UNIVERSIDADE DE SO PAULO FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS

QBQ0316 N - Bioqumica Experimental RELATRIO 01

Dborah F. Rigo, N USP 8021252 Pedro H. S. Medeiros N USP: 5899281 Tarik K. Andrade N USP 8072472 Grupo 10

So Paulo, 2013

1.0 Introduo:
As leveduras so fungos unicelulares que tm como principal funo para os humanos a fermentao. Mais especificamente a levedura saccharomyces cerevisiae, usada na fabricao de pes e bebidas alcolicas, sendo uma das mais antigas aplicaes de um microrganismo no cotidiano (1). Seu uso como modelo biotecnolgico j consagrado (2, 5), sendo um organismo robusto para experimentos na rea de bioqumica e biologia molecular. A enzima alpha glucosidase (figura1) a enzima responsvel por hidrolisar dissacardeos na poro no redutora com ligao alfa, liberando uma alpha glicose (figura2) (3). Ela est presente em diversos organismos, tendo papel, junto a outras enzimas (4, 5), de degradar acares complexos em monossacardeos que possam ser processados na gerao de ATP e formao de produtos metablicos secundrios.

Figura 1: estrutura tridimencional da alfaglucosidase

Figura 2: mecanismo de hidrolise da sacarose

2.0 Objetivos
Prtica 1: Romper cluas de Saccharomyces cerevisiae Prtica 2: Dosar colorimetricamente protenas no lisado de Saccharomyces cerevisiae. Prtica 3: Determinar a atividade da -glicosidase no lisado de Saccharomyces cerevisiae Prtica 4: Determinar o efeito do pH na atividade cataltica da glicosidase.

3.0 Materiais e Mtodos

3.1 Prtica 1: Foi ressuspenso 1g de clulas da levedura Saccharomyces cerevisiaeem 4 ml de tampo de lise, e em seguida foram adicionados 40 l de soluo de PMSF em etanol 100mM, homogeneizando-se a mistura com o auxlio de um agitador. Adicionou-se prolas de vidro (aprox. 8mL) e agitou-se a mistura por 1 minuto, seguido de 1 minuto de repouso em banho de gelo. Repetiu-se o ciclo por mais 4 vezes. A mistura foi centrifugada a 850 G por 2 minutos, coletando-se a poro lquida sobrenadante em tubo Falcon identificado como Lisado. Ao precipitado slido foi adicionado mais 4 ml de tampo de lise, 40 l da soluo em etanol 100 mM de PMSF, homogeneizando-se em agitador e centrifugando-se novamente, repetindose a adio de PMSF mais duas vezes. Ao fim, recolheu-se a poro lquida e esta foi guardada em freezer a -20C. 3.2 Prtica 2: Seguindo a tabela 1 da pgina 3 do protocolo (6) fez-se uma curva de calibrao com um tubo de ensaio como branco e 8 tubos de ensaio com concentraes variadas de albumina. Adicionou-se o reagente de Bradford e homogeneizou-se em vrtice. Fez-se a diluio do lisado. Seguindo a tabela 3, p.4 (6) fez-se 1 tubo de ensaio com o branco e adicionou-se volumes variados do lisado diludo a outros 4 tubos de ensaio. Estes procederam para a leitura de absorbncia a 595nm. 3.3 Prtica 3: Mantendo-se sempre os tubos de ensaio em gelo, transferiu-se 0,2 ml do lisado para um tubo identificado como L10X, adicionou-se 1,8 ml de gua destilada para completar 2ml e homogeneizou-se levemente; transferiu-se ento 0,4mL do L10X para outro tubo identificado como L50X, adicionando-se

em seguida 1,4mL de gua destilada, seguida de leve homogeneizao; para a ltima diluio transferiu-se 0,2mL do L50X para mais um tubo identificado como L500X adicionando-se ento 1,8mL de gua destilada, novamente homogeneizando a mistura. Feitas as diluies, deu-se prosseguimento, seguindo a tabela 1 na pgina 6 do protocolo (6), para as incubaes com as devidas triplicatas. Para cada diluio foram preparadas suas triplicatas e a cada uma delas foi adicionada 0,1ml do substrato, 0,1ml do tampo fosfato e 0,2ml do lisado diludo. Aps os tempos de incubao determinados no banho a 30C, adicionou-se 2ml do tampo carbonato/bicarbonato (pH11) para interromper a reao enzimtica. Aps agitao manual, prosseguiu-se para a preparao da microplaca de 96 poos; onde cada poo foi preenchido com 100 l de soluo de acordo com o diagrama 1 abaixo. A microplaca foi ento levada para leitura a 405nm.
Diagrama 1 Disposio das diluies na Microplaca

