Bromatologa - Trabajos Prcticos

ANALISIS DE LECHE Y PRODUCTOS LACTEOS

Preparacin de la muestra
Llevar la muestra de leche a aproximadamente 15C y mezclar por trasvase a otro recipiente
limpio, repitiendo la operacin hasta asegurar una muestra homognea. Si no se han dispersado los
grumos de crema, entiiar la leche en un a!o de agua a aprox. "#C y mezclar hasta
homogeneidad. $n%riar a 15C antes de medir un volumen para analizar &'('C 1)*+*, 1,#-..
I) Caracteres r!anl"ptics
La leche %resca otenida en circunstancias normales, es de color lanco intenso,
completamente opaca, de olor dil y saor suave, pastoso y dilmente azucarado. $valuar el
aspecto, color y olor de las muestras. NO E#ALUAR SA$OR%%
II) An&lisis '(sic)*u(mic
Determinacin de la densidad
Se puede determinar con picnmetro, alanza hidrost/tica o lactodens0metro, a 15C &'('C
1)*+1, 1,#-..
$l lactodens0metro est/ calirado a 15C. ' temperaturas di%erentes &15C 1 5C. se puede
hacer una correccin sumando o restando *.***+ a la densidad le0da, por cada grado de temperatura
respectivamente mayor o menor a 15C.
+ateria !rasa ,+"td de -er.er)
/undament2 se trata la leche en el denominado utirmetro con /cido sul%3rico 4erer en caliente,
separ/ndose por centri%ugacin la grasa lierada. La adicin del /cido am0lico %acilita la separacin de
%ases, de manera 5ue, luego de centri%ugar, el contenido de grasa se lee directamente en la escala
del instrumento.
Prcedimient2 6edir con pipeta 1* ml de S(-7+ 4erer &densidad 1.#1" 8 1.#19 a +*C, aprox.
,*:. e introducirlos en un utirmetro para leche, cuidando de no mo;ar las paredes internas del
cuello. 'gregar 11 ml de leche medidos con pipeta de dole a%oro goteando sore las paredes del
utirmetro de manera 5ue %orme una capa sore el /cido sin mezclarse con ste, tratando de
hacerlo lo m/s r/pido posile. 'gregar inmediatamente 1 ml de alcohol am0lico y tapar con el tapn
correspondiente. <omar el utirmetro con un repasador, y su;etando el tapn con el pulgar, invertir el
utirmetro varias veces de;ando escurrir su contenido. =eri%icar 5ue est/ ien tapado y colocarlo en
un a!o de agua a )589*C durante 581* min con el tapn hacia aa;o. >etirarlo del a!o, secarlo por
a%uera y centri%ugar durante "85 min en la centr0%uga especial con los tapones hacia a%uera. Llevar
nuevamente al a!o de agua -85 min y leer inmediatamente el espesor de la capa de grasa en la
parte superior graduada del utirmetro. ?or a;uste adecuado del tapn de cierre se puede hacer
coincidir la ase de la capa de grasa con el cero de la escala. La lectura del me!isco da directamente
el porcenta;e de grasa de la leche.
E0tract sec ttal
Prcedimient1 <arar un cristalizador ien limpio y seco de di/metro no menor de 5 cm con 1*815 g
de arena calcinada. 'gregar 5 ml de leche con pipeta a%orada, calentar a a!o 6ar0a 1*815 min.
Llevar luego a estu%a a ,#81**C hasta peso constante &aprox. " h.. $n%riar en desecador, pesar
r/pidamente y expresar el resultado como : de slidos totales &p@v.. &'('C 1)*"+, 1,#-,
modi%icado..
E0tract sec n !ras
Se otiene por di%erencia entre el valor de extracto seco total y el valor de materia grasa.
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Determinacin de prte(nas
Se pueden emplear el mtodo de A;eldahl &B x %actor )."#. o el mtodo de Crad%ord sore las
prote0nas precipitadas con /cido tricloroactico &<C' 1+:. y neutralizadas y dilu0das en solucin
alcalina. (tra alternativa es emplear el mtodo de Bitrgeno /lcali l/il descrito a continuacin2
Determinacin de prte(nas en lec2e pr destilacin directa1 +"td de 3'ran4i del
Nitr!en &lcali l&.il1 &1,5*. 6ilchDissenscha%ts, 5185- =ol. +..
/undament1 $s un mtodo r/pido asado en la lieracin de amon0aco cuando la leche es
calentada a eullicin en solucin alcalina. La mayor parte del amon0aco lierado proviene de la
r/pida hidrlisis de glutamina y asparagina.
