i
a

(
A
U
)
595

Figura 7.3: Espectro de absoro para diferentes concentraes de albumina depois de reagir
com o reagente Microprotein-PR. Da curva superior para a curva inferior:
100 mg/dl, 50 mg/dl, 30 mg/dl, 15 mg/dl, 7.5 mg/dl, 3 mg/dl.
7.1.5 Espectro de absorvncia do cido rico
A Figura 7.4 apresenta o espectro de absorvncia para diferentes concentraes
de cido rico. Os valores obtidos foram medidos temperatura de 25 C, com
padres de cido rico com concentraes de 5 mg/dl a 120 mg/dl, compreendendo a
gama de valores normais e anormais na urina (8 mg/dl a 67 mg/dl). Do espectro de
absorvncia conclui-se que:
1 - medida que a concentrao de cido rico decresce o valor da absorvncia
tambm decresce.

138
2 - O maior desvio na absorvncia entre concentraes consecutivas observa-se a
495 nm.
3 - O espectro de absorvncia tem uma FWHM aproximadamente de 90 nm.
O espectro de absorvncia do cido rico apresenta a 360 nm uma zona na qual
se verifica um desvio do valor de absorvncia para diferentes concentraes [7].
Contudo, para esse comprimento de onda, a diferena no valor de absorvncia entre
concentraes sucessivas trs vezes menor, quando comparado com o obtido a
495 nm.
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
400 450 500 550 600 650 700
A
b
s
o
r
v
n
c
i
a

(
A
U
)
495

Figura 7.4: Espectro de absoro para diferentes concentraes de cido rico depois de reagir
com o reagente Infinity
TM
uric acid reagent. Da curva superior para a curva
inferior: 120 mg/dl, 80 mg/dl, 60 mg/dl, 40 mg/dl, 30 mg/dl, 20 mg/dl, 15 mg/dl,
10 mg/dl, 5 mg/dl.
7.2 Instalao experimental
As fotografias das Figura 7.5 a 7.7 documentam o arranjo experimental
utilizado. Como fonte de luz utilizou-se uma lmpada de 250 W de
quartzo/tungstnio/halogneo (cuja irradincia espectral indicada na Figura 7.8(a)),
com um monocromador da ORIEL modelo Cornerstone 130
TM
(com uma grelha de
1200 l/mm, uma resoluo espectral de 0.5 nm e uma disperso espectral de 6.6 nm/m a
350 nm). Ao monocromador foi conectada uma fibra ptica para direccionar a sua luz
para o interior das caixas de medio. A resposta espectral da fibra ptica encontra-se na
Figura 7.8(b) [8]. Dois picoampermetros da KEITHLEY modelo 487 e 6487 (com uma
gama de fim de escala de 10 fA a 2 mA e uma resoluo de 5 dgitos e meio) foram
utilizados na medio das caractersticas espectrais do filtro ptico e das caractersticas

139
elctricas e responsividade espectral dos fotododos fabricados. Os fotododos foram
calibrados utilizando como referncia um fotododo comercial da Hamamatsu, modelo
S1336-5BQ (ver Figura 7.7).
Monocromador
Fibra
ptica
Caixa para medies
no Microlab
Caixa com fotododo
da Hamamatsu
Picoampermetros
Fonte de luz

Figura 7.5: Fotografia da instalao para as medies experimentais.
Fibra ptica

Figura 7.6: Fotografia do interior da caixa para as medies no Microlab e ampliao da zona
de medio do Microlab.

140

Fibra ptica

Figura 7.7: Fotografia da caixa com o fotododo da Hamamatsu e ampliao deste.

(a) (b)
Figura 7.8: (a) Irradincia espectral em funo do comprimento de onda para a lmpada
utilizada nas medies (curva com a referncia 6334); (b) Transmitncia em
funo do comprimento de onda para a fibra ptica utilizada nas medies (curva
com a referncia standard grade fused slica). Estes grficos foram retirados do
manual do fabricante - ORIEL [8].
Tanto o monocromador como os picoampermetros foram ligados a um
computador para controlo e recolha dos dados. A ligao efectuada atravs de uma
interface GPIB. A interface grfica com o utilizador foi desenvolvida num software
denominado de testpoint e relativamente fcil de usar. Na Figura 7.9 apresenta-se o
seu aspecto. Os picos que aparecem no grfico (corrente medida nos dodos) devem-se
ao espectro do conjunto lmpada e fibra ptica (ver Figura 7.8), concluindo-se assim,
que a intensidade da luz do conjunto no igual para todos os comprimentos de onda.

141

Figura 7.9: Interface grfica na medio simultnea de dois fotododos.
7.3 Sistema de filtragem ptica
Na Figura 7.10 apresenta-se o espectro de transmisso do filtro ptico fabricado.
Como de pode observar o seu desempenho est aqum do simulado. O centro do pico
encontra-se em 480 nm (o pretendido era 495 nm) e a FWHM de 18 nm (o pretendido
era de 6 nm). Estes desvios devem-se, em primeiro lugar, ao facto de o ndice de
refraco efectivo do TiO
2
ser ligeiramente diferente do utilizado nas simulaes, uma
vez que foram alterados os parmetros de controlo para se obterem taxas de deposio
mais elevadas. Em segundo lugar, a espessura total das 11 camadas deste filtro de 92%
da pretendida. Contudo, ao se introduzir o decrscimo da espessura total da estrutura
multicamada e o ndice de refraco real (medido no elipsmetro), obtm-se uma
resposta espectral similar medida. Daqui se conclui que, efectivamente, so
necessrias vrias iteraes para o apuramento preciso das taxas de deposio e
respectivos ndices de refraco. Conclui-se ainda que basta um pequeno desvio, quer na

142
espessura das camadas, quer no valor do ndice de refraco, para a resposta espectral
ficar alterada. Numa fase inicial foram fabricados dois filtros multicamadas (filtros
nmeros 3 e 8, ver Tabela 6.2). Os seus espectros apresentam-se, apenas por
curiosidade, na Figura 7.11. Este exemplo ilustra o problema que surgiu, inicialmente,
na deposio do TiO
2
(a corroso das camadas j depositadas, ver seco 6.2.3). Este
problema originou que a espessura total da estrutura multicamada fosse 56% do valor
pretendido (da os 60% a 70% de transmitncia fora da banda passante). Contudo, a
Figura 7.11 permite concluir que variando a espessura da camada 6 desvia-se a banda
espectral de transmisso para outros comprimentos de onda.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
400 450 500 550 600 650 700
T
r
a
n
s
m
i
t
n
c
i
a

(
%
)

Figura 7.10: Espectro de transmisso do filtro ptico fabricado. O grfico mostra os valores
medidos em relao a uma lamela de vidro sem filtro. Ambos foram medidos com
o fotododo comercial.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
400 450 500 550 600 650 700
T
r
a
n
s
m
i
t
n
c
i
a

(
%
)
Filtro 3
Filtro 8

Figura 7.11: Espectro de transmisso dos dois filtros, nmeros 3 e 8, fabricados inicialmente. A
espessura total de 56% da pretendida. O grfico mostra os valores medidos em
relao a uma lamela de vidro sem filtro. Ambos foram medidos com o fotododo
comercial.

143
7.4 Sistema de deteco e leitura
O sistema de deteco e leitura inclui um detector ptico e a electrnica de
leitura dos resultados. Esta realiza a converso do sinal analgico do fotodetector num
sinal digital, para posterior aquisio e tratamento dos dados. Ambos foram fabricados
no mesmo processo CMOS standard. Seguidamente apresentam-se os resultados
obtidos para o desempenho dos vrios fotodetectores fabricados, assim como da
electrnica de leitura.
7.4.1 Fotodetectores
A Figura 7.12 apresenta as caractersticas espectrais do fotododo comercial
calibrado da Hamamatsu S1336-5BQ (utilizando a instalao experimental descrita na
Figura 7.7). A caracterstica da corrente do fotododo em funo do comprimento de
onda foi obtida sem polarizar o dispositivo e colocando sobre a sua rea activa uma
chapa com um furo de 500 m de dimetro, normalmente denominada de pinhole.
Este procedimento necessrio para posterior comparao e calibrao dos fotododos
fabricados (relembre-se que estes tm uma rea activa de 500 m 500 m). A curva da
responsividade, fornecida pelo fabricante (Figura 7.12(b)) permite obter, atravs de
= I/P
incidente
, o espectro da luz incidente nos fotododos (Figura 7.12(c)), permitindo
assim calibrar os fotododos fabricados. As especificaes tcnicas deste fotododo
encontram-se no Anexo VI.
As medies para obter o desempenho dos fotododos fabricados foram
efectuadas com um pinhole de 500 m de dimetro sobre os dispositivos e utilizando o
fotododo comercial da Hamamatsu como referncia.