3.4 Prtica 4: Para este procedimento, utilizou-se a diluio L50X. Para a determinao da atividade enzimtica da NPGlc, foram preparados conjuntos de 4 tubos de ensaio para cada um dos tampes, seguindo a tabela 1, p.8 (6) do protocolo. Adicionando primeiro a enzima, seguida do lisado diludo, e mantendo os tubos incubados em banho a 30 por diferentes perodos de tempo. Aps serem retirados do banho, a reao enzimtica em cada tubo era interrompida pela adio de 2ml de tampo carbonato-bicarbonato. Depois de recuperados todos os tubos, preparou-se outra microplaca, com adio de 100ml de soluo a cada poo de acordo com o diagrama 2 abaixo. Esta placa ento prosseguiu para a leitura das absorbncias a 405nm.
Diagrama 2 - Disposio das diluies na microplaca

4.0 Resultados e Discusso

4.1 Resultados: 4.1.1 Prtica 2: Os resultados da leitura de absorbncia a 595nm(A 595) esto dispostos na tabela 1 abaixo.

Tabela 1 - Absorbncias a 595nm e respectivas massas de protena

Amostra 1 2 3 4 5 6 7 8 A1 A2 A3 A4

Massa de Protena 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 ----------------15,06882591 10,22267206

Absorbncia 0,1257 0,175 0,2653 0,2697 0,3043 0,3686 0,3855 0,5193 0,8664 0,6249 0,4514 0,3317

4.1.2 Prtica 3: Os resultados das leituras da microplaca do diagrama 1 a 405nm esto apresentadas na tabela 2 abaixo:
Tabela 2 - Leitura das absorbncias dos poos da microplaca a 405nm

Diluio
L10X L10X L10X L10X L50X L50X L50X L50X L500X L500X L500X L500X
Branco do Substrato Branco L10X Branco L50X Branco L500X

Tubos Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 -------------------------------------

Rplica 1 2,066 2,668 2,592 3,121 0,301 0,611 1,139 1,795 0,062 0,085 0,058 0,233 0,048 0,082 0,047 0,044

Rplica 2 1,221 1,299 2,448 2,532 0,240 0,364 0,905 1,504 0,066 0,119 0,041 0,210 0,030 0,080 0,064 0,065

Rplica 3 1,488 1,738 2,848 2,805 0,317 0,521 0,970 1,097 0,075 0,096 0,034 0,208 0,043 0,095 0,056 0,062

Mdia 1,592 1,902 2,629 2,819 0,286 0,499 1,005 1,465 0,068 0,100 0,044 20,217 0,040 0,086 0,056 0,057

4.1.3 Prtica 4: Os resultados das leituras da microplaca do diagrama 2 a 405nm esto apresentadas na tabela 3 abaixo:

Tabela 3 - Leitura das absorbncias dos poos da microplaca a 405nm

pH pH4 pH4 pH4 pH4 pH5 pH5 pH5 pH5 pH6 pH6 pH6 pH6 pH8 pH8 pH8 pH8 pH9 pH9 pH9 pH9 Branco Branco Branco Branco

Tubo Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 -------------------------------------

Rplica 1 0,128 0,098 0,118 0,125 1,804 2,742 3,111 2,724 1,377 2,792 2,538 2,727 2,213 3,046 1,068 2,645 0,175 0,256 0,234 0,240 0,047 0,052 0,053 0,054

Rplica 2 0,103 0,157 0,119 0,127 1,386 2,489 2,954 2,829 2,720 2,692 2,181 2,096 2,079 2,794 2,682 2,470 0,297 0,255 0,281 0,245 0,049 0,053 0,061 0,046

