Identif Icac I One Val

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

IDENTIFICACIN Y EVALUACIN
DE LA CAPACIDAD DE CORROSIN
DE UNA BACTERIA ESPORULADA
AISLADA DE UN GASODUCTO

T E S I S
PARA OBTENER EL GRADO DE:
MAESTRO EN CIENCIAS
Q U I M I C O B I O L O G I C A S
P R E S E N T A:
OSWALDO ARTURO RAMOS MONROY

DIRECTORES DE TESIS:
Dra. NORA RUIZ ORDAZ
Dra. MNICA JAZMN HERNNDEZ GAYOSSO

2008

IDENTIFICACIN Y EVALUACIN
DE LA CAPACIDAD DE CORROSIN
DE UNA BACTERIA ESPORULADA
AISLADA DE UN GASODUCTO

El presente trabajo fue realizado en los siguientes laboratorios:

Laboratorio de Bioingeniera del Departamento de Ingeniera Bioqumica
de la Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas.

Laboratorio de Microbiologa y Electroqumica del rea de Corrosin
del Instituto Mexicano del Petrleo.

CONTENIDO
ndice General

i
ndice de Tablas

v
ndice de Figuras

vi
Resumen

xi
Abstract

xii
Captulo 1
Introduccin

1
Captulo 2
Antecedentes

16
Captulo 3
Justificacin

20
Captulo 4
Objetivos

22
Captulo 5
Metodologa

24
Captulo 6
Material y Mtodos

26
Captulo 7
Resultados y Discusin

75
Captulo 8
Conclusiones

146
Captulo 9
Bibliografa

148
Captulo 10
Anexo
Pruebas Electroqumicas

160
i

ndice General
1. Introduccin

1.1. Generalidades
1.2. Corrosin
1.3. Tipos de corrosin
1.4. Corrosin inducida por microorganismos o biocorrosin
1.5. Biocorrosin de manera activa
1.5.1. Bacterias reductoras de sulfato
1.5.2. Bacterias productoras de cido
1.5.3. Bacterias depositadoras de metales
1.5.4. Bacterias formadoras de babaza
1.5.5. Otras bacterias
1.6. Biocorrosin de manera pasiva
1.7. Identificacin
1.8. Corrosin en la industria petrolera
1.9. Principales microorganismos en la industria petrolera
1.10. Indicios de la biocorrosin
1.11. Control del crecimiento bacteriano
1.12. Mtodos para evaluar velocidades de corrosin
1.13. Mtodos gravimtricos
1.14. Mtodos electroqumicos

2

2
2
2
3
4
5
7
7
7
8
8
9
10
10
11
12
13
14
14
2. Antecedentes

17
3. Justificacin

21
4. Objetivos

4.1. Objetivo general
4.2. Objetivos especficos

23

23
23
5. Metodologa

25

ii

6. Material y Mtodos

6.1. Recoleccin de la muestra
6.2. Microorganismos
6.3. Medios de cultivo
6.3.1. Medio de conservacin de cepas
6.3.2. Medios de cultivo empleados en la seleccin del medio para el
estudio de biocorrosin
6.3.3. Preparacin de la celda electroqumica para la seleccin del
medio de cultivo
6.4. Cupones de acero
6.4.1. Acondicionamiento de los cupones de acero al carbn API XL 52
6.5. Determinacin de crecimiento por el nmero ms probable (NMP)
6.6. Cuantificacin de sulfuros
6.7. Cuantificacin de sulfatos
6.8. Cuantificacin de fierro total
6.9. Determinacin de acidez
6.10. Determinacin del pH
6.11. Identificacin de los microorganismos
6.11.1. Pruebas bioqumicas de identificacin tradicionales
6.11.2. Aislamiento de DNA
6.11.3. Amplificacin del DNA por la reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR)
6.11.4. Electroforesis en gel con gradiente de temperatura
6.11.5. Electroforesis en gel de agarosa
6.11.6. Purificacin del DNA amplificado
6.11.7. Secuenciacin de un fragmento del gen 16S rDNA
6.11.8. Anlisis de restriccin del 16S rDNA amplificado (ARDRA)
6.11.9. Anlisis del DNA polimrfico amplificado aleatoriamente
(RAPD)
6.11.10. Extraccin de plsmidos
6.12. Medicin de la velocidad de corrosin
6.12.1. Tcnica gravimtrica
6.12.2. Resistencia a la polarizacin (Rp)
6.12.3. Espectroscopa de Impedancia Electroqumica (EIE)
6.13. Anlisis de las superficies metlicas
6.14. Determinacin del crecimiento de las bacterias planctnicas y ssiles
6.14.1. Bacterias planctnicas
6.14.2. Bacterias ssiles
6.15. Determinacin de la concentracin celular
6.15.1. Por peso seco
6.15.2. Por turbiedad
6.16. Determinacin de cidos orgnicos por cromatografa de gases (GC)
6.17. Cupn de referencia adicionado de cidos orgnicos
27

27
29
29
29
29

31

32
32
33
35
36
37
38
39
40
40
42
44

47
51
52
52
53
55

56
59
60
62
63
64
67
68
68
69
69
69
70
73
iii

7. Resultados y Discusin

7.1. Identificacin de los microorganismos aislados de un gasoducto
7.1.2. Observacin microscpica de las cepas G1-2006 y G1-2007
7.1.3. Identificacin de las cepas mediante ensayos bioqumicos
7.1.4. Identificacin de las cepas empleando tcnicas moleculares
7.1.4.1. Aislamiento de DNA
7.1.4.2. Amplificacin de un fragmento del 16S rDNA y TGGE
7.1.4.3. Anlisis de restriccin del 16S rDNA amplificado (ARDRA)
7.1.4.4. Anlisis del DNA polimrfico amplificado aleatoriamente
(RAPD)
7.1.4.5. Secuenciacin del gen 16S rDNA
7.1.4.6. Perfil de plsmidos
7.2. Cintica de crecimiento, consumo de sulfatos, produccin de H
2
S y de
fierro total
7.2.1. Seleccin del medio de cultivo para los estudios de corrosin
7.2.2. Consumo de sulfatos
7.2.3. Produccin de sulfuros
7.2.4. Formacin de fierro total en el medio de cultivo
7.3. Produccin de cidos orgnicos
7.5. Evaluacin gravimtrica de la biocorrosin y de la corrosin abitica con
adicin de cidos orgnicos
7.6. Observaciones al microscopio electrnico de barrido de los cupones
sometidos a corrosin
7.7. Determinacin de la velocidad de corrosin inducida por C. celerecrescens
7.8. Determinacin de la velocidad de corrosin por tcnicas electroqumicas,
Rp y EIE
7.8.2.1. Prueba de EIE para el sistema de referencia
7.8.2.2. Prueba de EIE para el sistema con C. celerecrescens (problema)
7.9. Microscopa electrnica de barrido ambiental (MEBA)

76

76
76
77
79
79
80
82
84

85
87
89

89
92
93
93
94
97
100

101

104
104
105

105
108
108
123
140
8. Conclusiones

145

9. Bibliografa

147
iv

10. Anexo

10. Pruebas Electroqumicas
10.1. Medicin de potencial-tiempo
10.2. Resistencia a la polarizacin (Rp)
10.2.1. Ecuacin de Butler-Volmer
10.2.2. La ecuacin de Tafel
10.2.3. Ecuacin de Stern y Geary
10.3. Espectroscopa de Impedancia Electroqumica (EIE)

159

159
159
159
160
161
162
165

v

ndice de Tablas

Tabla 1. Composicin del medio de cultivo API RP 38

29

Tabla 2. Composicin del medio Bold basal modificado

30
Tabla 3. Composicin del medio Postgate C

30
Tabla 4. Iniciadores utilizados para la evaluacin de la riqueza de especies

46
Tabla 5. Iniciadores utilizados para la identificacin de las cepas aisladas

46
Tabla 6. Iniciadores empleados para el RAPD

46
Tabla 7. Pruebas bioqumicas para identificacin de bacterias. Fermentacin de
carbohidratos

77
Tabla 8. Pruebas enzimticas para identificacin de bacterias

78
Tabla 9. Microorganismos identificados por secuenciacin de un fragmento del 16S
rDNA

86
Tabla 10. Velocidades de corrosin obtenidas por gravimetra para el cupn de
acero al carbn API XL 52 expuesto a tres diferentes medios de cultivo (API RP 38,
Bold basal modificado y Postgate C) en presencia de C. celerecrescens

104
Tabla 11. Valores de los elementos elctricos que componen el circuito
equivalente durante el ensayo electroqumico con el sistema de referencia

121

equivalente durante el ensayo electroqumico en el sistema que incluye al
microorganismo

136

vi

ndice de Figuras

Figura 1. Esquema de la corrosin inducida por microorganismos

3
Figura 2. Celda electroqumica de volumen nominal de 1000 mL empleada para la
seleccin del medio de cultivo

31
Figura 3. Cilindros de acero al carbn API XL 52 referidos como electrodos de
trabajo o cupones corrosimtricos

32
Figura 4. Bosquejo de las diluciones realizadas para la estimacin del nmero ms
probable (NMP)

34
Figura 5. Programa utilizado para la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

45
Figura 6. Equipo para llevar a cabo una electroforesis en gel con gradiente de
temperatura (TGGE)

49
Figura 7. Esquema de la celda utilizada en las tcnicas electroqumicas

59
Figura 8. Dibujo emblemtico de la elaboracin de los ampoviales

67
Figura 9. Sistema de anaerobiosis para incubar los cupones de referencia y los
cupones de referencia adicionados de cido actico y cido butrico

74
Figura 10. Morfologa microscpica de las bacterias aisladas (A) de la cepa G1-2006
y (B) de la cepa G1-2007

76
Figura 11. Fotografa del electroferograma en gel de agarosa al 1% del DNA
extrado de las cepas

79
Figura 12. Electroferograma en agarosa de los amplicones de 470 pb del 16S rDNA
de los cultivos G1-2006 y G1-2007

80
Figura 13. Resultados de la electroforesis en gel con gradiente de temperatura
(TGGE) de un fragmento del 16S rDNA de los cultivos

81
Figura 14. Patrn electrofortico del anlisis de restriccin del 16S rDNA de las
cepas G1-2006 y G1-2007

82
Figura 15. Patrn electrofortico del RAPD

84
vii

Figura 16. Electroferograma en gel de agarosa de los amplificados del 16S rDNA de
las cepas

85
Figura 17. Perfil electrofortico de la cuantificacin de plsmidos mediante la
prueba de lisis alcalina de las cepas G1-2006 y G1-2007

87
Figura 18. Electroferograma correspondiente a las cepas G1-2006 y G1-2007 con
ayuda del kit para extraccin de plsmidos

88
Figura 19. Cintica de crecimiento de C. celerecrescens en diferentes medios de
cultivo

89
Figura 20. Consumo de SO
4
2-
y produccin de S
=
y fierro total por C. celerecrescens
en medio de cultivo API RP 38

91
4
2-
y produccin de S
=
en medio de cultivo Bold basal modificado

91
4
2-
y produccin de S
=
en medio de cultivo Postgate C

92
Figura 23. Cromatogramas de productos metablicos de C. celerecrescens junto
con los perfiles de los estndares de cido actico y cido butrico. Las muestras se
tomaron a diferentes tiempos (504, 672, 840 y 1008 h) de cultivo

94
Figura 24. Determinacin cromatogrfica de la concentracin de cido actico
(Tr = 11.85) y cido butrico (Tr = 16.2) de las muestras del cultivo de
C. celerecrescens

95
Figura 25. Produccin de acidez total y pH en funcin del tiempo del cultivo de
C. celerecrescens en el medio Postgate C

96
Figura 26. Cintica de crecimiento de las bacterias planctnicas y ssiles en el
cultivo de C. celerecrescens durante la evaluacin de la corrosin inducida por
microorganismos

97
Figura 27. Imagen obtenida por microscopa electrnica de barrido de la
biopelcula formada por C. celerecrescens durante la evaluacin de la corrosin por
microorganismos

Figura 28. Velocidades de corrosin de los cupones metlicos en el sistema bitico,
en el sistema abitico adicionado de cidos orgnicos y en el sistema de referencia
(testigo)
99

101
viii

Figura 29. Observacin microscpica de la biopelcula (P) y de la biocorrosin (B),
as como de los testigos (referencias) (R) de los cupones de acero al carbn API XL
52 para el sistema que explica la corrosin inducida por microorganismos

102
Figura 30. Observacin microscpica de la corrosin de los cupones de acero al
carbn API XL 52, tanto para el sistema abitico adicionado de cido actico y de
cido butrico, como para sus respectivos testigos (referencias) en funcin de las
seis semanas de incubacin

103
Figura 31. Resistencia de polarizacin para el sistema de referencia y para el de
C. celerecrescens en funcin del tiempo

105
Figura 32. Evaluacin en funcin del tiempo de la velocidad de corrosin del acero
al carbn API XL 52 para ambos sistemas, tanto para el de referencia, como para el
de C. celerecrescens, estimada por medida de la resistencia a la polarizacin

106
Figura 33. Diagramas de Nyquist para el sistema de referencia, expuesto el cupn
de acero al carbn API XL 52 al medio de cultivo

109
Figura 34. Diagramas de Bode para el sistema de referencia, expuesto el metal de
acero al carbn API XL 52 al medio de cultivo. A) modulo; B) ngulo de fase

110
Figura 35. Circuito equivalente empleado en el ajuste de los datos experimentales
del sistema de referencia

111
Figura 36. Diagrama de Nyquist para el sistema de referencia ajustado al inicio de
la prueba electroqumica con el programa ZView

112
Figura 37. Diagramas de Bode para el sistema de referencia ajustados al inicio de la
prueba electroqumica con el programa ZView

Figura 38. Circuito equivalente y valores de cada elemento que forman el circuito
al tiempo de inicio de la prueba, estimados mediante el programa ZView

113

114
Figura 39. Diagrama de Nyquist para el sistema de referencia empleando el
programa ZView a la mitad de la prueba electroqumica.

114
Figura 40. Diagramas de Bode para el sistema de referencia utilizando el programa
ZView a la mitad de la tcnica electroqumica

115
al tiempo intermedio de la tcnica electroqumica
116
ix

Figura 42. Diagrama de Nyquist para el sistema de referencia al final de la
determinacin electroqumica correspondiente al ajuste con el programa ZView

117
Figura 43. Diagramas de Bode para el sistema de referencia al final de la
determinacin electroqumica ajustados mediante el programa ZView

118
al tiempo final de la determinacin electroqumica

119
Figura 45. Velocidad de corrosin para el sistema de referencia calculada
mediante EIE

122
Figura 46. Diagramas de Nyquist para el metal expuesto al microorganismo y al
medio de cultivo

124
Figura 47. Diagramas de Bode para el metal expuesto al microorganismo y al
medio de cultivo

125
del sistema con el microorganismo en su primera etapa

126
del sistema con el microorganismo en su segunda etapa

Figura 50. Diagrama de Nyquist para el sistema con el microorganismo ajustado
con el programa Zview para la primera etapa de la prueba electroqumica

126

127
Figura 51. Diagramas de Bode para el sistema con el microorganismo ajustados por
medio del programa ZView al inicio de la prueba electroqumica

128
en los primeros tiempos de la determinacin generados por el programa ZView

129
Figura 53. Diagrama de Nyquist para el sistema con el microorganismo empleando
el programa Zview a la mitad de la prueba electroqumica

130
Figura 54. Diagramas de Bode para el sistema con el microorganismo con el
programa ZView a la mitad de la prueba electroqumica

131
a la mitad de la tcnica aplicando el programa ZView

132

x

Figura 56. Diagrama de Nyquist para el sistema con el microorganismo
correspondientes al ajusta de con el programa ZView al final de la prueba
electroqumica

133
Figura 57. Diagramas de Bode para el sistema con el microorganismo usando el
programa ZView al final de la prueba electroqumica

134
al final de la determinacin valorados con el programa ZView

134
Figura 59. Velocidad de corrosin para el sistema con C. celerecrescens expuesto
al medio de cultivo Postgate C y a acero a l carbn API XL 52 determinada
mediante EIE

138
Figura 60. Velocidad de corrosin para los sistemas de referencia y con el
microorganismo, expuestos a acero al carbn API XL 52 y al medio de cultivo
Postgate C

139
Figura 61. Observacin microscpica del sistema de referencia (R), de la biopelcula
(P) y de la corrosin (C) (una vez eliminada la biopelcula) de los cupones metlicos
obtenidos al finalizar los ensayos electroqumicos

141
Figura 62. Microanlisis de la superficie metlica del cupn retirado de la celda
electroqumica al trmino del ensayo espectroscpico del sistema de referencia

142
electroqumica al trmino de la determinacin espectroscpica para el sistema con
C. celerecrescens

143
Figura 64. Relacin lineal entre la densidad de corriente, , y el sobrepotencial ,
que se obtiene cuando se polariza un sistema de corrosin ( 10 a 20 mV) desde
el E
corr

164
Figura 65. Circuito equivalente para un proceso de corrosin simple 165
Figura 66. Diagrama de Nyquist para un metal en proceso de corrosin con sus
componentes real e imaginario

166
Figura 67. Diagrama de Nyquist para un proceso gobernado por control de difusin

167
Figura 68. Circuito equivalente que modela la impedancia de Warburg

168

xi

Resumen
La corrosin del acero inducida por microorganismos es uno de los problemas que se
presentan en los ductos de la industria del petrleo. En el presente trabajo se aisl una
bacteria esporulada de un gasoducto y un ao despus nuevamente se aisl del mismo
sitio otra bacteria esporulada. Ambas bacterias se identificaron y se evalu su influencia
en la corrosin de acero al carbn API XL 52.
La identificacin de las bacterias se realiz utilizando tcnicas bioqumicas y mediante la
amplificacin (PCR) del 16S rDNA, su secuenciacin y comparacin con la base de datos
del NCBI. Tambin se compararon las cepas entre s empleando tcnicas moleculares
como los patrones de restriccin nicos del 16S rDNA (ARDRA) y el perfil de fragmentos
amplificados del DNA genmico empleando un iniciador inespecfico (RAPD). Los
resultados obtenidos mostraron que las dos cepas corresponden a Clostridium
celerecrescens con una homologa del 99% con la secuencia reportada en el NCBI, y los
perfiles electroforticos del ARDRA y RAPD de ambas cepas fueron idnticos; por lo que se
puede concluir que se trata de la misma cepa y que sta fue persistente. En ninguna de
las cepas se observ la presencia de plsmidos. Cuando se midi la velocidad de corrosin
del metal, mediante la tcnica gravimtrica, con ambas cepas se obtuvieron resultados
similares (5.5 mpy). La evaluacin de la velocidad de corrosin empleando tcnicas
electroqumicas se realiz nicamente con la ltima cepa aislada, siendo sta prxima a 5
mpy que es semejante a la obtenida con la tcnica gravimtrica. Estos valores de
velocidad de corrosin se consideran moderados de acuerdo con la NACE y,
efectivamente, son inferiores a los obtenidos con bacterias reductoras de sulfato como
Desulfovibrio vietnamensis o Desulfovibrio alaskensis que habitualmente son responsables
de la corrosin de ductos. Sin embargo, la importancia de C. celerecrescens radica en su
permanencia en el ducto y su contribucin al proceso de corrosin. Dada la naturaleza de
la cepa se podra atribuir su participacin en la corrosin, por lo menos en parte, a la
produccin de cidos orgnicos; por lo que tambin se evalu la generacin de algunos de
ellos durante el proceso de corrosin. Los resultados claramente mostraron la produccin
de cido actico y cido butrico que alcanzaron una concentracin de 18 ppm y 24 ppm
en el seno del lquido, concentracin que debe ser mayor en el interior de la biopelcula
adherida a la pared del metal puesto que ah se generan.
La microscopia electrnica de barrido sirvi como herramienta de apoyo para observar el
dao causado por las bacterias en la superficie e integridad del metal. En estas
observaciones se apreci que el tipo de corrosin fue puntual.
De acuerdo con todos los resultados obtenidos, se concluye que C. celerecrescens es un
agente agresor a las lneas de distribucin de los hidrocarburos.
xii

Abstract
The microbial steel corrosion is one of the problems that occur in the oil-industry pipes. In
this research a sporulated bacteria was isolated from a gas pipe and a year later, another
sporulated bacteria was isolated from the same place. Both bacteria were identified and
the influence they had on the API XL 52 carbon- steel corrosion was evaluated.
The identification was carried out by biochemical techniques and by 16S rDNA
amplification, sequencing, and comparison with the NCBI database. The strains were also
compared between them using molecular techniques as the restriction patterns, unique
for 16S rDNA (ARDRA), and the amplified bits profile from the genomic DNA, by using an
unspecific primer (RAPD). The results obtained showed that both strains corresponded to
Clostridium celerecrescens with a 99% homology according to the sequence reported on
the NCBI database. Also, the electrophoresis profiles of the ARDRA and RAPD of both
strains were identical; so it can be concluded these bacteria belong to the same strain and
that this was persistent. No plasmids were found in any of the strains. When the steel
corrosion rate was gravimetrically measured, similar results were appreciated (5.5 mpy).
The steel corrosion evaluation was carried out employing electrochemical techniques only
for the last isolated strain, resulting on 5 mpy, close to the result obtained using
gravimetric techniques.
These values of steel-corrosion rate can be considered as moderated according to the
NACE, and are effectively lower than those resulting from the sulfate reducing bacteria,
such as Desulfovibrio vietnamensis or Desulfovibrio alaskensis which are usually
responsible of the pipes corrosion. However, C. celerecrescens is important because of its
permanence on the internal pipe surface, and its contribution to the corrosion process.
Because of the strain nature, its contribution to the corrosion process could be due to the
organic acid production; thus, the production of some of them was evaluated during the
corrosion process. The results clearly showed the production of acetic and butyric acid
which reached 18 and 24 mg per liter concentration in the liquid sinus, which must best be
lower than in the biological film or biofilm added to the pipe surface.
The scanning electron microscopy analysis supported that the bacteria caused damage on
the surface and the steel integrity. In these images it was appreciated that the corrosion
process was localized.
Taken together the results obtained, it can be concluded that C. celerecrescens is an
aggressive agent which cause corrosion on the pipe lines that distribute hydrocarbons.