(a)
0.0E+00
1.5E-08
3.0E-08
4.5E-08
6.0E-08
7.5E-08
9.0E-08
1.1E-07
400 450 500 550 600 650 700
I

(
A
)


144

(b)
0
50
100
150
200
250
300
350
400
400 450 500 550 600 650 700
R
e
s
p
o
n
s
i
v
i
d
a
d
e

(
m
A
/
W
)

(c)
0.0E+00
5.0E-08
1.0E-07
1.5E-07
2.0E-07
2.5E-07
3.0E-07
3.5E-07
400 450 500 550 600 650 700
P
i
n
c
i
d
e
n
t
e

(
W
)

Figura 7.12: Caractersticas espectrais do fotododo comercial calibrado da Hamamatsu;
(a) corrente em funo do comprimento de onda, medida sem polarizar o fotododo
e com um pinhole de 500 m; (b) curva da responsividade fornecida pelo fabri-
cante [9]; (c) potncia incidente no fotododo em funo do comprimento de onda.
A Figura 7.13 ilustra a corrente medida, sem polarizao, nos trs tipos de
fotododos verticais permitidos no processo CMOS standard com n-well:
n-well / p-epilayer, p+ / n-well e n+ / p-epilayer. Estes fotododos tm apenas o 1 xido
sobre a juno pn (ver seco 6.3). A responsividade e eficincia quntica de cada
fotododo encontram-se na Figura 7.14 e Figura 7.15, respectivamente. A eficincia
quntica foi calculada a partir da responsividade e utilizando a expresso (5.4). Dos
grficos obtidos conclui-se que para a gama espectral pretendida para este trabalho
(500 nm a 600 nm), o fotododo que melhor se adapta o n+ / p-epilayer,
confirmando-se assim as simulaes obtidas.

145
0.0E+00
1.5E-08
3.0E-08
4.5E-08
6.0E-08
7.5E-08
9.0E-08
1.1E-07
400 450 500 550 600 650 700
C
o
r
r
e
n
t
e

(
A
)
(a) n-well / p-epilayer
(b) p+ / n-well
(c) n+ / p-epilayer
(c)
(b)
(a)

Figura 7.13: Corrente de cada fotododo em funo do comprimento de onda. Os valores foram
obtidos sem polarizar o fotododo e com um pinhole de 500 m.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
400 450 500 550 600 650 700
R
e
s
p
o
n
s
i
v
i
d
a
d
e

(
m
A
/
W
)
(b) p+ / n-well
(c) n+ / p-epilayer
(c)
(b)
(a)
= 633 nm

Figura 7.14: Responsividade de cada fotododo, calculada a partir da corrente medida e tendo
como referncia o fotododo comercial calibrado da Hamamatsu.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
400 450 500 550 600 650 700
E
f
i
c
i
n
c
i
a

Q
u
n
t
i
c
a

(
%
)
(b) p+ / n-well
(c) n+ / p-epilayer
(c)
(b)
(a)
= 633 nm

Figura 7.15: Eficincia quntica de cada fotododo, calculada a partir da expresso (5.4).

146
Uma vez que estava disponvel um LASER com = 633 nm e com uma
potncia incidente de 5W constante e precisa, foram efectuadas as mesmas medies
anteriores nos mesmos fotododos e em mais trs fotododos do mesmo tipo mas com as
trs camadas dielctricas sobre a juno pn (utilizando um pinhole igual em todos os
fotododos). A Tabela 7.1 apresenta os valores obtidos. Dela se conclui que, para
= 633 nm, o fotododo n-well / p-epilayer o que apresenta melhor desempenho
(devido sua juno ser mais profunda), seguido do fotododo n+ / p-epilayer e por fim
o fotododo p+ / n-well, tal como esperado. Conclui-se ainda que as trs camadas
dielctricas sobre a juno pn permitem uma maior eficincia quntica para esse
comprimento de onda, tal como previsto pela simulao da Figura 5.8, seco 5.3.3.
Contudo, essas camadas introduzem uma dependncia do comprimento de onda,
conforme se verifica pela Figura 7.16.
Tabela 7.1: Valores medidos da corrente e clculo da responsividade e eficincia quntica dos
3 tipos de fotododos verticais da Figura 5.1 para = 633 nm e P
incidente
= 5 W e
constante: (a) fotododo n-well / p-epilayer; (b) fotododo p+ / n-well e
(c) fotododo n+ / p-epilayer.
Com 1 xido Com as 3 camadas dielctricas
Tipo de fotododo (a) (b) (c) (a) (b) (c)
I (A) 1.70 0.49 1.62 1.87 0.62 1.73
(mA/W) 341 97 324 374 123 345
(%) 67 19 63 73 24 68
Na Figura 7.16 est representada a corrente em funo do comprimento de onda
dos fotododos n+ / p-epilayer (fotododo do prottipo), um deles contendo apenas o 1
xido e o outro as trs camadas dielctricas por cima da juno pn. Na Figura 7.17 e
Figura 7.18 representam-se a responsividade e a eficincia quntica dos fotododos. As
camadas de xido influenciam a resposta espectral dos fotododos influenciando assim a
quantidade de luz que chega superfcie do silcio e, consequentemente, a sua eficincia
quntica. Conforme se verifica pelos grficos apresentados, o fotododo com as trs
camadas dielctricas possui picos adicionais causados por essas camadas (tal como
previsto pela simulao da Figura 5.8). Devido tolerncia da espessura das trs
camadas de xido, os picos desviam-se um pouco do simulado.

147
0.0E+00
1.5E-08
3.0E-08
4.5E-08
6.0E-08
7.5E-08
9.0E-08
1.1E-07
400 450 500 550 600 650 700
C
o
r
r
e
n
t
e

(
A
)
Com o 1 xido
Com as 3 camadas dielctricas
= 633 nm

Figura 7.16 Corrente, em funo do comprimento de onda, dos fotododos n+ / p-epilayer com
o 1 xido e com as trs camadas dielctricas por cima da juno pn. Valores
medidos sem polarizar os fotododos.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
400 450 500 550 600 650 700
R
e
s
p
o
n
s
i
v
i
d
a
d
e

(
m
A
/
W
)
Com o 1 xido
= 633 nm

Figura 7.17: Responsividade dos fotododos medidos na Figura 7.16.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
400 450 500 550 600 650 700
E
f
i
c
i
n
c
i
a

Q
u
n
t
i
c
a

(
%
)
Com o 1 xido
= 633 nm

Figura 7.18: Eficincia quntica dos fotododos medidos na Figura 7.16.

148
A corrente de fuga para vrias tenses inversas dos fotododos n+ / p-epilayer
com o 1 xido e com as 3 camadas dielctricas apresenta-se na Figura 7.19. Sem
polarizao, o fotododo com o 1 xido possui uma corrente de fuga de 0.27 pA
enquanto que, para o outro, essa corrente de 0.63 pA.
0.0E+00
1.0E-12
2.0E-12
3.0E-12
4.0E-12
5.0E-12
6.0E-12
7.0E-12
0.01 0.10 1.00 10.00
Tenso Inversa (V)
C
o
r
r
e
n
t
e

(
A
)
Com o 1 xido

Figura 7.19: Corrente em funo da tenso inversa dos fotododos n+ / p-epilayer, medida
quando no esto expostos luz.
7.4.2 Electrnica de leitura
O circuito de leitura dos sinais analgicos vindos dos fotodetectores foi
alimentado com uma tenso de 5 V. A tenso de referncia de entrada do comparador
de 2 V e a frequncia do relgio de 1 MHz. Uma lmpada convencional de filamento
incandescente foi utilizada para iluminar os fotododos. As Figura 7.20 e Figura 7.21
apresentam o traado do ecr de um osciloscpio digital LeCroy9310 com as formas de
onda da tenso no condensador (onda superior), e da tenso negada de sada do
comparador (onda inferior), quando a lmpada est mais prxima e mais afastada do
fotodetector, respectivamente. A Tabela 7.2 mostra as caractersticas em corrente
contnua do comparador.
Como se pode constatar, a frequncia da sada do comparador directamente
proporcional intensidade da luz. Posteriormente, a sada do comparador utilizada
como sinal de relgio para um contador que conta impulsos durante um perodo de
tempo fixo, produzindo assim a leitura digital correspondente intensidade da luz.