Rplica 3 0,095 0,163 0,134 0,130 1,740 2,759 3,113 3,005 2,972 2,525 2,562 2,759 2,268 2,648 2,616 2,495 0,321 0,278 0,287 0,265 0,050 0,077 0,049 0,053

Mdia 0,108 0,139 0,123 0,127 1,772 2,663 3,059 2,852 2,356 2,669 2,427 2,743 2,186 2,829 2,122 2,536 0,264 0,263 0,267 0,250 0,048 0,060 0,054 0,051

Mdia pH

0,124

2,586

2,549

2,418

0,261

0,053

4.2 Discusso: 4.2.1 Prtica 1: Ao executar a lise celular da levedura Saccharomyces cerevisiae, expem-se os componentes internos clula ao meio externo e pem-se em contato diversas substncias que estariam a princpio separadas em diversas organelas e compartimentos. Como de nosso interesse preservar certos elementos, foi necessrio tomar certas medidas. A primeira delas foi a adio de PMSF ao lisado. PMSF um inibidor de proteases(7), mais especificamente um inibidor de proteases de serina. Este inibidor impede que as proteases clivem as protenas que iro ser analisadas aps a lise. Por fim, o lisado foi mantido em gelo para tanto diminuir a atividade de enzimas que no so inibidas pelo PMSF, como para impedir a desnaturao das enzimas de interesse analtico. Abre-se ainda a possibilidade de frear a atividade de possveis contaminantes que possam se aproveitar dos nutrientes disponveis

O sucesso e validade do experimento pode ser inferido com base nas medidas analticas das prticas seguintes. No entanto, para uma maior certeza a respeito de sua eficincia quanto quo disponvel os compostos de interesse se tornaram e qual a real efetividade do uso do PMSF e da manuteno do mesmo congelado, seriam necessrias repeties do mesmo com um estoque uniforme de leveduras. 4.2.2 Prtica 2: Ao relacionar os dados obtidos com a curva padro, notou-se que apenas 2 deles encaixavam-se no intervalo da mesma. Descartaram-se ento os resultados que no estavam dentro da curva e relacionou-se as suas absorbncias a uma concentrao de protenas em mg/ml e determinou-se a mdia dos dois resultados. Foi feita uma observao por parte dos professores que a amostragem de protenas estaria abaixo do normal para a quantidade de clulas lisadas. Essa variao, no entanto, pode ter origem na prpria variabilidade da populao da qual a amostra foi retirada ou ser fruto de algum erro metodolgico no procedimento de lise, porm, como no h uma mdia estabelecida para a amostra utilizada pelos diversos grupos e os resultados estavam dentro da curva de calibrao, no h porque invalid-los. 4.2.3 Prtica 3: *As medidas realizadas para as prticas 3 e 4 utilizando nosso lisado extrapolaram a curva de calibrao, impossibilitando a utilizao dos dados. Para fins de exerccio de anlise de dados foram utilizados dados de outro grupo. Foram tirados medidas de branco da enzima e do substrato pois no meio reacional complexo vrios constituintes que absorvam o mesmo comprimento de onda. Dessa maneira, o branco da enzima e do substrato somados deve ser retirado dos resultados experimentais. Nos dados analisados, a diluio de 50X adequou-se curva de calibrao da concentrao de NPGlc(y=0,0049x + 0,014) e foi utilizada para medio de protenas. As demais curvas, de 10X e 500X apresentam distores importantes que podem prejudicar a anlise, como dados fora da curva de calibrao e um R2 baixo, indicando pouca linearidade. Calculando ento o coeficiente angular do grfico, resultando em um valor equivalente de um e adequando-o s diluies executadas, temos os seguinte resultados para atividades enzimticas:

4.2.4 Prtica 4: Na prtica quatro foram feitos ensaios enzimticos semelhantes prtica 3 em diversos pHs. Os resultados observados revelam uma maior atividade em uma faixa de pH de 5 a 8. H pouca diferena entretanto entre as medies relativas a estes pHs, o que impossibilita a afirmao de qual pH medido est mais prximo quele de tima atividade da enzima. As referncias desta enzima em sua verso comercial, no entanto (8) revela pHs que giram em torno de 6,8 para certos tipos de alpha glucosidades comerciais de Saccharomyces cerevisiae.

