REPLICACIN DE ALFAVIRUS: UNA REVISIN DEL PROCESO

DE ENTRADA DEL ALFAVIRUS DENTRO DE LAS CLULAS

ALFAVIRUS

Los alfavirus son principalmente virus transmitidos por artrpodos (arbovirus) dentro de
la familia Togaviridae. Los virus pertenecientes a ste gnero a menudo son clasificados
como alfavirus del Nuevo Mundo, o alfavirus del Viejo Mundo, dependiendo de la
localizacin geogrfica en que fueron originalmente aislados. Los alfavirus del Nuevo
Mundo, incluyen al Eastern equine encephalitis virus (EEEV), Venezuelan equine
encephalitis virus (VEEV) y Western equine encephalitis virus (WEEV), tpicamente causan
encefalitis en humanos y otros mamferos, mientras que los alfavirus del Viejo Mundo,
como el Chikun-gunya virus (CHIKV), ONyong-Nyong virus (ONNV), Ross River virus (RRV),
Semliki Forest virus (SFV) y Sindbis virus (SINV) causan fiebre, salpullido y artralgia que
rara vez causa mortalidad. Mientras que los primeros estudios de alfavirus se enfocaron
en el prototipo SFV y SINV debido a su habilidad de crecer en altas concentraciones en
cultivos celulares, mientras no fueran patognicos al humano, la atencin reciente se ha
dirigido hacia la investigar al CHIKV. El brote de CHIKV en 2005 en La Reunin infect 40%
de los 785,00 habitantes, resultando 250 casos fatales. La reemergencia de CHIKV reitera
la amenaza potencial que los alfavirus poseen hacia el ser humano y la necesidad de
entender los mecanismos involucrados en la biologa del alfavirus.


COMPOSICIN GENMICA Y ESTRUCTURA DEL VIRIN

Los alfavirus son pequeos, de forma icosadrica, son virus envueltos, aproximadamente
70 nm de dimetro. El virin alfavirus tiene una membrana de lpidos adquirida de clula
husped. Incrustados dentro de sta membrana hay 80 picos, organizados en una T= 4
icosaedros. Las glicoprotenas E1 y E2 estn asociadas como subunidades heterodmeras,
las cuales son inducidos en trmeros para formar las protuberancias del pico. E1 y E2 son
protenas transmembrana con regiones citoplsmicas C-terminal que se cree interactan
con la nucleocpside. Adems del RNA genmico longitudinal, el RNA subgenmico que
codifica las protenas estructurales tambin es generado, ambas especies contiene la
cabeza 5 y la cola poli (A).
Durante la formacin de la nucleocpside, la protena (C) capsdica del alfavirus conecta
en el genoma viral RNA va N-terminal residuos Arg, Lys y Pro. Estudios de mutagnesis
identificaron un cierre de leucina localizado dentro de sta regin esencial para la
formacin de partculas de nucleocpside, probablemente mediante la dimerizacin
durante el ensamblado del virus. La protena C-terminal es el dominio serina-proteasa que
tambin contiene un espacio hidrofbico para conectar glicoprotenas adyacentes al sitio
de conexin del sustrato. El rol de la protena estructural E3 es indefinido y parece variar
entre los diferentes alfavirus. Mientras que las protenas E3 de SFV se encuentran
asociadas con los viriones, las protenas E3 no estn incorporadas en viriones de otros
alfavirus, incluyendo CHIKV, SINV ni WEEV. La glicoprotena E2 de los alfavirus responsable
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del receptor de ensamblaje est incrustrada dentro de la corteza de la membrana de 3
residuos C-terminal. Cambios en aminocidos identifican la protena E2 como
determinante de neurovirulencia. La mutagnesis dirigida identifica tripptidos Tyr-X-Leu
dentro del endodominio requerido para la interaccin con el dominio de la cpside
proteasa en concreto con sus residuos cys conservados que son modificados por la
palmitolacin. 6K es una protena estructural palmitolada esencial para armar las
partculas del alfavirus, donde se cree que influye en el transporte de sitios de ensamblaje
del virin a la membrana plasmtica, antes de ser incorporados dentro del virin en
pequeas cantidades. La protena del alfavirus 6K ha sido clasificada como viroporina
dado su habilidad de formar canales inicos selectivos para cationes y alta permeabilidad
de membrana en clulas bacterianas y mamferas. La protena E1 es un alfavirus protena
de fusin con u8n residuo peptdico de fusin dentro de un dominio hidrofbico
altamente conservado.



