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SECRETARIA DE SAUDE DO ESTADO DO PIAUI

LABORATORIO CENTRAL DE SADE PUBLICA


Dr. COSTA ALVARENGA.

PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRO - POP
POP N
25.1.01.03.029

TTULO: Procedimento para Teste de Sensibilidade
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ELABORADO POR: REVISADO POR: APROVADO POR:


Ronaldo Costa
Gerente Tcnico


Maria de Ftima Lima
Farmacutica Bioqumica



Margarida Moreira do E. Santo
Farmacutica Bioqumica

Data: _____ / _____ / ______


1. OBJETIVO
Este Procedimento Operacional Padro (POP) fixa condies, padroniza, define e
estabelece regras para o teste de sensibilidade.
2. CAMPO DE APLICAO
Este POP se aplica a identificao do teste de sensibilidade no laboratrio de NB3.
3. SIGLAS
TCH HIDROZIDA DO CIDO TIOFENO 2 CARBOXLICO
PNB CIDO P- NITROBENZICO
LJ LOWENSTEIN JENSEN
INH ISONIAZIDA
RPM RIPAMPICINA
SM ESTREPTOMICINA
EMB ETAMBUTOL
MNT MICOBACTERIUM NO TUBERCULOSIS
BK BACILO KOCH
CSB CABINE DE SEGURANA BIOLGICA

4. CONDIES GERAIS

4.1. Materiais e Equipamentos

5. CONDIES ESPECFICAS

Antes de iniciar o teste de sensibilidade deve, se fazer uma avaliao da cultura original,
preparar uma suspenso bacteriana e conservar a cepa para eventuais repeties.

5.1 Pr - requsitos para o teste de sensibilidade

5.1.1 O primeiro passo para o teste de sensibilidade a observao do
aspecto da cultura. O objetivo :
1. Confirmar a pureza da cultura, verificando a ausncia de contaminao, pois uma
cultura contaminada com outras bactrias causa resultados falsos positivos nos
testes de identificao;
2. Verificar o nmero de colnias na cultura que no deve ser inferior a 20, pois
poucas colnias no so suficientes para realizao de todos os testes. Nesse
caso, recomenda-se fazer um subcultivo da cultura original:
3. Verificar a morfologia e pigmentao das colnias;

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4. Verificar a mistura de duas espcies de micobactrias em uma cultura, pela
observao de diferenas na morfologia e pigmentao das colnias.

5.1.2 - O segundo passo para a identificao a realizao de um esfregao a partir
da cultura em meio slido ou lquido,corar pelo mtodo de Ziehi-Neelsen com o
objetivo de:

a) Confirmar se a cultura de BAAR;
b) Verificar a morfologia dos bacilos e a formao de corda, a qual sugere que a cultura
possa ser do CMTB;
c) Confirmar se a cultura no est contaminada por outras bactrias ou fungos. Caso a
cultura esteja contaminada, fazer a descontaminao;
d) Verificar se h mistura de duas espcies de micobactrias em uma cultura;

5.1.3 O terceiro passo a preparao da suspenso bacteriana.

5.2 - Preparo da Suspenso Bacteriana

5.2.1 Descrio

Para uniformizao do inoculo para os testes de inibio de crescimento em meios
contendo diversos componentes e alguns testes bioqumicos, recomenda-se preparar uma
suspenso bacteriana.

5.2.2 Procedimento

a) Transferir 0,5 mL de gua destilada estril e suspender com ala
bacteriolgica descartvel estril, o maior nmero possvel de colnias de
uma cultura crescida em meio slido para o tubo de ensaio contendo gua
destilada e prolas;
b) Homogeneizar em agitador mecnico por 20 a 30 segundos;
c) Deixar em repouso por 10 minutos;
d) Acrescentar aproximadamente 2 mL de gua destilada estril;
e) Deixar em repouso por 10 minutos para sedimentar as partculas maiores;
f) Retirar para outro tubo 1 mL da suspenso em repouso;
g) Ajustar a turvao com gua destilada estril gota a gota cada suspenso
com a turvao do tubo N 01 da escala de Mc Farland, utilizando pipeta de
Pasteur;
h) Preparar 6 tubos com 9 mL de gua destilada estril para realizar as 6
diluies;
i) A partir dessa suspenso padronizada, efetuar 6 novas diluies em escala
decimal;
j) Transferir 1 mL da suspenso padro para o tubo 10
-1
, agitar no agitador
mecnico;
k) Seguir as diluies trocando as pipetas ao transferir 1 mL para o tubo 10
-2
e
assim sucessivamente at o tubo 10
-6
(para cada diluio utilizar nova pipeta
estril);
l) Identificar os tubos de meio de cultura LJ sem drogas, 2 tubos para cada
diluio e 4 tubos de meio de cultura LJ correspondente as drogas para
diluio 10
-3
e 10
-5
.Sendo que na diluio 10
-3
realizar inoculo em meio de