5.0

Concluses
5.1 Prtica 1:

As clulas foram rompidas com sucesso, possibilitando o uso do lisado para anlises posteriores nas prticas seguintes no nvel de quantificao de protenas e ao das enzimas. 5.2 Prtica 2:

A curva padro de albumina com Bradford mostrou-se vlida no modelo, possibilitando a estimativa da quantidade de protenas no interior das clulas 5.3 Prtica 3:

A alpha-glicosidase analisada mostrou-se presente no nosso lisado e sua atividade foi constatada por meio da adio de seu substrato. 5.4 Prtica 4:

O pH timo pode ser estimado analisando-se a atividade da enzima em diferentes pHs e, com a ajuda da literatura, estima-se que seja por volta de 6, apesar de, em nossos testes, a atividade tima no poder ser estimada com preciso.

6.0

Referncias
Saccharomyces cerevisiae diversity reflects human history. Molecular Ecology 16. 2007. p.20912102. Ostergaard, S; Olsson, L; Nielsen, J. Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. Vol. 64, n.10. 2000. p. 3450. Bioinformatics Resource Portal. Aplha-Glucosidase. http://enzyme.expasy.org/EC/3.2.1.20. Acesso em 14/09/2013. Disponvel em:

1. LEGRAS, JL; MERDINOGLU, D; CORNUET, J-M; KARST, F. Bread, beer and wine: 2.

3. ExPASy

4. DEZSO, Z; OLTVAI, Z.N.; BARABSI, A-L. Bioinformatics Analysis of Experimentally

Determined Protein Complexes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae . Department of Physics, University of Notre Dame, Notre Dame.

5. KARATHIA, H; VILAPRYNIO, E; SORRIBAS, A; ALVES, R. Saccharomyces cerevisiae as a

Model Organism: A Comparative Study. PLoS ONE Vol. 6, n.2. 2011.

6. Carlos

Hotta Lab. Apostila de Exerccios. Disponvel http://www.carloshotta.com.br/storage/2013_qbq0316n/apostila_protocolos_Bioq_Exp.pdf. Acesso em 13/09/2013

em:

7. GRCIA-CARREO, FL. Protease inhibition in theory and pratice.Biotechnology Education

3. 4. 1992. p 145-150

8. Alpha-Glusidase

de Saccharomyces cerevisiae comercial: disponvel http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g5003?lang=pt&region=BR. Acesso em 13/09/2013

em:

7.0 Anexo: Questes complementares

---------------------------------------------------------------------------------------------------------1. A concentrao de protenas no lisado (mg/ml) e a quantidade total de protenas obtidas (mg). Para obter esta informao ser necessrio calcular: a) Plotar a curva padro da concentrao de protena pela Abs595nm:

Massa (mg) x Absorbncia (em 595nm)

0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000

Figura 3: grfico plotado com a curva padro obtida e a concentrao das amostras.

b) Calcular a equao da reta para o grfico plotado: Equao da reta: y = 2*10^-5x + 0,0792
Tabela 1: valores utilizados na curva padro (1 8) e valores obtidos a partir da medio das amostras (A1 A4)

c) A concentrao de protenas (mg/ml) no L100X: A diluio utilizada foi L20X, pois nosso lisado apresenta menor concentrao de enzimas do que o esperado. Como foi demonstrado no grfico e na tabela de resultados nossa curva padro abrange resultados entre 0,1257 e 0,5193. Portanto podemos utilizar apenas dois dos valores obtidos da medio das amostras (A3 e A4). Concentrao no L20X = 12,645748985mg (mdia das massas vlidas) / 1,1mL(volume) = 11,4961354409mg/ml d) A concentrao de protenas (mg/ml) no lisado inicial: CV(inicial)=CV(final) 11,4961354409/1,1 * 1,1= C(inicial) 15mL C(inicial) = 0,7664090294mg/mL 2. A concentrao da atividade enzimtica (mU/ml) e no lisado em pH 7,0. Para obter esta informao ser necessrio calcular: a) Converter a Abs420nm em concentrao de NPGlc (mM) A tabela a seguir mostra as absores em 405nm e as concentraes da -glucosidase nos quatro tubos em pH7, foi utilizado o lisado diludo em 50X: Absoro em Branco Concentrao(mMol) 420nm Tubo 1 0,317 5,538*10^-5 Tubo 2 0,521 9,885*10^-5 0,056 Tubo 3 0,97 2,021*10^-4 Tubo 4 1,097 2,960*10^-4 b) Plotar um grfico com a concentrao de NPGlc (mM) pelo tempo para cada concentrao de lisado.

