COLORACION DE GRAM

CAROLINDA AGUDELO
JULIETH BELTRAN
LAURA MIRANDA
ALEJANDRA RUIZ
PAOLA SALCEDO



















UNIVERSIDAD COOPERATIVA DE COLOMBIA
FACULTAD DE ODONTOLOGIA
MICROBIOLOGIA
VILLAVICENCIO, META
2014

COLORACION DE GRAM












CAROLINDA AGUDELO
JULIETH BELTRAN
LAURA MIRANDA
ALEJANDRA RUIZ
PAOLA SALCEDO







DOC. CRISTINA GIL RODRIGUEZ
















UNIVERSIDAD COOPERATIVA DE COLOMBIA
FACULTAD DE ODONTOLOGIA
MICROBIOLOGIA
VILLAVICENCIO, META
2014
INTRODUCCION



El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de
ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la
clula y el medio que la rodea. El modo ms simple de aumentar el contraste es la
utilizacin de colorantes.

Si se desea simplemente aumentar el contraste de las clulas para la microscopa,
son suficientes los procedimientos que usan un solo colorante llamado de tincin
simple. Sin embargo, a menudo se utilizan mtodos que no tien de igual modo
todas las clulas, es el proceso denominado tincin diferencial. Uno muy usado en
microbiologa es la tincin Gram. Basndose en su reaccin a la tincin Gram, las
bacterias pueden dividirse en dos grupos: Gram positivas y gramnegativos. Esta
tincin tiene gran importancia en taxonoma bacteriana ya que indica diferencias
fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias.
Mientras que las bacterias gramnegativos son constantes en su reaccin, los
microorganismos Gram positivos pueden presentar respuestas variables en ciertas
condiciones (son gramlbiles). Por ejemplo, los cultivos viejos de algunas
bacterias grampositivas pierden la propiedad de retener el cristal violeta, y en
consecuencia, se tien por la safranina apareciendo como gramnegativas.

























COLORACION DE GRAM

La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin
diferencial empleado en Bacteriologa para la visualizacin de bacterias, sobre
todo en muestras clnicas. Debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram,
que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la
morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin
a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las
bacterias que se visualizan de color morado, y Bacteria Gram negativa a las que
se visualizan de color rosa o rojo o grosella.

La tincin de gram utiliza en orden estricto de primero a cuatro los siguientes
reactivos:
1. CRISTAL VIOLETA o violeta de genciana: COLORANTE BASICO
2. LUGOL DE GRAM: MORDIENTE
3. ALCOHOL-ACETONA: DECOLORANTE
4. FUSCINA (SAFRANINA): COLORANTE DE CONTRASTE

Los pasos que se han de seguir para realizar la tincin son los siguientes:

1. Lamina portaobjeto
2. Colocar una gota de la muestra en la lamina
3. Flamear-fijar ( 3 veces)
4. Agregar cristal voleta por 1
5. Lavar H2O
6. Agregar lugol por 1
7. Lavar H2O
8. Agregar alcohol acetona 15
9. Lavar H2O
10. Agregar fuscina gram 30
11. Lavar con Agua
12. Llevar al microscopio


Para observar al microscopio ptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite
de inmersin.



Fundamentos y factores que afectan la tincin


Las bacterias Gram negativas
pierden un colorante (el cristal
violeta) con mayor facilidad que las
Gram positivas. La razn es la menor
cantidad de mucopptido de las
paredes de las bacterias Gram
negativas.

La diferenciacin se hace aadiendo pequeas cantidades de etanol a las clulas
teidas con cristal violeta. El citoplasma de las clulas que han perdido el cristal
violeta se tie con otro colorante (safranina). La diferencia de color se relaciona
con el tipo de pared bacteriano: clulas de color violeta (bacterias de pared Gram
positivas) y clulas de color rosa (bacterias de pared Gram negativa).

En realidad la diferencia de color no es especfica de la pared bacteriana: todas
las clulas sin pared (como las animales) pierden fcilmente el cristal violeta (se
vern de color rosa). Todas las clulas con pared gruesa (como las de hongos) se
vern de color violeta. La correlacin entre el color y el tipo de pared solo tiene
sentido con clulas bacterianas (salvo excepciones).

El cristal violeta es bsico (se une a componentes celulares de carga negativa).
Atraviesa la envuelta celular y se acumula en el citoplasma. Para facilitar la
diferenciacin se mezcla lugol con cristal violeta: el complejo cristal-violeta-lugol
precipita. As el lugol dificulta la salida del cristal violeta de ambos tipos de clulas,
pero es ms fcil de extraerlo de las Gram negativas que de las Gram positivas.