Prcedimient1 Colocar en un aln A;eldahl 1* ml de leche, +* ml de CaCl+ 1* : &usar propipeta. y
9* ml de Ba(7 "+ :. Eestilar durante ) min &exactamente medidos a partir del inicio de la eullicin.,
recogiendo sore 1** ml de C("7" + :. <itular el destilado con S(-7+ *.1B, usando como indicador )
a # gotas del indicador 6ortimer &*.*1) : ro;o de metilo y *.*#" : verde de romocresol en alcohol..
Calcular el porcenta;e de prote0na &p@vol. utilizando una curva de caliracin 5ue relaciona el :
prote0nas con los ml de S(-7+ *.1B gastados.
Curva de caliracin2 se otiene siguiendo el procedimiento anterior pero con muestras de leche con
contenidos de prote0na conocidos. ?ara otener las distintas muestras de leche se parte de una leche
entera a la 5ue se le midi el : de prote0nas por el mtodo de A;eldhalF con esta leche se hacen
diluciones o se agrega case0na para otener las concentraciones proteicas deseadas. $l contenido de
prote0nas 5ue cura el rango de la curva de caliracin, dee ser de 1 a - : &p@v..
B(<'2 'ctualmente los an/lisis en leche se realizan siguiendo la metodolog0a especi%icada en las
normas GEH, de la Hederacin Gnternacional de Lecher0a &HGL.. ?ara la determinacin del contenido de
prote0nas se utiliza el mtodo de A;eldhal, utilizando /cido rico para recoger el destilado.
Determinacin de Lactsa
#alracin pr el m"td de /e2lin!)Causse)$nnans mdi'icad ,AOAC 56789 p1 :68)
Prcedimient1 Colocar en un matraz de 1** ml, la cantidad adecuada de leche exactamente
medida, diluir con )*8#* ml de agua destilada, agregar 5 ml de suacetato de plomo "* :, agitar
enrgicamente, de;ar decantar y eliminar el exceso de plomo solule por agregado de 5 ml de sul%ato
de sodio "* :. Llevar a 1** ml con agua destiladaF homogeneizar y %iltrar por papel. =alorar la lactosa
en el l05uido %iltrado utilizando el mtodo de Hehling8Causse8Connans.
a. =aloracin del reactivo2 $n un erlenmeyer de +5* ml de capacidad se colocan exactamente 1* ml de
reactivo HCC, "* ml de agua destilada y + o " trozos de porcelana porosa y se calienta a eullicin. Ina
vez alcanzada sta, se comienza a agregar desde la ureta la solucin patrn de az3car a una velocidad
de goteo controlada &medirla. evitando interrumpir la eullicin. Cuando la coloracin azul del reactivo
disminuye de intensidad o alcanza un tono celeste verdoso, se agregan " gotas de la solucin acuosa de
azul de metileno y se contin3a con el agregado de solucin patrn, gota a gota, hasta decoloracin. La
primera gota 5ue torna a amarillo oro parte de la solucin indica el punto %inal. Se dee realizar esta
valoracin por duplicado.
Eeen gastarse alrededor de 58) ml de la solucin patrn para decolorar 1* ml de reactivo de
HCC. Si el volumen gastado cae %uera de estos valores hay 5ue modi%icar la velocidad de adicin hasta
lograr el valor indicado. La velocidad de goteo encontrada como ptima ser/ la empleada al valorar las
soluciones prolema.
. =aloracin de gl3cidos solules reductores2 Se titulan 1* ml de reactivo HCC seg3n el procedimiento
seguido en a. pero esta vez cargando la ureta con la solucin de az3cares solules otenida a partir de
la muestra &%iltrado.. $l gasto de esta valoracin dee estar comprendido entre " y # ml, si no es as0 hay
5ue modi%icar la concentracin de la solucin de az3cares.
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Bota 12 $s conveniente 5ue el agregado de solucin de az3cares &patrn y prolema. se haga al
principio a razn de 1 gota@s y despus del agregado de azul de metileno, a 1 gota@" s.
Bota +2 Se dee tener sumo cuidado en la oservacin del punto %inal de la titulacin, pues la coloracin
amarilla camia r/pidamente a parda.
C/lculo2 Considerar las siguientes e5uivalencias al e%ectuar los c/lculos2
5* mg glucosa J )) mg lactosa anhidra J ),.5 mg lactosa hidratada
III) Cntrl del estad de cnser;acin
Determinacin del pH
Prcedimient1 ?oner un volumen adecuado en un vaso precipitado y medir el p7 en un p7metro
previamente calirado.
Ensa4 del alc2l
Prcedimient1 Colocar 1 ml de leche en un tuo de ensayos y agregar igual volumen de etanol
9*:. 'gitar y oservar la %ormacin de co/gulos o grumos.
