Practica # 8 Tincin Diferencial Salvador Daniel Solano Rosado 1120748156 Departamento De Microbiologa-Facultad de Ciencias BsicasUniversidad De Pamplona

Resumen El objetivo fundamental de este laboratorio fue reconocer el tipo de pared celular y la inspeccin de esporas, a travs de tinciones compuestas o diferencial. Posteriormente se observan unos tipos de coloracin despus de hecha la tincin de las cuales las ms comunes son moradas para las bacteria Gram positivas y rojizas para las Gram negativas, en el caso de las esporas verdosas. Se pudo observar que en el momento de la coloracin se debe esperar el tiempo estipulado de acuerdo con el colorante agregado, esto con el fin de un mejor resultado; de lo que se pudo concluir que seguir las instrucciones debidamente genera una tincin acertada.

Palabras clave Compuesta, coloracin, colorantes, estructuras, fijacin. Introduccin La tincin compuesta o diferencial requiere dos o ms colorantes, como en la tcnica de Gram, la de Ziehl Neelsen, tincin de esporas etc. Algunas de estas tcnicas permiten la demostracin de estructuras especficas como capsulas, flagelos, esporas etc. Otras tien selectivamente bacterias de un tipo especfico.1 Debe su nombre al Bacterilogo Dans Christian Gram que la desarrollo en 1844. Es una tincin diferencial, clasificando a las bacterias en Gram positivas y Gram negativas de acuerdo a las propiedades de su pared celular. En su mayor parte los microorganismos son demasiado pequeos para observarse a simple vista: protozoos, algas, hongos, bacterias y virus. Estos microorganismos difieren en caractersticas tales como forma de nutricin, estructura, tamao, composicin entre otros aspectos; es por ello que se emplea el estudio microscpico el facilita notablemente la observacin; principalmente en las bacterias se facilita al tratarlas con colorantes o tintes los cuales facilitan

tambin la observacin de ciertas estructuras celulares y como en este caso particular las endosporas. En este informe se distinguirn las endosporas presentes en una muestra bacteriolgica y para lo cual se desarrollar el mtodo de tincin con verde de malaquita y safranina; asimismo se da a conocer un anlisis de los resultados obtenidos en la prctica.2 Materiales Porta y cubre objeto Solucin salina Asa bacteriolgica Cepas (Escherichia coli, staphylococcus, bacillus) Colorantes (cristal violeta, lugol, alcohol cetona, fuchina o safranina, verde malaquita) Microscopio Metodologa experimental 1. Se hace un frotis de la cepa en un porta objeto, este mismo es fijado y posteriormente se le agregan los colorantes de acuerdo con el tipo de tincin que se desea realizar; para cada colorante se debe esperar un tiempo y se deben enjuagar con agua. 2. Luego se seca al aire se le coloca el cubre objeto y se examina en el microscopio. 3. Por ltimo se observa que coloracin se obtuvo. Resultados Tincin de Gram
Tincin de Gram en Staphylococcus.

Tincin de Gram en Escherichia coli

Tincin

de

Gram

mixta

Colorante Cristal violeta Lugol solucin iodada Alcohol

Reaccin y coloracin de las bacterias GRAM POSITIVAS GRAM NEGATIVAS Clulas color violeta Clulas color violeta Se forma el complejo CV-I. Las clulas continan teidas de color violeta. Se deshidratan las paredes celulares. Se contraen los poros. Disminuye la permeabilidad. El complejo CV-I no sale de las clulas que continan teidas de color violeta. Clulas no decoloradas; quedan teidas de color violeta. Se forma el complejo CV-I. Las clulas continan teidas de color violeta. Eliminacin por extraccin de grasas de las paredes celulares. Aumenta la porosidad. El complejo CV-I se separa de la clula.

Safranina

Clulas decoloradas; se tien de color rojo o rosado.

Coloracin para esporas (mtodo se Scheffer Fulton) Bacillus Del montaje al microscopio ptico, se observaron bacillos Gram positivos esporulados; asimismo se apreciaron esporas solitarias de forma circular.

El verde de malaquita es un colorante dbilmente bsico (tiene una carga positiva dbil) y por tanto, se une dbilmente a la bacteria. Penetra en las clulas vegetativa Cuando se calienta la preparacin tambin penetra las endosporas. Durante el lavado con agua, el verde de malaquita se elimina de las clulas vegetativas, pero no de la endospora. El colorante de contraste (la safranina) solo puede teir a las clulas vegetativas (decoloradas por el agua).3 Anlisis de resultados Los colorantes son fundamentales para el mtodo de tincin compuesta ya que estos colorean la muestra lo que nos lleva a la identificacin del tipo de pared celular de la bacteria. Para cada colorante es importante el tiempo estipulado de espera ya que esto nos favorece en los resultados. Conclusin Se pudo realizar diferentes muestras de cepas a partir del mtodo tincin compuesta de lo cual se examin el tipo de pared celular y la formacin de esporas gracias a la coloracin que se obtuvo esta no permiti identifica la estructura celular de la bacteria o su forma. En la tincin de Gram se hizo una muestra mixta de lo que podemos decir que la mezcla de diferentes cepas no influye en la identificacin de su estructura y de su pared pero el frotis debe realizarse con ms cuidado que el de los otros

