Analiza cantitativa hplc a ceaiului verde, a polifenolilor din ceai verde

INTRODUCERE n timpul metabolismului celular normal, aproximativ 98% din oxigenul molecular este n totalitate redus la ap. estul de !% produce specii reactive de oxigen, afect"nd n mod direct #esuturile, prin oxidarea proteinelor celulare, a lipidelor $i a acizilor nucleici. n condi#ii fiziologice normale, exist un echilibru ntre formarea radicalilor liberi $i ndeprtarea lor de ctre sistemele de aprare antioxidant ale corpului. Acestea includ enzime ca superoxid dismutaza, glutation peroxidaza $i catalaza, dar $i antioxidan#i neenzimatici ca gluationul, acidul ascorbic, tocoferolii, etc. n condi#ii patologice, produc#ia radicalilor liberi cre$te, mpreun cu o cre$tere a consumului $i o descre$tere a produc#iei acestor molecule antioxidante de aprare, conduc"nd la afec#iuni celulare sau chiar la moarte. %lavan&'&olii, un subgrup al flavanoidelor, care include catechinele, contribuie alturi de sistemul antioxidant enzimatic la aprarea antioxidant a celulelor. %lavan&'&olii pot lupta de asemenea mpotriva (A)(* +,+-, contribuind la prevenirea acestei boli. +tiliz"nd tehnica (romatografiei de ,ichide de nalt .erforman# /0.,(1 se separ, se identific $i se evalueaz con#inutul de catechine din extracte de ceai verde. .entru extractele caracterizate se monitorizeaz $i se compar activitatea antioxidant utiliz"nd diferite metode2 3 A(, 4*A(, 5..0. 6etoda de determinare a capacit#ii de absorb#ie a radicalului oxigenului, 3 A( este o metod nou de evaluare a activit#ii antioxidante a alimentelor. 5eterminarea poten#ialului antioxidant al extractelor de ceai verde bogate n catechine $i capacitatea acestora de a prote7a in vitro celulele epiteliale pigmentate din retina uman, n scopul utilizrii lor ca suplimente n prevenirea degenerescen#ei maculare senile. 8&au ales celulele .* /linia 59:;1 pentru a studia mecanismul

<

molecular la rspunsul adaptativ la stresul oxidativ. Acesta este primul studiu ce evalueaz efectul catechinelor asupra sistemului antioxidant de aprare al celulelor .*. 5atele recente demonstreaz c polifenolii din ceaiul verde pot induce evenimente ale semnalizrii celulare, implicate n inhibarea cre$terii celulare, progresia ciclului celular, induc#ia apoptozei, inhibi#ia angiogenezei, a invaziei tumorii $i a metastazei cancerului de prostat. (a atare se utilizeaz extractul .ol=phenon * ca poten#ial agent chemopreventiv n cancerul de prostat. 8&au urmrit cile moleculare $i mecanismele de ac#iune ale acestui extract asupra metabolismului celular. Principalele obiective sunt: *xtrac#ia flavan&'&olilor din cele > extracte de ceai verde. (eaiurile au fost procurate de pe pia#a rom"neasc /?edda1 $i de pe pia#a 7aponez /ceai verde 7aponez1. 8uplimentele alimentare au fost ob#inute de la companiile comerciale /.harmanex@ 4eacalon@ Aapan@ .ol=phenon *1@ (aracterizarea extractelor de ceai verde prin (romatografia de ,ichide de nalt .erforman#@ *valuarea activit#ii antioxidante a extractelor de ceai verde, utiliz"nd metodele 3 A(, 4*A( $i 5..0 $i determinarea con#inutului total de polifenoli@ *fectele extractului de ceai verde /.ol=phenon *1 asupra viabilit#ii celulelor epiteliale din retina uman /59:;1 $i determinarea nivelului de specii reactive de oxigen intracelulare@ *valuarea activit#ii superoxid dismutazei, catalazei, glutation peroxidazei $i cuantificarea glutationului, dup tratamentul cu .ol=phenon * $i catechine. 8tudiul influen#ei produsului .ol=phenon * asupra morfologiei celulelor .(&' n func#ie de concentra#ia $i durata tratamentului@ *fectele induse de .ol=phenon * asupra proliferrii, folosind metoda B84&< $i colorarea cu cristal violet@ *valuarea apoptozei prin floC citometrie@