149

Figura 7.20: Tenso no condensador (1) e tenso na sada do comparador (2) do conversor
luz - frequncia, quando iluminado por uma lmpada de filamento incandescente
a cerca de 5 cm do fotododo.

Figura 7.21: Tenso no condensador (1) e tenso na sada do comparador (2) do conversor
luz - frequncia, quando iluminado por uma lmpada de filamento incandescente
a cerca de 50 cm do fotododo.

150
Tabela 7.2: Caractersticas em corrente contnua do comparador com relgio.
Caractersticas em corrente contnua Mnimo Tpico Mximo
Offset (mV) @ 2.5V 6
Tenso de alimentao (V) Vdd-Vss 4 5 7
Corrente de polarizao (A) 10
Gama de tenso de entrada (V) 0 5
Tempo de subida (ns) @ carga 12 pF 200
Tempo de descida (ns) @ carga 12 pF 300
Atraso de propagao mnimo (ns) 100
Mxima frequncia de relgio (MHz) 4.5
7.5 O Microlab na determinao da concentrao de protena total e
cido rico na urina
Os procedimentos para quantificar a concentrao, quer da protena total, quer
do cido rico na urina quando utilizado o Microlab como aparelho de medida, so os
mesmos descritos na seco 7.1. Nessa seco, utilizou-se o espectrofotmetro como
aparelho de medida e cuvetes ou placas com poos para deposio do lquido. No
Microlab a diferena reside no facto dos lquidos se moverem e misturarem nos canais e
o aparelho de medida ser o sistema de deteco e leitura fabricado num chip
(Figura 7.22). O volume total de soluo que circula no canal principal (canal de
mistura) de 14.28 l. Para as duas biomolculas a analisar (protena total e cido
rico) a razo amostra/reagente de 1:50, pelo que, a quantidade de reagente utilizada
de 14 l para 0.28 l de amostra. Os outros dois canais, acima e abaixo do principal, um
deles contendo o reagente e o outro um calibrador de concentrao conhecida, permitem
um volume de lquido de 1.5 l.

Figura 7.22: O Microlab (os canais tm 500 m de profundidade e 1 mm de largura).

151
7.5.1 Medio da protena total na urina
A Figura 7.23 apresenta o espectro de transmisso medido para diferentes
concentraes de albumina aps a sua reaco com o reagente especfico para deteco
de protena total na urina. Este espectro foi obtido utilizando o conjunto lmpada e
monocromador como fonte de luz. Os resultados foram obtidos temperatura de 25 C
com padres de albumina com concentraes de 3 mg/dl a 100 mg/dl, compreendendo a
gama de valores normais e anormais na urina humana. Diferenas menores que 5 mg/dl
no foram consideradas, uma vez que representam uma variao de menos de 10% nos
valores tpicos encontrados no ser humano. Foram realizadas 6 medies diferentes e 6
ensaios diferentes para cada concentrao. Os valores apresentados representam uma
mdia dos valores obtidos em cada experincia. No grfico da Figura 7.23, a recta para
T = 100% corresponde ao valor obtido quando foi medido apenas o reagente (sem
protena total, mais precisamente sem albumina).
Na Figura 7.24 encontra-se a curva de calibrao deste ensaio. Os resultados
esto de acordo com as medies efectuadas nos aparelhos convencionais e
consequentemente as mesmas concluses podem ser obtidas (ver seces 7.1.2 e 7.1.4).
Salienta-se que um incremento de 1 mg/dl no valor da concentrao de protena
corresponde a uma alterao do valor de transmitncia de 0.025%, conforme a equao
da recta de tendncia do grfico de calibrao.
400 450 500 550 600 650 700
T
r
a
n
s
m
i
t
n
c
i
a

(
%
)
Reagente
3 mg/dl
7.5 mg/dl
15 mg/dl
30 mg/dl
50 mg/dl
100 mg/dl
97.0%
97.5%
98.0%
98.5%
99.0%
99.5%
100.0%

Figura 7.23: Espectro de transmisso para diferentes concentraes de albumina depois de
reagir com o reagente especfico para protena total (Microprotein-PR). Da
curva superior para a inferior: reagente, 3 mg/dl, 7.5 mg/dl, 15 mg/dl, 30 mg/dl,
50 mg/dl e 100 mg/dl.

152
Transmitncia = -0.00025C + 1.00085
CR
2
= 0.99891
97.0%
97.5%
98.0%
98.5%
99.0%
99.5%
100.0%
0 20 40 60 80 100
Concentrao (mg/dl)
T
r
a
n
s
m
i
t
n
c
i
a

(
%
)

Figura 7.24: Curva calibrao para diferentes concentraes de albumina depois da sua reaco
com o reagente Microprotein-PR.
A Tabela 7.3 fornece alguns resultados teis de clculos baseados nos valores
medidos. O coeficiente de absoro () para cada concentrao foi calculado pela lei de
Lamber-Beer:

LP
LP I LP I

e ) 0 ( ) (

= = (7.4)
onde I representa a intensidade de luz que atinge o fotodetector e LP o caminho ptico
percorrido por essa luz na amostra a analisar (no presente caso de 500 m).
Tabela 7.3: Coeficiente de absoro para cada concentrao medida para = 595 nm e com
LP = 500 m.
Solues T (%) (m
-1
) T
dif
(%)
Reagente 100.00
3 mg/dl 99.98 0.27 0.02
7.5 mg/dl 99.89 2.05 0.09
15 mg/dl 99.72 5.66 0.17
30 mg/dl 99.33 13.19 0.39
50 mg/dl 98.88 22.40 0.45
100 mg/dl 97.55 45.82 1.33
Pela Tabela 7.3 pode concluir-se que a diferena no valor da transmitncia para
diferentes concentraes T
dif
, muito pequena. As transmitncias obtidas encontram-se
bastante perto de 100% (transmitncia para reagente sem protena). Isto deve-se a dois
factores. Em primeiro lugar o caminho ptico pequeno (500 m) quando comparado
com os espectrofotmetros convencionais (normalmente de 1 cm). Em segundo lugar,

153
a albumina a biomolcula que aparece em menor quantidade na urina humana (ver
Captulo 2).
Uma vez que os ensaios para analisar protena total na urina foram realizados
com padres de albumina, importava verificar o que aconteceria se alm de albumina
estivessem presentes outras protenas na amostra. A albumina representa um tero da
protena total na urina. Se estiverem presentes mais protenas, o valor da concentrao
em anlise aumenta. Experincias com pequenos volumes de soluo com amostras que
continham albumina e imunoglobulina G foram realizadas no Departamento de Biologia
da UM. Dessas experincias conclui-se que a aplicao conjunta dos mtodos de
determinao de albumina e de protena total eficaz [2].
As medies efectuadas no incluem nenhum filtro ptico no topo do Microlab,
uma vez que para o comprimento de onda ao qual este procedimento tem um mximo de
absorvncia ( = 595 nm), no foi fabricado, ainda, um filtro ptico. A seguir
apresentam-se os ensaios relativos determinao da concentrao de cido rico na
urina com o Microlab completo.
7.5.2 Medio do cido rico na urina
A Figura 7.25 apresenta o espectro de transmisso medido para diferentes
concentraes de cido rico aps a sua reaco com o reagente especfico para
deteco de cido rico na urina. Este espectro foi obtido utilizando o conjunto lmpada
e monocromador como fonte de luz. Os resultados foram obtidos temperatura de
25 C com padres de cido rico com concentraes de 5 mg/dl a 120 mg/dl,
compreendendo a gama de valores normais e anormais na urina humana. Diferenas
menores que 5 mg/dl no foram consideradas, uma vez que representam uma variao
de menos de 10% nos valores tpicos encontrados no ser humano. Foram realizadas 6
medies diferentes e 6 ensaios diferentes para cada concentrao. Os valores
apresentados representam uma mdia dos valores obtidos em cada experincia. No
grfico da Figura 7.25, a recta para T = 100% corresponde ao valor obtido quando foi
medido apenas o reagente (sem cido rico).