Cuando se aade etanol a una mezcla de clulas Gram positivas y Gram
negativas teidas con cristal violeta, las clulas Gram positivas quedan teidas de
violeta: no puede atravesar la gruesa capa de murena (pueden hacerlo si se
prolonga excesivamente el contacto con el alcohol). La pared de las bacterias
Gram negativas debe su rigidez a una capa de murena mas delgada, a travs de
la cual el alcohol extrae el cristal violeta de estas clulas. Su citoplasma queda
incoloro y puede teirse de color rosa con el colorante de contraste: la safranina.

Los factores que afectan el resultado de la tincin son la edad de las clulas,las
condiciones de cultivo y la actividad de sus autolisinas pueden afectar el
resultado de la tincin. Las clulas envejecidas, o crecidas en condiciones que
impiden la sntesis de mucopptido pueden verse de color rojo. La intensidad de la
decoloracin con alcohol suele ser el problema ms comn.

Utilidades
En el anlisis de muestras clnicas suele ser un estudio fundamental por cumplir
varias funciones:
Identificacin preliminar de la bacteria causal de la infeccin.
Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. Los morfotipos
bacterianos identificados en la tincin de Gram se deben de corresponder con
aislamientos bacterianos realizados en los cultivos. Si se observan mayor
nmero de formas bacterianas que las aisladas hay que reconsiderar los
medios de cultivos empleados as como la atmsfera de incubacin.
A partir de la tincin de Gram pueden distinguirse varios morfotipos distintos:
Los cocos son de forma esfrica. Pueden aparecer aislados despus de la
divisin celular (Micrococos), aparecer por pares (Diplococos), formar cadenas
(Estreptococos), o agruparse de manera irregular (Estafilococos).
Los bacilos poseen forma alargada. En general suelen agruparse en forma de
cadena (Estreptobacilos) o en empalizada.
Tambin pueden distinguirse los espirales, que se clasifican en espirilos si son de
forma rgida o espiroquetas si son blandas y onduladas. Si por el contrario, poseen
forma de "coma", o curvados, entonces se los designa vibrios.




Tincin GRAM: Bacterias Gram-Positivas
Cocos Gram-positivos

Racimos: forma tpica de Staphylococcus sp, como S. aureus

Cadenas: forma tpica de Streptococcus sp, como S.
pneumoniae, Streptococcus grupo B

Tetradas: forma tpica de Micrococcus sp

Bacilos Gram-positivos
Gruesos: forma tpica de Clostridium sp, como C. perfringens, C. septicum

Finos: forma tpica de Listeria sp

Ramificados: forma tpica de Actinomycetes y Nocardia, como A. israelii




Tincin GRAM: Bacterias Gram-Negativas
Cocos Gram-negativos

Diplococos: forma usual de Neiseria sp, como N. meningitidis
Tambin Moraxella sp y Acinetobacter sp aparecen con morfologa de diplococos.
Acinetobacter puede ser pleomrfico, y a veces aparece como coco Gram-positivo.

Cocobacilos: forma usual de Acinetobacter sp, que puede ser Gram-positivo o Gram-
negativo, y, a menudo, Gram-variable.


Bacilos Gram-negativos
Bacilos finos: forma usual de enterobacteriaceae, como E. Coli

Cocobacilos: forma usual de Haemophilus sp, como H. influenzae

Curvados: forma usual de Vibrio sp, como V. cholerae, y Campylobacter sp, como C.
jejuni

Forma de aguja fina: forma usual de Fusobacterium sp









DIFERENCIA ENTRE GRAM POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS

El universo que descubri Leeuwenhoek estuvo conformado por bacterias y
protozoarios de diversas caractersticas. Es por ello que hoy en da sabemos que
hay millones de microorganismos que se encuentran en todos los lugares de
nuestro planeta, en al agua dulce y salada, por tanto viven en el aire, agua y tierra,
se les halla tambien en los alimentos, en el exterior y el interior de los seres vivos.
Tambin causan enfermedades y otros que son beneficiosos para nosotros.

Por eso es de vital importancia conocer sobre estos microorganismos.
Especialmente hablaremos sobre bacterias, tipos, caractersticas y diferencias
entre gramnegativos y positivas.

Las bacterias pertenecen al filum de las Shizomycophyta, se les llama tambin
microbios o grmenes. Son de pequeo tamao. Casi siempre son unicelulares.

Estan recubiertas por una pared celular de naturaleza quitinosa en su superficie
externa. Poseen prolongaciones filamentosas que les permiten desplazarse otras
tienen flagelos.

La pared celular que rodea a las bacterias es compleja y existen dos formas
bsicas: pared celular grampositiva con una gruesa capa de pptidoglucano y una
pared gramnegativa con una delgada capa de pptidoglucano, as como una
membrana externa.