*valuarea efectelor induse de .ol=phenon * asupra expresiei proteinei .()A utiliz"nd analiza Bestern blot. < (apitolul < $i ! caracterizeaz flavan&'&olii, n func#ie de propriet#ile lor

chimice $i biochimice, $i trece n revist metodele analitice de separare $i dozare a acestora. ! (apitolul ' prezint implica#iile stresului oxidativ n etiologia

degenerescen#ei maculare senile $i importan#a prote7rii epiteliului pigmentat al retinei ' prostat 9 Capitolul 1 n zilele noastre ceaiul este consumat n mai mult de ': de #ri din ntreaga lume, cu un consum mediu per cap de locuitor de <!: mlD zi, ca $i butur ceaiul ocup"nd locul doi n lume, dup ap /Eraham, 0. )., <99!1. n func#ie de procesul tehnologic de ob#inere ceaiurile sunt clasificate astfel2 ceai verde FnefermentatG, ceaiul oolong Fsemi& fermentatG $i FfermentatG ceaiul negru sau ro$u. Flavan-3-olii sunt un subgrup al flavonoidelor, care include catechinele. %runzele de ceai verde con#in $ase catechine ma7oritare2 /H1&catechina /(1, /&1&epicatechina /*(1, /H1&galocatechina, /&1&epicatechin galat /*(E1, /&1&epigalocatechina /*E(1 $i /&1& epigalocatechin galat /*E(E1 /%ig.<1. (on#inutul total de catechine a fost evaluat utiliz"nd tehnica 0.,(. 5iferite metode antioxidante au fost utilizate pentru a monitoriza $i compara activitatea antioxidant a extractelor de ceai verde2 3 A(, 4*A(, 5..0. MATERIALE I METODE Extrac ia: :.! g pudr /.harmanex, 4eacalon, .ol=phenon *, Aapan Ereen 4ea1 sau frunze /?edda1 cu <: ml ap 6illipore fiart, au fost sonicate, centrifugate $i filtrate. (apitolul 9 rezum date referitoare la implicarea polifenolilor din ceaiul

verde n induc#ia apoptozei, inhibarea invaziei tumorii $i metastazei cancerului de

'

Cro!ato"ra#ia $e %nalt& Per#or!an & '(P)C* este o metod uzual utilizat pentru separarea unor antioxidan#i ca $i catechinele. Analiza 0.,( s&a realizat cu a7utorul unui sistem 8himadzu, echipat cu detec#ie cu fotodiod. A fost utilizat o coloan 8+.*,(38-, 46 ,(&<8, >Im, !> cm x 9.J mm. 8&a folosit un gradient de eluare2 faza mobil A& metanol2 acid acetic2 ap bidistilat $i faza mobil K, metanol2 acid acetic2 ap bidistilat. Con inutul total $e poli#enoli: (ompu$ii alba$trii forma#i ntre fenola#i $i reactivul %olin&(ioc"lteu sunt independen#i de structura compu$ilor fenolici, dezvolt"nd astfel complexe ntre centrul metalic $i compu$ii fenolici. Absorb#ia a fost nregistrat la lungimea de und ;J> nm. (on#inutul total de fenoli a fost exprimat n echivalen#i de acid galic. Capacitatea $e absorb ie a ra$icalului oxi"enului 'OR+C* determin capacitatea de inhibare a radicalului peroxil, induc"nd oxidarea, eviden#iind eliberarea clasic radicalului, prin transferul atomului de 0. ?alorile 3 A( au fost raportate ca echivalen#i 4rolox, fiind exprimate ca mol 4*D5B. -ntensitatea fluorescen#ei, ex. 98>nm, em. >!> nm a fost monitorizat pentru '> min. ,eto$a ec-ivalentului Trolox al capacit& ii antioxi$ante 'TE+C* se bazeaz pe capacitatea de neutralizare a radicalului anion AK48H de ctre antioxidan#i. AK48 este oxidat de ctre radicalii peroxil sau al#i oxidan#i la radicalul su cationic AK48. /, intens colorat /Lmax M ;'9 nm1. (apacitatea antioxidant este exprimat ca $i poten#ialul

compu$ilor testa#i de a decolora radicalul AK48. / prin reac#ie direct cu acesta. (apacitatea antioxidant a compu$ilor testa#i a fost exprimat ca $i echivalen#i 4rolox. Analiza cantitativ 0.,( a extractelor de ceai verde