154
60%
70%
80%
90%
100%
400 450 500 550 600 650 700
T
r
a
n
s
m
i
t
n
c
i
a

(
%
)
Reagente
5 mg/dl
10 mg/dl
15 mg/dl
20 mg/dl
30 mg/dl
40 mg/dl
60 mg/dl
80 mg/dl
120 mg/dl

Figura 7.25: Espectro de transmisso para diferentes concentraes de cido rico depois de
reagir com o reagente especfico para a sua quantificao (Infinity
TM
uric acid
reagent). Da curva superior para a inferior: reagente, 5 mg/dl, 10 mg/dl, 15 mg/dl,
20 mg/dl, 30 mg/dl, 40 mg/dl, 60 mg/dl, 80 mg/dl e 120 mg/dl.
Na Figura 7.26 encontra-se a curva de calibrao deste ensaio. Os resultados
esto de acordo com as medies efectuadas nos aparelhos convencionais e,
consequentemente, as mesmas concluses podem ser obtidas (ver seces 7.1.3 e 7.1.5).
Salienta-se que um incremento de 1 mg/dl no valor da concentrao de protena
corresponde a uma alterao do valor de transmitncia de 0.46%, conforme a equao
da recta de tendncia do grfico de calibrao. Para a obteno da recta de tendncia
considerou-se apenas a zona linear do grfico (concentraes at 30 mg/dl). Para
concentraes superiores a melhor opo, segundo o protocolo do mtodo, diluir as
amostras e multiplicar o valor obtido pelo factor de diluio.
Transmitncia = -0.0046C + 0.9904
CR
2
= 0.9873
60%
70%
80%
90%
100%
0 20 40 60 80 100 120
Concentrao (mg/dl)
T
r
a
n
s
m
i
t
n
c
i
a

(
%
)

Figura 7.26: Curva de calibrao para diferentes concentraes de cido rico depois da sua
reaco com o reagente Infinity
TM
uric acid reagent. A recta de tendncia foi
calculada apenas na zona linear.

155
A Tabela 7.4 obteve-se de modo idntico Tabela 7.3 e fornece alguns
resultados teis de clculos baseados nos valores medidos.
Tabela 7.4: Coeficiente de absoro para cada concentrao medida para = 495 nm e com
LP = 500 m.
Solues T (%) (m
-1
) T
dif
(%)
Reagente 100.00
5 mg/dl 97.29 54.97 2.71
10 mg/dl 94.29 117.68 3.00
15 mg/dl 91.42 179.42 2.87
20 mg/dl 90.09 208.64 1.33
30 mg/dl 85.56 311.95 4.54
40 mg/dl 82.76 378.49 2.80
60 mg/dl 75.66 557.75 7.10
80 mg/dl 71.52 670.15 4.13
120 mg/dl 62.14 951.65 9.39
Uma vez que o cido rico encontra-se em maior abundncia na urina do que a
albumina visvel uma maior diferena de valores de transmitncia (T
dif
) entre
concentraes consecutivas. Ensaios prvios com um sistema de microfluidos com
LP = 1 mm podem ser consultados em [7].
Medio do cido rico na urina utilizando o Microlab com filtro ptico
Ao colocar-se o filtro ptico sobre o Microlab e realizando exactamente os
mesmos ensaios acabados de descrever, obteve-se o grfico da Figura 7.27. Neste
grfico, foi considerado o valor T = 100% quando no estavam presentes nem o filtro
ptico nem soluo nos canais. Deste modo, observa-se melhor o efeito do filtro ptico
comparando este grfico com o obtido na Figura 7.25. Conforme se pode observar,
devido ao efeito do filtro ptico o valor mximo da transmitncia desviou-se de 495 nm
para 480 nm. Este desvio no crtico (quando se analisa apenas o cido rico) uma vez
que o espectro de transmisso do cido rico tem uma FWHM 90 nm (ver
Figura 7.25), pelo que para 480 nm existem ainda diferenas de transmitncia para as
vrias concentraes. A FWHM obtida pelo efeito do filtro ptico de 18 nm.
A curva de calibrao obtida com o filtro ptico sobre o Microlab encontra-se na
Figura 7.28. Pela equao da recta de tendncia conclui-se que esta curva ligeiramente
diferente da obtida sem o filtro ptico (ver Figura 7.26). Esta concluso esperada, uma
vez que os valores de transmitncia apresentados no grfico dizem respeito a um

156
comprimento de onda de 480 nm. Como se pode observar na Figura 7.25, a
sensibilidade do mtodo para 480 nm ligeiramente inferior do que para 495 nm. Mais
precisamente, um incremento de 1 mg/dl representa um aumento no valor da
transmitncia de 0.28% para 480 nm e de 0.46% para 495 nm. Note-se que este filtro
ptico no poderia ser utilizado para obter a curva de calibrao para = 495 nm, uma
vez que para este comprimento de onda quase no h diferena no valor da
transmitncia para as vrias concentraes.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
400 450 500 550 600 650 700
T
r
a
n
s
m
i
t
n
c
i
a

(
%
)
Reagente 5 mg/dl
10 mg/dl 15 mg/dl
20 mg/dl 30 mg/dl
40 mg/dl 60 mg/dl
80 mg/dl 120 mg/dl

Figura 7.27: Espectro de transmisso, obtido com o filtro ptico sobre o Microlab, para
diferentes concentraes de cido rico aps a reaco com o reagente especfico
para a sua determinao. Da curva superior para a inferior: reagente, 5 mg/dl,
10 mg/dl, 15 mg/dl, 20 mg/dl, 30 mg/dl, 40 mg/dl, 60 mg/dl, 80 mg/dl e 120 mg/dl.
CR
2
= 0.9837
45%
50%
55%
60%
65%
70%
0 20 40 60 80 100 120
Concentrao (mg/dl)
T
r
a
n
s
m
i
t
n
c
i
a

(
%
)

Figura 7.28: Curva de calibrao do ensaio demonstrado na Figura 7.27, para = 480 nm.

157
Medio do cido rico na urina utilizando uma fonte de luz branca
A Figura 7.29 apresenta a curva de calibrao quando os ensaios so realizados
com uma luz branca convencional direccionada para os microcanais. Neste ensaio os
valores da corrente dos fotododos foram transferidos para um computador para
posteriormente ser elaborada a curva de calibrao. Os procedimentos do ensaio foram
os mesmos do que os realizados nos ensaios anteriores. No traado do grfico foi
considerada T = 100% como sendo o valor medido para o reagente.
CR
2
= 0.9314
70%
75%
80%
85%
90%
95%
100%
0 20 40 60 80 100 120
Concentrao (mg/dl)
T
r
a
n
s
m
i
t
n
c
i
a

(
%
)

Figura 7.29: Curva de calibrao para diferentes concentraes de cido rico aps completa a
reaco com o reagente especfico para a sua determinao. Valores obtidos
quando o Microlab iluminado com uma fonte de luz branca convencional.
Pela curva de calibrao, um incremento de 1 mg/dl na concentrao de cido
rico corresponde a uma variao no valor da transmitncia de 0.34%. Contudo, o limite
mnimo de deteco obtido de aproximadamente 0.5 mg/dl e representa 0.8% da
concentrao de cido rico que pode existir na urina humana. Os coeficientes de
variao da repetitividade e reprodutibilidade para 6 medies e 6 ensaios diferentes
aumentaram 4% em relao aos obtidos na seco 7.1, isto , os seus valores neste
ensaio so aproximadamente de 10%. Uma vez que a fonte de luz uma luz branca
convencional, a medida de uma concentrao conhecida (denominado de calibrador)
para cada medio imprescindvel. Conforme foi referido no Captulo 4, o espectro de
uma fonte de luz branca convencional no constante (da a necessidade do terceiro
canal para o calibrador). Caso a urina apresente um aspecto turvo deve fazer-se uma
centrifugao antes das medies para eliminar os sedimentos que poderiam influenciar
os valores medidos. Este procedimento tambm efectuado nos laboratrios de anlises
clnicas.