1

CAPTULO 1
INTRODUCCIN
2

1. Introduccin

1.1. Generalidades
No cabe duda de que la industria petrolera mexicana es un motor de crecimiento
econmico, por lo tanto, clave del progreso social; sin embargo, uno de los principales
problemas que enfrenta en la actualidad es la corrosin en los ductos, por tal motivo
PEMEX hace nfasis en programas que maximicen el rendimiento, la seguridad y
confiabilidad de la red de ductos. Dichos programas, se dirigen a solucionar los principales
problemas por los que los ductos sufren fallas, ya que el 60% de las irregularidades
presentadas en las lneas de transporte se deben a la corrosin del acero (PEMEX, 2006).
De manera significativa la corrosin, tanto qumica, como microbiolgica presentan
severas consecuencias reflejadas en los siguientes sectores:
econmico
salud
seguridad
tecnolgico
cultural
1.2. Corrosin
En su principio ms bsico, la corrosin no es sino el proceso inverso de la metalurgia, por
el cual las estructuras metlicas enterradas o sumergidas tienden a retornar a su estado
mineral; es decir, se trata del deterioro de metales y aleaciones por accin qumica del
medio ambiente (agua o suelo). La caracterstica fundamental de este fenmeno, es que
slo ocurre en presencia de un electrlito, ocasionando regiones plenamente
identificadas, llamadas estas andicas y catdicas: una reaccin de oxidacin es una
reaccin andica, en la cual los electrones son liberados dirigindose a otras regiones
catdicas. En la regin andica se producir la disolucin del metal (corrosin) y,
consecuentemente en la regin catdica el metal permanecer intacto (Shreir, 1994).
1.3. Tipos de corrosin
Se pueden distinguir dos tipos bsicos de corrosin: la corrosin uniforme y la corrosin
localizada. La corrosin uniforme afecta ms o menos por igual a todos los puntos de la
pieza y la corrosin localizada supone prdidas pequeas de material, pero sus
consecuencias son peores. La corrosin uniforme permite un mayor seguimiento y
3

previsin, ya que la corrosin localizada es menos previsible y su evolucin es mucho
menos regular (Lee y col., 2006). Sin embargo, se ha dado una clasificacin ms detallada,
la cual est en funcin del tipo de dao causado a la estructura metlica, y es la siguiente:
uniforme, galvnica, por picadura, por fisuras, erosin intergranular, exfoliacin, bajo
tensin, por fatiga, por rozamiento, por hidrgeno o por prdida selectiva (NACE, 2004).
Cabe mencionar que se ha estimado que, para los pases industrializados, el 20% de los
casos de corrosin son atribuidos a los microorganismos (Iverson, 1987), por tal motivo es
importante evaluar su efecto en el proceso de corrosin.
1.4. Corrosin inducida por microorganismos o biocorrosin
Se entiende por biocorrosin, al deterioro acelerado de un metal debido a la actividad
microbiana, en la cual se confluyen tres importantes componentes para llevar a cabo el
proceso: metal, productos de corrosin qumica y biopelcula (Figura 1). En esta ltima se
considera que en la matriz polimrica (biopelcula) se encuentran embebidos los
microorganismos y los productos secretados por ellos (Beech y Sonner, 2004; Miranda y
col., 2006).

Figura 1. Esquema de la corrosin inducida por microorganismos.
4

En el proceso de la corrosin inducida por microorganismos (CIM) se han presenciado dos
tipos de comportamiento. Se ha establecido que los microorganismos pueden actuar en
forma benfica al inhibir las velocidades de corrosin y proteger de esta forma las
instalaciones (Potekhina y col., 1999; Dubiel y col., 2002) o bien acelerar el proceso de
corrosin y causar daos en la integridad de los sistemas (Sanders y Hamilton, 1984;
Feugeas y col., 1997).
Con base en lo reportado, la CIM se divide en (SIU, 2004):
Ataque biolgicamente activo.
Ataque biolgicamente pasivo.
En el ataque biolgico pasivo el desgaste del metal es una consecuencia indirecta de la
formacin de biomasa y productos, lo cual origina una biocorrosin lenta en el metal y
abarca grandes reas con una mayor cantidad de prdida de metal. Mientras que en el
ataque biolgico activo se presenta una biocorrosin intensa y localizada con una mayor
incidencia de irregularidades en la superficie metlica, debida a los productos generados
por los microorganismos (Boopathy y Daniels., 1991; Marchal y col., 2001).
1.5. Biocorrosin de manera activa
En la corrosin biolgica activa participan, tanto microorganismos aerobios, como
anaerobios, que al crecer cambian las caractersticas qumicas y la dinmica de la
biopelcula, por lo que sta se modifica a travs del tiempo. Entre los factores que afectan
la agresividad de las bacterias corrosivas estn: temperatura, concentraciones de carbono
orgnico total y de nitrgeno, el flujo, las concentraciones de oxgeno, el tratamiento
qumico, pH y otras (Boopathy y Daniels, 1991; Marchal y col., 2001; Else y col., 2003).
Existen cinco clases principales de bacterias implicadas en la corrosin.
Bacterias reductoras de sulfatos.
Bacterias productoras de cido.
Bacterias depositadoras de metales
Bacterias formadoras de babaza.
Otras bacterias.

5

1.5.1. Bacterias reductoras de sulfato
Las bacterias reductoras de sulfato presentan una amplia diversidad de caractersticas
morfolgicas y bioqumicas: crecen anaerbicamente y reducen sulfatos, SO
4
2-
, a sulfuros,
S
2-
(Boopathy y Daniels, 1991; Marchal y col., 2001).
Las bacterias reductoras de sulfato son las ms representativas en cuanto se refiere a la
corrosin metlica. Tres gneros anaerobios causan la mayor parte de la corrosin,
Desulfovibrio, Desulfuromonas y Desulfotomaculum, las bacterias reductoras de sulfato
sobreviven en hbitats muy extremos. Forzosamente deben estar presentes los sulfatos o
azufre para su crecimiento, toleran temperaturas altas hasta 80 C y un pH entre 8 y 9
(Boopathy y Daniels, 1991; Marchal y col., 2001; Else y col., 2003).
El mecanismo de la corrosin incluye la despolarizacin catdica, en donde se remueve al
hidrgeno de los sitios catdicos mediante enzimas capaces de utilizar el hidrgeno
(Boopathy y Daniels, 1991; Wagner y col., 1998; Tributsch y Rojas-Chapana, 2000; Marchal
y col., 2001).
H
+

Sulfatos inorgnicos Sulfuros
reducen

El ataque ocurre con mayor facilidad en las superficies metlicas. Las principales
reacciones en la corrosin de acero son:
nodo
4Fe
0
4Fe
++
+ 8 e
-

Disociacin del agua
8H
2
O 8H
+
+ 8OH
-

Ctodo
8H
+
+ 8e
-
8H

En el ctodo el H, se adsorbe en la superficie del metal para ser transformado por las
bacterias.
6

Conversin de sulfato por las bacterias
8H (adsorbido) + SO
4
2-
S
2-
+ 4H
2
O
La reaccin es llevada a cabo por las bacterias como una funcin directa.
Productos finales de corrosin
4Fe
2+
+ S
2-
+ 6OH
-
FeS + 3Fe(OH)
2

Reaccin total general
4Fe
2+
+ SO
4
2-
+ 4H
2
O 3Fe(OH)
2
+ FeS + 2OH
-

El grupo de los microorganismos nocivos, llamado bacterias del hierro y el azufre, no es
homogneo desde los puntos de vista morfolgico y fisiolgico, pero puede caracterizarse
por su capacidad para transformar o depositar cantidades significativas de hierro y azufre,
en general en forma de cienos. Sin embargo, estas bacterias no son las nicas productoras
de cienos bacterianos. Los microorganismos de este grupo se pueden clasificar en
filamentosos o unicelulares, auttrofos y hetertrofos, aerobios o anaerobios. En funcin
de la clasificacin bacteriana convencional, se incluyen en diversos rdenes, familias y
gneros. Las bacterias del hierro y el azufre son estudiadas por su eventual importancia en
el tratamiento de aguas y sistemas de distribucin y especialmente en aguas para uso
industrial en calderas y torres de enfriamiento donde ocasionan contaminacin del agua y
ampollamiento; en el agua causan olor, sabor, color, espuma desagradables e
incrementan la turbiedad, el suministro de nutrimentos puede ser total o parcialmente
inorgnico, un claro ejemplo de este microorganismo es Gallionella que obtiene su
energa de la oxidacin del hierro ferroso, otras utilizan pequeas cantidades de sulfuro
de hidrgeno. Thiobacillus ferroxidans contribuye al problema del drenaje de minas
cidas, se identifica por pruebas de transformacin de hiero ferroso a frrico u oxidacin
de sulfuros a pH bajo. La temperatura, luz, pH y suministro de oxgeno son crticos para el
crecimiento de estos microorganismos (Tributsch y Rojas-Chapana, 2000; Else y col., 2003;
Lee y col., 2006).
Las bacterias ferruginosas son capaces de utilizar el hierro reducido presente en habitats
acuosos y depositarlo en forma de oxido frrico hidratado o en sus secreciones
mucilaginosas, de un modo similar a las bacterias que utilizan manganeso. El hierro
ferroso lo obtienen de la tubera, en la obtencin de energa la forma frrica es
precipitada como hidrxido frrico [Fe (OH)
3
] (Tributsch y Rojas-Chapana, 2000; Lee y col.,
2006).
7

Algunas bacterias que no oxidan el hierro ferroso pueden indirectamente disolverlo o
depositarlo. En su crecimiento ellas liberan hierro por utilizacin de compuestos
orgnicos a los cuales el hierro est unido o porque las condiciones ambientales permiten
la solucin o depsito del hierro, bajo estas condiciones se produce menor hierro frrico,
pero puede generar obstruccin en el sistema (SIU, 2004; Lee y col., 2006).
1.5.2. Bacterias productoras de cido
Las bacterias productoras de cido disminuyen el pH, aceleran el ataque corrosivo,
algunas especies de Thiobacillus y Clostridium son las ms relacionadas con la corrosin
del acero. T. thioxidans, aerobio, oxida varios compuestos que contienen azufre para
formar cido sulfrico que contribuye a la destruccin del concreto unido al metal y a la
corrosin cida de los metales (Tributsch y Rojas-Chapana, 2000). Se encuentra en la
parte superior de los tubrculos (ndulos o ampollamientos por accin microbiana), se
asocia simbiticamente (mutualismo) con las bacterias reductoras de sulfato, oxida
sulfuros a sulfatos mientras que las bacterias reductoras de sulfato convierten sulfatos a
sulfuros. Las bacterias del gnero Clostridium, son anaerobias, producen cidos orgnicos
de cadena corta que pueden ser bastante agresivos hacia el acero, se encuentran cerca de
las superficies de corrosin y en el interior de los tubrculos (Tributsch y Rojas-Chapana,
2000).
1.5.3. Bacterias depositadoras de metales
Las bacterias depositadoras de metales, oxidan el hierro ferroso (Fe
2+
) a hierro frrico
(Fe
3+
) dando como resultado hidrxido frrico. Algunas oxidan manganeso y otros
metales. Bacterias del gnero Gallionella se asocian al hidrxido de hierro en las ampulas
(90% del peso seco puede ser Fe(OH)
3
), dando un aspecto filamentoso (Tributsch y Rojas-
Chapana, 2000; Lee y col., 2006). Sin embargo, no existe suficiente evidencia que indique
que la picadura en acero inoxidable es causada por este microorganismo (SIU, 2004; Lee y
col., 2006).
1.5.4. Bacterias formadoras de babaza
Con la excepcin del gnero Pseudomonas, las bacterias formadoras de babaza son en su
mayora aerobias. Las babazas son mezclas de secreciones denominados polmeros
extracelulares donde el 99% es agua. Las capas de babaza contribuyen a la corrosin
tanto activa como pasiva, consumen oxgeno y estimulan la formacin de celdas de
oxgeno diferenciales. Por ser aerobias estn presentes sobre los productos de corrosin;
muchas veces debajo de la babaza se encuentran anaerobias y frecuentemente bacterias
reductoras de sulfato y productoras de cido (Hedrick y col., 1964; SIU, 2004).
8

1.5.5. Otras bacterias
Dentro del grupo de otras bacterias, se encuentran las nitrificantes, aerobias
principalmente, oxidan NH
3
a nitratos NO
3
, Nitrosomonas y Nitrobacter, disminuyen el

pH y [O
2
], presentes en plantas de amonaco. Nitrobacter disminuye el pH oxidando
nitritos NO
2
a NO
3
produciendo cido ntrico alcanzando un pH entre 3-5, requiere altas

concentraciones de oxgeno y causa problemas nicamente en los sistemas oxigenados.
Algunas cianobacterias producen masas densas y fibrosas que se comportan como fuentes
pasivas de corrosin, adems crean altas concentraciones de oxgeno disuelto debido a su
crecimiento (Gevertz y col., 2000; Else y col., 2003).
1.6. Biocorrosin de manera pasiva
La corrosin biolgica pasiva causada por sustancias qumicamente inertes, es la misma ya
sea que el microorganismo est vivo o muerto; debido a que la corrosin se da por los
productos metablicos y no por procesos metablicos en s; entre estos materiales se
encuentran las capas de babazas o polmeros extracelulares como hebras entremezcladas
con bacterias, agua, gases y materiales extraos; la biomasa tiende a formarse sobre las
superficies y adherirse a ellas. (Keresztes y col., 2001; Marchal y col., 2001).
Se ha propuesto que las bacterias reductoras de metales como las que convierten los
iones frricos a ferrosos, actan como aceleradoras para la corrosin del acero, pero hay
escasa evidencia de esto. En circunstancias especiales, ciertas bacterias anaerobias que
son capaces de producir hidrgeno pueden contribuir a la fragilizacin de aleaciones
debido al hidrgeno. La descomposicin puede generar amonaco en concentraciones
locales lo bastante altas como para producir un agrietamiento debido a corrosin y
esfuerzos en los tubos de latn. Este fenmeno ocurre donde hay material biolgico
depositado o adherido sobre las superficies, el ataque microbiolgico suele ocurrir donde
la temperatura del agua est por debajo de los 82 C. Los tubrculos sobre el acero al
carbono y los hierros vaciados a veces contienen bacterias reductoras de sulfato y
productoras de cidos. Las bacterias anaerobias, corrosivas en potencia, estn presentes
muchas veces debajo de capas de babazas y, en la ausencia de babazas o tubrculos, en
sistemas que contengan poco oxgeno.
Los sistemas sucios con aceites y grasas generalmente contienen grandes cantidades de
bacterias. Los organismos que se observan a simple vista (hongos) son un indicador
seguro de la presencia bacterial y directamente pueden causar un ataque al metal (SIU,
2004; Else y col., 2003; Javaherdashti y col., 2006; Lee y col., 2006).
9

En lo que se refiere a factores crticos, el material biolgico o los organismos ofensivos
tienen que estar presentes en un sistema que sufra un ataque actual. Sin embargo, no
todos los sistemas que contengan tales materiales u organismos sern atacados en forma
perjudicial. Una presencia biolgica (actual o pasada) es virtualmente una certeza de
corrosin en cualquier sistema, pero no todos los sistemas son atacados en forma
significativa. Para que en un diagnstico la corrosin pueda atribuirse a causas biolgicas,
tienen que darse todas las siguientes condiciones (SIU, 2004):
El material biolgico tiene que estar presente al ocurrir el ataque.
La morfologa de la corrosin debe ser consistente con el ataque biolgico.
Los productos de la corrosin y los depsitos deben ser caractersticos de una
interaccin biolgica.
1.7. Identificacin
La corrosin inducida por microorganismos se puede reconocer mediante el examen de
las morfologas del desgaste, la composicin y distribucin de los productos de corrosin,
as como de los depsitos, los anlisis biolgicos y las condiciones ambientales
compatibles. Debe hacerse hincapi en que el conjunto de factores para identificar la
corrosin deben ser compatibles con el diagnstico de una corrosin por influencia
biolgica. La sola presencia de bacterias corrosivas potenciales u otros organismos no es
prueba de que la corrosin se relacione con estos organismos. El diagnstico no se basa
en una preponderancia de indicios; se basa en la compatibilidad completa de toda la
evidencia (SIU, 2004; Lee y col., 2006).
Tienen que estar presentes cuatro factores para un diagnstico de corrosin con
influencia microbiolgica (SIU, 2004; Lee y col., 2006).
La presencia de microorganismos o de sus productos.
Morfologas de corrosin microbiolgicamente nicas.
Productos y depsitos de corrosin especficos.
Condiciones ambientales compatibles.
Cada uno de los factores mencionados es nico para bacterias especficas.
Las bacterias reductoras de sulfato se encuentran en ambientes anaerobios, tal como
dentro de un tubrculo o debajo de una mancha de depsito. Es difcil percibir una
biopelcula delgada y homognea en tales microambientes. Las acumulaciones de
productos de corrosin que contengan recuentos de bacterias reductoras de sulfatos de
10
4
o ms unidades formadoras de colonias por gramo (UFC/g) suelen asociarse con
desgastes significativos.
10

Si bien las reductoras de sulfato probablemente no estn distribuidas de manera uniforme
por toda la masa de depsitos y productos de corrosin (especialmente en los sistemas
aireados), son comunes los recuentos similares en grandes cantidades de material
tomadas de superficies de acero corrodas. Los recuentos en fluidos son casi siempre
mucho ms bajos, pero cualquier recuento positivo en fluidos suele indicar nmeros
grandes de bacterias ssiles (clulas fijas) viables en alguna parte del sistema (Keresztes y
col., 2001).
Recientemente se han desarrollado pruebas que no requieren del cultivo de las bacterias
reductoras del sulfato. Estas pruebas se basan en la deteccin de ciertos compuestos
producidos por estas bacterias y, en algunos casos, tienen aplicacin aun si los organismos
productores han muerto recientemente. Los estudios de laboratorio han mostrado una
concordancia adecuada entre tales pruebas y los anlisis por cultivos vivos cuando estn
presentes organismos viables (SIU, 2004).
Cuando los recuentos biolgicos de bacterias reductoras de sulfato en los materiales
slidos raspados de las superficies corrodas son del orden de 10
4
UFC/g, es posible un
ataque significativo; pero los recuentos mayores de 10
5
UFC/g, son comunes slo en los
sistemas que se encuentran atacados severamente (SIU, 2004).
Los recuentos planctnicos (clulas libres) suelen ser poco confiables como indicadores de
una corrosin activa. Sin embargo, la presencia de cualquier bacteria reductora de sulfato
indica concentraciones mucho ms altas de estos organismos sobre superficies en algn
lugar del sistema (SIU, 2004).
1.8. Corrosin en la industria petrolera.
Las bacterias habituales en instalaciones petroleras pueden causar graves problemas de
corrosin o taponamiento en lneas, tanques o en los mismos yacimientos. Se han
identificado diversas bacterias, las cuales contribuyen a la corrosin en diferentes formas:
algunos actan como despolarizantes catdicos, mientras otros forman pelculas o
crecimientos que cubren una parte del metal, produciendo celdas de concentracin de
oxgeno, mientras que las bacterias reductoras de sulfato pueden producir H
2
S, el cual es
corrosivo (Gevertz y col., 2000; Keresztes y col., 2001).
1.10. Principales microorganismos en la industria petrolera.
Las bacterias reductoras del sulfato, como Desulfovibrio, son las ms importantes y
dainas, en cuanto a corrosin se refiere. Crecen en medios anaerbicos, pero pueden
sobrevivir en ambientes oxigenados, creciendo debajo de depsitos o pelculas donde el
oxgeno no pueda penetrar. Las bacterias reductoras de sulfato utilizan en su metabolismo
11

hidrgeno atmico para reducir el in sulfato existente en el medio (agua) y producir H
2
S.
El hidrgeno lo obtienen del ctodo de los procesos de corrosin del hierro, causando por
lo tanto una despolarizacin del ctodo en las celdas de corrosin, que incrementa el
grado de corrosin. Adems, el sulfuro de hidrgeno generado (H
2
S) en el proceso se
combina con el in ferroso producido en el nodo para formar sulfuro ferroso (FeS) de
color negro (Gevertz y col., 2000).
Las ferrobacterias, como Gallionella, pueden causar corrosin en sistemas que manejen
agua. Los compuestos ferrosos provenientes de procesos de corrosin se oxidan a
hidrxido frrico hidratado, removiendo el oxgeno del agua y causando condiciones
anaerbicas debajo de depsitos. En un segundo mecanismo, las ferrobacterias en reas
de baja concentracin de oxgeno, convierten el in ferroso a in frrico, el cual se
precipita como hidrxido frrico cubriendo las superficies del metal y produciendo celdas
de concentracin de oxgeno (Gevertz y col., 2000).
Las bacterias formadoras de pelcula, como las Aerobacterias, proliferan sobre las
superficies y producen grandes masas que impiden la penetracin del oxgeno a las
superficies metlicas, creando ambientes propicios para las bacterias reductoras de
sulfato y celdas de concentracin de oxgeno (Gevertz y col., 2000).
La biopelcula se forma en las tuberas del sistema de distribucin cuando las clulas se
unen a la superficie de sta y se multiplican para formar una pelcula; al observarse en
microscopa electrnica de barrido (SEM) se aprecian comunidades complejas de
microorganismos sobre la superficie metlica (Gevertz y col., 2000; Marchal y col., 2001).
1.10. Indicios de la biocorrosin
La sola presencia de bacterias en el medio no necesariamente significa un problema grave
de corrosin, as como un bajo recuento de bacterias tampoco significa necesariamente
que no exista problema, puesto que las bacterias pueden estar debajo de depsitos y slo
aparecen cuando la corriente de fluido o un fenmeno mecnico las descubre. Por lo
tanto, para detectar problemas de corrosin por bacterias se deben tener en cuenta
diferentes observaciones. De all la importancia del cuidado en la toma de las muestras
para que realmente sean representativas.
La presencia de sulfuro de hidrgeno puede indicar la existencia de reductoras de sulfato,
tambin la presencia de partculas negras de FeS pueden indicar que el H
2
S se est
produciendo en el sistema (Gevertz y col., 2000; Marchal y col., 2001).