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cultura LJ/PNB e meio de cultura LJ/TCH. As diluies 10
-3
(1/1.000), 10
-5
(1/100.000) e 10
-6
(1/1.000.000) sero as diluies semeadas nos meios com
e sem droga (trocar pipeta para semear cada diluio;
m) Inocular 0,1 mL das diluies 10
-3
e 10
-5
em cada tubo de meio de cultura com
droga e sem droga e 0,1 mL da diluio 10
-6
em dois tubos de meio de cultura
LJ sem droga e nos 2 tubos de meio de cultura LJ sem droga para diluio
10
-6
;
n) Aps cada inoculo fechar os tubos sem rosquear a tampa at o fim, colocar
os tubos na estantes;
o) Retirar os tubos com inculo da estante e movimentar cada um deles
banhando toda a superfcie inclinada do meio para facilitar o crescimento de
colnias separadas para contagem;
p) Acondicionar os tubos inclinados com a superfcie do meio voltada para cima
e ter cuidado para que os tubos no rolem, pois isto propicia crescimento nas
bordas do tubo;
q) Incubar em estufa bacteriolgica a 361C por 48 h e aps, fechar as tampas
completamente, somente se o inoculo tiver sido absorvido totalmente, se
ainda permanecer mido manter a tampa frouxa por 24 ou 48 h;
r) Realizar a limpeza, descontaminao da bancada e o descarte do material
contaminado;

5.3 Separao das espcies do complexo M. tuberculosis das Micobactrias No
causadoras de Tuberculose (MNT)

A separao das espcies do CMTB das MNT pode ser feita por quatro testes
fenotpicos a partir do primo-cultivo. muito importante que os testes sejam feitos utilizando-
se culturas com crescimento ativo de 3 a 4 semanas. indispensvel a incluso de
controles positivos e negativos ao realizar os testes.

6. PROCEDIMENTO
6.1 Sinonmia
TS (Teste de Sensibilidade)
6.2 Amostra: O material deve ser colhido em pote plstico descartvel de boca larga (50
mm) transparente com tampa de rosca capacidade 35 a 50 ml.
6.2.1 Tipos e Quantidade Necessria
6.2.1.1 Tuberculose Pulmonar: escarro, lavado brnquico, aspirado transtraqueal, lavado
gstrico, fragmento de tecido pulmonar (bipsia)
6.2.1.2 Tuberculose Extra Pulmonar: Urina; lquidos; pleural sinovial, peritoneal,
pericrdio, asctico e LCR; secrees purulentas ganglionarias e de ndulos; secrees
purulentas de pele, nariz, ouvido, olhos, garganta; sangue e aspirados de medula
aspirados de gnglios e de tumores.


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6.2.1.3 A quantidade dever ser no mnimo 5 ml
6.2.2 Identificao: A identificao deve ser no corpo do pote com fita gomada ou caneta
de retroprojetor com o nome completo do paciente, data de nascimento, nome da me,
endereo completo e telefone.
.2.3 Amostras transportadas em caixas trmicas, armazenadas em geladeira a 4 C
devendo ser processado cultura at 3 dias (72 horas)
6.2.4 Critrios de Aceitao e Rejeio
Devem ser aceitas as amostras que fizerem parte de acordos e convnios
estabelecidos pelo Laboratrio Central de Sade Pblica LACEN PI, a requisio
deve estar assinada e carimbada de modo legvel. O material clnico deve estar
devidamente rotulado, embalado e transportado de maneira a proteger o pessoal
responsvel pelo transporte, dos riscos de infeco. Se a embalagem ou recipiente com o
material no estiver ntegro o material ser rejeitado. Qualquer irregularidade ser
informada a quem enviou o material, todo o material rejeitado ser esterilizado em
autoclave a 121 C e descartado no lixo.