Diluio 10X (nMol X Tempo)

600 400 200 0 0 10 20 30 Diluio 10X (nMol X Tempo) y = 17.992x + 208.47 R = 0.9519

Diluio 50X (nMol X Tempo)

400 300 200 100 0 0 10 20 30 Diluio 50X (nMol X y = 16.502x - 43.187 R = 0.975

Diluio 500X (nMol X Tempo)

60 40 20 0 0 10 20 30 Diluio 500X y = 1.5959x - 1.0154 R = 0.4334

c) Calcular a equao da reta para o grfico plotado L10X - y = 17.992x + 208.47 L50X - y = 16.502x - 43.187 L500X - y = 1.5959x - 1.0154 d) Utilizar a equao da reta para calcular a atividade enzimtica (mU) de cada concentrao de lisado. Utilizando o coeficiente angular da reta e lembrando que foi utilizado 0,4 mL de lisado, tem-se que a atividade enzimtica do grfico de diluio 50X foi de 41,255 mU e) Calcular a concentrao da atividade enzimtica (mU/ml) do lisado original, no se esquea de corrigir pela diluio. Retirando-se o efeito da diluio (50X), temos que que a atividade enzimtica do lisado original utilizado para anlise era de 2062,75 mU. f) Calcular a atividade especfica do lisado (mU/mg) Levando-se em conta que foi utilizado 0,4 mL do lisado, sendo a contrao do lisado 0,7664090294mg de protenas/mL, temos que a atividade especfica : 6732 um/mg

3. O grfico com a concentrao a atividade enzimtica (mU/ml) em diversos pH. Para obter esta informao ser necessrio calcular: a) Converter a Abs420nm em concentrao de NPGlc para cada pH. pH 4: Concentrao (nmol/ml) Atividade enzimtica (mU) Tubo 1 19,319 Tubo 2 25,578 0,164 Tubo 3 22,380 Tubo 4 23,129 pH 5: Concentrao (nmol/ml) Atividade enzimtica (mU) Tubo 1 358,775 Tubo 2 540,680 14,849 Tubo 3 621,496 Tubo 4 579,319 pH 6: Concentrao (nmol/ml) Atividade enzimtica (mU) Tubo 1 478,027 Tubo 2 541,972 0,374 Tubo 3 492,448 Tubo 4 556,938 pH 8: Concentrao (nmol/ml) Atividade enzimtica (mU) Tubo 1 443,401 Tubo 2 574, 557 1,398 Tubo 3 430,204 Tubo 4 514,829 pH 9: Concentrao (nmol/ml) Atividade enzimtica (mU) Tubo 1 51,088 Tubo 2 50,816 0,157 Tubo 3 51,700 Tubo 4 48,163 b) Plotar o grfico do aumento da concentrao de NPGlc ao longo do tempo para cada pH.

Ph 4 (nMol/mL X min)
30 20 10 0 0 10 20 30 Linear (Ph 4 (nMol/mL X min)) y = 0.1646x + 20.544 R = 0.1697 Ph 4 (nMol/mL X min)

Ph 5 (nMol/mL X min)
800 600 400 200 0 0 10 20 30 Linear (Ph 5 (nMol/mL X min)) y = 14.849x + 339.46 R = 0.6867 Ph 5 (nMol/mL X min)

Ph 6 (nMol/mL X min)
580 560 540 520 500 480 460 0 10 20 30 y = 3.7442x + 470.54 R = 0.4038 Ph 6 (nMol/mL X min) Linear (Ph 6 (nMol/mL X min))