12

El examen de productos de corrosin encontrados en equipos, tuberas, tanques, etc. es
otra de las informaciones bsicas para detectar problemas asociados a actividad
microbiana (Hedrick y col., 1964). La corrosin en forma de picadura que se encuentra
debajo de tubrculos y que da lugar a un producto de corrosin negro, en lugar de uno de
color rojizo, puede indicar la presencia de bacterias reductoras de sulfato. La forma de
diferenciar el sulfuro de hierro de la magnetita Fe
3
O
4
(ambos de color negro) se basa en
que el FeS no es atrado por un imn, mientras que el FeO si. Otra forma de diferenciarlos
es poniendo unas gotas de HCl en el depsito negro. S se desprende un olor a sulfuro, el
depsito es de sulfuro de hierro lo cual es una fuerte evidencia de la existencia de
reductoras de sulfato (SIU, 2004; Javaherdashti y col., 2006).
Las posibles causas de la corrosin inducida por microorganismos son (Videla, 2002; SIU,
2004):
Ataque qumico de metales, concreto y otros materiales, debido a los
subproductos de la actividad microbiana.
Ataque microbiolgico de materiales orgnicos, algunas materias inorgnicas
naturales o inhibidores.
Despasivacin de superficies metlicas e induccin de celdas de corrosin.
Ataque metlico por un proceso en el cual los microorganismos y el metal
cooperan entre s para sostener la reaccin de corrosin.
El ataque puede ser por combinacin de bacterias.
1.11. Control del crecimiento bacteriano
Existe una amplia variedad de productos qumicos usados para controlar el crecimiento de
bacterias. Se pueden clasificar en bactericidas o bacteriostticos de acuerdo con s
eliminan o retardan el crecimiento de las bacterias. Pueden ser inorgnicos, como el
cloro, los cromatos y compuestos de mercurio y plata; u orgnicos como aminas,
clorofenoles, derivados cuaternarios del amonaco, etc. Algunos bactericidas tienen una
funcin dual en el sistema, por ejemplo, las aminas cuaternarias funcionan tanto como
biocidas como inhibidores de formacin de pelculas. La adicin insuficiente de estos
agentes qumicos para cubrir adecuadamente las reas puede dejarlas desprotegidas
contra la corrosin. Los bactericidas no pueden matar las bacterias a menos que entren en
contacto con ellas, esto significa que las bacterias que crezcan debajo de depsitos no
sern destruidas a menos que estos sean removidos. Por lo tanto, la operacin de limpieza
es fundamental antes de iniciar la aplicacin de un biocida. Esto incluye limpieza de lneas,
retrolavado de pozos y equipos, remocin de depsitos del fondo de tanques, etc.
(Gevertz y col., 2000; Videla, 2002; Hernndez y col., 2005).
13

Como medida de prevencin, se aconseja realizar lo siguiente (Videla, 2002; SIU, 2004).
Analizar posibilidades de contaminacin.
Uso controlado de biocidas.
Asegurar un ambiente no agresivo.
Seleccionar materiales de resistencia adecuada.
Seleccionar materiales de recubrimiento.
Usar proteccin catdica.
Programar sistemas de limpieza frecuente.
A modo de conclusin, es importante sealar que si no existen las condiciones para que
haya corrosin en un determinado medio, las bacterias pueden crearlas, a condicin (para
las hetertrofas) de que exista en el medio materia orgnica. Cuanto mayor sea la
cantidad de materia orgnica contenida en un electrolito, mayor ser el crecimiento
microbiano y mayor y ms intensa la actividad bioqumica y, por lo tanto, la corrosin
(Genesc, 1995; Keresztes y col., 2001; Marchal y col., 2001).
Todo ello justifica plenamente los esfuerzos que realizan numerosos investigadores en
todo el mundo para estudiar y conocer el mecanismo de desarrollo de estos organismos,
con el fin de tratar de combatirlos y reducir, en lo posible, las grandes prdidas que
ocasionan (Genesc, 1995).
1.12. Mtodos para evaluar velocidades de corrosin
Con el paso del tiempo se han desarrollado herramientas experimentales para determinar
la velocidad de corrosin de materiales metlicos expuestos a algn medio corrosivo, las
cuales aportan informacin mecanstica del proceso y se agrupan de la forma siguiente.
Mtodos gravimtricos.
Mtodos basados en tcnicas electroqumicas.
El primer tipo, se caracteriza por cuantificar la prdida de peso y el segundo por aplicar un
sobrepotencial al sistema. Cabe mencionar que los mtodos electroqumicos han
desplazado a los gravimtricos por la reproducibilidad en sus resultados; sin embargo, los
mtodos tradicionales (gravimtricos) son bien aceptados en estos das (Vong, 1991).

14

1.13. Mtodos gravimtricos
Histricamente, la primera forma de evaluar cuantitativamente la corrosin que el
material sufra fue la determinacin de prdida de peso de un material metlico en
contacto con un ambiente agresivo, lquido y/o vapor. Posteriormente, se relacion la
prdida de peso con el tiempo de exposicin, la densidad del material metlico y el rea
expuesta al ambiente agresivo; con lo que se obtiene una expresin que permite
determinar la velocidad de corrosin (vila y Genesc, 2003).
En las determinaciones gravimtricas, la velocidad de corrosin se expresa generalmente
en unidades de penetracin de ataque conocidas como milsimas de pulgada por ao
(mpy) donde se supone que la corrosin que sufre el material es uniforme, es decir, la
superficie geomtrica del material se afecta de igual forma en toda su extensin. Esto
puede representar un gran error cuando el tipo de corrosin que ocurre es localizado, por
ejemplo, la picadura; ya que la velocidad de corrosin determinada ser ms baja que la
que ocurre realmente en la picadura (NACE, 2005; PEMEX, 2000).
Las principales ventajas que ofrece la prueba gravimtrica son: el bajo costo y la
simplicidad en la evaluacin. Adems, debido a la ausencia de perturbaciones
superficiales, este mtodo simula mejor las condiciones reales que los mtodos
electroqumicos y de anlisis de superficie. Esta tcnica es comnmente usada como
primer paso en el estudio de la corrosin; sin embargo, proporciona informacin limitada
con respecto a los procesos y mecanismos de la corrosin. La determinacin del tipo de
corrosin se realiza al final de la prueba de forma visual (Gonzlez, 1989).
1.14. Mtodos electroqumicos
En contraste con el mtodo de prdida de peso, los mtodos electroqumicos son ms
rpidos y, por lo tanto, ampliamente usados para medir la velocidad de corrosin en
menor tiempo (ASTM G 01-03). Estos mtodos se basan en la electroqumica de la
corrosin y en la medicin de potencial y corriente para evaluar el dao por corrosin
(Bardal, 2004). El potencial electroqumico est fundamentalmente relacionado a la
termodinmica de las reacciones de corrosin, mientras que la corriente est relacionada
a la cintica de la reaccin (velocidad de corrosin) (Gonzlez, 1989).
Frecuentemente para conocer los parmetros que controlan las reacciones
electroqumicas, se perturba al sistema y, con base en estas perturbaciones, las tcnicas
electroqumicas se clasifican en tres grupos: mediciones no perturbadas, mediciones
perturbadas linealmente y mediciones perturbadas no linealmente (Zavala, 1997 y 2001).
15

Las mediciones no perturbadas, son aquellas que no requieren una perturbacin externa
del sistema, por ejemplo, mediciones de potencial-tiempo, corriente-tiempo y ruido
electroqumico (Zavala, 1997 y 2001).
Las mediciones perturbadas linealmente, estn diseadas y analizadas bajo el supuesto de
que el sistema electroqumico puede ser tratado como una combinacin de elementos de
circuitos lineales (resistores, capacitores, etc.). Esto es casi siempre una aproximacin a
la realidad, pero con restriccin a pequeos cambios de potencial (10 mV) y es posible
obtener una aproximacin a un comportamiento lineal, dos claros ejemplos son las
tcnicas de resistencia a la polarizacin (Rp) y espectroscopa de impedancia
electroqumica (EIE) (Zavala, 1997 y 2001).
Las mediciones perturbadas no linealmente, ejercen alteraciones de gran amplitud y, por
lo tanto, no responden de manera lineal y, como ejemplo, se tienen a las mediciones de
curvas de polarizacin y tcnicas de anlisis armnico (Zavala, 1997 y 2001).
Cuando se estudia la biocorrosin se recomienda utilizar mediciones no perturbadas y/o
mediciones perturbadas linealmente, ya que de esta forma no se altera la biopelcula
formada por los microorganismos sobre la superficie metlica y as se puede obtener un
registro contnuo a travs del tiempo (Hernndez y col., 2004, a y b).
Los detalles de esta metodologa se indican en el anexo.

16

CAPTULO 2
ANTECEDENTES
17

2. Antecedentes
En la ltima dcada se han realizado numerosas investigaciones en torno a la biocorrosin
o a la corrosin inducida por microorganismos (CIM). Sin embargo, existen pocos trabajos
que combinan diversas tcnicas que sustentan la participacin del microorganismo en el
fenmeno de corrosin. Los investigadores prefieren abordar el tema segmentndolo, ya
sea que slo consideren el uso de ensayos bioqumicos, de tcnicas moleculares, de
tcnicas electroqumicas u otras tcnicas, pero no se engloban todas las determinaciones.
Un claro ejemplo de esto lo expresaron Vsquez y colaboradores (2003), quienes
consideran que debido a las dificultades experimentales involucradas en el estudio de este
tipo de sistemas, existen en la literatura muy pocos trabajos relacionados con tcnicas
electroqumicas basadas en el proceso de corrosin del acero utilizado en el manejo de
crudos de petrleo.
Aunque hace mucho tiempo se conoce el papel que desempean las bacterias en los
procesos de corrosin metlica, los primeros trabajos en este campo se deben a Von
Wolzogen-Kuhr, que en 1923 evidenci el mecanismo electroqumico del ataque del
hierro por los microorganismos reductores del sulfato (Genesc, 1995). No obstante, fue
en la dcada de los 80 que se reconoci a nivel mundial que la corrosin microbiolgica
genera serios problemas en la industria petrolera (Prasad, 2000; Duque, 2004),
representando entre un 50 a 90 % de la corrosin metlica localizada y un 30 % del total
de los costos de corrosin metlica en la industria (Jones, 1992; Duque, 2004).
En 1997, el Corrosion Atlas public un compendio de casos reales en los que se muestran
los daos generados por la corrosin. En su mayora, se exponen las agresiones sufridas a
diversos materiales (metales, cermica, concreto, etc.), dejando una pequea seccin para
la CIM. Este apartado se divide en microorganismos aerobios y anaerobios, dndole peso
a los anaerobios, especficamente, a las bacterias reductoras de sulfato. De modo
particular se evidenci en los casos histricos No. 01.21.17.01 y 01.21.17.02, el deterioro
manifestado por dos piezas metlicas de acero al carbn en un barco. Una de ellas era
una tubera y, la otra, una seccin de un compartimiento que estaba en contacto con
lquidos. En la tubera se manejaban altas temperaturas (70 C) mientras que el
compartimiento estaba expuesto a temperaturas ambientales. En el reporte se describe
la apariencia interna de la tubera, presentando una excesiva corrosin localizada
(picadura), un adelgazamiento en las paredes y un ampollamiento en toda la superficie y,
en lo que respecta al compartimiento, se mostr la misma evidencia. Una bacteria
productora de cido fue la causante de este tipo de corrosin. El cido encontrado fue
cido actico, que se produjo gracias a las condiciones dadas en estos sistemas
18

(temperatura y ausencia de oxigeno) y la autora de este tipo de corrosin inducida por
microorganismos fue la bacteria Clostridium aceticum.
En el ao 2006 Padilla y col., estudiaron muestras provenientes del interior de gasoductos,
las cuales aislaron e identificaron bacterias anaerobias y, mediante el uso de tcnicas
electroqumicas (ruido electroqumico), pudieron detectar la corrosin (localizada de tipo
picadura) generada por este tipo de bacterias. Al encontrar una diversidad de bacterias
anaerobias, con el propsito de evidenciar la capacidad metablica de las bacterias
probaron diferentes medios de cultivo, tanto mnimos como enriquecidos. Asmismo,
aplicando tcnicas de microscopia electrnica de barrido y de barrido de sonda
caracterizaron la biopelcula formada por los anaerobios y el dao inducido por estos.
En un estudio reportado entre 2004 y 2005 (Hernndez y col., 2004 a y b; Hernndez y
col., 2005) se puso de manifiesto que el uso de tcnicas electroqumicas (resistencia a la
polarizacin, espectroscopa de impedancia electroqumica y ruido electroqumico) fue de
gran utilidad para describir el fenmeno de corrosin inducido por un consorcio
microbiano. Con estas tcnicas tambin fue posible evaluar el efecto de biocidas en el
fenmeno de corrosin inducida por microorganismos.
El uso constante de la microscopa electrnica ha beneficiado, de manera considerable, al
entendimiento de los mecanismos de accin de los microorganismos. Tal es el caso de la
biocorrosin, en donde se emplea al microscopio electrnico de barrido (SEM) para
observar las biopelculas (Beech, 2004) o, ltimamente, se visualizan en el microscopio
electrnico de barrido ambiental (ESEM) (Wagner y col, 1992).
Evidencias obtenidas en el 2004 mediante tcnicas electroqumicas y anlisis de superficie
(Padilla y col., 2004), demostraron que una bacteria reductora de sulfatos
(Desulfovibrio sp.) procedente de un gasoducto, fue la responsable del proceso de
biocorrosin.
La corrosin inducida por microorganismos (CIM) est, principalmente, constituida por
bacterias aerobias y anaerobias; siendo las ltimas, particularmente las bacterias
reductoras de sulfato, las causantes de un dao progresivo al ambiente que las rodea,
reflejando una inestabilidad en su entorno; por lo que este tipo de bacterias son
consideradas como ofensivas (Postgate, 1984).

19

En el 2005 se describi la situacin actual de la investigacin en biocorrosin y
bioensuciamiento de metales y de aleaciones de uso industrial; as como los conceptos
claves para comprender los efectos principales de los microorganismos en el deterioro del
metal (Videla y Herrera, 2005). Los aspectos fundamentales que se abordaron en esta
revisin fueron las estrategias seguidas para el control de la corrosin inducida por
microorganismos, haciendo nfasis en las bacterias reductoras de sulfato y, como apoyo,
se sugiri hacer uso de las tcnicas electroqumicas para evaluar los efectos de la
biocorrosin. La recomendacin final dada fue sustentar el anlisis con tcnicas de
microscopia electrnica.
Espaa y Venezuela sumaron esfuerzos en el 2004 (Duque y col., 2004) para resolver un
problema existente en la industria petrolera venezolana (el conflicto bsico que se tiene
en este tipo de industria es la corrosin). Dicho conflicto lo detectaron en el sistema de
inyeccin de agua para la recuperacin secundaria de crudo, en donde al recolectar
muestras encontraron microorganismos anaerobios, entre ellos del gnero Desulfovibrio y
Clostridium, por lo que decidieron evaluar la actividad (produccin de H
2
S) y corrosividad
de stas, llegando a la conclusin de que aunque las bacterias reductoras de sulfato
producen ms H
2
S que las que no son consideradas como causantes de los problemas de
biocorrosin y, gracias a la valoracin microscpica, dedujeron que el ataque generado
fue de tipo localizado para ambas bacterias.

20

CAPTULO 3
JUSTIFICACIN
21

3. Justificacin

Debido al riesgo y a la importancia econmica que para la industria petrolera tiene la
corrosin interna de ductos para el transporte de crudo o derivados del petrleo, ha
crecido el inters en los estudios de corrosin abitica y bitica de las lneas de transporte
de hidrocarburos. En el segundo caso se han logrado definir algunos mecanismos y
agentes de biocorrosin.
Para investigar la corrosin inducida por microorganismos (CIM), se requieren diversas
herramientas, como tcnicas electroqumicas para la evaluacin de la velocidad de
corrosin, lo mismo que tcnicas de biologa molecular para el estudio de las biopelculas
responsables de la CIM. Tambin se ha recurrido al apoyo de la microscopia electrnica
de barrido que magnifica y expone los daos en la superficie metlica.
En este trabajo se hace nfasis en la importancia que tiene la identificacin y participacin
de microorganismos presentes en el interior de gasoductos de la industria petrolera.

22

CAPTULO 4
OBJETIVOS
23

4. Objetivos

4.1. Objetivo general
Identificar y estudiar la influencia en el proceso de corrosin de dos cepas de bacterias
esporuladas, aisladas de cupones corrosimtricos retirados con diferencia de un ao del
interior de un gasoducto.

4.2. Objetivos especficos

Identificar las bacterias esporuladas aisladas mediante tcnicas bioqumicas
y tcnicas de biologa molecular (PCR-secuenciacin del 16S rDNA).

Definir la diferencia, si es que existe, entre las dos cepas aisladas por
ensayos moleculares (ARDRA y RAPD).

Determinar la presencia de plsmidos en las cepas.

Evaluar la influencia en el proceso de corrosin de la cepa del ltimo
aislamiento por tcnicas gravimtricas y electroqumicas.

24

CAPTULO 5
METODOLOGA
25

Evaluacin de la produccin de cidos
orgnicos en el medio seleccionado en
ampoviales durante los estudios de
corrosin.
Pureza de las cepas por PCR-TGGE.
Ensayos bioqumicos.
Tcnicas moleculares:
PCR-ARDRA (16 S rDNA).
PCR-RAPD.
PCR-secuenciacin (16S rDNA).
Determinacin de la presencia de
plsmidos.
Identificacin del microorganismo
esporulado aislado recientemente
(cepa G1-2007) y del aislado (cepa G1-
2006) previamente (1 ao) en un
gasoducto.

Seleccin del medio de cultivo para
estudios de crecimiento y corrosin.
Crecimiento celular (NMP).
Consumo de SO
4
2-
.
Formacin de H
2
S.
Fierro total
Acidez.
pH.

Concentracin de cidos orgnicos
por cromatografa de gases.
Acidez titulable.
pH.

pH.
Medicin del crecimiento de bacterias
ssiles y planctnicas en los ampoviales
durante los estudios de corrosin.
Crecimiento celular (NMP).
Determinacin de la velocidad de corrosin
de los cupones metlicos.
Tcnica gravimtrica.
Resistencia a la
Polarizacin (RP).
Espectroscopa de
Impedancia
Electroqumica (EIE).

Gravimetra:
Problema.
Testigo abitico con cidos.
Testigo abitico.

Observacin de la corrosin en los cupones
metlicos.
Microscopia electrnica de barrido:
Problema.
Testigo abitico con cidos.
Testigo abitico.
Determinacin de la velocidad de corrosin
empleando una celda electroqumica.
Observacin de los cupones de corrosin por
Microscopia Electrnica de Barrido (MEB)
26

CAPTULO 6
MATERIAL Y MTODOS
27

6. Material y Mtodos

6.1. Recoleccin de la muestra
Para la recoleccin de la muestra se dividi el procedimiento en tres etapas:
1.- Elaboracin de medio de cultivo de conservacin para el transporte de las cepas (NACE
TM0194-2004).
Se emplearon dos botellas con tapa de rosca de polipropileno de 500 mL,
previamente esterilizados.
A cada botella se le adicionaron 300 mL de medio de cultivo PBS (solucin
salina de fosfatos) para anaerobios (NaCl 8.7 g/L, KH
2
PO
4
0.4 g/L, K
2
HPO
4

1.23 g/L, cido ascrbico al 5% 20 mL/L y resarzurina al 1% 1 mL/L;
solucin a pH 7.0).
2.- Remocin del cupn corrosimtrico (NACE RP0775-2005).
Durante los procedimientos de retiro e instalacin de testigos
corrosimtricos, se quit un cupn de corrosin colocado en un gasoducto.
De los sedimentos depositados en el testigo de corrosin se tom una
muestra representativa.
Los sedimentos fueron introducidos a la botella de polipropileno con medio
de cultivo PBS y se le adicion una capa de aceite mineral; se cerr y se
rotul adecuadamente.
Inmediatamente, el cupn corrosimtrico se introdujo a la segunda botella
con medio de cultivo PBS y se le agreg una capa de aceite mineral; se
cerr y se etiquet debidamente.
3.- Manejo de las muestras en laboratorio (NACE TM0194-2004 y API RP 38-1990).
Para el manej de las muestra se trabaj en condiciones aspticas.
Se prepar una solucin concentrada de Tween 80 (detergente).
De la solucin concentrada se hizo una dilucin 1:100 con agua
desionizada.
A las botellas se les adicionaron 0.4 mL de la solucin diluida para
solubilizar la materia orgnica (hidrocarburos) presente.
Se homogeneiz, invirtiendo las botellas 25 veces.
28

Con la finalidad de remover las incrustaciones y desprender las bacterias
adheridas al cupn, la botella que contena el cupn corrosimtrico fue
sometida a bao ultrasnico por 7 minutos.
Transcurrido el tiempo de sonicacin, se retir la botella y se pudo apreciar
la formacin de fases en su interior.
En la parte superior de la botella se ubic el hidrocarburo solubilizado y en
el fondo se localizaron pequeas partculas de hidrocarburo precipitado y
entre el hidrocarburo solubilizado y el precipitado, se observ turbiedad, a
la cual se le atribuy la presencia de microorganismos. Esta caracterstica
tambin se observ en la botella que no contena cupn corrosimtrico.
Con un frote en fresco se corrobor la presencia de microorganismos en la
fase turbia de las botellas.
Atravesando la fase orgnica con una jeringa estril de 10 mL, se tom una
alcuota (10 mL) de cada botella.
Con el propsito de favorecer el crecimiento, cada alcuota de 10 mL fue
inoculada en un ampovial con 90 mL de medio de cultivo PBS para
anaerobios con la adicin de extracto de levadura (1 g/L).
El crecimiento se detect por la aparicin de turbiedad, aproximadamente,
en 120 h.
Se subcultiv cada uno de los tubos positivos (con turbiedad) en medio
para anaerobios PBS con extracto de levadura y en medio de cultivo API RP
38 con intenciones confirmativas (cultivo puro).
El crecimiento en medio de cultivo API RP 38, se evidenci por la
produccin de H
2
S, que junto con el fierro presente en solucin, forma un
precipitado de sulfuro de fierro, confirindoles un color negro a los cultivos
positivos.
El cultivo se mantuvo activo, realizando resiembras cada 720 h en
ampoviales de 10 mL los cuales se conservaron en una atmosfera de
anaerobiosis a 37 C.
De el procedimiento anteriormente descrito, se obtuvieron dos cepas, etiquetados como
G1-2006 y G1-2007.

29

6.2. Microorganismos
Cepa G1-2006. Microorganismo esporulado aislado de un cupn
corrosimtrico de un gasoducto.
Cepa G1-2007. Microorganismo esporulado aislado de un cupn
corrosimtrico, del mismo gasoducto, un ao despus del aislamiento de la
cepa G1-2006.
6.3. Medios de cultivo
6.3.1. Medio de conservacin de cepas
Las dos cepas se conservaron en medio de cultivo API RP 38 en ampoviales en condiciones
de anaerobiosis (Tabla 1).
Tabla 1. Composicin del medio de cultivo API RP 38.
Componente Concentracin (g/L)
Lactato de sodio 60% (p/v) 8.0
Extracto de levadura 2.0
cido ascrbico 0.2
L-cistena 0.5
MgSO
4
7H
2
O 0.4
K
2
HPO
4
0.02
FeSO
4
(NH
4
)
2
6H
2
O 0.2
Na
2
SO
3
0.4
NaCl 15
Resarzurina 0.5

6.3.2. Medios de cultivo empleados en la seleccin del medio para el estudio de
biocorrosin
Para la seleccin del medio de cultivo se propusieron: el API RP 38, el Bold basal
modificado y el Postgate C; cuya composicin se muestra en las tablas 1, 2 y 3
respectivamente.

