Você está na página 1de 4

DEPARTAMENTO DE CINCIAS DA VIDA (FCTUC)

LICENCIATURA EM BIOQUMICA

LABORATRIOS DE BIOQUMICA II
(ANO LECTIVO DE 2013/2014)

Professores:

Angelo Tom (Responsvel) Euclides Pires Rui Carvalho

TRABALHO PRTICO N 7 ANLISE DE ACARES REDUTORES EM AMOSTRAS ALIMENTARES


1. OBJECTIVO

Determinao da quantidade de acares redutores (em termos de glucose) existentes em farinhas lcteas Nestum ou Crelac usando espectrofotometria do visvel. 2. INTRODUO

A anlise de acares redutores atravs do teste com o cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS) simples, rpida, com resultados dignos de confiana e tem sido muito utilizada na pesquisa de hidratos de carbono em diagnsticos mdicos. Desde que o DNS foi introduzido como reagente para a determinao de substncias redutoras na urina (1921), este composto tem sido usado para a quantificao de acares no sangue, de grupos terminais redutores produzidos na hidrlise do amido e para ensaios da actividade de carbohidrases. Na presena de acares redutores e por aquecimento, o DNS, de cor amarela, forma um produto de reduo de cor vermelho-acastanhada, o 3-amino-5-nitrosalicilato, que absorve na regio do visvel a um =540 nm (podem, no entanto, ocorrer reaces laterais que compliquem a qumica do processo). Com o auxlio de uma curva padro obtida com os valores de absorvncia lidos em solues de D-glucose de concentrao conhecida possvel determinar a quantidade de hidratos de carbono redutores nas amostras alimentares a analisar. Como a capacidade redutora dos diferentes hidratos de carbono no a mesma, os resultados so apresentados em termos da percentagem de D-glucose de cada amostra alimentar. 3. PARTE EXPERIMENTAL

3.1. Material - Esptula metlica - Pilo e almofariz - Papel de pesagem - Pra de borracha - Proveta de 100 mL - Erlenmeyer de 100 mL - Copo de 600 mL - Placa de aquecimento elctrica - Esguicho com gua - Vareta de vidro - Funil de vidro - Papel de filtro - Suporte para tubos de ensaio - Tubos de ensaio de vidro de 16 cm - Pinas de madeira - Suporte p/ pipetas - Pipeta graduada de 20 mL - Balo de diluio de 50 mL - Clulas espectrofotomtricas plsticas - Colormetro ou espectrofotmetro - Pipetas volumtricas de 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL

3.2. Reagentes -Amostras alimentares (Nestum ou Crelac) -cido 3,5-dinitro-saliclico (DNS, cido 2-hidroxi-3,5-dinitro-benzico) -D-glucose -cido sulfrico -Hidrxido de sdio -Tartarato de sdio e potssio tetra-hidratado 3.3. Solues -Reagente de DNS: dissolver com agitao e aquecimento 10 g de DNS em 200 mL de NaOH 2M; dissolver 300 g de tartarato de sdio e potssio tetra-hidratado em 500 mL de gua destilada. Misturar as duas solues e ajustar o volume final a 1 L com gua destilada. -Soluo-padro de D-glucose de concentrao 1.50 mg/mL (conservar no frigorfico). -Soluo de H2SO4 1.5 M -Soluo de NaOH 10% (m/v) 3.4. Tcnica 3.4.1. Preparao das amostras alimentares Pesar rigorosamente cerca de 50 10 mg de amostra alimentar para analisar (se necessrio, proceder previamente a uma triturao da amostra de modo a ter o material em p) e transferir para um balo erlenmeyer. 3.4.2. Hidrlise dos di e polissacardeos Ao balo erlenmeyer contendo a amostra adicionar 10 mL de H2SO4 1.5 M e aquecer num banho de gua em ebulio durante 20-30 minutos, agitando ocasionalmente. Arrefecer o erlenmeyer, adicionando cuidadosamente 12 mL de NaOH a 10% (m/v) e agitar. 3.4.3. Filtrao dos hidrolisados Aquecer novamente o erlenmeyer contendo o hidrolisado e proceder a uma filtrao por gravidade para uma proveta de 100 mL, ou para um copo. A filtrao deve realizar-se enquanto as solues esto quentes, caso contrrio esta processar-se- lentamente. Para que no haja perdas, uma vez que se trata de uma anlise quantitativa, lavar com gua quente o erlenmeyer que continha o hidrolisado e filtrar as guas de lavagem. Transferir o filtrado para um balo de diluio de 50 mL, acertar o volume final com gua destilada e homogeneizar.

3.4.4. Adio de DNS aos hidrolisados filtrados Transferir 1.0 mL do hidrolisado para cada um de trs tubos de ensaio (A1, A2 e A3; ensaio em triplicado). Adicionar a cada um dos tubos 1.0 mL de reagente DNS e em seguida 2 mL de gua destilada. 3.4.5. Adio de DNS s solues-padro de D-glucose Pipetar quantidades apropriadas de soluo-padro de D-glucose 1.5 mg/mL e gua destilada, para tubos devidamente identificados, de modo a obter 1.00 mL de cada uma das seguintes solues-padro de D-glucose: 0.30, 0.54, 0.96, 1.20 e 1.50 mg/mL. Para um sexto tubo de ensaio, que servir de branco, pipetar 1.0 mL de gua destilada. A cada tubo adicionar 1.0 mL de reagente de DNS e 2.0 mL de gua destilada. 3.4.6. Desenvolvimento da cor do DNS reduzido Aquecer num banho de gua em ebulio durante pelo menos 5 minutos os tubos de ensaio que contm os hidrolisados, bem como os que contm as solues-padro de D-glucose, para permitir que se d a reaco entre o acar redutor e o DNS. Arrefecer os tubos para ter a certeza que a reaco terminou. Ajustar o volume de cada tubo a 14 mL com gua destilada e agitar. 3.4.7. Leituras de absorvncia Depois de calibrar o colormetro com a soluo designada de branco, para =540 nm, proceder s leituras de absorvncia de cada uma das solues-padro de D-glucose e das solues correspondentes s amostras alimentares a analisar.

4.

CLCULOS E TRATAMENTO DOS RESULTADOS

4.1. Fazer a representao grfica da lei de Beer-Lambert a =540 nm para as amostras de Dglucose de concentrao conhecida. 4.2. Calcular a percentagem de acares redutores (em termos de D-glucose) em cada amostra alimentar analisada.

5.

BIBLIOGRAFIA

Um livro de referncia de Bioqumica (ver o(s) captulo(s) sobre sidos ou glcidos).