%ig. ! eviden#iaz separarea amestecului de catechine standard pure, n !! minute. 3rdinea de eluare a fost2 E(, (, *E(, *E(E, *(, E(E, *(E, (E.
(on#inutul total de catechine a fost foarte sczut n probele ?edda /<!.:' mgDg1 $i Aapan Ereen 4ea /<;.>J mgDg1, posibil datorit oxidrii polifenolilor $i Dsau polimerizrii induse de fermentarea frunzelor de ceai. Acest fapt ar putea de altfel explica $i activitatea antioxidant redus a acestora, eviden#iat cu a7utorul metodelor2 3 A(, 4*A(, 5..0. (on#inutul total de catechine din suplimentele alimentare /.harmanex, 4eacalon and .ol=phenon *1 este semnificativ mai ridicat, comparativ cu probele de ceai verde, datorit concentrrii probei n urma tehnologiei de extrac#ie prin pulverizare uscat. *E(E, *(E $i *( sunt catechinele ce se regsesc n concentra#ie mai mare n extractele de ceai verde. 8uplimentul alimentar 4eacalon con#ine *( /<'9.J; mgDg1, ( /!!.8' mgDg1 $i E(E /!'.J9 mgDg1, compu$i identifica#i n cantit#i mici n alte dou suplimente alimentare .harmanex $i .ol=phenon *. .roba .harmanex con#ine >J.>8 mgDg *( $i 9!.:; mgDg *(E, n compara#ie cu .ol=phenon * <<.J! mgDg *( $i J'.'9 mgDg *(E. (on#inutul de E( din probele .harmanex $i 4eacalon a fost similar2 <<.J9 $i respectiv <<.9' mgDg. %ig.'. (romatogramele extractelor de ceai verde analizate2 A1..harmanex@ K1.4eacalon Tabel 1. (on#inutul /mgDg1 n catechine al probelor de ceai verde, conform determinrii 0.,( $i calibrrii cu standarde pure
!"0" extract Denu!ire prob& P-ar!anex <.J9N: .:> J.J' N:.< <:.<9 N:.:9 1C C E1C E1C 1 :8.9'N :.8; >J.>8N:. ' ;.;<N:.: J 9!.:;N:. :9 <.<<N:.: ! !>9.8> EC 1C1 EC1 C1 Total

>

Teacalon Pol2p-enon E 3e$$a 4apan Tea 1reen

<.9'N: .:> 8.''N: .:J <.':N: .:> <.<9N: .:>

!.8'N: .:< :.;!N: .:! 9.!8N: .:! 9.:9N: .:9

J.<9 N:.:; <.>J N:.:; :.8J N:.<< <.;' N:.:>

;J.!:N :.9' <9J.'! N:.;! <.9>N: .:9 J.8'N: .:>

<'9.J;N: .J <<.J!N:. :> '.9'N:.: ! !.>JN:.: !

!'.J9N:. <> !<.>>N:. < & :.'9N:.: !

;'.9'N:. ' J'.'9N:. <9 :.!<N:.: > :.;<N:.: !

'.99N:.: > <.89N:.< < & :.<JN:.: <

;!.'; '<>.'9 <!.:' <;.>J

(on#inutul total de polifenoli (on#inutul total de polifenoli variaz de la ;9 la J9> mgDg acid galic. (el mai redus con#inut de polifenoli s&a nt"lnit n proba Aapan green tea /;9.9'N<.J: mgDg acid galic1 n timp ce proba 4eacalon /J9>.<N'.>J mgDg acid galic1 nregistreaz cel mai ridicat con#inut de polifenoli, urmat de proba .ol=phenon * /J;;.>N8.J' mgDg acid galic1. (on#inutul altor probe de ceai verde a fost !89.!N8.J', ;>.'8N!.>J mgDg acid galic acid n proba .harmanex, respectiv proba ?edda /%ig. 91. (on#inutul de polifenoli totali variaz considerabil ntre probele de ceai verde $i suplimentele alimentare.

%ig. 9. (on#inutul total de polifenoli din cele cinci extracte de ceai verde2 .harmanex, 4eacalon, .ol=phenon, ?edda, Aapan green tea. ?alorile sunt exprimate ca media N 8*6.

(orelarea metodelor 0.,( $i %olin&(ioc"lteu (oeficientul de corelare .earson pentru analiza cantitativ determinat prin metoda 0.,( $i con#inutul total de polifenoli a fost ob#inut utiliz"nd programul de analiza statistic . -86, versiunea > /Eraph.ad 8oftCare, 8an 5iego, (A1. Analiza 0.,( s&a corelat semnificativ cu analiza spectrofotometric a con#inutului total de polifenoli, .earson r& :.9', p O :.:< /%ig. >1.