30

Tabla 2. Composicin del medio Bold basal modificado.
NaCl 10
Na
2
SO
3
0.4
MgSO
4
7H
2
O 0.32
L-cistena 0.5
Resarzurina 0.5

Adems de los reactivos anteriores, se adicion 1 mL de cada una de las siguientes
soluciones.
Solucin Componente Concentracin (g/L)
1 NaNO
3
25
2 MgSO
4
7H
2
O 7.5
3 K
2
HPO
4
7.5
4 KH
2
PO
4
17.5
5 CaCl
2
2H
2
0 2.5
6 ZnSO
4
7H
2
O
MnCl
2
4H
2
O
MoO
3

CuSO
4
5H
2
O
Co(NO
3
)
2
6H2O

8.82
1.44
0.71
1.57
0.49
7 H
3
BO
3
11.4
8 EDTANa
2

KOH
50
31

Tabla 3. Composicin del medio Postgate C.
KH
2
PO
4
0.5
NH
4
Cl 1.0
Na
2
SO
4
4.5
MgSO
4
7H
2
O 0.06
CaCl
2
2H
2
0 0.06
FeSO
4
7H
2
0 0.004
Citrato de sodio 0.3
NaCl 15
Resarzurina 0.5

31

6.3.3. Preparacin de la celda electroqumica para la seleccin del medio de cultivo
Con la finalidad de elegir el medio de cultivo ptimo para las determinaciones se
prepararon tres celdas electroqumicas con 900 mL de cada medio de cultivo (Tabla 1, 2 y
3). Estas fueron inoculadas con 5 mL de un cultivo previamente propagado (360 h) en
medio de cultivo API RP 38 en condiciones de anaerobiosis a 37 C por 720 h (Figura 2).

Figura 2. Celda electroqumica de volumen nominal de 1000 mL empleada para la
seleccin del medio de cultivo.

32

6.4. Cupones de acero
Para los estudios de corrosin se utilizaron cupones de acero al carbn API XL 52, con
forma cilndrica y un rea de exposicin de 30.2922 pulgada
2
y 25.6703 pulgada
2

(Figura 3), pulidos hasta lija de carburo de silicio nmero 600.

Figura 3. Cilindros de acero al carbn API XL 52 referidos como electrodos de
trabajo o cupones corrosimtricos.
6.4.1. Acondicionamiento de los cupones de acero al carbn API XL 52
Antes de cada ensayo en donde se requera la presencia del cupn, la superficie del
electrodo de trabajo (cupones corrosimtricos) fue pulida con lijas de papel de carburo de
silicio marca FRADELI. Las lijas utilizadas fueron nmero 80, 100, 120, 150, 180, 220,
240, 280, 320, 360, 400, 500 y 600; se emple esta gran variedad de lijas con el propsito
de no alterar la estructura y apariencia del metal y poder obtener una superficie
uniformemente pulida. Para alcanzar un pulido homogneo el cupn fue montado en un
motor monofsico de caballo de fuerza a baja velocidad de rotacin (1875 rpm). Una
vez concluido el lijado el cupn fue limpiado con agua y detergente en polvo, seguido de
un enjuague con agua desionizada y desengrasado con acetona, posteriormente se
registr el peso y rea del cupn y se envolvi en papel de inhibidor de corrosin (Protek
Wrap de DAUBERT VCI, INC.), mantenindose en un desecador hasta su uso.

33

6.5. Determinacin de crecimiento por el nmero ms probable (NMP)
Para establecer la cintica de crecimiento se emple la tcnica del NMP, la cual estima la
poblacin microbiana a travs de una serie de diluciones (Figura 4) de la muestra
problema y dependiendo de la sensibilidad requerida se hacen de 3 a 10 replicas de cada
dilucin; estas son sometidas a ciertas condiciones de incubacin (tiempo y temperatura)
y para apreciar el crecimiento, se evala el nmero ms probable de microorganismos por
unidad de volumen de cada dilucin hecha. Con ayuda de tablas estadsticas se conoce el
NMP/mL del microorganismo en estudio.
Las tablas (US FDA/CFSAN-BAM, 2006) ocupadas para esta determinacin consideran que
la estimacin se basa en la presuncin de que las bacterias se encuentran
homogneamente distribuidas en un medio lquido; dicho de otra forma, en muestras
repetidas del mismo tamao y del mismo producto, debe esperarse que contengan, en
promedio, el mismo nmero de microorganismos. Sin embargo, algunas de las muestras
pueden contener microorganismos de ms o de menos, pero la tcnica permite calcular
una media logartmica con un intervalo de confianza el 95 %, lo cual permite obtener la
cifra del NMP/mL.
Teniendo en consideracin lo expuesto anteriormente se hizo lo siguiente.
Se prepararon 3 series de 10 ampoviales cada una con 9 mL de medio de
cultivo.
Condiciones de esterilidad fueron aplicados para los siguientes pasos.
Con una jeringa de 5 mL, previamente purgada con nitrgeno estril (filtro
de 2 m), se extrajeron 3 mL de la celda electroqumica (sistema: medio de
cultivo-bacteria-cupn de acero al carbn API XL 52).
Se inocul con 1 mL cada serie de 10 ampoviales.
Se homogeneiz el primer ampovial de cada serie.
Partiendo del primer ampovial de cada serie, se realizaron diluciones
decimales hasta 10
-10
para cada una; en cada transferencia se emplearon
jeringas nuevas, previamente purgadas; as como de una homogeneizacin
a los ampoviales.
Se incubaron los ampoviales a 37 C por 240 h.
Los ampoviales que presentaron cambio, ya sea turbiedad (medio de
cultivo Postgate C y Bold basal modificada) o abundancia de precipitacin
(API RP 38), se consideraron positivos.
Con tablas estadsticas, se estim el NMP/mL de bacterias presentes en la
muestra.

34

Figura 4. Bosquejo de las diluciones realizadas para la estimacin del nmero ms
probable (NMP).

En la Figura 4, se muestran por triplicado los ampoviales realizados para el NMP con sus
respectivas diluciones que fueron incubados para su posterior observacin.

35

6.6. Cuantificacin de sulfuros
La concentracin de sulfuros se estim espectrofotomtricamente a 665 nm empleando el
mtodo de azul de metileno. Se sigui el procedimiento descrito por Hach en el 2005,
que se basa en el mtodo de referencia equivalente a EPA, USEPA 376.2 y al mtodo
estndar 4500-S
2
-D

para aguas contaminadas (Hach, 2005).
La determinacin de la concentracin de sulfuro, ya sea como ion sulfuro (S
2-
), ion
sulfhdrico (HS
-
) y cido sulfhdrico (H
2
S), en el sistema electroqumico se bas en la
reaccin entre el cido sulfhdrico e iones de sulfuros metlicos solubles, con
N,N-dimetil-p-fenilenediamina para formar azul de metileno en presencia de dicromato de
potasio (agente oxidante).
Esta determinacin se hizo lo ms rpido posible, ya que de no ser as se pueden tener
prdidas en la concentracin final.
La metodologa fue la siguiente.
Se prendi el espectrofotmetro HACH DR2000 y despus de 30 minutos
se calibr el equipo con estndares de registr rpido (HACH).
Se corrobor el mtodo instalado en el espectrofotmetro,
correspondiente a la determinacin de sulfuros No. 690, empleando 10 mL
(aforo de las celdas) de agua desionizada tanto en la celda testigo como en
la celda problema y as verificar la precisin y exactitud del mtodo.
Con una jeringa estril, se extrajo una alcuota de 5 mL de la celda
electroqumica.
A la celda problema, se le adicion 1 mL de muestra y se afor con agua
desionizada.
A la celda testigo, se le agreg 10 mL de agua desionizada.
Tanto a la celda testigo como a la problema se le adicion 1 mL de reactivo
Sulfide 1 y se mezcl la solucin con 5 movimientos circulares.
Se adicion 1 mL de reactivo Sulfide 2 a la celda testigo y problema.
Se taparon las celdas y se homogeneizaron invirtindolas 25 veces.
Se dej reaccionar por 5 minutos.
Concluido el tiempo de reaccin, se coloc la celda testigo al
espectrofotmetro y se calibr a cero (0 g S
2-
/L).
Posteriormente, se instal la celda problema en el espectrofotmetro y se
ley la muestra.
Se consider la dilucin para conocer la concentracin de sulfuros
(g S
2-
/L).
36

6.7. Cuantificacin de sulfatos
La concentracin de sulfatos se valor espectrofotomtricamente a 450 nm utilizando el
mtodo de cloruro de bario. Se sigui el procedimiento descrito por Hach en el 2005, el
cual se basa en el mtodo de referencia equivalente a EPA, USEPA 375.4 y al mtodo
estndar para aguas contaminadas (Hach, 2005).
Los iones de sulfato en la muestra reaccionan con el cloruro de bario y forman un
precipitado de sulfato de bario que es insoluble en medio acuoso, encontrndose como
partculas slidas muy finas en la muestra. La turbiedad producida es proporcional a la
cantidad de sulfato presente.
El procedimiento fue el siguiente.
Se encendi el espectrofotmetro HACH DR2000 y despus de 30
minutos se calibr el equipo con estndares de registro rpido (HACH).
Se verific el mtodo instalado en el espectrofotmetro, correspondiente a
la determinacin de sulfatos No. 680, utilizando 10 mL (aforo de las celdas)
de agua desionizada tanto en la celda testigo como en la celda problema y
as corroborar la precisin y exactitud del mtodo.
Con una jeringa estril, se extrajo una alcuota de 5 mL de la celda
electroqumica.
A la celda testigo y a la celda problema se les adicion 1 mL de muestra y se
complet el aforo (9 mL) con agua desionizada.
Se le adicion a la celda problema el contenido de 1 sobre del reactivo
SulfaVer4.
La celda problema se agit con movimientos circulares por 25 veces para
disolver el reactivo.
Se esper a que se llevara a cabo la reaccin (5 min).
Finalizado el tiempo de reaccin, se introdujo la celda testigo al
espectrofotmetro y se calibr a cero (0 mg SO
4
2-
/L).
Posteriormente se insert la celda problema en el espectrofotmetro y se
ley la muestra.
Se consider la dilucin para conocer la concentracin de sulfatos
(mg SO
4
2-
/L).

37

6.8. Cuantificacin de fierro total
La concentracin de fierro total se apreci espectrofotomtricamente a 510 nm aplicando
el mtodo de fenantrolina. Se sigui el procedimiento descrito por Hach en el 2005, el
cual se basa en el mtodo de referencia equivalente a EPA, USEPA 45(126:43459) y al
mtodo estndar para aguas contaminadas (Hach, 2005).
Para poder determinar el contenido de fierro total en el sistema electroqumico, se
necesit convertir todo el fierro presente en ion ferroso (Fe
2+
), el cual reacciona con la
1,10 fenantrolina, propiciando la formacin de un complejo colorido (rojo-naranja)
proporcional a la concentracin de fierro total.
El desarrollo fue el siguiente.
Se encendi el espectrofotmetro HACH DR2000 y despus de 30
minutos se calibr el equipo con estndares de registro rpido (HACH).
Se confirm el mtodo instalado en el espectrofotmetro, correspondiente
a la determinacin de fierro total No. 265, con ayuda de las celdas testigo y
problema, ajustando el volumen a 10 mL con agua desionizada y as poder
verificar la precisin y exactitud del mtodo.
Con una jeringa estril se extrajo una alcuota de 5 mL de la celda
electroqumica.
Se les adicion 1 mL de muestra a la celda testigo y a la celda problema y se
afor a 10 mL con agua desionizada.
Se le adicion el contenido de 1 sobre del reactivo FerroVer4 a la celda
problema.
Se homogeneiz la celda problema con 25 movimientos circulares.
Se dej reaccionar por 3 min.
Transcurrido el tiempo de reaccin se instal la celda testigo al
espectrofotmetro y se calibr a cero (0 mg Fe/L).
Posteriormente se coloc la celda problema en el espectrofotmetro y se
ley la muestra.
Se tom en cuenta la dilucin para conocer la concentracin de fierro total
(mg Fe/L).

38

6.9. Determinacin de acidez
Durante la seleccin del medio de cultivo para los ensayos de biocorrosin se emple un
titulador digital marca Hach, modelo 16900, el cual aplica el principio de que a un
determinado volumen de muestra se le adiciona un indicador para su posterior titulacin
con un acido o base fuerte y la cantidad de titulante usado es directamente proporcional a
los mili equivalentes de cido o base en la muestra (Whitten y col., 1980).
El procedimiento fue el No. 8200 (acid determination por Hach).
Se acondicion el titulador digital con un cartucho de titulacin digital de
NaOH 0.16 N (14377-01 de Hach).
Una vez instalado el cartucho se le incorpor la cnula distribuidora, se
verific la salida del titulante a travs de sta y se llev a cero los dgitos.
Con una jeringa estril se extrajo una alcuota de 10 mL de la celda
electroqumica y se depositaron en un matraz Erlenmeyer de 250 mL.
Se diluy la muestra con agua desionizada, aproximadamente hasta 100 mL
y se le agreg el contenido de un sobre de reactivo Phenolphthalein.
Se homogeneiz el contenido con 25 movimientos circulares.
Se incorpor el titulador digital dentro del matraz Erlenmeyer procurando
que la cnula quedara hasta el fondo del matraz.
Se empez a titular gota a gota con giros lentos dados a la perilla del
titulador.
El punto final de la titulacin se hizo evidente con el cambio del indicador a
color rosa plido.
Se tomaron en cuenta los dgitos requeridos, la normalidad y el factor
multiplicador correspondiente a los dgitos gastados en la titulacin para
conocer los meq de cido /L.
En forma alternativa en el ensayo de produccin de cidos orgnicos se realiz la
titulacin directa con NaOH 0.1 N y fenolftalena como indicador.

39

6.10. Determinacin del pH
En este trabajo se emplearon dos electrodos de pH, uno de ellos se utiliz en las pruebas
electroqumicas y el segundo para el monitoreo de los productos metablicos producidos
por las cepas G1-2006 y G1-2007.
Se verific el buen funcionamiento de los potencimetros empleando soluciones
estndares a pHs diferentes. Para los ensayos electroqumicos se calibr el
potencimetro antes de sumergirlo en la celda electroqumica y para los productos
metablicos se calibr semanalmente; todas las calibraciones se hicieron a pH de 4 y 7.
El primer potencimetro es de la marca Thermo Orion digital con conector BNC, el cual
fue sumergido dentro de la celda electroqumica.
El segundo potencimetro es de la marca Lutron modelo YK-21PH, el cual se introdujo en
cada una de las muestras filtradas a travs de membranas GF/F.
Ambos potencimetros presentaron una resolucin de 0.001 unidades de pH.
El valor de pH tard en estabilizarse, aproximadamente, 30 segundos, por lo que se
esper 1 minuto para registrar la lectura de pH reportada por los potencimetros.

40

6.11. Identificacin de los microorganismos
Para observar las caractersticas microscpicas de las bacterias se hizo lo siguiente:
Para verificar si es Gram positivo o Gram negativo se realizaron tres frotes
y se tieron por la tcnica de Gram.
Para mostrar la presencia de esporas se elaboraron tres frotes y se tieron
por la tcnica de Shaeffer y Fulton.

6.11.1. Pruebas bioqumicas de identificacin tradicionales
Las cepas aisladas G1-2006 y G1-2007 se incubaron en ampoviales con medio de cultivo
Postgate C y en condiciones de anaerobiosis. Con estos cultivos se llevaron a cabo las
determinaciones bioqumicas (Bergeys Manual).
Cada cepa, fue sometida al anlisis bioqumico por duplicado y en forma paralela un
testigo, denominado cepa de referencia.
La fermentacin de carbohidratos y la demostracin de la presencia de algunas enzimas,
son parte de las pruebas diferenciales que se realizaron. El procedimiento fue el
siguiente:
Con una pipeta Pasteur se sembraron las bacterias en medio de cultivo,
gelosa sangre hemina menadiona y se incubaron en condiciones aerbicas
y anaerbicas a 37 C por un lapso de 72 a 120 h. El objetivo de mantener a
las bacterias en condiciones diferentes es evidenciar el grado de
sensibilidad que manifiestan ante el oxgeno molecular presente en el
ambiente. A esta determinacin se le conoce como prueba de
aerotolerancia.
Con la finalidad de observar el crecimiento de las bacterias y corroborar la
identificacin microscpica al finalizar el tiempo de incubacin se realizaron
frotes de las colonias y se tieron por las tcnicas de Gram y Shaeffer y
Fulton.
A partir del medio de cultivo gelosa sangre hemina menadiona fue
necesario propagar a las bacterias en un caldo tioglicolato enriquecido con
hemina menadiona sin glucosa y sin indicador, ya que estos pueden
interferir o dar falsos positivos en la interpretacin de las pruebas
bioqumicas. Se incubaron en condiciones anaerbicas, mediante la
41

colocacin de un sello de aceite mineral a 37 C en un intervalo de 72 a 120
h.
Transcurrida la incubacin, se observaron los tubos de caldo tioglicolato y
el crecimiento de las bacterias se expres por la turbiedad en el fondo del
tubo y a este tubo se le nombr semilla y fue el inculo para los ensayos
bioqumicos.
Con ayuda de una pipeta Pasteur se tom una alcuota de la semilla y se
sembraron una serie de tubos con caldo base de tioglicolato sin glucosa y
sin indicador adicionados de los siguientes hidratos de carbono al 1%:
adonitol, almidn, arabinosa, celobiosa, dulcitol, esculina, fructosa,
galactosa, glicerol, glucosa, inulina, lactosa, maltosa, manitol, manosa,
melibiosa, rafinosa, ramnosa, ribosa, sorbitol, trehalosa y xilosa; asmismo
caldo indol nitratos, caldo urea, tiogel o gelatina, leche fierro, caldo
tioglicolato carne cocida, gelosa cerebro corazn en tubo inclinado y una
placa con gelosa yema de huevo.
Se efectu el sembrado de todos los ensayos diferenciales, evitando
introducir aire y/o aceite mineral y se incubaron en condiciones
anaerbicas a 37 C con un tiempo de 72 a 120 h.
Una vez transcurrida la incubacin se leyeron e interpretaron las pruebas
diferenciales.
Con la finalidad de observar el cambio efectuado por la bacteria a los tubos
con carbohidratos se les adicion azul de bromotimol al 1%.
Para verificar la produccin de indol se usaron xilol y reactivo de Ehrlich.
cido sulfanlico y dimetil naftil amina fueron utilizados en la determinacin
de la reduccin de nitratos a nitritos.
En la hidrlisis de la esculina se emple citrato frrico de amonio al 10%.
Para interpretar la licuefaccin de la gelatina se refriger el tubo de tiogel
(aproximadamente 4 C) por una hora.
Para la determinacin enzimtica de la catalasa se us perxido de
hidrgeno al 3%.
Para observar la presencia de la lipasa fue empleada solucin acuosa
saturada de sulfato de cobre.
Con el propsito de verificar la hidrlisis del almidn fue empleada solucin
de lugol.
Con el manual de anaerobios obligados y el Bergeys Manual se pudo
identificar el gnero y especie de las bacterias en estudio.

42

6.11.2. Aislamiento de DNA.
Para la extraccin del DNA de las cepas G1-2006 y G1-2007 se emple la tcnica de lisis
qumica con la adicin de lisozima, que consiste en lo siguiente (Becker y col., 1990).
Se recuperaron las clulas por centrifugacin.
Se lav el paquete celular con agua desionizada y se centrifug a 11000 x g
durante tres minutos.
Se adicionaron 600 L de solucin de lisis (SDS 0.5%, Tris 100 mM y EDTA
50 mM), succionando y descargando con la punta de la micropipeta hasta
suspender las clulas.
A la suspensin se le adicionaron 20 L de lisozima a 12.5 mg/mL en
regulador de Tris 100 mM y se incub a temperatura ambiente por tres
minutos.
Posteriormente las muestras se mantuvieron a 80 C por cinco minutos.
Finalizado el tiempo se enfri a temperatura ambiente.
Se adicionaron al lisado 3 L de RNAsa (400 U/mg) invirtiendo 25 veces y se
incub a 37 C por 45 minutos.
Las muestras se colocaron en refrigeracin (4 C) durante 10 minutos.
Se adicionaron 200 L de solucin de acetato da amonio (10 M) y se agit
en vortex por 20 segundos.
Se centrifug a 11000 x g durante tres minutos. Cuidadosamente se vaci
el sobrenadante a tubos de 1.5 mL que contenan 600 L de isopropanol y
se mezcl invirtiendo las muestras 50 veces.
Se centrifug a 11000 x g por tres minutos, se vaci el sobrenadante y se
escurrieron los tubos sobre papel secante. Se adicionaron 600 L de etanol
al 70% y se invirtieron los tubos varias veces para lavar el precipitado.
Se centrifug a 11000 x g durante tres minutos y cuidadosamente se vaci
el etanol sin descargar el paquete de DNA.
Se drenaron los tubos sobre papel secante y se dejaron las muestras al aire
por 15 minutos.
Se rehidrat el DNA con 50 mL de agua desionizada estril por 24 horas.
Se mantuvo en congelacin (-20 C) hasta su uso.

43

Asmismo, se utiliz un kit (DNeasy Tissue de QIAGEN) para la extraccin y purificacin
de DNA (DNeasy Tissue Handbook, 2003) que se basa en la interaccin entre las cargas
negativas de los grupos fosfato de la cadena de DNA y las cargas positivas de los grupos
DEAE de la superficie de la resina. Para ello se necesitan reguladores con ciertas
caractersticas (concentracin de sales y pH) y por medio de estos el DNA se enlaza o
bien se eluye de la columna (QIAgen, 2001).
El procedimiento fue el siguiente.
Se recuperaron las clulas por centrifugacin.
Se lav el paquete celular con agua desionizada y se centrifug a 5000 x g
por diez minutos.
Se resuspendi el paquete de bacterias en 180 L de regulador de lisis (20
mM Tris-HCl a pH 8.0, 2 mM EDTA, 1.2% Triton X-100 y lisozima 20
mg/mL).
Se incub a 37 C durante 1 hora.
Se adicionaron 25 L de proteinasa K y 200 L de regulador AL y se mezcl
en vrtex.
Se incub a 70 C por 30 minutos.
Se agregaron 200 L de etanol al 96% y se homogeneiz.
Se transfiri la mezcla dentro de la DNSC (DNeasy Spin Column), que se
haba colocado previamente en un tubo de recoleccin de 2 mL.
Se centrifug a 6000 x g durante 1 minuto.
Se coloc la DNSC en un tubo de recoleccin nuevo, se adicionaron 500 L
de regulador AW1 y se centrifug a 6000 x g por un minuto.
Se coloc la DNSC en un tubo de recoleccin nuevo, se agregaron 500 L de
regulador AW2, se centrifug por 3 minutos a mxima velocidad para secar
la resina contenida dentro del DNSC.
Se asent la DNSC en un tubo de 2 mL y se agreg 100 L de regulador AE,
directamente sobre la resina de DNSC.
Se incub a temperatura ambiente por un minuto y luego se centrifug 1
minuto a 6000 x g para eluir.
Se mantuvo en congelacin (-20 C) hasta su uso.