Anexos 1. en que radican las diferencias estructurales entre bacterias Gram positivas y bacterias Gram negativas? BACTERIAS GRAM POSITIVAS Poseen una pared celular interna y una pared de peptidoglucano. Peptidoglucano: es un exoesqueleto que da consistencia y forma esencial para replicacin y supervivencia de la bacteria. No tiene membrana externa BACTERIAS GRAM NEGATIVAS Poseen una pared celular ms compleja: -pared celular interna -pared de peptidoglucano - bicapa lipdica externa Membrana externa: forma un saco rgido alrededor de la bacteria, mantiene estructura y es barrera impermeable a macromolculas, ofrece proteccin en condiciones adversas Espacio periplasmtico: espacio entre la superficie externa de la membrana citoplasmtica y la interna de la membrana externa. La red de murena presenta una sola capa

No tiene espacio periplasmtico

La red de murena est muy desarrollada y llega a tener hasta 40 capas La penicilina mata a las Gram positivas, ya que bloquea la formacin de enlaces peptdicos entre las diferentes cadenas del peptidoglucano

La penicilina no mata a las Gram negativas, a causa de la capa de lipopolisacridos situada en la parte externa de la pared celular. Contiene LPS: estimulador de No contiene LPS respuestas inmunes: activa clulas B, liberacin de IL, FNT, IL 6 por macrfagos. En la tincin de Gram, retienen la tincin Quedan decoloradas. azul Conservan el complejo yodocolorante Son esporulantes y no esporulantes, como Streptococcus, Cisteria, Frankia. Poseen otros componentes: cidos teicoicos y lipoteicoicos, y polisacridos complejos.
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Pierden el complejo yodocolorante Pueden ser anaerobios o aerobios

Poseen protenas con concentraciones elevadas.

2. Por qu razn los colorantes deber guardarse en frascos de color mbar? Para la proteccin de la luz ya que estos son reactivos fotosensible 3. Qu se debe tener en cuenta al preparar un colorante? Las fases en que pueden considerarse desglosado el proceso de fabricacin son: 1 reaccin 2 filtracin 3 secado 4 molturacin Las dos ltimas fases se emplearn en aquellos colorantes en forma de polvo pero no cuando es en forma de pasta. La reaccin tiene lugar en los reactores, que suelen ser aparatos cilndricos provistos de todos los elementos necesarios para que se verifique el proceso de obtencin del colorante, tales como serpentines de calefaccin, agitadores, condensadores, conductores, dispositivos... El material empleado en la construccin de aquellos deber estar proyectado de acuerdo con las sustancias y las condiciones de trabajo presentes. Dado que la mayor parte de los colorantes se obtienen por precipitacin desde un medio lquido que puede ser acuoso, alcohlico, o mezcla de ambos, hay que proceder a la filtracin para separar el colorante del resto. Estas soluciones no son neutras sino alcalinas o cidas, dato que tambin debe tenerse en cuenta a la hora de la eleccin de los materiales. El tipo de filtro a emplear vendr condicionado por la cantidad de productos manipulados. La parte filtrada, si contiene disolventes, tiene que ser enviada a evaporar, para separar estos y ser utilizados de nuevo en el proceso. La parte slida, separada en la filtracin es enviada para su secado. Los sistemas de secado son muy variados destacando los tneles de secado, con circulacin de aire caliente, estufas, proyeccin sobre superficies calientes, etc... Es muy importante en la operacin del secado no alcanzar, y sobre todo, no sobrepasar la temperatura para a cual el colorante se descompone. Algunas de ellos lo hacen a temperatura baja siendo, por tanto, preciso realizar el secado utilizando conjuntamente calor y vaco. Le sigue al secado la molturacin. Aqu tambin hay que tener presente el grado de pulverizacin exigida, a la hora de la eleccin del molino. Estos son tipos especialmente fabricados para la molienda de los colorantes secos, alcanzndose con los molinos de chorro, y por exigencias del colorante, partculas que tiene de dimetro entre una y diez micras.

Dado que con frecuencia la tonalidad del colorante obtenido no coincide exactamente con el de preparaciones anteriores, antes de ser envasado, se le adicionan pequeas cantidades de otras sustancias hasta que el colorante tenga la tonalidad adecuada. 4. Por qu algunas tinciones no se fijan por calor? Los bacterilogos fijan con calor frotis bacterianos calentando suavemente con una llama una pelcula de bacterias secada previamente al aire. Este mtodo conserva adecuadamente la morfologa general, pero no las estructuras internas de la clula. Hay que utilizar la fijacin qumica para proteger la subestructura fina y la morfologa de microorganismos delicados de mayor tamao. Los fijadores qumicos penetran las clulas y reaccionan con componentes celulares, normalmente protenas y lpidos, para inactivarlos y convertirlos en insolubles e inmviles. Las mezclas comunes de fijacin contienen sustancias como etanol, cido actico, cloruro mercrico, formaldehido y glutaraldehido. 5. Por qu la edad de un cultivo afecta las tinciones? Al tener mayor edad se afectan las estructuras de las bacterias, como su pared celular, la membrana, es general las externas, que son las que el colorante debe atravesar para poder ver al microscopio. As por ejemplo, una bacteria Gram positiva puede llegar a verse como Gram negativa, por la prdida progresiva de su pared celular.

Bibliografa 1. Luis Roberto Alarcn, 2004, manual de prctica de microbiologa bsica y de alimentos, ciudad de Jurez, pagina 14. 2. http://www.monografias.com/trabajos69/tincion-esporas-bacterianas/tincionesporas-bacterianas.shtml. 3. http://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/tinciones/endosporas. 4. Estudiantes de Medicina Humana de la Universidad de San Martn de Porres, 2010, bacteria Gram positivas y Gram negativas, Biologa Mdica Seminarios de Biologa Celular y Molecular USMP Filial Norte, http://biologiamedica.blogspot.com/2010/09/bacterias-gram-positivas-ygram.html.