158
7.6 Concluso
Neste captulo ficou provado que a reduo de volumes de ensaio para a ordem
das dezenas de microlitros no influencia a validade do mtodo de medio das
biomolculas. Obtm-se o mesmo desempenho, preciso, fiabilidade e sensibilidade das
anlises realizadas actualmente nos laboratrios de anlises clnicas, os quais utilizam
um volume de soluo de 1 ml. O Microlab pode, por isso, ser utilizado para a
determinao da concentrao de biomolculas na urina.
O Microlab foi testado, com sucesso, na determinao da concentrao de cido
rico na urina, para concentraes que compreendem a gama de valores normais e
anormais no ser humano. A Tabela 7.5 apresenta um resumo dos principais resultados
obtidos.
Tabela 7.5: Resumo dos parmetros obtidos do Microlab.
Caractersticas Condio Resultado
Tecnologia ------ CMOS analgica 1.6 m
rea de cada canal ptico ------ 500 m 500 m
Espessura do caminho ptico ----- 500 m
Mtodo de leitura da
concentrao da biomolcula
----- Absoro ptica
Camadas do filtro ptico Dielctricas 11
FWHM do filtro ptico = 480 nm 18 nm
Transmitncia = 480 nm 70%
Corrente de fuga do fotodetector @ 0 V 0.27 pA
Sensibilidade do fotodetector = 480 nm, 0 V 211 mA/W
Eficincia quntica do
fotodetector
= 480 nm, 0 V 54.4%
Tenso de operao do sistema
de deteco e leitura
----- 5 V
Variao de 1 mg/dl na
concentrao de cido rico
Sem filtro ptico,
= 495 nm, LP = 500 m
T = 0.46%
Com filtro ptico,
= 480 nm, LP = 500 m
T = 0.28%
Com filtro ptico, fonte de
luz branca, LP = 500 m
T = 0.34%
Repetitividade 6 medies 10%
Reprodutibilidade 6 medies 10%
Limite mnimo de deteco
de cido rico
Fonte de luz branca 0.5 mg/dl

159
O limite mnimo de deteco de aproximadamente 0.5 mg/dl, com um caminho
ptico de 500 m. Este limite mnimo funo no s do caminho ptico mas tambm
da sensibilidade do fotodetector, do sistema de leitura, do mtodo colorimtrico e dos
reagentes.
Bibliografia
[1] Biochemistry and Organic Reagents: for bioscience investigation. Sigma, 2002.
[2] LIMA, C. - Normalizao de procedimentos para determinaes bioqumicas em
fluidos biolgicos com a utilizao de pequenos volumes. Relatrio da bolsa de
iniciao investigao cientfica no mbito do projecto de investigao:
Laboratorial microsystem in silicon for biological fluid analysis: a lab-on-a-chip
in CMOS technology, 2001.
[3] McELDERRY, L. A.; TARBIT, I. F.; CASSELLS-SMITH, A. J. - Six methods
for urinary protein compared. Clinical Chemistry. Vol. 28, n 2 (1982),
p. 356-360.
[4] WATANABE, N. [et al.] - Urinary protein as measured with a pyrogallol
red-molybdate complex, manually and in a Hitachi 726 automated analyzer.
Clinical Chemistry. Vol. 32, n 8 (1998), p. 1551-1554.
[5] YOUNG, D. S. - Effects of drugs on clinical laboratory tests. 3 ed. American
Society Publisher, Vol. 3 (1990), p. 360-370.
[6] TRIVEDI, R. C.; BERTA, E. J.; REBAR, L. - Enzymatic uric acid determination
at 500 nm by trinder method. Worthington Biochemical Corporation, Freehold,
N. J. 07728.
[7] MINAS, G. [et al.] - Biological microsystem for measuring uric acid in
biological fluids. Sensors and Actuators A, Vol. 110 (2004), p. 33-38.
[8] http://www.oriel.com/netcat/catindex.htm.
[9] http://sales.hamamatsu.com/assets/pdf/parts_S/S1336-5BQ.pdf.

161
8

Concluses e trabalho futuro
8.1 Concluses
Esta tese apresenta um microssistema laboratorial (Microlab) para anlise de
fluidos biolgicos por absoro ptica na gama visvel do espectro electromagntico. O
seu objectivo permitir a determinao, em tempo real, sem requisitos especiais e a
baixo custo, do valor da concentrao de biomolculas em fluidos humanos. Utilizando
como fonte emissora uma fonte convencional de luz branca (como uma lmpada
comercial de filamento incandescente, por exemplo), permite que as anlises sejam
efectuadas sem recorrer a sistemas complexos e economicamente dispendiosos como
sistemas que incluam um espectrofotmetro, por exemplo. O Microlab um
microssistema porttil para diagnsticos clnicos. Permite realizar anlises em
consultrios mdicos no decorrer da consulta, na casa dos pacientes e nos prprios
laboratrios de anlises, permitindo assim a determinao exacta da concentrao de
biomolculas em fluidos biolgicos. Sendo de pequenas dimenses, baixo consumo,
porttil e utilizando quantidades reduzidas de reagentes e de amostras apresenta, apesar
de tudo, resultados com a mesma fiabilidade e preciso dos sistemas de anlises de
fluidos biolgicos existentes, actualmente, nos laboratrios de anlises clnicas.
O Microlab possui uma estrutura modular (Multi-Chip-Module) composta por
trs unidades: o sistema de microfluidos, o sistema de filtragem ptica e o sistema de
deteco e leitura.

162
O sistema de microfluidos foi micromaquinado em vidro e contm os
microcanais nos quais circulam os fluidos. Os microcanais so trs, cada um com 1 mm
de largura e 500 m de profundidade. Um dos microcanais permite obter a linha de
referncia. O segundo microcanal permite a medio no fluido a analisar. Tem duas
entradas e uma sada para possibilitar a mistura do fluido com o reagente de forma
automtica. O terceiro microcanal necessrio para calibrar a fonte de luz e calibrar a
concentrao da biomolcula a medir (com um padro de concentrao conhecida). O
formato dos microcanais rectangular devido reflexo da luz, uma vez que o processo
de medio por absoro ptica.
O recurso a filtros pticos faz com que seja possvel realizar medies no
Microlab usando uma fonte de luz branca convencional (que contm todos os
comprimentos de onda), o que representa uma importante vantagem porque evita o
recurso a uma fonte de luz monocromtica especfica, vinda de um LASER, por
exemplo. O sistema de filtragem ptica encontra-se sob o sistema anterior. Os filtros
pticos tm como funo seleccionar, dentro do espectro electromagntico de luz
visvel, o comprimento de onda adequado biomolcula que se pretende analisar. So
constitudos por 11 camadas de filmes finos dielctricos de SiO
2
e TiO
2
. Estes filmes
tm como vantagem uma elevada reflexo e uma baixa taxa de absoro. Foram
depositados, numa lamela de vidro de 500 m de espessura, por tcnicas de PVD. Neste
trabalho foram projectados 16 filtros pticos, para analisar 16 biomolculas diferentes
que varrem comprimentos de onda desde 480 nm a 600 nm em intervalos de 8 nm. Cada
filtro tem uma rea activa de 500 m 500 m e sensvel a uma banda muito estreita
de comprimentos de onda com uma FWHM 6 nm. O fabrico desta matriz de filtros
pticos requer apenas 4 mscaras e 15 deposies. O funcionamento do sistema de
filtragem ptica foi demonstrado na anlise de cido rico na urina. O filtro ptico
fabricado para essa anlise tem uma transmitncia de 70% e uma FWHM = 18 nm, para
= 480 nm.
O sistema de deteco e leitura foi fabricado segundo um processo de
microelectrnica standard CMOS de 1.6 m, com n-well, de uma camada de polisilcio
e duplo metal. Contm os fotodetectores para medir a intensidade do feixe de luz
transmitido atravs da mistura. Este feixe, com vrias componentes espectrais, filtrado
pelos filtros pticos, obtendo-se assim um intervalo estreito de comprimentos de onda.
O nmero de fotodetectores depende do nmero de filtros pticos. Os fotodetectores
fabricados, fotododos de juno, tm uma rea activa de 500 m 500 m, uma
sensibilidade de 211 mA/W para = 480 nm e uma corrente de fuga de 0.27 pA. Os