44

6.11.3. Amplificacin del DNA por la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
La amplificacin de una regin especifica de DNA, se lleva a cabo mediante la reaccin en
cadena de la polimerasa (PCR) (Vosberg, 1989).
Los requerimientos para una PCR son: solucin amortiguadora de reaccin, mezcla de
nucletidos (dNTPs: adenina, timina, citosina y guanina), que son la materia base para
fabricar el DNA y los iniciadores (oligonucletidos) especficos que flanquean el gen o
segmento que acta como blanco para la reaccin (Mas Eva y col., 2001).
La reaccin en cadena de la polimerasa se desarrolla en tres pasos consecutivos,
determinados por temperaturas y tiempos especficos:
1er paso.- Desnaturalizacin (92-98 C, 30 a 90 segundos), en el cul se separan las dos
cadenas complementarias del DNA blanco.
2do paso.- Alineamiento (50-60 C, 30 a 60 segundos), en el que se realiza el
apareamiento especifico entre los iniciadores y las cadenas simples del segmento de DNA
blanco desnaturalizado.
3er paso.- Extensin (70-74 C, 30 a 90 segundos), la DNA polimerasa extiende la longitud
de los iniciadores apareados al DNA blanco al ir polimerizando los desoxirribonucletidos
libres, resultando en nuevas cadenas complementarias a las dos cadenas sencillas
presentes al inicio de la reaccin.
Consecuentemente, con la sucesin de ciclos se logra una sntesis exponencial del
segmento de DNA blanco.
La reaccin de PCR se llev a cabo en un termociclador (Applied Boisystems GeneAmp PCR
System 2400) con el siguiente programa: primero se tiene una desnaturalizacin a 94 C
por 5 minutos, seguidos de 35 ciclos consistentes en 1 minuto a 94 C, un alineamiento a
55 C por 1 minuto y una extensin a 72 C por 2.5 minutos, apoyado por 10 minutos para
la extensin final a 72 C. Finalizada la amplificacin, se dejan enfriar las muestras
durante 10 minutos a 4 C (Figura 5).

45

94 C 94 C
5 1 72 C 72 C
55 C 2.5 10
1 4 C
10

35 ciclos
Figura 5. Programa utilizado para la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).

La mezcla de reaccin para la amplificacin fue de 25 L de volumen final
Componente Volumen (L)
Regulador 10X 2.5
MgCl
2
(50mM) 0.75
dNTPs (10mM) 0.5
Taq DNA polimerasa 0.125
H
2
O desionizada 18.125
Iniciador 1 (10mM) 1.0
Iniciador 2 (10mM) 1.0
DNA muestra 1.0

Los iniciadores fueron distintos dependiendo de la longitud deseada del amplificado, por ejemplo:
para los amplificados utilizados en la TGGE se utilizaron los iniciadores U 968-GC y L 1401 (Tabla 4)
(Felske y col., 1996), dando un producto de 500 pb aproximadamente del 16S rDNA. Para la
identificacin de los microorganismos se utilizaron los iniciadores 8FLP y 13B (Tabla 5) (Relman
D.A. 1993), los cuales dan productos de amplificacin de aproximadamente 1400 pb del 16S rDNA.
En el caso del anlisis del DNA polimrfico amplificado aleatoriamente (RAPD) (Tabla 6) (Madico y
col., 1995; Chvez y col., 2005) la temperatura de alineamiento fue de 35 C y el tiempo de
extensin de 2 minutos.

46

Tabla 4. Iniciadores utilizados para la evaluacin de la riqueza de especies.
Iniciadores Secuencia
*U968-GC 5-(GC pinza)-AAC GCG AAG AAC CTT AC-3
L1401 5-CGG TGT GTA CAA GAC CC-3

Tabla 5. Iniciadores utilizados para la identificacin de las cepas aisladas.
Iniciador Secuencia
8FPL
Forward
5-GCG GAT CCG CGG CCG CTG CAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3
13B
Reverse
5-CGG GAT CCC AGG CCC GGG AAC GTA TTC AC-3

Tabla 6. Iniciadores empleados para el RAPD
Iniciador Secuencia
1283
Forward
5-GCG ATC CCC A-3
1290
Reverse
5-GTG GAT GCG A-3

47

6.11.4. Electroforesis en gel con gradiente de temperatura
La electroforesis en gel con gradiente de temperatura (TGGE) es una tcnica de
separacin, que depende de la forma de la molcula, por lo que pueden separarse
fragmentos de la misma longitud. La forma est determinada principalmente por la
estructura secundaria y terciaria de la molcula y puede ser cambiada por factores
externos como la temperatura, concentracin de sales, pH, etc. (Biometra, 1999).
Mediante esta tcnica se pueden separar fragmentos de DNA de la misma longitud con
secuencias de bases distintas, generando un patrn nico de identificacin; por lo que
cada banda obtenida representara a un microorganismo.
El mtodo consiste en amplificar, por medio de la reaccin en cadena de la polimerasa,
fragmentos del gen 16S rDNA con una longitud entre 200 y 500 pb (la longitud est en
funcin del diseo de los iniciadores) y su posterior anlisis electrofortico utilizando un
gradiente de temperatura (agente desnaturalizante) a lo largo del gel de poliacrilamida.
Durante la migracin de las muestras amplificadas en el gel con el gradiente de
temperatura, las muestras presentan diferentes estados de transicin en su estructura,
pasando de estructura terciaria (DNA de doble cadena) a estructura secundaria (cadena
sencilla), este fenmeno ocurre en determinado punto del gel en donde la migracin
termina o se vuelve ms lenta.
Se aconseja utilizar en la amplificacin del gen un iniciador rico en G-C o un iniciador con
una secuencia adicional en el extremo 5 abundante de G-C. La regin rica en G-C acta
como una abrazadera que evita la formacin de DNA de cadena sencilla y como la
secuencia de los fragmentos es diferente, cada muestra adopta una conformacin
particular de DNA de cadena sencilla parcial, lo que ocasiona que los fragmentos se
detengan en diferente posicin a lo largo del gel (Maniatis y col., 1982).
Para la realizacin de la TGGE, el procedimiento se segment en cuatro fases.

48

1.- Preparacin del gel de poliacrilamida.
Se lavaron las placas de vidrio (molde) con alcohol al 70% y agua
desionizada.
En la placa que no tiene pozos se colocaron 200 L de acryl glide y se
distribuyeron con papel cebolla uniformemente en toda la superficie de la
placa.
Se coloc una membrana de polibond entre las dos placas de vidrio,
sujetadas con tres pinzas.
Se prepar 1 mL de persulfato de amonio al 4%, es decir, se pesaron 40 mg
y se llevaron a 1 mL con agua desionizada.
En un matraz Erlenmeyer (estril) de 25 mL, se pesaron 2.4 g de urea y se
adicion 1 mL de acrilamida-bisacrilamida (40% w/v). A la mezcla, se le
adicionaron 100 L de regulador TEA 10X (Tris base 400 mM,
Na
2
EDTA2H
2
O 20mM, acetato de sodio anhidro 200 mM, cido actico
glacial 296 mM, se afor a 1 L con agua desionizada y el pH final de la
solucin fue de 7.8), 250 L de glicerol al 40% y 1.3 mL de agua desionizada
(estril).
La solucin anterior fue homogeneizada perfectamente hasta la disolucin
de la urea y se transfiri a un matraz Kitasato y se elimin el aire disuelto
conectando el matraz a una bomba de vaco durante 5 minutos en tiempos
intermitentes de 20 segundos.
Se llev al aforo de 5 mL con agua bidestilada (estril) y se adicionaron
23 L de persulfato de amonio al 4% y 10 L de TEMED
(N,N,N,N-tetrametilendiamina), seguida de una homogeneizacin.
Se verti la solucin entre las placas y se dej gelificar durante 30minutos.

49

2.- Acondicionamiento de las muestras.
En un tubo de 1.5 mL se coloc 1 L de regulador de carga (0.25% de azul
de bromofenol y 0.25% de xilen cianol en una solucin de sacarosa al 50 %;
la concentracin final de esta solucin es de 5X), 2 L de regulador TAE 0.2X
y 1 L de DNA amplificado.

Figura 6. Equipo para llevar a cabo una electroforesis en gel con gradiente
de temperatura (TGGE).

50

3.- Arreglo del sistema de electroforesis (Figura 6).
Se prepararon 500 mL de regulador TAE 0.2X (10 mL de regulador 10X y se
llev al afor a 500 mL con agua desionizada.
Se adicionaron 240 mL del regulador 0.2X en cada una de las cubetas de la
cmara de electroforesis.
En la superficie del equipo se encuentra la placa del gradiente de
temperatura que se caracteriza por tener lneas que proporcionan el grado
de temperatura y en estas lneas se adicion 50 L de tritn al 0.1 % y fue
puesta la membrana de polibond con el gel evitando la formacin de
burbujas.
Se colocaron las muestras en cada pozo y se instalaron los puentes de papel
debidamente alineados.
Se cubri el gel con la segunda membrana de polibond y finalmente se fij
la placa de vidrio para cubrir el gel con los sellos de silicn.
Se cerr la cmara electrofortica y se inici la corrida con las condiciones
de voltaje (125 V), corriente (8 mA), potencia (0.6 W) y tiempo (2 horas).
4.- Revelado y observacin del gel.
Concluido el tiempo de corrida, se retir el gel de la cmara electrofortica
y se pas al recipiente de revelado adicionando una solucin de TEA 1X con
syber green I por 30 minutos.
Transcurrido el tiempo de revelado, se observ el gel en un transiluminador
(Bio-Imaging Systems, Visible & Ultraviolet Transilluminator) acoplado a un
documentador de geles (Kodak ID Image Analysis Software, 2000).

51

6.11.5. Electroforesis en gel de agarosa
El DNA, extrado de las cepas G1-2006 y G1-2007 y el generado por PCR, fueron sometidos
a una electroforesis en gel al 1% y el protocolo fue el siguiente.
Se midieron 20 mL de regulador TBE 10X (Tris 121.1 g, cido brico anhidro
61.8 g, Na
2
EDTA2H
2
O 7.4 g y se afor a 1 L con agua desionizada, el pH de
la solucin fue de 8.3) y se llev a 200 mL con agua desionizada para
obtener una concentracin 1X.
Se prepar el gel de agarosa al 1% (0.2 g de agarosa) con 20 mL de
regulador 1X y se disolvi perfectamente la mezcla calentando en un horno
de microondas.
A la mezcla fundida se le adicionaron 0.7 L de bromuro de etidio
(revelador).
Se prepar la cmara de electroforesis (Gibco BRL Electrophoresis
Apparatus) para la formacin del gel, a la que previamente se le han
colocado el peine y los separadores.
Se adicion la agarosa fundida al molde de la cmara y por 30 minutos se
dej solidificar el gel.
Transcurrido el tiempo, se retiraron el peine y los separadores y se inund
la cmara electrofortica con el resto del regulador TBE 1X.
Se prepararon las muestras de DNA purificado, colocando en un tubo de
1.5 mL una mezcla de DNA (4 L) y regulador de carga TBE 1X (1 L). Para
el marcador de peso molecular (para comparar el tamao de los
fragmentos de DNA), se adicion en un tubo de 1.5 mL una mezcla de
regulador de carga TBE 1X (4 L) y el marcador de peso molecular (1 L).
Se colocaron las muestras en cada uno de los pozos, en uno de ellos el
marcador de peso molecular y se cerr la cmara de electroforesis.
Se conect el equipo a una fuente de poder marca Thermo modelo
EC250-90; con las siguientes condiciones: voltaje 80 V, corriente 40 mA y
tiempo 1 hora.
Una vez concluido el tiempo de corrida se retir el gel y se observ en un
transiluminador (Bio-Imaging Systems, Visible & Ultraviolet
Transilluminator) acoplado a un documentador de geles (Kodak ID Image
Analysis Software, 2000).

52

6.11.6. Purificacin del DNA amplificado
Antes de llevar a cabo la secuenciacin de los amplicones estos se purificaron empleando
el juego de reactivos QIAquick (Spin Handbook, 2001) de acuerdo con el protocolo
siguiente:
Se midi el volumen total de muestra de DNA amplificado y se agreg cinco
veces ese volumen de regulador PB para obtener una dilucin 1:6.
Se deposit la muestra en una columna de intercambio inico contenida en
un tubo de coleccin y se centrifug a 11000 x g durante 1 minuto. Se
elimin el filtrado y se coloc la columna en el mismo tubo.
Se lav con 750 mL de regulador de PE y se centrifug por 1 minuto a
11000 x g.
Se descarg el filtrado y se coloc la columna sobre el mismo tubo de
coleccin, se centrifug a 11000 x g durante 1 minuto para eliminar
completamente el etanol que contiene el regulador PE.
Se coloc la columna en un tubo limpio y, a travs de ella, se eluy el DNA
adicionando 35 mL de agua desionizada estril en el centro de la columna,
se dej reposar 1 minuto y se centrifug a 11000 x g por 1 minuto.
Se cuantific la concentracin de DNA midiendo la absorbencia a 260 nm
de la muestra diluida 1:126 (espectrofotmetro Beckman DU 650).
Para la cuantificacin de DNA se consider que 1 unidad de absorbencia a 260 nm es igual
a 50 g/cm
3
; as que: 50 X Abs
260
= concentracin de la muestra de DNA (g/cm
3
)
(Becker y col., 1990).
6.11.7. Secuenciacin de un fragmento del gen 16S rDNA
Una vez obtenido el DNA de las cepas puras, se realiz la amplificacin del 16S rDNA
por PCR, empleando los iniciadores universales 8FLP y 13B (Tabla 8) (Relman D.A., 1993)
para cada una de las cepas, los que generan amplicones de aproximadamente 1400 pb.
La secuenciacin de los amplificados de DNA se llev a cabo en el Laboratorio de Biologa
Molecular del Instituto de Biologa de la Universidad Nacional Autnoma de Mxico, con
un secuenciador ABI PRISMDNA SEQUENCER modelo 310 de Perkin Elmer, el cual
funciona bajo el principio del mtodo de Sanger (Sanger, 1981; Bohinski, 1998).
Una vez obtenidas las secuencias para cada una de las cepas, se compararon en la base de
datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) con secuencias de bases
conocidas o de referencia en el programa Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)
(Altschul y col., 1992).
53

6.11.8. Anlisis de restriccin del 16S rDNA amplificado (ARDRA)
El anlisis de restriccin de DNA ribosomal amplificado (ARDRA) se basa en la obtencin
del 16S rDNA mediante amplificacin por PCR utilizando iniciadores universales. El
producto resultante de la amplificacin se digiere o se corta con enzimas de restriccin y
los fragmentos generados se visualizan y analizan en geles de agarosa o poliacrilamida, los
cuales migran de acuerdo con su peso molecular. Con esta metodologa se obtienen
patrones de bandas o huellas digitales que son particulares para cada microorganismo y
cada uno presenta diferentes longitudes en sus fragmentos debido a mutaciones en los
sitios de restriccin, como inserciones o deleciones y estos fragmentos de restriccin de
longitud polimrfica se utilizan para comparacin con otros patrones de huella gentica
(Liu y col., 1997; Daz y Wacher, 2003; Ganesh-Babu, 2004).
El proceso fue el siguiente.
Se extrajo el DNA de las cepas G1-2006 y G1-2007.
El DNA obtenido de cada cepa se amplific con los iniciadores 8FLP y 13B,
que amplificaron un fragmento de 1400 pb del 16S rDNA.
Para cada cepa se purific el 16S rDNA.
El purificado fue sometido a una digestin con enzimas de restriccin
(Mbo1, Alu1 y Eco R1).
Se realiz una electroforesis en gel de poliacrilamida al 17% [19.8 mL de
acrilamida, 7.9 mL de agua desionizada, 7 mL de regulador TBE 5X, 245 L
de persulfato de amonio (APS) y 12.5 L de TEMED].
Las condiciones de la electroforesis fueron: voltaje de 300V, corriente de 56
mA y un tiempo de 4 horas.
El gel se observ en un transiluminador acoplado a un documentador de
geles.
Se compararon las bandas caractersticas de cada una de las cepas.
La digestin enzimtica del 16S rDNA de cada cepa se realiz con una mezcla de dos y tres
enzimas de restriccin.
1.- Con dos enzimas de restriccin.
Se hizo la mezcla digestora en un tubo de 1.5 mL y estuvo conformada por
1 L de Alu1, 1 L de Eco R1, 3 L de regulador TBE 5X y 7 L de agua
desionizada.
Fue adicionada a la mezcla el volumen constante (18 L) del 16S rDNA.
Se incub el tubo de 1.5 mL por 16 horas a una temperatura de 37 C.
54

2.- Con tres enzimas de restriccin.
En un tubo de 1.5 mL se realiz la mezcla digestora con un volumen final de
12 L (el volumen est en funcin del nmero de enzimas de restriccin
empleadas).
La solucin digestora estuvo compuesta por 1 L de Mbo1, 1 L de Alu1,
1 L de Eco R1, 3 L de regulador TBE 5X (Tris 60.55 g, cido brico anhidro
30.9 g, Na
2
EDTA2H
2
O 3.7 g y se afor a 1 L con agua desionizada, el pH de
la solucin fue de 8.3) y 6 L de agua desionizada.
Se complet el volumen a 30 L con 18 L del 16S rDNA.
Durante 16 horas fue incubado el tubo de 1.5 mL a una temperatura de
37 C.
Una vez obtenida la digestin, se prepar el digerido para ser sometido a una
electroforesis.
En un tubo de 1.5 mL se adicionaron 20 L de producto digerido, ms 5 L
de regulador de carga (0.25% de azul de bromofenol y 0.25% de xilen cianol
en una solucin de sacarosa al 50%; la concentracin final de esta solucin
es de 5X).
Para el marcador de peso molecular se agregaron 5 L del marcador de
peso molecular y 2 L de regulador de carga en un tubo de 1.5 mL.
Las preparaciones fueron homogeneizadas por medio de una punta de una
micropipeta por succin y descarga (25 veces).
Se tom una alcuota de 7 L y se coloc en el pozo del gel; de igual forma
se procedi con el marcador de peso molecular.

55

6.11.9. Anlisis del DNA polimrfico amplificado aleatoriamente (RAPD)
El anlisis del DNA polimrfico amplificado al azar (RAPD) o tambin conocido como PCR
arbitrariamente iniciada (APPCR), es la tcnica que ha tenido xito en el anlisis de
colecciones microbianas, debido a que es muy rpida y sencilla. El DNA extrado de los
microorganismos es amplificado en diversas regiones al azar y los iniciadores se
seleccionan arbitrariamente, por lo que no es necesario conocer las secuencias del DNA
de los microorganismos. Por lo general, se emplean temperaturas de alineacin bajas, de
manera que se obtengan productos de PCR que permitan el alineamiento de los
iniciadores a pesar de que existan una o dos bases que no coincidan. Para la separacin,
se realiza una electroforesis en gel de agarosa y se obtienen patrones nicos de
fragmentos de DNA de diferentes tamaos (Fell, 1993; Cocconcelli y col. 1997; Daz y
Wacher, 2003).
El protocolo fue el siguiente.
A las cepas G1-2006 y G1-2007, se les extrajo el DNA.
Se utilizaron los iniciadores 1283 y 1290 (Tabla 9) (Madico y col., 1995;
Chvez y col., 2005).
A 4 L de las muestras amplificadas, en tubos de 1.5 mL, se les adicion 1
L de regulador de carga TBE 1X y, para el marcador de peso molecular, se
agreg en un tubo de 1.5 mL una mezcla de regulador de carga TBE 1X
(4 L) y el marcador de peso molecular (1 L).
Se hizo una electroforesis en gel de agarosa al 1% con las siguientes
caractersticas: voltaje 80 V, corriente 40 mA y tiempo 1 hora.
Finalizado el tiempo de corrida el gel se observ en un transiluminador
acoplado a un documentador de geles.

56

6.11.10. Extraccin de plsmidos
La presencia de DNA plasmdico o plsmidos en las bacterias se relaciona con algunas
funciones metablicas que realizan los microorganismos; debido a sus caractersticas o
por las tareas que desempean, a los plsmidos se les considera generalmente benficos.
Para la extraccin de plsmidos de las cepas G1-2006 y G1-2007 se aplic la tcnica de lisis
alcalina (Birnboim y Doly., 1979), de acuerdo con el siguiente protocolo:
Se sembraron las cepas en condiciones anaerbicas en medio de cultivo
Luria Bertani (Triptona 10 g/L, extracto de levadura 5 g/L y NaCl 5 g/L;
solucin a pH 7) y se incubaron a 37 C, hasta obtener turbiedad, la cual
apareci, aproximadamente en 120 h.
Se recuperaron las clulas por centrifugacin en tubos de 1.5 mL.
Se lavaron los paquetes celulares con agua desionizada y se centrifugaron a
11000 x g durante tres minutos.
Se desecharon los sobrenadantes y se adicionaron 100 L de solucin de
lisozima a cada uno de los tubos.
Se resuspendi la silucin de los tubos agitando en vrtex por 1 minuto.
Se incubaron a 4 C por 30 minutos.
Se agregaron 200 L de SDS (duodecil sulfato de sodio) a cada uno de los
tubos y se mezcl por inversin.
Se aadieron 150 L de acetato de sodio 3M y se mezclaron los tubos por
inversin.
Se centrifugaron a 11000 x g por 5 minutos.
Los sobrenadantes se transfirieron a otros tubos de 1.5 mL y se adicionaron
1000 L de etanol frio.
Se centrifugaron a 11000 x g por 30 minutos.
Se transfirieron los sobrenadantes a otros tubos de 1.5 mL y se adicionaron
100 L de acetato de sodio 1M y tris 0.05M a pH8.
Se precipit el DNA adicionando 300 L de etanol frio.
Se eliminaron los sobrenadantes y se agregaron a cada tubo 10 L de
solucin amortiguadora 5X (sacarosa al 25%, acetato de sodio 5mM, azul
de bromofenol al 0.05% y SDS al 0.1%).
A cada tubo se le adicionaron 3 L de RNAsa (400 U/mg).
Se incubaron los tubos a 60 C por 10 minutos.
57

Se mantuvo el DNA plasmdico a -20 C.
Posteriormente se aplicaron, aproximadamente, 10 L de cada muestra
obtenida en los pozos de los geles de agarosa al 0.7% para el anlisis por
electroforesis.
Simultneamente se prob un Kit de extraccin de plsmidos (StrataPrep Plasmid
Miniprep Kit de Stratagene) y el protocolo fue el siguiente.
Se sembraron las cepas en condiciones anaerbicas en medio de cultivo
Luria Bertani y se incubaron a 37 C, hasta obtener turbiedad, la cual
apareci, aproximadamente en 120h.
Se recuperaron las clulas por centrifugacin en tubos de 1.5 mL.
Se lavaron los paquetes celulares con agua desionizada y se centrifugaron a
11000 x g por 1 minuto.
Se adicionaron 100 L de la solucin 1 al tubo de 1.5 mL y se resuspendi
por 1 minuto en vortex.
Se agregaron 100 L de la solucin 2 y se mezcl invirtiendo el tubo de 1.5
mL 25 veces.
Se adicionaron 125 L de la solucin 3 y se homogeneiz invirtiendo el tubo
25 veces.
Se centrifug a 11000 x g durante 5 minutos (el sobrenadante formado
contiene el DNA plasmdico).
Se transfiri el sobrenadante con una micropipeta, aproximadamente 325
L, y se descarg al centro del tubo columna de 2 mL.
Se centrifug a 11000 x g por 1 minuto (el DNA plasmdico se retuvo en la
columna, ya que esta presenta una capacidad de retencin de
aproximadamente 20 g).
Se desech el filtrado y se volvi a ocupar el tubo columna.
Se adicionaron 750 L de buffer nucleasa al tubo columna y se centrifug a
11000 x g durante 1 minuto.
Se desech el filtrado y nuevamente se centrifug a 11000 x g por 1
minuto.
Se elimin el filtrado del tubo columna.
Se prepar la solucin buffer de lavado 1 X con etanol al 100% en
proporcin 1:1.
Se adicionaron 750 L de buffer de lavado a la columna y se centrifug a
11000 x g durante 1 minuto.
58

Nuevamente, se centrifug a 11000 x g por 1 minuto para eliminar el buffer
de lavado.
Se retir la columna del tubo y se coloc en un nuevo tubo de 1.5 mL.
Se eluy el DNA plasmdico con 50 L de buffer.
El tubo se conserv a temperatura ambiente por 5 minutos y se centrifug
a 11000 x g durante 1 minuto.
Se almacen el DNA plasmdico a -20 C.
El anlisis electrofortico se llev a cabo en un gel de agarosa al 0.7%.
Para la visualizacin del DNA plasmdico, se realiz una electroforesis en gel al 0.7%
utilizando detergentes y el procedimiento fue el siguiente.
Se prepar un gel de agarosa al 0.7% con regulador TBE 0.5X.
Se prepar el marcador de peso molecular (LAMBDA DNA HIND III DIGEST
AQUEOUS) en un tubo de 1.5 mL, adicionando 0.5 L del marcador, 2 L de
regulador (gel loading solution) y 4.5 L de agua bidestilada.
La solucin contenida en el tubo de 1.5 mL se calent en un termoblock
(Boekel Scientific) a 65 C por 5 minutos e inmediatamente se coloc en
bao de hielo.
Para preparar la muestra (DNA plasmdico de las cepas G1-2006 y
G1-2007), a un tubo de 1.5 mL se le adicionaron 5 L de muestra (DNA
plasmdico) y 2 L de regulador (gel loading solution).
Se coloc en cada pozo del gel de agarosa al 0.7%, el marcador de peso
molecular y las muestras.
A la cmara electrofortica se le aplic un voltaje de 40 V, una corriente de
20 mA y un tiempo de 12 horas.
Finalizado el tiempo de corrimiento el gel se revel en una solucin de
bromuro de etidio durante 30 minutos.
Una vez transcurrido el tiempo de revelado, el gel se observ en un
transiluminador acoplado a un documentador de geles.
El marcador de peso molecular evidenci 8 bandas y cada una tiene un
valor de 125, 564, 2027, 2322, 4361, 6557, 9416 y 23130 pb.

