Clonacin del gen del factor VIII de coagulacin humano

en un vector de expresin


INTRODUCCIN

Muchas hormonas proteicas y otras protenas reguladoras suelen expresarse
a muy bajas concentraciones, lo cual imposibilita su aislamiento y purificacin
mediante tcnicas bioqumicas estndares.
Las tcnicas de recombinacin de ADN que
convierten las clulas de E. coli en fbricas para sintetizar
protenas poco abundantes, se usan para producir, entre
otras, factor VIII (ubicado en el cromosoma X). Este factor es
una protena no enzimtica implicada en la coagulacin de la
sangre, que principalmente produce el hgado. La hemofilia
clsica (hemofilia A) se asocia con una deficiencia en dicho
gen. Las personas afectadas por esta enfermedad requieren
de la administracin de esta globulina antihemoflica.
La sntesis de protenas por ingeniera gentica
permite reducir al mnimo los riesgos de contaminacin por
agentes patgenos (virus de la hepatitis y HIV) que puede
producirse cuando los hemoflicos son tratados con
concentrados de plasma.
Clonar un gen significa tenerlo puro en el tubo de
ensayos o, mejor an, dentro de un vector (una molcula
mayor de ADN que permite guardar fragmentos de ADN en
forma estable y prctica por ms tiempo). La clave para clonar un gen de inters es
conectarlo a una molcula vector de ADN, la cual podr replicarse dentro de una
clula husped.

VECTOR FRAGMENTO DE ADN

ADN RECOMBINANTE

REPLICACIN DE ADN RECOMBINANTE EN CLULAS
HUSPED

AISLAMIENTO, SECUENCIACIN Y MANIPULACIN DEL
FRAGMENTO DE ADN PURIFICADO

Este proceso requiere de diversos elementos y herramientas moleculares:
Un vehculo molecular
Un fragmento de inters que se desea clonar.
Enzimas de restriccin para cortar el ADN.
La enzima ligasa para unir el gen de inters con el del vehculo.
Una clula husped
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DESCRIPCIN DEL GEN DE INTERS

El gen del factor VIII es muy grande. Abarca 186 kb y tiene 26 exones que en
total comprenden 7,05 kb, de modo que la mayor parte del gen est ocupada por
largos intrones.




El producto del gen es una glicoprotena que se sintetiza en las clulas
hepticas (hepatocitos) y en las clulas endoteliales, inicialmente como una protena
precursora de cadena sencilla de 2.351 aminocidos con un peso molecular de
265.000 daltons. La molcula precursora intacta comprende tres tipos de dominios.
1. Dominio A: tres segmentos A (A1, A2, A3), cada uno de 330
aminocidos aproximadamente.
2. Dominio B: Corresponde al exn 14 y consta de 925
aminocidos. La remocin de este dominio se asocia con la activacin de la
protena.
3. Dominios C: dos segmentos C (C1, C2) de 150 aminocidos
cada uno.

En el plasma, la molcula de factor VIII es escindida para producir dos
pptidos, una cadena amino terminal pesada (dominios A1, A2, B) y una cadena
carboxi terminal liviana (A3, C1, C2). La protena circula como un dmero, con iones
de calcio ligando entre s las dos cadenas mediante el enlace de los dominios A y C.




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ESQUEMA DE LA CLONACIN DEL GEN DEL FACTOR VIII DE COAGULACIN


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V
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El gen se puede extraer de una biblioteca
genmica entre los fragmentos del
cromosoma X obtenidos a partir de
sujetos no hemoflicos y por accin de una
enzima de restriccin. Para localizarlo es
necesario preparar una sonda capaz de
reconocer y aparearse con el ADN del
gen del factor VIII. Buscando en las
bibliotecas genticas se encuentran otros
fragmentos del gen que al juntarlos
permite obtener el gen completo del factor
VIII.

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Los 26 segmentos obtenidos se
transcriben sin secuencias intermedias
(intrones) en un filamento de ARN
mensajero, y luego utilizando una enzima:
la transcriptasa reversa se obtiene el gen
del factor VIII, el cual consta de 9000
bases. (ADN complementario). La tcnica
de PCR permite amplificar la cantidad de
ADN y esto facilita el clonado del gen de
inters. Se aade al ADN donante
extremos pegajosos que localizarn las
secuencias complementarias en el
plsmido de ADN receptor. De este modo
se obtiene el casete que deber ser
insertado en el plsmido de expresin.

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El ADN del plsmido es acortado
especialmente para poder insertar el ADN
del factor VIII. El plsmido debe tener tres
regiones esenciales para la clonacin del
ADN: un ORI, un sitio de insercin para el
ADN y un marcador, es decir, un gen que
confiere resistencia a un antibitico
determinado (esto es importante para el
momento de la seleccin de los clones
incorporados). Para obtener vectores de
expresin se deben incluir secuencias
especficas necesarias para que el gen
eucariota pueda expresarse en la clula
husped procariota. Estas secuencias
adicionales son: el promotor bacteriano, el
finalizador de trascripcin y secuencia para
la unin al ribosoma.

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El ADN hospedador (plsmido
bacteriano) se abre por la secuencia
complemetaria de los extremos pegajosos
del ADN donante mediante una
endonucleasa de restriccin especfica.
Se fija el ADN donante al plsmido abierto
utilizando una enzima denominada ADN
ligasa. De este modo se obtiene un ADN
recombinante denominado plsmido
vector.

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El plsmido vector se reinserta en una
clula husped bacteriana no patgena (E.
coli) la cual puede ser tratada con Ca
2+
,
shock trmico o pulso elctrico

para
favorecer la permeabilidad y de este modo
permitir la entrada del plsmido vector.
La mezcla de incubacin contiene pocos
plsmidos por clula para estimular la
captacin individual de los plsmidos
(proceso de transformacin).

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Debido a que no todas las clulas husped
pudieron incorporar el plsmido vector, es
necesario realizar una seleccin.
Para ello se cultivan en un medio que
contenga un antibitico especfico
(coincidente con el gen de resistencia que
posee el plsmido)
Slo las clulas transformadas
sobrevivirn y en ellas el ADN plasmdico
se replicar permitiendo la formacin de
una colonia de clulas que contengan
copias del plsmido recombinante que
contiene el gen para la protena
antihemoflica.

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De este modo cada clula expresar las
instrucciones contenidas en el gen
obtenindose la cantidad mxima de
protena activa (factor VIII recombinante
de coagulacin).

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El hgado es el centro principal de sntesis
del facto VIII. Como consecuencia de que
no es posible realizar cultivos de
hepatocitos, ha sido necesario utilizar
clulas de mamferos capaces de realizar
una correcta maduracin de la protena.
Las clulas de hmster son, actualmente,
las ms apropiadas para una produccin a
escala industrial de factor VIII, debido a
que:
Han sido estudiadas en detalle.
Se usan para producir otras
protenas recombinantes.
Son genticamente estables a lo
largo del tiempo.
Se replican eficientemente.
Son resistentes a las infecciones.



BIBLIOGRAFA

CAMBOU, C. Y MAYAUX J . (1993). Las biotecnologas de la sangre, en:
Mundo Cientfico N 137.
GHIO, S. (2007). Biologa molecular como herramienta de la
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LODISH, H. Y OTROS (2005). Biologa celular y molecular.
Panamericana. Buenos Aires.
PURVES, W. K. Y OTROS (2004). Vida. La Ciencia de la Biologa.
Panamericana. Buenos Aires.
VZQUEZ, M. (2006). La intimidad de las molculas de la vida. De los
genes a las protenas. Eudeba. Buenos Aires.


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