163
fotodetectores so posicionados exactamente debaixo dos filtros pticos. Para converter
o sinal analgico dos fotodetectores num sinal digital, foi integrado no mesmo processo
de fabrico um conversor luz frequncia. Este necessita externamente de apenas uma
tenso de alimentao contnua de 5 V.
O Microlab foi testado na determinao quantitativa de cido rico na urina. Nos
testes foi utilizada uma lmpada convencional de filamento incandescente. A escolha da
urina deveu-se ao facto deste fluido no necessitar de uma preparao prvia para a
realizao da anlise e por ser o fluido biolgico menos viscoso, fluindo mais
facilmente nos microcanais. Contudo, outros fluidos biolgicos podem ser utilizados,
tais como o sangue, a saliva, o fluido cerebrospinal, etc. O cido rico foi escolhido
como a primeira biomolcula candidata ao funcionamento global do Microlab, por ser
uma biomolcula frequentemente analisada na urina. A mistura completa e homognea
nos microcanais da urina com o reagente especfico para a determinao quantitativa do
cido rico obtida em cerca de 40 s. A determinao quantitativa do cido rico na
urina foi testada eficazmente para concentraes desde 5 mg/dl a 120 mg/dl,
concentraes essas que compreendem a gama de valores normais e anormais na urina
humana (8 mg/dl a 67 mg/dl). O limite mnimo de deteco obtido aproximadamente
de 0.5 mg/dl, o que significa que a resoluo do Microlab suficiente, tendo em conta
os valores observados no ser humano.
8.2 Trabalho futuro
Como trabalho futuro destaca-se o fabrico da matriz de 16 filtros pticos,
utilizando o sistema de deposio, a configurao das mscaras e a sequncia de fabrico
indicados no captulo 6.2. O Microlab ficar assim habilitado a determinar
quantitativamente a concentrao de 16 biomolculas diferentes em fluidos biolgicos.
Para o Microlab se tornar num equipamento totalmente autnomo seria
interessante a construo de um leitor associado ao Microlab, o que permitiria a
visualizao do resultado quantitativo num mostrador. A Figura 8.1 apresenta o desenho
artstico de um possvel leitor. O sistema de microfluidos seria descartvel, evitando
assim os custos associados lavagem dos reagentes e amostras. Os restantes sistemas
(filtragem ptica e deteco e leitura) poderiam ser utilizados em vrias anlises.

164

Figura 8.1: Desenho artstico de um possvel leitor para o Microlab.
Quanto ao sistema de microfluidos existe ainda bastante trabalho que pode ser
desenvolvido. Como se viu, interessante que este seja descartvel. A utilizao de
polmeros para o seu fabrico apresenta vantagens, principalmente econmicas, face ao
fabrico em vidro. Em geral, os sistemas de microfluidos em vidro so fabricados atravs
de tcnicas de corroso qumica utilizando cido fluordrico (tcnicas complexas,
dispendiosas, txicas e perigosas) ou atravs de tcnicas de microfresagem e
microperfurao (que no so boas para produo em massa e apresentam uma
superfcie rugosa). Uma soluo promissora pode ser alcanada utilizando o photoresist
SU-8 [1-3] no fabrico de sistemas de microfluidos. O photoresist SU-8 um material
fotossensvel com boas propriedades mecnicas, boa resistncia qumica e muito boa
biocompatibilidade. O fabrico de microcanais em SU-8 compatvel com a
fotolitografia ultravioleta dos semicondutores, com a vantagem de que no necessita de
mscaras dispendiosas, uma vez que as mscaras podem ser fabricadas numa
transparncia como as usadas no fabrico de circuitos impressos. Permite ainda a
construo de microcanais com profundidades at 1 mm e com uma rugosidade muito
baixa, o que extremamente vantajoso para medies por absoro ptica. A Figura 8.2
apresenta um esquema de como seria o Microlab com o sistema de microfluidos
fabricado por tcnicas de SU-8.
No sistema de microfluidos a mistura da amostra do fluido biolgico com o
reagente feita por difuso. Contudo, apenas os fluidos cujas molculas envolvidas na
reaco tenham elevado coeficiente de difuso e baixo peso molecular podem ser
misturados eficazmente e homogeneamente. Um sistema de microfluidos mais
abrangente necessitaria de elctrodos para mover e misturar os fluidos ao longo dos
microcanais (princpio da electroforese e electroosmose). O desenvolvimento e fabrico
de microbombas e microvlvulas um tpico de elevado interesse para uma nova
gerao do Microlab.

165
Silcio Fotodetectores
SU-8
Cmara de
deteco
C
a
n
a
l
Vidro
E
n
t
r
a
d
a

d
o
s

f
l
u
i
d
o
s
500 m
500 m
500 m
500 m

Figura 8.2: Desenho artstico, em corte e em perspectiva, do Microlab com o sistema de
microfluidos fabricado atravs de tcnicas de SU-8.
Bibliografia
[1] IBM - Photoresist composition and printed circuit boards and packages made
therewith. GELORME, J. D.; COX, R. J.; GUTIERREZ, S. A. R.; US Patent
4882245, 1989.
[2] SHAW, J. M. [et al.] - Negative photoresists for optical lithography. IBM
Journal of Reseach and Development. Vol. 41, n 1-2 (1997), p. 81-91.
[3] http://www.microchem.com/products/su_eight.htm.

ANEXOS

I

Informaes essenciais e
requisitos das anlises por
deteco colorimtrica

ANEXO
Anexo I

A - 5
I.1 Curva de calibrao
A determinao da concentrao (desconhecida) da biomolcula que se pretende
analisar obtida atravs de uma curva de calibrao. Esta preparada utilizando uma
referncia que no contenha a biomolcula que se pretende analisar (geralmente
utiliza-se o reagente) e uma srie de amostras com concentraes conhecidas da
biomolcula que se pretende analisar (denominados padres da biomolcula). A
Tabela I.1 apresenta um exemplo de uma curva de calibrao. Nela, encontram-se um
conjunto de amostras de concentrao conhecida utilizadas para descrever a curva de
calibrao (Figura I.1) e a amostra desconhecida a analisar. Aps a reaco entre essas
amostras e o reagente, as absorvncias das misturas so lidas. Com estes valores
traado um grfico, Absorvncia = f (Concentrao). Esse grfico denomina-se de
curva de calibrao. Normalmente o grfico da curva de calibrao apresenta a
equao da curva, denominada de recta de tendncia, calculada atravs de tcnicas de
regresso. Um outro parmetro estatstico que calculado juntamente com a curva de
calibrao o coeficiente de correlao (CR). Este reflecte a extenso de uma relao
linear entre dois conjuntos de dados. um parmetro adimensional, o seu valor varia
entre -1.0 e 1.0 e dado pela expresso de Pearson,

( ) ( )( )
( ) [ ] ( ) [ ]
2 2 2 2
Y Y n X X n
X X XY n
CR

= (I.1)
onde X e Y so o conjunto de dados e n o nmero de dados. Normalmente o que se
representa no grfico da curva de calibrao o quadrado desse coeficiente. Este
quadrado interpretado como a proporo da varincia em Y que pode ser atribuda
varincia em X.
A medida de concentraes desconhecidas dessa mesma biomolcula
realizada, normalmente, ao mesmo tempo que a curva de calibrao. Os valores das
absorvncias medidas para as concentraes desconhecidas so interceptados com a
curva de calibrao e assim obtidos os valores das concentraes. Algumas anlises
colorimtricas resultam numa curva de calibrao no linear. Nestes casos,
selecciona-se uma pequena zona da curva onde a resposta linear, ou esteja muito perto
da linearidade, e dilui-se as amostras de forma aos seus valores de absorvncia se
encontrarem dentro dessa zona. Caso a curva no tenha nenhuma zona linear, ter-se-

A - 6
que utilizar tcnicas analticas de regresso no linear. A utilizao destas tcnicas pode
consultar-se em [1].
Tabela I.1: Determinao de uma curva de calibrao.
Amostra n
Concentrao da
biomolcula (mg/dl)
Vol. amostra
(ml)
Vol. reagente
(ml)
ABS
Referncia com
amostra n
1 0 1 4 0.000 1
2 2 1 4 0.143 1
3 4 1 4 0.261 1
4 6 1 4 0.379 1
5 Desconhecida 1 4 0.168 1
ABS = 0.0628C + 0.0075
CR
2
= 0.9976
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0 1 2 3 4 5 6
Concentrao (mg/dl)
A
b
s
o
r
v
n
c
i
a

(
A
U
)
Amostra desconhecida
ABS = 0.168 -> C = 2.55 mg/dl

Figura I.1: Curva de calibrao.
I.2 Requisitos da anlise
Neste tipo de anlises existe uma srie de requisitos que tm que ser cumpridos.
O seu incumprimento resulta em curvas de calibrao incorrectas e consequentemente
em valores de concentrao incorrectos da biomolcula analisada.
fundamental que a concentrao da biomolcula na mistura seja directamente
proporcional concentrao da biomolcula na amostra. Este requisito implica que
nenhuma biomolcula da amostra, diferente da que se pretende analisar, tenha uma
reaco com o reagente, dentro da gama de comprimentos de onda para a qual essa
biomolcula tem um mximo de absorvncia. Isto quer dizer que a reaco tem que ser
selectiva, caso contrrio, o valor medido da absorvncia referente no s
Anexo I