59

6.12. Medicin de la velocidad de corrosin
En la tcnica gravimtrica y en las pruebas electroqumicas se emple una celda
electroqumica (Figura 7) con las mismas caractersticas (volumen nominal de 1 L) que
para la seleccin del medio de cultivo, lo nico que vari fue el medio de cultivo y la
procedencia del inculo, ya que aqu se emplearon 900 mL de medio de cultivo
seleccionado (Postgate C) y 5 mL de inculo de un cultivo de 360 h de propagacin en
medio de cultivo Postgate C y de igual manera se conserv por 720 h en condiciones
anaerbicas.

Figura 7. Esquema de la celda utilizada en las tcnicas electroqumicas.
Se emple una celda de volumen nominal de 1000 mL (Figura 7) que cuenta con cinco
entradas y una horadacin; estas son empleadas para soportar a cada uno de los
siguientes elementos: un electrodo auxiliar (electrodo de grafito) inmerso dentro de un
capilar de Luggin (conteniendo una solucin saturada de cloruro de potasio), un electrodo
de referencia (electrodo saturado de calomel), un electrodo de trabajo (cupn de acero al
carbn API XL 52), un difusor de nitrgeno (cuenta con un extractor de gases) y un
electrodo de pH; as como el orificio para inyeccin y toma de muestra. Toda esta
estructura (celda electroqumica) provee al sistema de condiciones de presin,
temperatura, esterilidad, hermeticidad y anaerobiosis para el crecimiento de las cepas.
60

En los ltimos aos se han implementado e incorporado nuevas tcnicas para la
evaluacin de la corrosin, sin embargo, el mtodo para la determinacin que ha
perdurado por su sencillez y bajo costo es el mtodo gravimtrico.
El procedimiento descrito por la NACE (RP0775-2005), el recomendado por la ASTM
(G 01-03 y 31-72) y el establecido por PEMEX (NRF-005-PEMEX-2000), se fundamentan en
el clculo de la prdida de peso de cupones metlicos debido a la corrosin. De tal forma
que para conocer la velocidad de corrosin por la tcnica gravimtrica se hizo lo siguiente:
Con la finalidad de obtener una superficie homognea se puli el cupn de
acero al carbn API XL 52 hasta lija No. 600 (papel de carburo de silicio).
El cupn se limpi con agua y detergente (en polvo) y se enjuag con agua
desionizada.
El cupn fue desengrasado con acetona por 5 minutos en un sonicador.
Se enroll el cupn en papel inhibidor (Protek Wrap de DAUBERT VCI,
INC.) y se mantuvo en un desecador por 24 horas.
Se registr el peso y rea del cupn.
Durante 720 h, se expuso el cupn al medio de cultivo Postgate C y a la
cepa G1-2007.
Finalizado el tiempo, se retir el cupn embebido en el medio de cultivo.
Se limpi el cupn con cido inhibido (HCl 100mL/L, SbO
3
2g/L y SnCl
2
5g/L),
para eliminar la biopelcula y los productos de corrosin formados durante
el tiempo de exposicin.
Se coloc inmediatamente el cupn en una solucin saturada de
bicarbonato de sodio para neutralizar al cido inhibido.
Se enjuag el cupn con agua desionizada para eliminar los productos
neutralizados, se sec con papel adsorbente libre de pelusas y se le dio una
ligera frotada con acetona.
Se enroll el cupn en papel inhibidor y se mantuvo en un desecador
durante 24 horas.
Nuevamente, se determin el peso del cupn.
Se determin la velocidad de corrosin del cupn.

61

Al mismo tiempo, un cupn de acero al carbn API XL 52 fue sometido a un sistema
electroltico, el cual fungi como blanco del sistema en estudio.
Para conocer la velocidad de corrosin de los cupones de acero al carbn API XL 52 se
emple la siguiente ecuacin:

Donde:
V
corr
= velocidad de corrosin en mpy.
K = factor de velocidad de corrosin, es de 2.227x10
4
(NACE RP0775-2005)
W = prdida de peso del material en gramos.
A = rea expuesta del material en pulgada cuadradas.
T = tiempo de exposicin en das.
D = densidad del material (7.86 g/cm
3
).

Existen diferentes unidades que han sido usadas para reportar los resultados de prdida
de peso, como son milmetros por ao (mm/y) o milsimas de pulgada de penetracin por
ao (mpy), pero normalmente se expresa en milsimas de pulgada de penetracin por ao
(mpy).

62

El criterio usado por la NACE (TM0169-2000) y por la ASTM (G 59-91) se basa en la
creacin de curvas de polarizacin y stas a su vez forman pendientes, las cuales estn
relacionadas con la velocidad de corrosin.
Tomando en consideracin las recomendaciones (NACE, ASTM y PEMEX) se realiz lo
siguiente:
Se verific el buen funcionamiento del potenciostato (marca Solartron,
modelo SI 1280B) con ayuda de un estndar (Dummy cell).
Se conectaron las terminales correspondientes a los electrodos de
trabajo (cupn de acero al carbn API XL 52), de referencia (ESC) y al
auxiliar (grafito).
El software utilizado para la adquisicin de datos fue el CorrWare.
Fue empleado el mtodo potenciodinmico para obtener la relacin E-i
(potencial y densidad de corriente).
Se obtuvo la relacin E-i aplicando un sobrepotencial de -10 a 10 mV
con respecto al potencial de corrosin, con una velocidad de barrido de
10 mV/min.
Se registraron 350 puntos por sesin.
Las mediciones fueron hechas cada 24 h por un lapso de 720 h.
Con ayuda del programa CorrView fueron visualizados y analizados los
datos electroqumicos.

63

Debido a que en un proceso electroqumico se puede deducir el comportamiento de la
interfase metal-solucin, la EIE ofrece mayor informacin del fenmeno de corrosin. El
siguiente protocolo se basa en el principio establecido por la NACE (1989) y por la ASTM
(G 106).
Para obtener informacin del desarrollo del proceso en la celda electroqumica se hizo lo
siguiente:
Con ayuda de un estndar (Dummy cell) se confirm el funcionamiento del
potenciostato (marca Solartron, modelo SI 1280B).
Se conectaron las terminales correspondientes a los electrodos de trabajo
(cupn de acero al carbn API XL 52), de referencia (ESC) y al auxiliar
(grafito).
Empleando el software ZPlot se obtuvieron valores electroqumicos.
Fueron realizados los diagramas de impedancia al potencial de corrosin
(E
corr
).
Se utiliz una amplitud en la seal sinusoidal de -10 a 10 mV con respecto
al E
corr
.
El intervalo de frecuencia utilizado fue de 10 KHz a 0.01 Hz.
Se registraron 61 puntos por sesin.
Las condiciones experimentales fueron a temperatura de 37 C y a presin
ambiental.
Las determinaciones se realizaron cada 24 h por 720 h.
El programa utilizado para la visualizacin, anlisis y modelacin de datos
electroqumicos fue el ZView.

64

6.13. Anlisis de las superficies metlicas
Hoy en da, la microscopia electrnica es una herramienta fundamental en muchas de las
investigaciones, cientficas, ya que su principal objetivo es conocer la microestructura de
cualquier material (Yacamn y Reyes, 1995).
Por la naturaleza de las muestras tratadas en esta investigacin se decidi utilizar el
microscopio electrnico de barrido (MEB). Este tipo de microscopio produce imgenes
con electrones, con radiaciones emitidas o reflejadas por el espcimen del mismo lado
que recibe el haz electrnico, de manera que generalmente se observa una superficie de
un objeto opaco al haz (Vazquez-Nin y Echeverra, 2000).
Para la obtencin de imgenes caractersticas relacionadas con el estudio electroqumico
se emplearon dos diferentes tipos de microscopio electrnico, siendo el primero de
barrido y el segundo de barrido ambiental (MEBA); la diferencia significativa que existe
entre los dos microscopios es que en el primero se introducen muestras secas mientras
que en el segundo se pueden colocar muestras hmedas; ya que el MEBA permite
controlar su cmara ambiental. Por tal razn, no es necesario dar un tratamiento a las
muestras para poder ser visualizadas en el microscopio.
Los cupones de acero al carbn API XL 52 que fueron sometidos al anlisis electroqumico
fueron observados en el MEBA antes y despus de cada ensayo electroqumico; mientras
que los cupones de acero al carbn API XL 52 que sustentaron las determinaciones
restantes fueron visualizados en el MEB.
Se utiliz un MEBA marca Philips Electronic Instruments modelo A XL 30 equipado con
un controlador de cmara ambiental. Las observaciones se realizaron al vacio, con una
aceleracin de voltaje de 25 kV y un lmite de resolucin de 3.5 nm.
El MEB empleado es de la marca JEOL, modelo JSM-58000 LV, con una aceleracin de
voltaje de 15 kV.
El procedimiento utilizado en el MEB se segment en dos fases (Bozzola y Russell, 1999).

65

1.- Antes de la prueba
Los cupones de acero al carbn API XL 52 previamente pulidos, limpiados y
desengrasados, fueron sujetados con cinta adhesiva conductora (carbn)
en un porta espcimen metlico y observados en el MEB.
Se tomaron micrografas a diferentes magnitudes.
2.- Despus de la prueba
Se retir el cupn de acero al carbn API XL 52 del ampovial de sacrificio e
inmediatamente se sumergi en la primera solucin fijadora durante dos
horas a 4 C.
La solucin fijadora fue glutaraldehdo al 2.5% (10 mL de glutaraldehdo al
25%, 90 mL de solucin amortiguadora de fosfatos y 0.5 mL de CaCl
2
al 1%
[1 g de CaCl
2
en 100 mL de agua desionizada]).
La solucin amortiguadora de fosfatos que se utiliz es la solucin
reguladora de Srensen y se prepar con 405 mL de solucin A (Na
2
HPO
4

28.4 g/L) y 95 mL de solucin B (NaH
2
PO
4
H
2
O 27.6 g/L); posteriormente se
afor a 1 L con agua desionizada.
Transcurrido el tiempo de la primera fijacin se realizaron a 4 C tres
lavados de 10 minutos cada uno con una solucin lavadora para eliminar el
exceso de gluteraldehdo.
La composicin de la solucin lavadora en 100 mL fue: 100 mL de solucin
amortiguadora de fosfatos, 10 g de sacarosa y 0.5 mL de CaCl
2
al 1% (1 g de
CaCl
2
en 100 mL de agua desionizada).
Se realiz una segunda fijacin con tetraxido de osmio al 1% por 2 horas a
4 C.
La postfijacin se lleva a cabo con una solucin de tetraxido de osmio al
1% (1 ampolleta de OsO
4
de 1 g en 100 mL de agua desionizada).
Finalizado el tiempo de la segunda fijacin, se hicieron tres lavados a 4 C
de 10 minutos cada uno con la solucin lavadora para eliminar el exceso del
tetraxido de osmio.
A los cupones se les realiz un tren de deshidratacin con alcohol etlico a
diferentes concentraciones (del 10 al 90%). La corrida consisti en
conservar los cupones en cada una de las concentraciones por 10 minutos a
4 C.
66

Para completar la deshidratacin, se realiz una serie de tres pasos; cada
paso estuvo conformado de una deshidratacin con alcohol etlico al 100%
durante 30 minutos a 4 C.
Para eliminar el alcohol etlico, se realiz un secado al punto crtico de los
cupones con CO
2
(licuefaccin del CO
2
), ya alcanzadas las condiciones de
temperatura (-120 C) y presin (1800 psi) se mantuvo en el secador
(secadora de punto crtico Marca tousimis research corporation modelo
Samdri-780B) por 40 minutos.
A los cupones se les recubri con una capa de oro en una ionizadora de
metales marca Denton Vacuum modelo Desk II.
Con mucho cuidado se evit desprender la pelcula de oro y se montaron
los cupones en el porta espcimen metlico con ayuda de una cinta
adhesiva conductora (carbn).
Se distinguieron diferentes caractersticas presentes en los cupones y se
tomaron micrografas a diferentes aumentos.

67

Las condiciones que se generan en el gasoducto permiten el desarrollo bacteriano, por lo
cual se origina una biopelcula sobre la superficie del metal base y, como es bien sabido, la
biocorrosin es dominada por la biopelcula generada por las bacterias. En la corrosin
inducida por microorganismos, a las bacterias adheridas al metal se les denomina
bacterias ssiles, mientras que las bacterias que se encuentran en el seno del lquido se
conocen como bacterias planctnicas. Siguiendo las recomendaciones establecidas por la
NACE (TM0194-2004) se pudo cuantificar la poblacin bacteriana, tanto ssil como
planctnica. El siguiente protocolo de estimacin bacteriana se realiz cada 72 horas
durante 720 h (Figura 8).

Figura 8. Dibujo emblemtico de la elaboracin de los ampoviales.

68

6.14.1. Bacterias planctnicas
Se retir un ampovial de sacrificio de la incubadora a 37 C.
El ampovial fue homogeneizado.
En los pasos subsecuentes se trabaj en condiciones de asepsia.
Con una jeringa estril de 3 mL, previamente purgada con nitrgeno estril
(filtro de 0.2m), se tom 1 mL del ampovial de sacrificio.
El mililitro fue inoculado en un ampovial de 10 mL de volumen nominal con
9 mL de medio de cultivo Postgate C.
Se sigui la tcnica del nmero ms probable con 3 series de 10 ampoviales
y en cada transferencia se ocup una jeringa estril previamente purgada
con nitrgeno estril.
Con ayuda de las tablas de la US FDA/CFSAN-BAM se determin el NMP de
bacterias planctnicas/mL.
6.14.2. Bacterias ssiles
Un ampovial con 9 mL de medio de cultivo Postgate C fue sometido por 5
minutos al proceso de desgasificacin en un bao ultrasnico.
De aqu en adelante, se realiz el proceso en condiciones de asepsia.
Se retir el cupn de acero al carbn API XL 52 del ampovial de sacrificio
que se extrajo 1 mL para la determinacin de bacterias planctnicas.
El cupn se introdujo inmediatamente en el ampovial desgasificado y
sometido a un bao ultrasnico por intervalos uno a uno de sonicacin-
descanso durante tres minutos para remover las bacterias adheridas al
cupn.
Con una jeringa estril de 3 mL se tom una alcuota (1 mL) de la
suspensin resultante de la ultrasonicacin.
Se inocul el mililitro en un ampovial de 10 mL de volumen nominal con 9
mL de medio de cultivo Postgate C.
Fue utilizada la tcnica del nmero ms probable con 3 series de 10
ampoviales, ocupando en cada transferencia una jeringa estril
previamente purgada con nitrgeno estril.
Mediante las tablas de la US FDA/CFSAN-BAM se determin el NMP de
bacterias ssiles/pulgada
2
.

69

6.15. Determinacin de la concentracin celular
Se cuantific la biomasa producida por la bacteria, tanto por peso seco como por
turbiedad.
6.15.1. Por peso seco:
Se utilizaron membranas de fibra de vidrio con dimetro de poro de 0.7 m
(GF/F marca Whatman), las cuales fueron secadas hasta peso constante,
en una estufa a 98 C.
Se registr el peso de cada membrana en una balanza analtica con poder
de resolucin de 0.0001 g (marca OHAUS).
Se filtraron 20 mL del sistema electroqumico (medio de cultivo-bacteria-
cupn de acero al carbn API XL 52), previamente filtrado con membranas
GF/A (dimetro de poro de 1.2 m).
Se dej secar la membrana durante 24 h a 98 C.
Transcurrido el tiempo de secado se volvi a pesar la membrana.
Se consider la diferencia de peso y el volumen filtrado y se obtuvo la
concentracin de la biomasa.
6.15.2. Por turbiedad:
Se emple un espectrofotmetro (Spectronic 20 de Milton Roy Company).
Se calibr el equipo a cero de absorbencia con el medio de cultivo Postgate
C.
Se tomaron 5 mL del ampovial filtrado en membranas GF/A.
Se ley la absorbencia de la muestra a 600 nm.
Cuando se presentaron valores de absorbencia mayores de 0.3 la
suspensin celular se diluy con agua desionizada, ya que la curva de
calibracin es lineal solo a valores inferiores a ste.
Considerando las diluciones se calcul la densidad ptica a 600 nm.

70

6.16. Determinacin de cidos orgnicos por cromatografa de gases (GC).
La cromatografa de gases tiene dos importantes campos de aplicacin, por una parte
sirve para separar mezclas orgnicas complejas, compuestos organometlicos y sistemas
bioqumicos. Su otra aplicacin es como mtodo para determinar cuantitativamente y
cualitativamente los componentes de la muestra. Para el anlisis cualitativo se suele
emplear el tiempo de retencin, que es nico para cada compuesto dadas determinadas
condiciones (mismo gas portador, rampa de temperatura y flujo), o el volumen de
retencin. En aplicaciones cuantitativas, integrando las reas de cada compuesto o
midiendo su altura, y utilizando los estndares adecuados se obtiene la concentracin o
cantidad presente de cada analito (Skoog y Leary, 1994).
Mediante la cromatografa de gases se determin la presencia y concentracin de los
cidos orgnicos: actico, butrico, frmico y lctico, por ser los metabolitos
caractersticos del genero Clostridium al que pertenece la bacteria esporulada aislada.
Para llevar a cabo la extraccin de cidos orgnicos presentes en el medio de cultivo de la
cepa G1-2007, se requiri un disolvente soluble en compuestos orgnicos y el ms
adecuado fue el acetato de etilo, por lo que se utiliz como agente extractor.
Fue importante conocer el punto de ebullicin ( 77 C) del agente extractor (acetato de
etilo/CH
3
COOCH
2
CH
3
/C
4
H
8
O
2
), as como de los estndares empleados para la realizacin
de la curva tipo, cido actico (CH
3
COOH/C
2
H
4
O
2
) con punto de ebullicin de 118 C, cido
butrico (CH
3
CH
2
CH
2
COOH/C
4
H
8
O
2
) con punto de ebullicin de 164 C, cido frmico
(HCOOH/CH
2
O
2
) con punto de ebullicin de 101 C y cido propinico
(CH
3
CH
2
COOH/C
3
H
6
O
2
) con punto de ebullicin 141 C. El punto de ebullicin es una
variable importante, ya que de l va a depender el grado de separacin de los diferentes
componentes de la muestra. Todos los estndares empleados son ChemService Inc., con
una pureza del 99% y el acetato de etilo es J.T. Baker grado cromatogrfico.
Como se puede ver en el prrafo anterior, los analitos (cidos) muestran diferentes puntos
de ebullicin y para que se pueda observar la elucin de todos los componentes de la
muestra, es necesario ajustar adecuadamente la temperatura de corrida. Debido a esto
se ajusta la temperatura en forma gradual, ya que mediante el gradiente de temperatura,
se permitir la separacin de cada componente y a esto se le llama rampa de
temperatura. Cabe mencionar que a temperaturas muy altas la velocidad de elucin es
ms alta pero se corre el riesgo de descomponer los analitos.