Acide< Drnic
Prcedimient1 6edir exactamente 1* ml de muestra o pesar con exactitud alrededor de 1* g.
Colocar en un erlenmeyer de +5* ml. Eiluir con aproximadamente + veces su volumen con agua
destilada lire de C(+ &para eliminar el C(+ hervirla 5 min y en%riarla evitando la incorporacin de
aire.. 'gregar gotas de %eno%tale0na al 1: &solucin de %eno%tale0na 1: en etanol de ,5: v@v., y titular
con Ba(7 Eornic &*.11B. o de normalidad similar &Ba(7 *.1 B. hasta color rosa dil pero
persistente. $xpresar los resultados en grados Eornic y en : en /cido l/ctico p@p &'('C 1)*+",
1,#-..
5=Drnic > ?15 ml NaOH Drnic > 5 m! &cid l&ctic@5? ml lec2e
Ensa4 del a<ul de metilen1 Reductasimetr(a
Prcedimient1 <raa;ar en condiciones de esterilidad y evitar la exposicin a la luz solar. Colocar en
un tuo de ensayo ancho &aprox. "8- cm de di/metro. -* ml de leche cuidando de no mo;ar un
costado de la pared interior del tuo. 'gregar 1 ml de solucin de azul de metileno sin 5ue la punta de
la pipeta entre en contacto con la leche. <apar el tuo con un tapn de algodn y colocarlo en un
a!o a "98"#C. 6edir el tiempo en 5ue se produce decoloracin total o hasta 5 mm de la super%icie.
La leche se clasi%icar/ seg3n la siguiente tala2
51) +u4 malaA se decolora antes de los +* min.
B1) +alaA se decolora entre +* min y + h.
C1) +edicreA se decolora entre las + h y 5 h.
:1) $uenaA conserva el color por m/s de 5 h.
B(<'2 La solucin de azul de metileno se prepara disolviendo azul de metileno en alcohol de ,)
hasta saturacin, y diluyendo 5 ml de esta solucin con 1,5 ml de agua destilada estril. Eescartar
despus de + meses. Bo exponer a la luz.
Ensa4 de la 's'atasa alcalina
Prcedimient1 $l ensayo consiste en incuar la muestra con un sustrato de la enzima en
condiciones de temperatura y p7 adecuados para la reaccin enzim/tica. $l producto %inal se detecta
por una reaccin colorimtrica cualitativa. Eee hacerse un ensayo en lanco en las mismas
condiciones con la misma leche previamente hervida y en%riada.
Se realiza seg3n el siguiente protocolo2
Sustrato2 %enil%os%ato de sodio. Cada comprimido contiene +- Kmoles de sustrato y se disuelve en ).5
ml de u%%er C("
L
@C("7
8
.
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>eactivo diazo2 na%talen81,5 disul%onato de la sal de diazonio del 58nitro8+8amino anisol. Cada
comprimido contiene -.5 mg de reactivo y se disuelve en -.5 ml de agua destilada.
CIHH$>2 -)., g C("Ba+, "9.+ g C("7Ba y agua destilada para completar 1 litro.
6uestra Clanco
Leche + ml 88
Leche calentada 1 min a #*8,*C 88 + ml
Ee;ar 1* min a "98--C
Sustrato + ml + ml
<apar el tuo y agitar por inversin varias veces. Ee;ar 1* min a "98--C. 7ervir y en%riar.
>eactivo diazo 1 ml 1 ml
>esultado2 color ro;o2 H'L &M. color amarillo &idem lanco.2 H'L &8.
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PRODUCTOS LACTEOS
51) COA-ULACION ENDI+ATICA DE LA LECHE
a1 +edida de la acti;idad ca!ulante
Recuerde que la actividad es una medida de velocidad, estar dada por la accin cataltica de
la enzima sobre un sustrato, en este caso estamos viendo el efecto de la renina sobre la apa-
casena!
6ezcla de reaccin2 +.* ml Leche
*.+ ml Cl+Ca *.1 6
M *." ml $nzima &en el momento de agregar la solucin de
enzima dee contailizar el tiempoNN..
La temperatura de traa;o ser/ de "9C.
Se mide el tiempo necesario para 5ue comience la coagulacin. ?ara detectarlo, despus del
agregado de la enzima se comienza a agitar con una varilla de vidrio2 inclinando el tuo se eleva la
varilla sore el nivel del l05uido rozando la pared del tuo y se oserva en el l05uido 5ue cae sore la
pared, la aparicin de pe5ue!os co/gulos.
"n este caso particular, usted no detendr la accin de la enzima, simplemente definir el
tiempo en que #a comenzado la coagulacin!