%ig. >. (orelarea analizei 0.,( cu determinarea spectrofotometric a con#inutului total de polifenoli /acid galic mgDg 5B1

(apacitatea de absorb#ie a radicalului oxigenului /3 A(1 .ol=phenon * $i 4eacalon sunt extractele de ceai verde cu cele mai mari valori 3 A( /><9' m6 4*Dg prob, respectiv 9988 m6 4*Dg prob1. (el mai ridicat con#inut n *E(E /dup cum s&a ob#inut n urma analizei 0.,(1 $i cele mai mari valori 3 A( au fost nregistrate pentru probele 4eacalon $i .ol=phenon *. *E(E este considerat catechina cu cel mai mare poten#ial antioxidant. .harmanex con#ine o cantitate redus de *E(E, ca atare prezint o activitate antioxidant mai redus comparativ cu probele .ol=phenon * $i 4eacalon. .robele de ceai verde ?edda $i Aapan green tea au nregistrat cele mai mici valori 3 A( /<:'' m6 4*Dg, respectiv 898 m6 4*Dg1. ?alorile 3 A( s&au corelat cu valorile ob#inute n urma determinrii con#inutului total de polifenoli, dup cum se observ n %ig. >.

%ig.J. ?alorile ob#inute prin metoda capacit#ii de absorb#ie a radicalului oxigenului /3 A(1 pentru cinci extracte de ceai verde. ?alorile sunt prezentate ca medie N 8*6.

*chivalentul 4rolox al capacit#ii antioxidante /4*A(1 .ol=phenon * $i 4eacalon sunt extractele de ceai verde cu cele mai mari valori 4*A( /<;9NJ.J m6 4*Dg prob, respectiv !:<N'.J m6 4*Dg prob1. .harmanex prezint o activitate antioxidant mai redus comparativ cu .ol=phenon * $i 4eacalon, <<J.> N <.9; m6 4*Dg. ?edda $i Aapan green tea au nregistrat cele mai mici valori 4*A( /;<N<.:8 m6 4*Dg, respectiv >8.>N <.!8 m6 4*Dg1. ?alorile 4*A( s&au corelat cu con#inutul total de polifenoli, dup cum se observ n %ig. ;.

Fig. 7. Capacitatea antioxidant a echivalentului Trolox (TEAC) pentru cele cinci extracte de ceai verde: Pharmanex, Teacalon, Pol phenon, !edda, "apan#

(orelarea metodelor 3 A(, 4*A( $i %olin&(ioc"lteu (oeficientul de corelare .earson pentru activitatea antioxidant determinat prin metodele 4*A(, 3 A( $i con#inutul total de polifenoli, cu a7utorul programului de analiz statistic . -86. Activit#ile antioxidante determinate prin metodele 4*A( $i 3 A( s&au corelat semnificativ cu con#inutul total de polifenoli, .earson r& :.99, p M :.::<<, respectiv r& :.98, p M:.::!J /%ig. 81. %ig. 8. (orelarea metodelor antioxidante 4*A(, respective 3 A( cu cantitatea de polifenoli totali din extractele de ceai verde. ?alorile sunt exprimate ca mediaN 8*6@

CONCLUZII < > ceaiuri achizi#ionate de pe pia#a romaneasc /?edda1 $i 7aponez /Aapan .&0.,(, pentru cuantificarea catechinelor din ceaiul

Ereen 4ea1 $i trei suplimente alimentare /.harmanex, +8A@ 4eacalon, Aapan@ .ol=phenon *, +8A1 au fost analizate prin verde /E(, (, *(, *E(, *E(E, *(E, E(E, E(1@ ! *E(E, *(E $i *( sunt catechinele ma7oritare din ceaiul verde $i

suplimentele alimentare, dup cum s&a demonstrat prin analiza cantitativ 0.,(@ ' (on#inutul total de polifenoli din extracte variaz de la ;9 la J9> mgDg

acid galic. (el mai sczut con#inut a fost nregistrat pentru proba Aapan green tea, n timp ce proba 4eacalon a nregistrat cel mai ridicat con#inut@ 9 polifenoli@ > 6etodele antioxidante /4*A(, 3 A(1 s&au corelat cu analiza .robele 4eacalon, .ol=pheon * $i .harmanex prezint activitatea

antioxidant /3 A(, 4*A(, 5..01 cea mai ridicat $i cel mai mare con#inut total de

spectrofotometric a con#inutului total de polifenoli@ J Analiza cinetic a 5..0 eviden#iaz c panta cea mai abrupt fost

nregistrat pentru proba .ol=phenon *