6.3- Princpio do Mtodo
Cultura de Inoculo puro
6.4 Materiais
Equipamentos
CSB
Agitador Mecnico
Estufa Bacteriolgica a 36 1 C
Pipetador automtico ou manual

6.5 Reagentes
gua destilada estril
Soluo de lcool a 70%
Soluo de Fenol a 5%

6.6 Insumos

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Papel absorvente (papel de filtro ou papel toalha) para forrar a bancada
Gaze estril em pedaos
Estante para os tubos de ensaio estril 20 x 150 mm
Ala bacteriolgica descartvel e estril
Tubos de ensaio 20 x 150 mm, de paredes reforadas, com tampa de rosca,
contendo 10 prolas de vidro, estreis
Tubos de ensaio 20 x 150 mm para as diluies
Pipetas estreis de 1 a 10 ml
Recipiente de vidro ou metal, fundo e de boca larga, para descarte de material a ser
autoclavado e lavado
Bandeja de polipropileno com furos para a circulao do ar, para incubao dos
tubos semeados. De preferncia, uma bandeja para cada conjunto de tubos de uma
mesma amostra
Saco plstico autoclavvel para acondicionamento dos recipientes de descarte
Para cada amostra: seis tubos de meios LJ sem droga e dois tubos de meios LJ com
as drogas (INH, RMP, EMB, SM) e um tubo para o TCH e PNB
Cepas de referncia para controle de qualidade do TS (cepa sensvel e cepa
resistente): sugerimos que estas cepas sejam preparadas junto com as amostras a
serem testadas.
Tubo n 1 da Escala McFarland

6.7 EPI / EPC
6.7.1 EPI: luvas, toucas, culos de proteo jalecos de mangas cumpridas e punho retrtil
e mscara N95, sapatos fechado e antiderrapante.
6.7.2 EPC: lavatrio / chuveiro de emergncia, lava olhos e extintor de incndios Cabine
Segurana Biolgica
6.8 DESCRIO
Subitens 1, 2, 3 realizar fora da cabine
6.8.1 Identificar tubos de ensaio com prolas para suspenso bacteriana
6.8.1.2 Identificar tubos de ensaio para diluies para cada amostra incluindo as cepas
controle tubos 10
-1
, 10
-2
, 10
-3
, 10
-4
, 10
-5
, 10
-6
.
6.8.1.3 Identificar tubos de meios LJ sem e com drogas para semeadura do TS

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1 srie, rotulados de 10
-3
: dois tubos de meio sem droga (controle) os demais tubos
de meio LJ contendo cada um a droga correspondente.
2 srie, rotulados de 10
-5
: dois tubos de meio LJ sem droga (controle) os demais
tubos de meio LJ contendo cada um a droga correspondente.
3 srie, rotulados 10
-6
: dois tubos de meio LJ sem droga (controle)
Observao: A diluio 10
-6
nem sempre utilizada, facilita a leitura do TS quando o
inoculo for muito turvo (espesso) e a contagem das colnias ficam prejudicadas nas
outras diluies. Preparar a CSB.
Todos os subitens abaixo devem ser realizados dentro da CSB (Cabine de Segurana
Biolgica)
6.8.1.4 Organizar os materiais que sero utilizados na mesa auxiliar ao lado
da CSB e colocar recipiente de descarte conforme normas de Biossegurana
6.8.1.5 Forrar a bandeja de metal com papel absorvente e coloc-la na bancada da CSB a
sua frente
6.8.2 Suspenso bacteriana inoculo (dentro da cabine)
6.8.2.1 Transferir, com ala biolgica descartvel estril, o maior nmero possvel de
colnias de uma cultura em meio slido para um tubo de ensaio com prolas e 0,5 ml de
gua destilada estril
6.8.2.2 Homogeneizar em agitador mecnico por 20 30 segundos
6.8.2.3 Manter em repouso por 10 minutos
6.8.2.4 Acrescentar aproximadamente 2 ml de gua destilada da estril
6.8.2.5 Deixar em repouso por 10 minutos para sedimentar as partculas maiores.
6.8.3 Diluies Seriadas
6.8.3.1 Ajustar a turvao de cada suspenso com a turvao do tubo n 1 da Escala de
Mc Farland utilizando gua destilada estril, gota a gota
6.8.3.2 A partir dessa suspenso padronizada, efetuar suas novas diluies em escala
decimal.
6.8.3.3 Colocar 9 ml de gua destilada estril em cada um dos tubos
6.8.3.4 Transferir 1 ml de suspenso padro para o tubo 10
-1
, agitar no agitador mecnico
6.8.3.5 Trocar a pipeta e seguir as diluies transferindo 1 ml para o tubo 10
-2
e assim
sucessivamente at o tubo 10
-6
. Para cada diluio utilizar novas pipetas estreis
6.8.3.6 As diluies 10
-3
(1/1000), 10
-5
(1/100.000) e 10
-6
(1/1000.000) sero diluies
semeadas nos meios LJ com ou sem droga
6.8.4 Semeadura nos Meios de Cultura