$a medida de actividad coagulante de la lec#e ser e%presada directamente como el tiempo de
coagulacin requerido para los &ml de lec#e ensa'ados!
.1 E'ect de la ;ariacin de la cncentracin de en<ima en el tiemp de ca!ulacin1
Recuerde que al ser el tiempo de coagulacin una medida indirecta de la actividad de la
enzima, mas especficamente podemos decir que es inversamente proporcional, podemos
observar cual ser el efecto de la concentracin de la enzima en los tiempos de coagulacin!
(omo se esta trabajando a concentracin de sustrato saturante ' se fija el tiempo en que
aparece el coagulo, se puede decir que la variacin en el tiempo esta relacionado con la
variacin en la concentracin de enzima!
Prcedimient1 <raa;ar/ con cuatro mezclas de reaccin a "9C, colocando en cada tuo un
volumen di%erente de solucin de enzima &coagulante., hasta un volumen m/ximo de *." ml. La
mezcla de reaccin es e5uivalente a la del punto a., con un volumen %inal de +.5* ml. $l volumen se
completa con ACl *.15 6. La solucin de enzima se agrega en 3ltimo trmino e inmediatamente se
incuan los tuos y se contailiza el tiempo. ' continuacin tiene una tala donde se resumen las -
mezclas de reaccin.
+e<cla 5 +e<cla B +e<cla C +e<cla :
Lec2e ,ml) +.** +.** +.** +.**
ClBCa ?15 + *.+* *.+* *.+* *.+*
3Cl ?158 + ,ml) *."* *.+* *.1* *.**
En<ima ,ml) *.** *.1* *.+* *."*
Se miden los tiempos de coagulacin para cada mezcla de reaccin, 5ue deer/n estar en el
rango de 1 a "* min. Si no %uera as0, se deer/ repetir la serie, modi%icando las cantidades de
solucin coagulante.
4ra%icar el tiempo de coagulacin en %uncin de la cantidad de solucin de enzima. 7aga una
interpretacin de estos resultados.
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c1 O.ser;acin de las ds etapas del prces de ca!ulacin
Recuerde que se #a propuesto un mecanismo en dos etapas para que ocurra la coagulacin,
en este caso deber interpretar los protocolos ' analizar los resultados!
?reparar/ mezclas de reaccin, con concentraciones di%erentes de enzima, con temperaturas
de incuacin di%erentes y con agregado de CaCl+ en momentos di%erentes. $n todos los casos se
medir/n los tiempos de coagulacin de cada tuo.
Las mezclas 1 y + ser/n los controles 5ue utilizar/ para el estudio. Las mezclas " y - le
permitir/n estudiar la posile inactivacin de la enzima por e%ecto de la a;a temperatura, ya 5ue
deer/ incuar amas mezclas a *
o
C durante + horas y posteriormente llevar a "9
o
C momento en
5ue empezar/ a tomar el tiempo. Las mezclas 5 y ) le permitir/n estudiar el e%ecto del agregado de
calcio, ya 5ue deer/ incuar amas mezclas en ausencia de cloruro de calcio durante "* minutos y
a partir del agregado del mismo contailizar/ el tiempo de coagulacin.
CE

C ?

C ,B2) @ CE

C CE

C
+e<cla 5 +e<cla B +e<cla C +e<cla : +e<cla 8 +e<cla 7
Lec2e ,ml) +.** +.** +.** +.** +.** +.**
ClBCa ?15 + *.+* *.+* *.+* *.+* "*min *.+ml "*min *.+ml
3Cl ?158 + ,ml) *.+* *.** *.+* *.** *.+ *.*
En<ima ,ml) *.1* *."* *.1* *."* *.1 *."
)aga un anlisis de los resultados obtenidos para los pares de mezclas de reaccin,
identificando con ellos el mecanismo propuesto para el proceso de coagulacin!
B1) COA-ULACION ACIDA DE LA LECHE1 CINETICA DE ACIDI/ICACION DE LA LECHE POR
ACCION $ACTERIANA1
Prcedimient1 ?reparar una mezcla de incuacin con 1** ml de leche y 5 ml de inculo.
Hraccionar la mezcla en # tuos estriles, poniendo 5 ml exactos en cada tuo. Gncuar a -+C. Cada
"* min sacar un tuo y valorar la acidez con Ba(7 *.1B.
B(<'2 $l inculo acteriano dee ser un cultivo %resco en %ase estacionaria temprana, con 1*
#
IHC@ml. $l %ermento para yogur dee tener una proporcin 121 de Streptococcus termophilus y
Lactobacillus bulgaricus.