A - 7
biomolcula que se pretende analisar mas tambm a mais outras biomolculas, pelo que
no possvel discriminar a concentrao nem da biomolcula pretendida nem das
outras. Em algumas reaces apenas se consegue a selectividade quando o comprimento
de onda, para o qual a absorvncia da biomolcula mxima, desviado para outro
valor. Esse desvio deve-se composio qumica do reagente, que desvia apenas a
biomolcula a analisar.
fundamental que a leitura da absorvncia seja feita s aps a reaco estar
completa. Reaces incompletas podem ser causadas pela seleco inadequada do
tempo, temperatura ou razo entre amostra e reagente.
O conhecimento da estabilidade da mistura a chave para a seleco do tempo
necessrio para a medio. A temperatura da reaco afecta o tempo necessrio para se
completar a reaco. Quando se pretende acelerar a reaco pode, em alguns casos,
aumentar-se a temperatura qual realizada a anlise.
Uma causa comum da anlise por deteco colorimtrica ser no linear a
inadequada razo entre a concentrao do reagente e a concentrao da amostra. Essa
inadequada razo pode resultar numa reaco incompleta, mesmo aumentando o tempo
de reaco, ou seja, nem todos os compostos qumicos da biomolcula conseguiram
reagir com o reagente. Normalmente, uma razo entre a concentrao do reagente e a
concentrao da amostra maior que 50 elimina esse problema.
I.3 Seleco do comprimento de onda para a leitura das
absorvncias das misturas
O comprimento de onda para a leitura das absorvncias de uma determinada
biomolcula deve ser escolhido atravs do mximo valor do espectro da absorvncia da
mistura. Contudo, existem, por vezes, sobreposies entre os espectros das absorvncias
da mistura, do reagente e da amostra. Esta, geralmente, alm da biomolcula a analisar
contm outros compostos que podem absorver em comprimentos de onda dentro do
espectro de absorvncia da mistura.
O melhor cenrio para a deteco colorimtrica aquele em que no existe
sobreposio do espectro da mistura com os outros espectros (reagentes e compostos da
amostra). Deste modo, nas medies no h interferncia quer do reagente quer dos
compostos da amostra (Figura I.2). O reagente conseguiu desviar o comprimento de

A - 8
onda, onde a mistura tem um mximo de absorvncia, para fora do seu comprimento de
onda e do dos outros compostos da amostra. O comprimento de onda utilizado para
medir a concentrao da biomolcula pretendida , ento, dado pelo mximo da
absorvncia da mistura ( 520 nm).
400
A
b
s
o
r
v
n
c
i
a

(
A
U
)
Comprimento de onda
Mistura Compostos
da amostra
Reagente
420 440 460 480 500 520 540 560 580 (nm)

Figura I.2: Espectros sem sobreposio [2].
Uma ocorrncia mais comum nas deteces colorimtricas quando o espectro
da mistura tem sobreposio com o espectro do reagente (Figura I.3). de igual modo
utilizado o comprimento de onda onde a mistura tem um mximo de absorvncia para
analisar a concentrao da biomolcula pretendida ( 530 nm). Contudo, quando o
espectro da mistura e do reagente esto em sobreposio, a absorvncia do reagente tem
que ser subtrada da mistura de forma a obter-se apenas a absorvncia da biomolcula
a analisar.
400
A
b
s
o
r
v
n
c
i
a

(
A
U
)
Comprimento de onda
Mistura
Compostos
da amostra
Reagente
420 440 460 480 500 520 540 560 580 (nm)

Figura I.3: Espectros do reagente e mistura sobrepostos [2].
Um caso mais difcil o que se apresenta na Figura I.4 onde quer os compostos
da amostra, quer o reagente e quer a mistura tm absorvncias no comprimento de onda
no qual a mistura tem uma absorvncia mxima ( 480 nm). Neste caso, o analista
tem que medir primeiro a absorvncia apenas do reagente e a absorvncia apenas dos
compostos da amostra para cada comprimento de onda a medir e subtrair estes dois
Anexo I

A - 9
parmetros ao valor obtido na mistura. de igual modo utilizado nas medies o
comprimento de onda no qual a mistura tem um mximo de absorvncia.
400
A
b
s
o
r
v
n
c
i
a

(
A
U
)
Comprimento de onda
Mistura
Compostos
da amostra
Reagente
420 440 460 480 500 520 540 560 580 (nm)

Figura I.4: Espectros da amostra, do reagente, e da mistura sobrepostos [2].
Bibliografia
[1] SKOOG, A.; EST, D. M. - Fundamentals of analytical chemistry. 5 ed.
Saunders College Publishing, Philadelphia, 1987.
[2] STEWART, K. K.; EBEL, R. E. - Chemical measurement in biological systems.
John Wiley & Sons, USA, 2000.

II

ndices de refraco
do SiO
2
e do TiO
2

ANEXO
Anexo II

A - 13
SiO
2

(Base de dados da Sopra Company, http://www.sopra-sa.com/indices.htm)
(nm)
n k
(nm)
n k
163 1.653 0.000 310 1.485 0.000
165 1.643 0.000 318 1.483 0.000
168 1.633 0.000 326 1.481 0.000
170 1.624 0.000 335 1.480 0.000
172 1.616 0.000 344 1.478 0.000
175 1.608 0.000 354 1.476 0.000
177 1.600 0.000 365 1.475 0.000
180 1.592 0.000 376 1.473 0.000
182 1.585 0.000 387 1.472 0.000
185 1.579 0.000 400 1.470 0.000
188 1.573 0.000 413 1.469 0.000
191 1.567 0.000 428 1.467 0.000
194 1.562 0.000 443 1.466 0.000
197 1.556 0.000 459 1.465 0.000
200 1.552 0.000 477 1.464 0.000
203 1.547 0.000 496 1.463 0.000
207 1.543 0.000 517 1.461 0.000
210 1.538 0.000 539 1.460 0.000
214 1.534 0.000 564 1.459 0.000
218 1.531 0.000 590 1.458 0.000
221 1.527 0.000 620 1.457 0.000
225 1.524 0.000 653 1.457 0.000
230 1.521 0.000 689 1.456 0.000
234 1.517 0.000 729 1.455 0.000
238 1.514 0.000 775 1.454 0.000
243 1.511 0.000 827 1.453 0.000
248 1.509 0.000 886 1.452 0.000
253 1.506 0.000 954 1.451 0.000
258 1.503 0.000 1033 1.450 0.000
264 1.501 0.000 1127 1.449 0.000
270 1.498 0.000 1240 1.448 0.000
276 1.496 0.000 1378 1.446 0.000
282 1.494 0.000 1550 1.444 0.000
288 1.491 0.000 1771 1.441 0.000
295 1.489 0.000 2066 1.437 0.000
302 1.487 0.000