71

Por las caractersticas requeridas en esta determinacin (polaridad de la muestra), se
emple una columna capilar (de alto desempeo) polar, siendo la fase estacionaria
(composicin de la columna) polietilenglicol, el cual es muy til para separar compuestos
polares y de esta forma evidenciar los cidos orgnicos producidos por la cepa. La
columna empleada es de la marca Hewlett Packard (HP) y el modelo HP-INNOWax. Las
propiedades fsicas de la columna fueron: 30 m de longitud, dimetro interno de 0.53 mm,
espesor del recubrimiento de la pelcula de 1 m; cabe mencionar que este tipo y modelo
de columna es eficaz para determinar alcoholes, cidos libres, aromticos y aceites
esenciales.
Se utiliz un cromatgrafo de gases marca Perkin Elmer modelo AutoSystem XL
acoplado a un carrusel automuestreador, equipado con un detector de ionizacin de
flama (FID), un sistema de interfase PE Nelson modelo NCI 900 y un integrador de datos
(software) Turbo crom versin 4.1.
El gas portador usado fue el nitrgeno de ultra alta pureza de la marca PRAXAIR con una
presin 10 psi y un flujo de 30 mL/min.
Para el anlisis de las muestras por cromatografa de gases se procedi en la forma
siguiente:
Del ampovial de sacrificio empleado para la determinacin de la
concentracin celular, se tom una alcuota (2 mL) del filtrado con
membranas de fibra de vidrio GF/F.
En un embudo de separacin se colocaron los 2 mL junto con 2 mL de
acetato de etilo, se agit por 5 veces y se expuls el gas formado; se sigui
agitando 25 veces ms, se dej reposar por 2 minutos y se desecho la fase
inorgnica.
A la fase orgnica (acetato de etilo + cidos orgnicos), se le adicionaron
otros 2 mL de acetato de etilo, se agit por 5 veces y se expuls el gas
formado; se continu agitando 25 veces ms, se permiti la formacin de
las fases y se elimin la fase inorgnica. Con el propsito de saturar y
permitir la adicin de cidos orgnicos al agente extractor este paso se
repiti dos veces.
El extracto final fue depositado en dos tubos de 1.5 mL.
Se centrifugaron los dos tubos a 11000 x g por cinco minutos.
La suspensin obtenida fue decantada y colectada en otros dos tubos de
1.5 mL.
Los tubos fueron sellados con papel parafilm para evitar la volatilizacin de
los componentes.
72

Los tubos se mantuvieron en refrigeracin (4 C) hasta su anlisis por CG.
El cromatgrafo y la columna capilar fueron acondicionados por 12 horas.
Finalizado el acondicionamiento del equipo, las muestras se sacaron del
refrigerador y se atemperaron por 1 hora.
Las muestras fueron transferidas a tubos portamuestras, se sellaron y se
colocaron en el carrusel.
Para la reproducibilidad de los datos, se emple el automuestreador, el
cual inyect 1 L de cada muestra.
La temperatura del inyector fue de 160 C, con la finalidad de preparar a la
muestra, la cual va a entrar a la columna.
La muestra entr a la columna a una temperatura de 50 C por 2 minutos
seguido de una velocidad de incremento en la temperatura de 5 C/minuto
hasta alcanzar una temperatura de 180 C.
Conforme se separaron los analitos el detector FID los registr.
El integrador permiti visualizar los espectros cromatogrficos
caractersticos de la muestra y de los estndares.
Con ayuda del software se pudo comparar los espectros de las muestra y de
los estndares.
Se consider el tiempo de elucin y el rea de cada analito para la
realizacin de las curvas tipo y de esta forma se pudo determinar la
concentracin de cada analito.

73

6.17. Cupn de referencia adicionado de cidos orgnicos
En las determinaciones en donde se expuso el cupn de acero al carbn API XL 52 a la
accin de la cepa G1-2007, se observ corrosin de la estructura metlica, por lo que se
pretendi averiguar si los cidos orgnicos en el seno del liquido producidos por la
bacteria contribuyen al dao del metal.
Para hacer evidente la corrosin por acidez se hizo lo siguiente.
De los datos generados de la determinacin de cidos orgnicos por
cromatografa de gases, se consider la mayor concentracin de cidos
orgnicos formados por la cepa G1-2007.
Con base en estos resultados, se tom un cupn de acero al carbn API XL
52, previamente pulido a lija 600, limpio, desengrasado, a peso constante y
dimensionado; y fue introducido en un ampovial de sacrificio con medio de
cultivo Postgate C.
Al ampovial de sacrificio se le adicion cido actico para dar una
concentracin de 18 ppm y cido butrico para dar una concentracin de 24
ppm.
El ampovial fue homogeneizado con 25 movimientos circulares.
El ampovial fue incubado durante 720 h a 37 C (Figura 9).
Finalizado el tiempo de incubacin, se retir el cupn del ampovial de
sacrificio, se limpi con acido inhibido y se neutraliz con bicarbonato de
sodio.
Se enjuag el cupn con agua desionizada, se sec y se desengras con
acetona.
Se enroll el cupn en papel inhibidor y se mantuvo a peso constante por
24 horas.
Se registr el peso y se calcul la velocidad de corrosin inducida por
acidez.
El dao causado o el desgaste generado se visualiz por microscopa
electrnica de barrido.
En forma paralela se desarroll un cupn de referencia al que no se le
adicionaron cidos orgnicos.

74

Figura 9. Sistema de anaerobiosis para incubar los cupones de referencia y los
cupones de referencia adicionados de cido actico y cido butrico.

75

CAPTULO 7
RESULTADOS Y DISCUSIN
76

7. Resultados y Discusin
7.1. Identificacin de los microorganismos aislados de un gasoducto
7.1.2. Observacin microscpica de las cepas G1-2006 y G1-2007
La identificacin de las bacterias esporuladas aisladas del mismo sitio de un gasoducto con
un ao de separacin se inici con la observacin microscpica por contraste de fases
(100 x).
La morfologa microscpica mostr que los microorganismos son bacilos esporulados
(Figura 10), sin embargo, esta observacin directa no permiti diferenciar las
caractersticas de ambas cepas.

Figura 10. Morfologa microscpica de las bacterias aisladas (A) de la cepa
G1-2006 y (B) de la cepa G1-2007.
A

B

77

Con los frotes realizados a las cepas G1-2006 y G1-2007 se pudo definir que ambas
corresponden a bacilos esporulados Gram positivos.
Se verific con la prueba de aerotolerancia que las cepas G1-2006 y G1-2007 requieren
condiciones especiales de cultivo, ya que en condiciones de aerobiosis no hay crecimiento;
sin embargo, cuando se trabaj en condiciones de anaerobiosis el crecimiento fue bueno;
por lo que se deduce que las bacterias son anaerobios estrictos.

7.1.3. Identificacin de las cepas mediante ensayos bioqumicos
Con el uso de un sistema bioqumico convencional, es posible (Tabla 7) apreciar las
caractersticas diferenciales de las cepas G1-2006 y G1-2007 y con ayuda de la cepa de
referencia se puede identificar a las bacterias.
Tabla 7. Pruebas bioqumicas para identificacin de bacterias. Fermentacin de
carbohidratos.
Fermentacin de
carbohidratos
Cepa de referencia
ENCB 1040
G1-2006 G1-2007
Adonitol - + +
Almidn - - -
Arabinosa - + +
Celobiosa - - -
Dulcitol - - -
Esculina - + +
Fructosa - + +
Galactosa - + +
Glicerol - - -
Glucosa - + +
Inulina - - -
Lactosa - + +
Maltosa - + +
Manitol - + +
Manosa - + +
Melibiosa - + +
Rafinosa - + +
Ramnosa - + +
Ribosa - + +
Sorbitol - - -
Trehalosa - + +
Xilosa - + +
78

Tabla 8. Pruebas enzimticas para identificacin de bacterias.
Actividad
enzimtica
Cepa de referencia
ENCB 1040
G1-2006 G1-2007
Catalasa - - -
Lecitinasa - - -
Digestin de la
carne cocida
+ - -
Digestin y cogulo
de la leche
+ + +
Hidrlisis de la
casena
+ - -
Licuefaccin de la
gelatina
+ + +
Lipasa - - -
Produccin de indol - + +
Reduccin de
nitratos
- - -
Ureasa - - -

Con los resultados anteriores, se pudo conocer el perfil bioqumico (Tabla 7) y el perfil
enzimtico (Tabla 8), lo que permiti identificar a las bacterias usando la base de datos de
los manuales de anaerobios obligados y Bergey, as como en los libros de diagnstico
microbiolgico, en donde se puede apreciar el comportamiento de cada gnero y especie.
Las dos cepas ensayadas mostraron el mismo perfil bioqumico y enzimtico, entre s, y
diferente al de la cepa de referencia. De acuerdo con los resultados stas se pudieron
clasificar como:
Identificacin Cepa de referencia
ENCB 1040
G1-2006 G1-2007
Especie Clostridium
subterminale

Clostridium
celerecrescens
Clostridium
celerecrescens

Al finalizar el anlisis bioqumico fue revelada la informacin del tipo de cepa de
referencia utilizada en el ensayo bioqumico, la cual es una cepa de coleccin, identificada
como ATCC 29748.
79

Aparentemente, la cepa G1-2007 es la misma que se aisl un ao antes en el mismo
gasoducto, sin embargo, es necesario confirmar su identidad mediante el anlisis de su
material gentico, es decir, recurrir a tcnicas moleculares.
7.1.4. Identificacin de las cepas empleando tcnicas moleculares
7.1.4.1. Aislamiento de DNA.
Debido a las condiciones de crecimiento de las cepas, fue un requisito demostrar la
extraccin del DNA, ya que los productos de corrosin y las sustancias polimricas
extracelulares formadas durante el proceso de biocorrosin (Geesey, 2000) suelen ser un
factor determinante en la obtencin de DNA, por tal motivo, se verific la extraccin de
DNA de las cepas G1-2006 y G1-2007.
En la Figura 11 se muestra la fotografa del electroferograma del DNA sometido a
electroforesis en gel de agarosa. Las bandas reveladas son ntidas demostrando que el
mtodo de extraccin (lisis qumica con la adicin de lisozima) de DNA fue adecuado para
estas cepas.

Figura 11. Fotografa del electroferograma en gel de agarosa al 1% del DNA
extrado de las cepas.
Carril 1.- DNA de la cepa G1-2006.
Carril 2.- DNA de la cepa G1-2007.
1 2

80

7.1.4.2. Amplificacin de un fragmento del 16S rDNA y TGGE
Para evaluar la pureza de las cepas y la similitud entre ellas, se extrajo el DNA de cada
cultivo y se amplificaron fragmentos de DNA de, aproximadamente, 450 pb del 16S rDNA
con los iniciadores U968 y L1401 y se visualizaron por electroforesis en gel de agarosa
(Figura 12). Posteriormente, los fragmentos de DNA se analizaron mediante una
electroforesis en gel con gradiente de temperatura (TGGE).
El perfil electrofortico obtenido (Figura 13) mostr una sola banda con migracin similar,
lo que denota que los cultivos estn formados por una sola especie y, debido a que la
TGGE es una tcnica presuntiva, se puede presumir que se trata del mismo
microorganismo.

Figura 12. Electroferograma en agarosa de los amplicones de 470 pb del 16S rDNA
de los cultivos G1-2006 y G1-2007.
Carril 1.- Marcador de peso molecular (100 bp DNA Ladder).
Carril 2.- Amplicn del DNA del cultivo G1-2006.
Carril 3.- Amplicn del DNA del cultivo G1-2007.

1 2 3
600 pb
470 pb
81

Figura 13. Resultados de la electroforesis en gel con gradiente de temperatura
(TGGE) de un fragmento del 16S rDNA de los cultivos.
Carril 1.- Amplicn del cultivo G1-2006.
Carril 2.- Amplicn del cultivo G1-2007.

La comigracin sera un indicador de que la secuencia de bases en el fragmento
amplificado es la misma, ya que, de acuerdo con algunos autores (Maniatias y col., 1982;
Malacinski, 2003) la diferencia en una sola base presentara un corrimiento distinto. Sin
embargo, se ha observado que amplicones procedentes de diferentes gneros presentan
la misma velocidad de migracin; por lo que es necesario recurrir a otras alternativas
como la obtencin de la huella digital por anlisis de restriccin del 16S rDNA.

1 2

470 pb
82

7.1.4.3. Anlisis de restriccin del 16S rDNA amplificado (ARDRA)
El 16S rDNA de las cepas G1-2006 y G1-2007 se amplific empleando los iniciadores 8FLP y
13B, seguido de una purificacin del DNA amplificado, el cual se someti a una digestin
enzimtica con las enzimas de restriccin Alu1, Eco R1 y Mbo1. Finalmente, el DNA
digerido se separ en un gel de poliacrilamida al 17% para obtener una banda o bandas
caractersticas de las cepas.
Al comparar las bandas caractersticas de cada una de las cepas, se evidencio el patrn
electrofortico, el cual fue idntico para ambas cepas, con las diferentes enzimas de
restriccin.

Figura 14. Patrn electrofortico del anlisis de restriccin del 16S rDNA de las
cepas G1-2006 y G1-2007.
Carril 1.- Marcador de peso molecular.
Carril 2.- 16S rDNA de la cepa G1-2006 digerido con Alu1, Eco R1 y Mbo1.
Carril 3.- 16S rDNA de la cepa G1-2007 digerido con Alu1, Eco R1 y Mbo1.
Carril 4.- 16S rDNA de la cepa G1-2006 digerido con Alu1 y Eco R1.
Carril 5.- 16S rDNA de la cepa G1-2007 digerido con Alu1 y Eco R1.

1 2 3 4 5
5
83

Como se puede apreciar (Figura 14), en los dos primeros carriles despus del marcador de
peso molecular, se emple una mezcla de tres enzimas de restriccin; de igual manera en
los ltimos dos carriles se utiliz una mezcla con dos enzimas de restriccin. Estas mezclas
propiciaron un perfil nico de identidad para ambas cepas, ya que el ARDRA se basa en la
generacin de patrones de bandas, cuyo nmero y tamao depende de la presencia o
ausencia de sitios de restriccin al interior del gen 16S rDNA (Massol y col., 1997).
Consecuentemente, los resultados obtenidos por el ARDRA, permitieron establecer que se
trata de la misma cepa, ya que el mapa de restriccin es el mismo cuando se utilizan los
dos juegos de enzimas de restriccin.

84

7.1.4.4. Anlisis del DNA polimrfico amplificado aleatoriamente (RAPD)
Una alternativa ms para corroborar los resultados encontrados de todo el anlisis
molecular es mediante la amplificacin inespecfica (RAPD). En este caso se utiliz el DNA
total de la bacteria y se amplific utilizando iniciadores inespecficos (1283 y 1290). Para
ambas cepas, el producto generado de la amplificacin fue igual, lo que revel que son de
la misma especie. La electroforesis reflej una analoga muy especfica entre las bandas
obtenidas (Figura 15) de las dos cepas y con este argumento se presume que se trata de la
misma cepa.

Figura 15. Patrn electrofortico del RAPD.
Carril 2.- Cepa G1-2006.

1 2 3
600 pb
85

7.1.4.5. Secuenciacin del gen 16S rDNA
Con base en los resultados obtenidos de la TGGE, en donde se observ una sola banda
para cada una de las cepas, se procedi a amplificar el DNA de cada microorganismo con
los iniciadores 8FLP y 13B, obtenindose amplicones que se purificaron y se sometieron a
una electroforesis en gel de agarosa al 1% para verificar su presencia y pureza.

Figura 16. Electroferograma en gel de agarosa de los amplificados del 16S rDNA de
las cepas.
Carril 1.- Amplicn de la cepa G1-2007.
Carril 2.- Amplicn de la cepa G1-2006.

Se cuantific el DNA de ambas cepas espectrofotomtricamente, leyendo absorbencia a
260 nm. Para la cepa G1-2006 se tuvo una concentracin de DNA de 95 g/mL y para la
cepa G1-2007 fue de 98 g DNA/mL.

1 2 3
600 pb
86

Posteriormente, los amplicones de aproximadamente 1400 pb, se secuenciaron en el
Laboratorio de Biologa Molecular del Instituto de Biologa de la Universidad Autnoma de
Mxico.
Una vez obtenidas las secuencias, se procedi a comparar cada una de estas en la base de
datos del Gen Bank de la NCBI, lo que permiti identificar al microorganismo esporulado
persistente en el gasoducto y posiblemente asociado al proceso de corrosin (Tabla 9).
Tabla 9. Microorganismos identificados por secuenciacin de un fragmento del 16S
rDNA.
Cepa Iniciadores Nombre cientfico Identidad Clave de acceso
G1-2006 8FLP y 13B Clostridium
celerecrescens
99 % X71848
G1-2007 8FLP y 13B Clostridium
celerecrescens
99 % X71848

Los resultados obtenidos de la secuenciacin indicaron que se trata de la misma bacteria,
por lo que se concluye que debido a su residencia y persistencia en los ductos las cepas
G1-2006 y G1-2007 resisten ambientes agresivos.

87

7.1.4.6. Perfil de plsmidos
En lo que se refiere a la determinacin de plsmidos, se obtuvo el mismo resultado con las
dos tcnicas probadas, lisis alcalina (Figura 17) y kit de extraccin de plsmidos (Figura
18). En ambos casos, en las electroforesis en gel de agarosa al 0.7% no se registr
evidencia alguna de la presencia de plsmidos.

Figura 17. Perfil electrofortico de la cuantificacin de plsmidos mediante la
prueba de lisis alcalina de las cepas G1-2006 y G1-2007.
Carril 1.- Marcador de peso molecular.
Carril 2.- Cepa de referencia.

1 2 3 4
23.1 kpb
2.3 kpb
88

Figura 18. Electroferograma correspondiente a las cepas G1-2006 y G1-2007 con
ayuda del kit para extraccin de plsmidos.
Carril 1 y 15.- Marcador de peso molecular.
Carril 2, 3 y 4.-. Cepa G1-2006.
Carril 5, 6 y 7.- Cepa G1-2007.
Carril 9, 10, 11, 12 y 13.- Cepa de referencia.

Con base en los productos obtenidos del corrimiento electrofortico, en los que no se
present indicio alguno de la presencia de plsmidos, se concluye que toda la informacin
gentica de las cepas G1-2006 y G1-2007 reside en el genoma.
Todos los estudios posteriores se realizaron con la cepa etiquetada como G1-2007 y
referida como Clostridium celerecrescens.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
89

7.2. Cintica de crecimiento, consumo de sulfatos, produccin de H
2
S y de fierro
total
Con el propsito de conocer su comportamiento y establecer un sistema de trabajo
(medio de cultivo ms adecuado para su desarrollo) se determin el consumo de sulfatos,
la produccin de H
2
S y fierro total e indirectamente el crecimiento celular de
C. celerecrescens, expuesto al cupn de acero al carbn API XL 52 y en diferentes medios
de cultivo.
7.2.1. Seleccin del medio de cultivo para los estudios de corrosin
Cuando se probaron los medios de cultivo API RP 38, Bold basal modificado y el Postgate
C (Figura 19) para el crecimiento de C. celerecrescens en presencia del cupn de acero al
carbn API XL 52, el microorganismo present curvas de crecimiento caractersticas, en
donde se presentaron las diferentes fases del comportamiento bacteriano y en la fase
exponencial se determin la velocidad especfica de crecimiento mximo (
mx
). En el
medio de cultivo Postgate C se obtuvo una
mx
de 0.0048 h
-1
, en el medio de cultivo API
RP 38 una
mx
de 0.0037 h
-1
y en el medio de cultivo Bold basal modificado una
mx
de
0.0031 h
-1
. Es importante mencionar que la
mx
se obtuvo a partir de los logaritmos
naturales del nmero ms probable de bacterias por mililitro en cierto perodo. Con base
en estos resultados, se eligi el medio de cultivo ms adecuado para el desarrollo de la
bacteria y ste fue el medio de cultivo Postgate C.

Figura 19. Cintica de crecimiento de C. celerecrescens en diferentes medios de cultivo.
90

Es claro que la
mx
es un respuesta a las variables ambientales, entre stas, la
composicin del medio de cultivo, por lo que resulta lgico que la mayor velocidad
especifica de crecimiento se obtenga en el medio Postgate C, que es un medio rico
adecuado para el crecimiento de bacterias, mientras que el medio API RP 38 es un medio
de sostenimiento y selectivo para un grupo determinado de bacterias (BRSs = bacterias
reductoras de sulfato); mientras que el de Bold basal es un medio rico para desarrollo de
bacterias, pero al ser modificado, est limitado en sus nutrientes (Balows y col., 1992; Holt
y col., 1994).
En la literatura se han reportado diversas investigaciones en donde hacen uso del medio
de cultivo Postgate C, las cuales estn enfocadas al estudio de las bacterias reductoras de
sulfato (Mora y col., 2003; Galvn y col., 2003; Duque y col., 2004); sin embargo, hay poca
informacin para otro tipo de gneros, por lo que resulta inapropiado para este anlisis
utilizarlos como punto de referencia o comparacin.
El comportamiento obtenido por C. celerecrescens en los tres diferentes medios de cultivo
es muy similar al obtenido en el estudio de bacterias reductoras de sulfato (Mora y col.,
2003; Galvn y col., 2003; Duque y col., 2004). En esas investigaciones consideran el uso
de cepas de referencia, que por lo general es Escherichia coli, la cual es una bacteria no
reductoras de sulfato. En la comparacin, el desarrollo de C. celerecrescens es anlogo al
de una BSR, aunque las concentraciones alcanzadas son inferiores por varios rdenes de
magnitud (Hernndez y col., 2004).
Se realizaron 10 rplicas de cada dilucin, lo que permiti tener cierta exactitud en los
datos obtenidos, ya que el mtodo del nmero ms probable (NMP) da una sensibilidad
con el 95% de confianza en sus resultados (US FDA/CFSAN-BAM, 2006).

91

4
2-
y produccin de S
=
en medio de cultivo API RP 38.

4
2-
y produccin de S
=
en medio de cultivo Bold basal modificado.
92

4
2-
y produccin de S
=
en medio de cultivo Postgate C.

7.2.2. Consumo de sulfatos
En lo que respecta al consumo de SO
4
2-
, C. celerecrescens caus una disminucin
considerable de sulfatos; no obstante, estos valores no pueden ser equiparables con los
obtenidos con una BSR; ya que sta por su naturaleza asimila casi el 100% de sulfatos
disponibles a su alrededor (Colleran y col., 1995; Hulshoff y col., 1998), pero si puede
compararse en cuanto a la trayectoria del consumo de sulfatos seguida por una BSR
(Galushko y col., 1999; Imachi y col., 2006). El mayor consumo de SO
4
2-
se present en el
medio de cultivo Postgate C (Figura 22), seguido del medio de cultivo API RP 38 (Figura 20)
y, por ltimo, el medio de cultivo Bold basal modificado (Figura 21).