Ph 8 (nMol/mL X min)
800 600 400 200 0 0 10 20 30 Linear (Ph 8 (nMol/mL X min)) y = 1.3986x + 473.27 R = 0.0181 Ph 8 (nMol/mL X min)

Ph 11 (nMol/mL X min)
52 51 50 49 48 47 0 10 20 30 y = -0.1578x + 52.415 R = 0.4245 Ph 11 (nMol/mL X min) Linear (Ph 11 (nMol/mL X min))

c) Calcular a equao da reta para o grfico plotado pH4 - y = 0.1646x + 20.544 pH5 - y = 14.849x + 339.46 pH6 - y = 3.7442x + 470.54 pH8 - y = 1.3986x + 473.27 pH11 - y = -0.1578x + 52.415 d) Utilizar a equao da reta para calcular a atividade enzimtica em cada pH pH4 = 0,164 pH5 = 14,849 pH6 = 3,744 pH8 = 1,398 pH11 = -0,157 e) Calcular a atividade enzimtica relativa em cada pH. A atividade enzimtica relativa a porcentagem da atividade enzimtica em cada pH em relao maior atividade enzimtica observada (incluir as medidas da P3 em pH 7,0 na anlise). pH4 = 1,104% pH5 = 100% pH6 = 25,213% pH8 = 9,414% pH11 = 1,057% f) Plotar um grfico com a atividade enzimtica relativa pelo pH do tampo

Atividade Enzimtica X pH
16000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 0 2 4 6 8 10 12

Alm disso, o relatrio dever conter as respostas das seguintes perguntas: a) Qual a razo de se manter o lisado em gelo? Sabe-se que as reaes enzimticas apresentam uma faixa tima de ao, sabe-se tambm que ao lisar-se uma clula as enzimas de apoptose celular so ativadas e essas por sua vez destroem as demais enzimas, e para que isso no ocorra ns retiramos as enzimas de apoptose de sua faixa de atuao para que possamos extrair a enzima desejada. O gelo ento utilizado para manter a atividade enzimtica reduzida.

b) Por que foi adicionado 100 mM PMSF ao tampo de lise? O PMSF largamente utilizado como Inibidor enzimtico que inativa as enzimas de apoptose.
Disponvel em: http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=Fluoreto+De+Fenilmetilsulfonil&lang=3. Acesso 17/09/2013

c) Qual a razo de se usar um branco ao utilizar o espectrofotmetro? O branco importante para que a medida seja relativa somente concentrao de enzimas na amostra e de substrato adicionado mesma, uma vez que ele tenta retirar o interferente relativo aos demais componentes da soluo, impedindo assim que uma condio prvia ao experimento interfira nos resultados. d) Por que se utiliza NPGlc para medir a atividade enzimtica da glicosidase? O NPGlc um substrato enzima provavelmente no presente ou no presente em quantidades significativas no lisado. Desta maneira, podemos, portanto, inferir que a atividade detectada por meio da degradao do mesmo corresponde exatamente ao da -glicosidase sobre ele. Temos ento uma medida confivel. e) Qual a razo de se utilizar um branco do substrato e um branco da enzima? O branco tem como finalidade minimizar os erros decorrentes da absoro da luz pela soluo onde a amostra est contida, porm nesse caso no a amostra sozinha que nos fornece a medio, ela ainda precisa reagir com o

substrato. Para manter ento os erros experimentais baixos procura-se subtrair no s a absoro do substrato como tambm a da amostra de enzimas (Disponvel em: http://www.infoescola.com/quimica/espectrofotometria/. Acesso em 17/09/2013). f) Em qual pH a atividade da enzima deve ser mxima? Como o pH de um tampo pode influenciar na atividade enzimtica? A atividade mxima da enzima deve ocorrer por volta de pH 5 e 6, conforme foi detectado nas medies. O pH tem influncia vital na atividade da enzima pois a forma que esta ir assumir esta ligada suas cadeias laterais protonadas ou desprotonadas. Dependendo do balano de cargas de suas cadeias laterais, a enzima assumir conformaes diferentes, podendo afetar seus stios ativos de maneira quer no mais consigam catalisar a reao.