CICLO DE VIDA DEL ALFAVIRUS


A la entrada, las partculas del alfavirus se someten a desmontaje, liberando RNA
genmico dentro del citoplasma de clulas infectadas. El genoma viral luego es traducido
de dos ORFs para generar la no estructural (P1234) y la estructural poliprotena. Al inicio
de una infeccin P1234 es partido en cis entre nsP3 y nsP4 para producir P123 y nsP4.
P123 y nsP4 forman un complejo de replicacin inicial inestable, el cual es capaz de
sintetizar RNA de cadena negativa. La divisin de P123 a nsP1 y P23 slo puede ocurrir en
trans, y slo a una concentracin suficientemente alta de la poliprotena. Los productos de
poliprotena nsP1, P23 y nsP4 forman un complejo de replicacin dentro de vacuolas
citopticas inducidos por virus (CPV I) que son activas en sntesis de cadenas negativas,
tambin en la sntesis genmica de RNA, pero no en sntesis subgenmica de RNA. Luego
de la divisin completa de nsP1, nsP2, nsP3 y nsP4, la sntesis de cadena negativa es
inactivada y ahora un complejo de replicacin estable cambia a sntesis de RNA genmica
y subgenmica de cadena positiva. En la mayora de los alfavirus, un codn de terminacin
permeable est presente siguiente de nsP3 con una lectura-a travs estimada a ocurrir
con slo 10-20% de eficiencia. Esto conduce a un exceso d poliprotena no estructural
P123 comparada con P1234, y una reduccin de nsP4 relativo a los otros nsPs. Una mayor
disminucin de nsP4 intracelular lo hace un residuo de tirosina desestabilizadora en la N-
terminal cuyas seales se degradan rpidamente por la va de la regla N-terminal. Una
pequea fraccin de nsP4 en clulas es relativamente estable, probablemente en la forma
de complejos de replicacin, sugiriendo que nsP4 slo es degradado cuando est en
exceso. Eliminando el desestabilizador de residuo Tyr conduce a una replicacin de RNA
pobre. La divisin de la estructura de poliprotena ocurre cotraduccionalmente,
empezando con la divisin autoproteoltica de la protena de cpside del resto de la
poliprotena. La protena C est disponible para asociarse con RNA recin sintetizado,
reconociendo seales especficas de embalaje en la mitad 5 del genoma, de tal manera
que slo el RNA genmico de larga duracin es empaquetado dentro de las partculas de
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la nucleocpside. La protena E3 acta como una seal de secuencia para la insercin de la
poliprotena restante dentro del retculo endoplsmico, donde es procesado por una
seal husped peptidasa. Similarmente, la protena 6K acta como una seal de secuencia
para el procesamiento posterior de la protena E1.
En sntesis, el precursor de glicoprotena E2, PE2 (p62 en SFV), y glicoprotenas E1
interactan el uno con el otro (preferentemente en cis) para formar heterodmeros. stos
complejos de heterodmeros son transportados desde el retculo endoplsmico hacia la
superficie de las clulas va complejo Golgi. En la ltima etapa del transporte, el precursor
PE2 se divide en su dominio luminal por proteasas husped similar a furina para generar
protenas maduras E2 y E3. sta divisin induce cambios conformacionales que debilitan la
interaccin E1-E2 en el heterodmero pico, impidiendo la fusin del pptido por activacin
despus de la exposicin a un bajo pH. Las interacciones entre la protena C y el dominio
citoplsmico de la protena E2 dirigen el proceso de desarrollo, con heterodmeros E1 y
E2 formando partculas de envoltura alrededor como una nucleocpside.
Despus de la liberacin de clulas, los viriones adquieren una doble membrana derivada
del plasma de membrana plasmtica husped.