A - 14
TiO
2

(Base de dados da Sopra Company, http://www.sopra-sa.com/indices.htm)
(nm)
n k
(nm)
n k
(nm)
n k
180 1.370 1.998 620 2.880 0.000 1060 2.747 0.000
190 1.535 1.831 630 2.875 0.000 1070 2.746 0.000
200 1.536 1.696 640 2.870 0.000 1080 2.745 0.000
210 1.460 1.650 650 2.860 0.000 1090 2.743 0.000
220 1.433 1.806 660 2.850 0.000 1100 2.742 0.000
230 1.443 2.084 670 2.844 0.000 1110 2.741 0.000
240 1.363 2.453 680 2.840 0.000 1120 2.740 0.000
250 1.365 2.847 690 2.835 0.000 1130 2.739 0.000
260 1.627 3.197 700 2.830 0.000 1140 2.738 0.000
270 1.952 3.432 710 2.825 0.000 1150 2.737 0.000
280 3.355 3.561 720 2.820 0.000 1160 2.736 0.000
290 3.835 3.535 730 2.814 0.000 1170 2.735 0.000
300 4.732 3.280 740 2.810 0.000 1180 2.734 0.000
310 5.235 2.734 750 2.810 0.000 1190 2.733 0.000
320 5.391 2.076 760 2.810 0.000 1200 2.732 0.000
330 5.291 1.570 770 2.806 0.000 1210 2.731 0.000
340 4.969 1.093 780 2.800 0.000 1220 2.730 0.000
350 4.477 0.651 790 2.794 0.000 1230 2.729 0.000
360 3.870 0.251 800 2.790 0.000 1240 2.729 0.000
370 3.661 0.033 810 2.790 0.000 1250 2.728 0.000
380 3.498 0.000 820 2.790 0.000 1260 2.728 0.000
390 3.375 0.000 830 2.785 0.000 1270 2.727 0.000
400 3.286 0.000 840 2.780 0.000 1280 2.726 0.000
410 3.225 0.000 850 2.780 0.000 1290 2.726 0.000
420 3.186 0.000 860 2.780 0.000 1300 2.725 0.000
430 3.162 0.000 870 2.775 0.000 1310 2.725 0.000
440 3.149 0.000 880 2.770 0.000 1320 2.725 0.000
450 3.141 0.000 890 2.770 0.000 1330 2.724 0.000
460 3.130 0.000 900 2.770 0.000 1340 2.724 0.000
470 3.104 0.000 910 2.765 0.000 1350 2.723 0.000
480 3.080 0.000 920 2.760 0.000 1360 2.722 0.000
490 3.054 0.000 930 2.759 0.000 1370 2.722 0.000
500 3.030 0.000 940 2.760 0.000 1380 2.721 0.000
510 3.014 0.000 950 2.761 0.000 1390 2.721 0.000
520 3.000 0.000 960 2.760 0.000 1400 2.720 0.000
530 2.985 0.000 970 2.755 0.000 1410 2.719 0.000
540 2.970 0.000 980 2.750 0.000 1420 2.719 0.000
550 2.954 0.000 990 2.749 0.000 1430 2.718 0.000
560 2.940 0.000 1000 2.750 0.000 1440 2.717 0.000
570 2.929 0.000 1010 2.750 0.000 1450 2.716 0.000
580 2.920 0.000 1020 2.749 0.000 1460 2.715 0.000
590 2.910 0.000 1030 2.749 0.000 1470 2.714 0.000
600 2.900 0.000 1040 2.748 0.000 1480 2.713 0.000
610 2.889 0.000 1050 2.747 0.000 1490 2.711 0.000

III

Especificaes tcnicas de filtros
pticos passa-banda da Schott

ANEXO
Anexo III

A - 17


A - 18

Anexo III

A - 19


A - 20

IV

Principais esquemas da
electrnica de leitura
ANEXO
Anexo IV

A - 23
v
n
m
o
s
1
P
M
q11
q10
q9
q8
q7
q6
q5
q4
q3
q2
q1
q0
v
p
m
o
s
1
0
u
A
m
u
x
1
m
u
x
2
v
r
e
f
n
q
c
l
k
P
h
i
1
P
h
i
2
v
c
o
m
p
r
e
s
e
t
T
G
3
v
n
m
o
s
2
T
G
_
L
1
v
q
r
e
f
C
=
1
p
F
b11
b10
b9
b8
b7
b6
b5
b4
b3
b2
b0
b1
C
l
k
C
l
r
C
o
n
t
1
2
b
E
N
q
1
q
0
C
l
b
1
b
0
b
3
b
2
b
5
b
4
b
7
b
6
q
3
q
2
q
5
q
4
q
7
q
6
L
a
t
c
h
1
2
D
b
1
0
b
1
1
b
8
b
9
E
N
q
8
q
9
q
1
0
q
1
1
ABCD
MUX4
out
s
1
s
2
+-
i
b
i
a
s n
Q
P
1
P
2
Q
C
l
kC
l
o
c
k
l
a
p
p
i
n
g
N
o
n
o
v
e
r
Phi1 Phi2
V
=
2
C
L
K
L
E
R
S
T
T
i
m
e
r
+
L
g
i
c
a

Figura IV.1: Esquema detalhado do conversor luz - frequncia.

A - 24
i
n
-
n
q
P
h
i
1
P
h
i
2
ibias
i
n
+
q

Figura IV.2: Esquema detalhado do comparador.

V

Sequncia de fabrico da estrutura
multicamada da Tabela 4.6

ANEXO
Anexo V

A - 27
A Figura V.1 ilustra a configurao das mscaras e respectivas espessuras
necessrias para o fabrico da matriz de 16 filtros pticos descritos na Tabela 4.6 e cujos
espectros de transmisso foram apresentados na Figura 4.19.
(a)
1 mscara, deposita 5 nm

Espessura das camadas
at ao momento
60 320 325
320 325
320 325
320 325
60
60
65
65
65
65 60
60 320 325
320 325
320 325
320 325
60
60
65
65
65
65 60

(b)

at ao momento
80 485 490
480 485
485 490
480 485
75
80
80
75
80
75 75
80 485 490
480 485
485 490
480 485
75
80
80
75
80
75 75

(c)

at ao momento
90 495 490
490 485
495 490
490 485
85
90
80
75
80
75 85
80 485 500
480 495
485 500
480 495
75
80
90
85
90
85 75

(d)

Espessura das camadas antes da
deposio das camadas 8 a 11
110 515 510
490 485
495 490
510 505
85
90
100
75
80
95 105
100 505 520
480 495
485 500
520 515
75
80
110
85
90
105 95

Figura V.1: Mscaras e espessuras em nanmetros da matriz de 16 filtros pticos descrita na
Tabela 4.6. As cruzes so marcas para o alinhamento das mscaras.
Aps a deposio das 5 primeiras camadas em toda a matriz, sendo depositada
apenas uma espessura de 60 nm na camada 5, utilizada a 1 mscara para depositar
mais 5 nm de TiO
2
em apenas metade da matriz. Obtm-se assim os valores das

A - 28
espessuras apresentados na Figura V.1(a). Seguidamente deposita-se, em toda a matriz,
as camadas 6 e 7, esta ltima com 75 nm de espessura. Aplica-se a 2 mscara para
depositar mais 5 nm na camada 7, ficando esta camada com duas zonas de espessuras
diferentes (Figura V.1(b)). Aplica-se a 3 mscara e com ela deposita-se mais 10 nm na
camada 7, ficando esta camada com quatro zonas de espessuras diferentes
(Figura V.1(c)). Ao aplicar-se a 4 mscara depositando-se mais 20 nm na camada 7
concluem-se as 8 espessuras diferentes para esta camada (Figura V.1(d)). Por fim,
deposita-se em toda a matriz as camadas 8 a 11.
A posio dos 16 filtros pticos na matriz encontra-se na Figura V.2.
Nmero do filtro
15
5
7
12
2
4
10 13
11
1
3
16
6
8
14 9

Figura V.2: Posio dos 16 filtros pticos na matriz, utilizando as mscaras descritas na
Figura V.1 e as espessuras apresentadas na Tabela 4.6.

VI

Especificaes tcnicas do fotododo
comercial S1336-5BQ da Hamamatsu

ANEXO
Anexo VI

A - 31


A - 32

Anexo VI


A - 34

VII

Constantes fsicas, elctricas e
prefixos nas unidades de engenharia

ANEXO
Anexo VII

A - 37
Constantes fsicas e elctricas

Nome Smbolo Valor
Permitividade elctrica do vazio
0
8.85418781710
-12
Fm
-1

Permeabilidade magntica do vazio
0
410
-7
NA
-2

Constante dielctrica SiO
2

SiO
2
3.97
0

Constante de Planck h 6.6260687610
-34
J s
Nmero de Avogadro N
AV
6.0221419910
23
mol
-1

Velocidade da luz no vazio c
0
2.9979245810
8
ms
-1

Carga do electro q 1.60210
-19
C
Electro Volt eV 1.60210
-19
J

Prefixos nas unidades de engenharia

Factor multiplicativo Prefixo Smbolo
10
12
Tera T
10
9
Giga G
10
6
Mega M
10
3
Kilo k
10
2
Hecto h
10 Deca da
10
-1
Deci d
10
-2
Centi c
10
-3
Mili m
10
-6
Micro
10
-9
Nano n
10
-12
Pico p
10
-15
Fento f
10
-18
ato a

GM Tesephd

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GRAA MARIA HENRIQUES MINAS

MICROSSISTEMA LABORATORIAL PARA

E . Combinando as equaes (4.40), (4.41) e (4.42),

Energia do foto (eV)

. Nestes kits so utilizados reagentes para que os

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