Algunas bacterias carecen de pared celular y compensan su ausencia
sobreviviendo tan solo al interior de clulas del organismo anfitrin o en un
ambiente hipertnico.

Para clasificar a las bacterias debemos tener en cuenta su tamao, forma,
disposicin espacial, propiedades.

Se encuentran en todos los lugares de nuestro planeta, en al agua dulce y
salada, por tanto viven en el aire, agua y tierra, y se les halla tambien en los
alimentos y en el exterior y el interior de los seres vivos.

Encontramos tambin bacterias que pueden provocar enfermedades
potencialmente mortales. La enfermedad puede deberse a los efectos txicos de
los productos bacterianos o a la invasin de regiones corporales que acostumbran
a ser estriles.





BACTERIAS

Caractersticas:
-Las bacterias son de vidas libres, cosmopolitas y patgenas para el hombre y
animales.
-Miden entre 1 y 10 um.
-Estos causan enfermedades infecciosas en los seres vivos.
- Son beneficiosos como los que reciclan el carbono, azufre, nitrgeno y fsforo;
algunos viven el intestino del hombre (ejemplo: Escherichia coli), los cuales
sintetizan vitaminas como BIOTINA; en rumiantes elaboran celulosa, una enzima
que digiere la celulosa.

Funciones:
-Nutricin: auttrofa: por fotosntesis y quimiosntesis y hetertrofa (bacterias).
-Reproduccin: asexual y sexual, la reproduccion de las bacterias se realiza a gran
velocidad; algunas se dividen un vez cada 20 minutos.

Estructura:

constituida por:

Pared celular.
Membrana Celular.
Estructura Citoplasmticas.
Genforo.
Cpsula.
Fimbrias o Pilis.
Ausencia de Envoltura Nuclear


Estructura de las Gram Positivas y Gram Negativas


La tincin Gram es una prueba potente y rpida que nos permite diferenciar dos
clases de bacterias estas son: Bacterias grampositivas y las gramnegativas.

Las grampositivas se tien de morado ya que el colorante se queda atrapado en la
capa gruesa de peptidoglucanos que rodea a la clula

Las gramnegativas tienen una capa de petidoglucano mucho ms delgada es por
ello que no retiene el violeta cristal y por esto las clulas se tien con safranina y
las observamos rojas.















DIFERENCIAS MOLECULARES ENTRE UNA BACTERIA GRAN POSITIVA Y
OTRA GRAN NEGATIVA.

BACTERIAS GRAM POSITIVAS BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

Poseen una pared celular interna y una
pared de peptidoglucano.
*Peptidoglucano: es un exoesqueleto
que da consistencia y forma esencial
para replicacin y supervivencia de la
bacteria.

Poseen una pared celular ms
compleja:
-pared celular interna
-pared de peptidoglucano
- bicapa lipdica externa

No tiene membrana externa

Membrana externa: forma un saco
rgido alrededor de la bacteria,
mantiene estructura y es barrera

Tincin GRAM
impermeable a macromolculas, ofrece
proteccin en condiciones adversas


No tiene espacio periplasmtico

Espacio periplasmtico: espacio entre
la superficie externa de la membrana
citoplasmtica y la interna de la
membrana externa.

La red de murena est muy
desarrollada y llega a tener hasta 40
capas

La red de murena presenta una sola
capa

La penicilina mata a las gram positivas,
ya que bloquea la formacin de enlaces
peptdicos entre las diferentes cadenas
del peptidoglucano

La penicilina no mata a las Gram
negativas, a causa de la capa de
lipopolisacridos situada en la parte
externa de la pared celular.

No contiene LPS

Contiene LPS: estimulador de
respuestas inmunes: activa clulas B,
liberacin de IL, FNT, IL 6 por
macrfagos.

En la tincin de Gram, retienen la tincin
azul

Quedan decoloradas.

Conservan el complejo yodocolorante


Pierden el complejo yodocolorante



Son esporulantes y no esporulantes,
como Streptococcus, Cisteria, Frankia.


Pueden ser anaerobios o aerobios

Poseen otros componentes: cidos
teicoicos y lipoteicoicos, y polisacridos
complejos.

Poseen protenas con concentraciones
elevadas.








BIBLIOGRAFIA

1. http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Gram
2. http://facultadsalud.unicauca.edu.co/Documentos2010/DptoMedInt/Tencion
_de_gram.pdf
3. http://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/tinciones/gram#__doku
_fundamentos_y_factores_que_afectan_el_resultado_de_la_tincion
4. http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm
5. http://www.slideshare.net/Prymer/gram-positivos-y-negativos
6. http://www.unavarra.es/genmic/microclinica/01%20estructura%20MC%20%
2008-09.pdf