ENDOCITOSIS MEDIADA POR RECEPTOR

Los virus entran a las clulas en la membrana plasmtica, ya sea por fusin con los
componentes de la membrana en la superficie celular, o por un ataque de receptor e
internalizacin, seguido de una fusin con membrana intracelular de vesculas endocticas.
La endocitosis mediada por receptor es el modo predominante de entrada, ms a menudo
mediada por la formacin de depresiones revestidas de clatrina, y el subsecuente
transporte a endosomas tempranos, donde el ambiente de bajo pH desencadena la
fusin. Alternativamente, algunos virus utilizan vas de clatrina independientes para ganar
entradas dentro de las clulas. La va caveolar transporta virus internos a caveosomas de
pH neutro, antes de redistribuir al RE. Tambin hay cierto nmero de vas de clatrina,
caveolina independientes que los virus usan como entrada celular donde confan en
pequeas GTPasas, a pesar de que esto no est bien entendido.
La entrada de los virus dentro de las clulas es facilitada por la interaccin del
componente del pico E2 con receptores de protena en la superficie de clulas diana. Una
protena de 63 KDa en la superficie de clulas aviares fue el primer receptor alfavirus
observado, a pesar de que su identidad no fue determinada. Los anticuerpos generados
contra protenas de membrana BHK fueron protegidas para identificar el receptor 67 KDa
de laminina como un receptor de alta afinidad de cohesin para infeccin por SINV en
clulas mamferas. Experimentos posteriores de fijacin de SINV en clulas dendrticas
demostraron ser dependientes SIGN con DC-SIGN y L-SIGN actuando como molculas
receptoras. Sulfato de heparn, un glicosaminoglicanos de superficie celular, tambin
puede actuar como un receptor de adhesin para alfavirus. Sin embargo, la afinidad de
divisin del alfavirus con el sulfato de heparn, parece ser adquirido luego de pases
seriados en cultivos celulares, con aislamiento de campos que muestran mucho menor
afinidad por el sulfato de heparn que las cepas adaptadas en laboratorio.
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FUSIN


Los primeros estudios revelaron que la protena E1 del alfavirus podra ser la protena de
fusin.
Adems, la eliminacin de la protena E2 por la digestin de la proteasa sugiri que la
protena E1 sola es suficiente para que la fusin de membrana se produzca. Sin embargo,
la actividad fusiognica de la protena E1 es suprimida por la interaccin con la protena
E2.
Dentro de las vesculas endosomales, el heterodmero E1- E2 experimenta cambios
conformaciones irreversibles debido a la exposicin de pH de 6 o menor. ste ambiente
de bajo pH libera la subunidad E1 de la asociacin con la subunidad E2, permitiendo el
rearreglo a un complejo homotrimrico activo para fusin. Homotrmeros E1 asociados a
relacionar la membrana va insercin de membrana de fusin de pptidos hidrofbicos
para formar poros en membranas celulares y virales y liberar la nucleocpside entro del
citoplasma. El proceso de fusin ocurre muy rpido, antes que los alfavirus estn en riesgo
de degradacin lisosomal. El tratamiento de clulas con bases dbiles lisosomotrpicas
cloroquina, concanamicina, cloruro de amonio, bafilomicina o monesina neutralizan el pH
en endosomas, previendo fusin con membranas.
En adicin a la dependencia de pH bajo, la fusin del alfavirus a la membrana requiere la
presencia de colesterol. Pequeas cantidades de esfingolpidos tambin se necesitan en
membranas diana para actuar en un rol indefinido durante la reaccin de fusin. El
colesterol parece ser necesario para la interaccin hidrofbica en el ectodominio E1 del
alfavirus con la membrana diana previo a la fusin. Sim embargo, sta dependencia al
colesterol difiere entre los alfavirus, mientras que la entrada de CHIKV, SFV y SINV es
inhibida por el agotamiento de colesterol, VEEV todava puede entrar a las clulas en
condiciones similares. Se propuso que la variacin de las protenas envueltas de VEEV
comparadas con otros alfavirus puede explicar porque se observan stas diferencias.
Como se predijo, la dependencia de colesterol de SFV y SINV le fue atribuida a un residuo
especfico dentro de la protena E1 en la posicin 226. Los virus que contenan una
mutacin E1-P226S eran ms eficientes en fusin en la ausencia de colesteroles
comparados con un tipo salvaje, con la protena E1 convertida al homotrmero de fusin
activa ms fcilmente. Anlisis secuenciales de la protena E1 del VEEV muestran que sta
mutacin ya est presente. Se he mostrado que la membrana de endosomas tempranos
est enriquecida en colesterol mientras que los endosomas tardos estn reducidos en
colesterol de membrana. Esto ha sido usado para explicar las diferencias en
requerimientos de colesterol, desde que SFV parece experimentar fusin en endosomas
tempranos mientras que VEEV trata con endosomas tardos, para fusin.