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6.8.4.1 Inocular 0,1 ml das diluies 10
-3
, 10
-5
em cada tubo de meio de cultura com droga
e sem droga, j identificados e 0,1 ml da diluio 10
-6
em dois tubos de meios de LJ sem
droga. Trocar a pipeta para semear cada diluio.
6.8.4.2 fechar os tubos de meio de cultura, sem rosquear a tampa at o fim e colocar
esses tubos na estante.
Itens abaixo realizado fora da Cabine:
6.8.4.3 Retirar os tubos de meios de cultura da estante e movimentar cada um deles de
modo que o inoculo banhe a superfcie do meio, distribuindo bem o inoculo na superfcie
para facilitar o crescimento de colnias separadas para contagem.
6.8.4.4 Acondicionar os tubos inoculados em bandeja de polipropileno inclinados de
maneira que o lado da tampa fique ligeiramente mais alto e com a superfcie do meio
voltada para cima , evitando que os tubos no role.
6.8.4.5 - Incubar em estufa bacteriolgica a 36 1 C. fechar a tampa completamente
somente aps absoro total, continuando mido manter por mais 24 ou 48 horas.
6.8.4.6 - Realizar a limpeza, descontaminao da bancada e o descarte do material
contaminado.
6.8.5 Incubao do TS em meio LJ
Aps 48 horas verificar secagem do inoculo e ausncia de contaminao. Fechar bem
as tampas dos tubos e deixar incubados na estufa bacteriolgica 36 1 C
(Formulrio de leitura do TS)

6.8.6 - Leitura e Interpretao
6.8.6.1 Condies necessrias para interpretar resultados
Crescimento suficiente (mais de 100 colnias) no tubo controle (LJ sem droga),
semeado com a direo mais concentrada (10
-3
)
Colnias separadas e contveis no tubo controle (LJ sem droga) semeado com a
diluio menos concentrada (10
-5
)
Boa correlao com o nmero de colnias desenvolvidas em cada um dos meios
semeados com as suspenses de acordo com o fator de diluio aplicada
6.8.6.2 Com 28 dias de incubao fazer a primeira leitura e observar se houve
desenvolvimento de colnias para interpretar os resultados. Se houve casos de resistncia
pode ser emitido nesse perodo. Se no houve resistncia aguarda-se a segunda leitura ao
final de 42 dias.
6.8.6.3 Procedimentos para leitura e interpretao do TS
Realizar leitura dos tubos em bancada bem iluminada
Para acompanhar a leitura observar o fluxograma de leitura em anexo.

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Para que os clculos sejam vlidos deve-se realizar os procedimentos de 1 a 3
1. Quantificar o inoculo contando e fazendo a mdia das colnias desenvolvidas nos
tubos LJ controle (sem droga). Se o nmero de colnias na diluio 10
-3

incontvel, contar o numero de colnias da diluio 10
-5
ou 10
-6
, de maneira que
seja possvel contar colnias separadas. Fazer a mdia entre os tubos da mesma
diluio. A partir dessa mdia podemos inferir o nmero de UFC (unidade
formadoras de colnias) desenvolvidas nos controles semeados com diluies mais
concentradas, multiplicando pelo fator de diluio correspondente.

2. Quantificar o nmero de UFC nos tubos contendo cada uma das drogas. Da mesma
maneira, procurar o tubo onde as colnias estejam separadas e contveis.

3. Calcular a porcentagem de UFC desenvolvidas na presena de cada droga com
relao medida de UFC dos tubos controles. Se essa poro maior do que 1%,
o isolado bacteriano considerado resistente a droga em questo. Se a proporo
menor do que 1% o isolado bacteriano considerado sensvel.


6.8.7 Valores de Referncia
Sensvel
Resistente

7. HISTRICO DE REVISO

N da
Reviso
Data Descrio
Responsvel pela
Elaborao
01 10/05/2010
- Procedimento revisado em sua
totalidade
Maria de Ftima de Lima