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DESMONTAJE DE NUCLEOCPSIDE


Debido al impedimento estrico, slo una pequea fraccin de molculas en fusin de la
protena E1 presentes en la superficie de la partcula individual del virus sern aptas para
participar en las reacciones de fusin dentro de la membrana endosomal. Se ha propuesto
que las protenas de fusin restantes que no han reaccionado con la membrana diana tal
vez se plieguen y reaccionen con la membrana viral en la cual han sido ancladas, dando
lugar a la formacin de poros permeables a iones. Juntos, estos procesos permiten la
entrega de la nucleocpside dentro del citoplasma, y un flujo de iones a travs de la
membrana diana. La formacin de poros permeables a iones por protenas virales durante
la entrada ha sido encontrada con otros virus como el virus de la influenza, con la protena
M2 implicada en el flujo de protones del endosoma a un pH bajo.
Una funcin similar para el alfavirus de la protena E1 ha sido propuesta. En efecto, la
acumulacin de estructuras proteicas virales en la membrana celular durante la
multiplicacin del virus altera la permeabilidad de membrana a bajo pH al final de una
infeccin. Cuando la permeabilidad de membrana de clulas incubadas con SINV y SFV a
bajo pH fue evaluado, las medidas de voltaje confirmaron la formacin de poros
permeables a iones. El flujo de protones resultante desde el endosoma hacia dentro del
citoplasma a travs de ste poro habra conducido hacia una regin de bajo pH,
consecuente con el descubrimiento que un ambiente de pH bajo estimula fuertemente el
desmontaje de la cpside del alfavirus.
La fusin del virus envuelto con la membrana endosomal libera nucleocpside dentro del
citoplasma de la clula. Exponer las nucleocpsides del alfavirus ocurre casi de inmediato
(1 minuto) despus de la penetracin dentro del citoplasma. RNA ribosomal 60S
interacta con la protena C, facilitando exponer la nucleocpside y liberar el RNA viral
para iniciacin de la sntesis proteica.


CONCLUSIN


El estudio de alfavirus ha provisto un sinnmero de ideas relacionadas a la entrada de
virus. De hecho, reportes de SFV fueron los primeros en demostrar la entrada de los virus
va receptor mediada por endocitosis, y el uso de vesculas revestidas de clatrina. La va
de entrada del alfavirus ha sido remotamente dilucidada, proporcionando un gran
entendimiento de eventos como la fusin traficante de virus, fusin y la liberacin de
material genmico dentro de las clulas. Sim embargo, quedan algunas preguntas que an
deben contestarse. Un rea para investigacin es la identificacin de receptores usados en
el ataque del alfavirus a las clulas. Hasta ahora, los receptores han sido identificados slo
por SFV y SINV entrando a las clulas. Receptores de aislamiento podran dar lugar al
desarrollo de nuevos antivirales dirigidos a la entrada de alfavirus. Otro tema de
exploracin es el uso de vas alternas para la entrada de alfavirus dentro de las clulas.
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Hay evidencia creciente que los alfavirus son capaces de infectar clulas
independientemente de la endocitosis mediada por clatrina, ya sea empleando una va de
entrada diferente en conjunto, o siendo capaz de entrar a las clulas usando diferentes
vas. En el caso de CHIKV, la entrada tambin ha sido demostrada que ocurre en la
ausencia de cav-1 (requerido para la formacin de vesculas caveola). Puede ser posible
que los alfavirus como el CHIKV sean capaces de utilizar una va dependiente dinmica
confiando en la pequea GTPasa RhoA. sta va no involucra clatrina, caveolas, ni Eps15,
aunque es fuertemente inhibida por un knock out dinmico, RhoA o el agotamiento de
colesterol o esfingolpidos, coincidiendo con trabajos anteriores. Se espera que el estudio
continuo del alfavirus brinde una luz de conocimientos de los procesos involucrados en su
entrada.











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