93

7.2.3. Produccin de sulfuros
Como era de esperarse, C. celerecrescens, no mostr una produccin de S
=

estequiomtrica con respecto a la disminucin de sulfatos, ya que en medio de cultivo
Postgate C (Figura 22) alcanz un valor mximo de 30 ppm, en medio de cultivo API RP 38
(Figura 20) alcanz un valor mximo de 17 ppm y en medio de cultivo Bold basal
modificado (Figura 21) de 8 ppm. Estos valores de produccin de sulfuro son bajos al
compararse con los obtenidos con BRSs, las que presentan un amplio rango de
produccin, tal es el caso de las especies de Desulfotomaculum con 50 ppm de sulfuros
(Min y Zinder, 1990) o las especies Desulfovibrio (Desulfovibrio desulfuricans) con 230 ppm
de sulfuros (Okabe y col., 1995) o, en general, para las BRSs que arrojan valores de 80
ppm de sulfuros (Widdel, 1988), 400 ppm de sulfuros (Nazina y col., 1987), 500 ppm de
sulfuros (Reis y col., 1992) o hasta 1000 ppm (Duque y col., 2004). Por lo anterior podra
considerarse a C. celerecrescens como una bacteria productora de sulfuros dbil.
Es evidente, por las caractersticas metablicas presentadas, que C. celerecrescens es una
bacteria reductora dbil de sulfatos, sin embargo, no est considerado como BSR, es por
eso que surge la necesidad de reclasificar a las bacterias en gneros ms acordes con sus
propiedades funcionales, ya en 1997 Stackebrandt y colaboradores (1997) reclasificaron a
una BSR y propusieron la reclasificacin de bacterias Gram positivas, as como en el 2006
(Lpez y col., 2006) se dio la reclasificacin de una bacteria reductoras de sulfato
(Desulfovibrio oxamicus).
7.2.4. Formacin de fierro total en el medio de cultivo
Ahora bien, con el otro producto, Fe
2+
, derivado de la accin de C. celerecrescens hacia el
cupn de acero al carbn API XL 52, se obtuvo una concentracin mxima de fierro total
de 40 ppm en medio de cultivo Postgate C, de 35 ppm de fierro total en medio de cultivo
API RP 38 y de 15 ppm de fierro total en medio de cultivo Bold basal modificado. Sin
embargo, la concentracin de fierro total no es proporcional a la produccin de sulfuros
(Parkin y col., 1990), pero si es un indicativo del dao causado al metal (Hamilton, 1998),
ya sea mediante desgaste, desprendimiento o prdida de alguna fraccin del cupn
corrosimtrico (Lee y Newman, 2003). Lo ms probable es que el fierro se encuentre en
solucin o como sulfuros o como xidos, y estos ltimos son muy evidentes, ya que se
aprecian como precipitados (Hutchens y col., 2007).
Por todo lo anteriormente descrito y por los resultados encontrados, se seleccion al
medio de cultivo Postgate C como medio de cultivo base para todas las determinaciones,
adems de ser el medio de referencia para las pruebas electroqumicas (Mora y col., 2003;
Hernndez y col., 2005).
94

7.3. Produccin de cidos orgnicos
Una vez que se seleccion el medio de cultivo para realizar los experimentos de corrosin,
se consider pertinente determinar la produccin de cidos orgnicos, ya que el gnero
Clostridium es, en general, productor de cidos, que tambin contribuyen en los procesos
de corrosin.
Los resultados mostrados en la Figura 23 indican que por lo menos se generan dos cidos:
actico (tiempo de elucin de 11.85 minutos) y butrico (tiempo de elucin de 16.2).

Figura 23. Cromatogramas de productos metablicos de C. celerecrescens junto
con los perfiles de los estndares de cido actico y cido butrico. Las muestras se
tomaron a diferentes tiempos (504, 672, 840 y 1008 h) de cultivo.

95

En los tiempos de elucin del cido frmico y del cido lctico no se detect seal de las
muestras tomadas del ampovial retirado a los diferentes tiempos. En la misma figura
(Figura 23) se puede apreciar el incremento de la concentracin del cido actico y cido
butrico en funcin del tiempo.
Los perfiles para la determinacin cuantitativa se presentan en la Figura 24. En las dos
primeras semanas no se presenci la formacin de cidos orgnicos, sino hasta la tercer
semana en donde aparecieron pequeas crestas a los tiempos de 11.85 y 16.2 con una
concentracin de cido actico de 1.2 ppm y 2.7 ppm de cido butrico, alcanzando un
mximo a las seis semanas de 18 ppm de cido actico y 24 ppm de cido butrico.

Figura 24. Determinacin cromatogrfica de la concentracin de cido actico
(Tr = 11.85) y cido butrico (Tr = 16.2) de las muestras del cultivo de
C. celerecrescens.

96

Como se puede ver en los cromatogramas (Figuras 23 y 24), C. celerecrescens es capaz de
producir tanto cido actico como cido butrico. A manera de comparacin, se
encontraron en la literatura tres especies del gnero Clostridium, los cuales producen
cidos orgnicos similares a los que excreta C. celerecrescens; como primer ejemplo, se
tiene a C. aceticum, que produce cido actico (Cato y col., 1986; Balows y col., 1992; Holt
y col., 1994; During, 1997), as como el C. butyricum, que genera cido butrico (Cato y
col., 1986; Balows y col., 1992; Holt y col., 1994) y, por ltimo, C. acetobutyricum con la
formacin de cido actico y cido butrico (Cato y col., 1986; Balows y col., 1992; Holt y
col., 1994). Esta ltima bacteria es la ms prxima metablicamente a C. celerecrescens,
ya que genera los mismos cidos orgnicos. Sin embargo, en la literatura consultada no se
tiene registrada la cantidad o concentracin de cidos formados por estas bacterias.
A la par de la cuantificacin de cidos orgnicos se registraron la acidez total y el pH. En la
Figura 25 se observa que la acidez total generada por C. celerecrescens se increment
gradualmente en funcin del tiempo y, por consiguiente, el pH disminuy; lo cual
concuerda con la acumulacin de cidos producidos por la bacteria (Figura 23).

Figura 25. Produccin de acidez total y pH en funcin del tiempo del cultivo de
C. celerecrescens en el medio Postgate C.
97

Es importante no perder de vista que las mediciones se hicieron en el seno del lquido,
donde la concentracin de los metabolitos es inferior al que se tiene en el interior de la
biopelcula del cupn de corrosin; por lo que se consider primordial medir el
crecimiento de C. celerecrescens tanto en el seno del lquido (clulas planctnicas) como
en la superficie del cupn metlico (clulas ssiles).

La cintica de crecimiento de las bacterias planctnicas y ssiles se muestra en la Figura
26.

Figura 26. Cintica de crecimiento de las bacterias planctnicas y ssiles en el cultivo de
C. celerecrescens durante la evaluacin de la corrosin inducida por microorganismos.

98

El comportamiento cintico de las bacterias adheridas a la superficie del cupn (ssiles),
permitieron corroborar la afinidad que presenta C. celerecrescens ante una superficie
metlica de acero al carbn. Cabe mencionar que en las primeras horas,
aproximadamente 144 h, las bacterias ssiles no colonizan la superficie del cupn y esto
se ve reflejado en una pronunciada fase de adaptacin, pero, una vez concluida esta fase,
las bacterias ssiles empiezan a saturar la superficie del cupn y comienzan a desarrollar
un crecimiento acelerado en toda el rea del cupn y es en este momento donde empieza
a formarse una biopelcula de bacterias ssiles alrededor del cupn (Figura 27). Una vez
finalizada la saturacin del cupn, las bacterias ssiles empiezan a decaer por la falta de
soporte y por el inadecuado suministro de nutrimentos a la biopelcula (Marshall, 1997).
La contraparte de las bacterias ssiles son las bacterias que se encuentran libremente en
la fase acuosa (planctnicas), las cuales presentaron un comportamiento cintico clsico al
de una curva de crecimiento microbiano, con una pequea fase de adaptacin, con un
crecimiento activo y una fase de desaceleracin, logrando un equilibrio con las bacterias
ssiles (Zintel y col., 2001).
Se evalu la velocidad mxima de crecimiento, tanto para las bacterias planctnicas, como
para las bacterias ssiles, siendo la
mx
de 0.0049 h
-1
para las planctnicas y una
mx
de
0.0088 h
-1
para las ssiles. Es evidente que las bacterias crecieron ms rpido en la
biopelcula adherida a la superficie metlica, lo cual explica una alta concentracin de
microorganismos en el cupn y esto se refleja en el dao generado al acero al carbn API
XL 52.

99

Figura 27. Imagen obtenida por microscopa electrnica de barrido de la
biopelcula formada por C. celerecrescens durante la evaluacin de la corrosin por
microorganismos.
100

La corrosin inducida por microorganismos se debe a la actividad metablica de
stos, por lo que ser mayor en las superficies donde crece la biopelcula, puesto
que los productos metablicos se encuentran ah en mayor concentracin que en
el resto del sistema. Sin embargo, los metabolitos capaces de daar la superficie
metlica, pueden difundir y llegar a zonas donde no hay formacin de biopelcula
y, aunque su concentracin suele ser menor, tambin podran causar corrosin.
Por esta razn se consider conveniente evaluar la corrosin causada por los
cidos orgnicos producidos por C. celerecrescens (actico y butrico) en las
concentraciones que se alcanzaron en el seno del lquido.
7.5. Evaluacin gravimtrica de la biocorrosin y de la corrosin abitica con adicin de
cidos orgnicos
Con el propsito de evaluar la contribucin de los cidos orgnicos producidos por
C. celerecrescens en el proceso de corrosin se emplearon dos sistemas: el primero de
ellos estaba destinado a medir la corrosin inducida por microorganismos, por lo tanto se
incub a C. celerecrescens por seis semanas en medio Postgate C y en compaa del cupn
de acer al carbn API XL 52. En el segundo sistema, se consideraron los resultados
obtenidos en la determinacin de produccin de cidos orgnicos generados por la
bacteria (cido actico y cido butrico, con una concentracin mxima en seis semanas de
18 ppm y 24 ppm respectivamente), ya que se pretendi averiguar el efecto que causa el
cido actico y el cido butrico a la superficie metlica (cupn de acero al carbn API XL
52). Este sistema fue idntico al primero, ya que se incub en las mismas condiciones de
temperatura, de medio de cultivo y del mismo tipo de cupn, pero la diferencia en
comparacin con el primer sistema radic en la sustitucin del microorganismo por la
adicin de 18 ppm de cido actico y de 24 ppm de cido butrico y as poder visualizar la
corrosin que causan estos cidos. El testigo del experimento se realiz en las mismas
condiciones slo que no incluy microorganismos ni adicin de los cidos orgnicos.
Con los resultados de velocidad de corrosin obtenidos (Figura 28) se puede concluir que
la contribucin a la corrosin de los cidos orgnicos producidos por la bacteria y
difundidos al seno del lquido, aunque es importante, es mucho menor a la ocasionada por
la biopelcula formada en la superficie del cupn. Estos resultados podran explicarse en
trminos de concentracin de estos metabolitos y la presencia de otros no evaluados en
este experimento, como es el H
2
S cuyo papel en el fenmeno de corrosin est bien
documentado (Bardal, 2004; Perez, 2004).
101

Figura 28. Velocidades de corrosin de los cupones metlicos en el sistema bitico (-), en
el sistema abitico adicionado de cidos orgnicos (-) y en el sistema de referencia
(testigo) (-).

7.6. Observaciones al microscopio electrnico de barrido de los cupones sometidos a
corrosin
Por microscopa electrnica de barrido se observ el tipo de dao causado en la superficie
metlica, tanto en el sistema abitico adicionado de cidos orgnicos (Figura 30), como en
el sistema que a C. celerecrescens (Figura 29) en un lapso de seis semanas.
El anlisis microscpico permiti corroborar lo determinado por la tcnica gravimtrica
con las siguientes precisiones: en el sistema adicionado de cido actico y cido butrico la
corrosin fue generalizada en toda la superficie del cupn (Figura 30); mientras que en el
sistema con biopelcula se present el dao localizado (Figura 29). Asmismo, se visualiz
la formacin de la biopelcula, la cual se fue incrementando en funcin del tiempo de
incubacin (Figura 29).

102

Primera semana Tercera semana Sexta semana
z
T

Figura 29. Observacin microscpica de la biopelcula (P) y de la biocorrosin (B), as como
de los testigos (referencias) (R) de los cupones de acero al carbn API XL 52 para el sistema
que explica la corrosin inducida por microorganismos.

R

P

B

103

Referencia Problema adicionado de cidos orgnicos

Figura 30. Observacin microscpica de la corrosin de los cupones de acero al
carbn API XL 52, tanto para el sistema abitico adicionado de cido actico y de
cido butrico, como para sus respectivos testigos (referencias) en funcin de las
seis semanas de incubacin.

1

3

6

S
e
m
a
n
a
s

6
104

7.7. Determinacin de la velocidad de corrosin inducida por C. celerecrescens
Con los resultados de la tcnica gravimtrica se pudo establecer la prdida de peso que sufri el
cupn de acero al carbn API XL 52 en presencia y ausencia de C. celerecrescens durante la
prueba.
Tabla 10. Velocidades de corrosin para el cupn de acero al carbn API XL 52 expuesto a
tres diferentes medios de cultivo (API RP 38, Bold basal modificado y Postgate C) en
presencia de C. celerecrescens obtenidas por gravimetra.
Sistema Velocidad de
corrosin
(mpy)
Medio API RP 38 + cupn de acero al carbn API XL 52 1.68
Medio API RP 38 + cupn de acero al carbn API XL 52 + C clerecrescens 5.73
Medio Bold basal modificado + cupn de acero al carbn API XL 52 1.35
Medio Bold b.m. + cupn de acero al carbn API XL 52 + C clerecrescens 5.11
Medio Postgate C + cupn de acero al carbn API XL 52 1.38
Medio Postgate C + cupn de acero al carbn API XL 52 + C clerecrescens 5.48

Es evidente que los valores de la velocidad de corrosin obtenidos por sta tcnica son
considerablemente mayores para los sistemas compuestos por C. celerecrescens que para los
sistemas de referencia (ausencia del microorganismo); lo cual sugiere que el microorganismo
aporta una variable ms en el sistema. Mediante estos resultados (Tabla 10) se puede conocer
cul es el medio de cultivo ms agresivo o activo para la superficie de acero al carbn API XL 52 e
indirectamente da informacin de la actividad microbiana.
La NACE (RP0775-2005) categoriza el tipo de dao causado a las superficies de acero al carbn
empleadas en la industria petrolera en bajo, moderado, alto y severo; por lo que, interpolando los
valores obtenidos para los sistemas de referencia, se consideran de bajo a moderado y para los
sistemas con C. celerecrescens se clasifican de moderado a alto. Con base en estos resultados, se
establece que la funcin del microorganismo influye en una prdida considerable del material
base del cupn (API XL 52).
Con este ensayo gravimtrico se estim la susceptibilidad del acero al carbn API XL 52 a sufrir un
ataque tanto qumico (sistemas de referencia) como biolgico (sistemas con el microorganismo),
sin embargo, esta tcnica considera que la velocidad de corrosin es uniforme y no de forma
puntual o localizada que es la que se presenta en la biocorrosin (Beech y Sonner, 2004).

105

7.8. Determinacin de la velocidad de corrosin por tcnicas electroqumicas, Rp
y EIE

Se evalu la resistencia a la polarizacin (Figura 31) mediante las curvas de polarizacin.
Tomando en cuenta que existe una relacin lineal entre el potencial y la corriente aplicada
(ASTM G 59-91). Se obtuvo la resistencia a la polarizacin (Figura 31) y, por aplicacin de
los principios de Stern-Geary, se determin la velocidad de corrosin (V
corr
) (Figura 32).

Figura 31. Resistencia a la polarizacin para el sistema de referencia y para el de
C. celerecrescens en funcin del tiempo.
106

Figura 32. Evaluacin en funcin del tiempo de la velocidad de corrosin del acero
al carbn API XL 52 para ambos sistemas, tanto para el de referencia, como para el
de C. celerecrescens, estimada por medida de la resistencia a la polarizacin.

Haciendo una comparacin entre ambas mediciones, se puede apreciar que son
inversamente proporcionales; por lo que conociendo el comportamiento que tuvo la
prueba de Rp, automticamente se deduce cul es la tendencia de la V
corr
.
La velocidad de corrosin (Figura 32) determinada en el sistema de referencia disminuy
conforme transcurra la prueba, presentando un valor inicial de 11 mpy; el cual fue
decayendo constantemente hasta 0.5 mpy a un tiempo de 168 h; despus de este lapso la
V
corr
se estabiliz hasta valores prximos a 0.2 mpy. En lo que se refiere al sistema que
incluye a la bacteria, la velocidad de corrosin tom un rumbo muy similar al de
referencia en las primeras 360 h, posteriormente la V
corr
se increment en el intervalo de
384 a 792 h hasta alcanzar un valor de 5 mpy.

107

Cabe mencionar que ambos sistemas presentaron al inicio de la determinacin
velocidades de corrosin altas (Figura 32), lo cual es atribuido a la composicin del medio
de cultivo utilizado (Postgate C), que es rico en iones, especficamente, aniones, como, Cl
-
,
SO
4
=
y S
=
. Sin embargo, conforme transcurri la prueba electroqumica, en ambos
sistemas, se forman productos de corrosin en la superficie del cupn de acero al carbn
API XL 52, dando lugar a una pelcula que puede ser protectora, por lo que se disminuye el
rea del electrodo de trabajo y as se da una disminucin en la V
corr
. En el sistema que
incluye a C. celerecrescens la bacteria coloniza el cupn despus de varias horas de
incubacin, formando una biopelcula adherida a la superficie metlica (bacterias ssiles)
donde secretan metabolitos agresivos al cupn, favoreciendo el ascenso de la velocidad
de corrosin.
Una ventaja de la tcnica de Rp es que permite obtener valores de resistencia
instantneos, por lo que a cada momento da informacin relevante del proceso y
obviamente a cada momento se puede conocer la V
corr
(Bardal, 2004).

108

Para la realizacin de la Espectroscopa de Impedancia Electroqumica (EIE) se emple
acero al carbn API XL 52 embebido en medio de cultivo Postgate C por 792 h. Las
pruebas para el sistema de referencia y el sistema problema (C. celerecrescens) se llevaron
a cabo en forma paralela.
Se registraron 33 espectros de impedancia para cada sistema estudiado. Debido a que
esta informacin es muy abundante, es difcil mostrar los 33 diagramas de cada uno en
una sola imagen, ya que diversos espectros llegan a traslaparse e impiden su fcil
entendimiento e interpretacin; es por eso que slo se muestran los caractersticos de la
determinacin espectroscpica (al inicio, en el intermedio y al final de la prueba
electroqumica).
7.8.2.1. Prueba de EIE para el sistema de referencia.
EL sistema de referencia fue monitoreado cada 24 h y los espectros de impedancia del
sistema de referencia reportan un mismo comportamiento, el cual tiende a incrementar
sus magnitudes de impedancia imaginaria (Z'') e impedancia real (Z') en el transcurso de
las mediciones (Figura 33).

109

Figura 33. Diagramas de Nyquist para el sistema de referencia, expuesto el cupn
de acero al carbn API XL 52 al medio de cultivo.

En la Figura 33 se observan los espectros de impedancia a diferentes tiempos de la
prueba, donde las magnitudes de impedancia imaginaria y real alcanzan valores de
Z'' -218.9 cm
2
y Z' 912.95 cm
2
al inicio, a la mitad de Z'' -8779.3 cm
2
y Z' 9503.3
cm
2
y al final de Z'' -11653 cm
2
y Z' 9678.9 cm
2
. Estos valores sugieren que bajo estas
condiciones de trabajo se estn originando pelculas o capas semiconductoras de
productos de corrosin y, conforme transcurre la determinacin electroqumica, la
pelcula se torna resistiva, es decir, protectora y esto se debe a que ya no existen especies
oxidantes que promuevan el fenmeno de oxidacin o corrosin; dicho de otra manera, a
medida que la resistencia aumenta, la velocidad de corrosin disminuye (Prez, 2004;
Marn y col., 2004).

0 5000 10000 15000
-15000
-10000
-5000
0
Z'
Z
'
'
0 h..z
384 h..z
792 h..z
Ohm cm
2

Ohm cm
2

110

Figura 34. Diagramas de Bode para el sistema de referencia, expuesto el cupn de
acero al carbn API XL 52 al medio de cultivo. A) modulo; B) ngulo de fase.
Se presentan en una sola impresin los diagramas de Bode [de mdulo (|Z|) y de ngulo
de fase (theta)] (Figura 34) por estar estrechamente relacionados, ya que si se exponen
por separado es muy difcil su interpretacin. En el diagrama de Bode de ngulo de fase
se observa la presencia de tres mximos, uno de ellos bien definido en el inicio de la
determinacin y al ir avanzando en el tiempo los dos ltimos no logran concretarse; sin
embargo, es un indicativo de que el proceso electroqumico es constante al primer tiempo
e inconstante para los tiempos restantes. De esta forma se puede saber que la pelcula
formada por los productos de corrosin se va alterando en funcin del tiempo toda esta
informacin se corrobora con el diagrama de Bode de mdulo, donde se presentan
pendientes bien definidas en cierto intervalo y de esta manera se puede deducir el
comportamiento del fenmeno de corrosin.
Con la finalidad de establecer un significado fsico o tangible del proceso corrosivo, se
simularon y modelaron en un circuito equivalente los espectros de impedancia, llegando
as, a un ajuste de los datos experimentales; tal circuito elctrico satisfizo las necesidades
fsicas de cada etapa del proceso electroqumico. El programa que ayud a establecer las
condiciones reales del proceso fue el Zview y con base en ste se dio una explicacin
fsica del sistema.
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
5
Frequency (Hz)
|
Z
|
0 h..z
384 h..z
792 h..z
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
-100
-75
-50
-25
0
Frequency (Hz)
t
h
e
t
a
A
B
111

Con el manejo adecuado de los datos de impedancia y con el circuito equivalente
propuesto, se logr dar un seguimiento a la determinacin electroqumica, ya que de esta
forma se puede decir que fenmeno o circunstancia se est llevando a cabo en el sistema
de referencia.
El modelo del circuito equivalente que present un mejor ajuste a los datos
experimentales se muestra en la Figura 35. Este circuito elctrico consta de una
resistencia (Rs), de un elemento de fase constante (EFC), cuya funcin es muy similar a un
capacitor, y de una resistencia (Rtc); y para tales elementos del circuito elctrico, la Rs
representa la resistencia de la solucin, el EFC simboliza la capacitancia de la doble capa y
la Rtc constituye la resistencia a la transferencia de carga. Todos estos componentes del
circuito equivalente estn designados a facilitar el entendimiento del fenmeno de
corrosin, es por eso que estos adquieren un significado real para las mediciones.

del sistema de referencia.

Con la finalidad de verificar el funcionamiento del circuito equivalente, se prob al inicio
de la prueba electroqumica el espectro de impedancia a las 0 h con el circuito elctrico
(Figura 35), dando como resultado un adecuado ajuste a los datos experimentales (Figura
36), por lo tanto el arreglo utilizado en el circuito equivalente fue apropiado.
Rs EFC
Rtc
Element Freedom Value Error Error %
Rs Free() 9.193 N/A N/A
EFC-T Free() 0.0092484 N/A N/A
EFC-P Free() 0.91639 N/A N/A
Rtc Free() 1126 N/A N/A
Data File:
Circuit Model File: C:\Users\Oswaldo\Documents\Anlisis Electroqumico\EIS\BLANCO\Segundo blanco\Blanco final final.mdl
Mode: Run Fitting / Freq. Range (0.001 - 1000000)
Maximum Iterations: 100
Optimization Iterations: 0
Type of Fitting: Complex
Type of Weighting: Calc-Modulus
112

Figura 36. Diagrama de Nyquist para el sistema de referencia ajustado al inicio de
la prueba electroqumica con el programa ZView. Experimental (-); Ajuste (-).

Al igual que el diagrama de Nyquist (Figura 36) los diagramas de Bode tuvieron un buen
ajuste al aplicar el circuito elctrico (Figura 35), por lo que para esta etapa del ensayo
electroqumico el circuito funcion bien, de tal forma que se puede decir que el modelo
de circuito equivalente seleccionado es el apropiado en este intervalo.

0 250 500 750 1000
-1000
-750
-500
-250
0
Z'
Z
'
'
0 h..z
FitResult
Ohm cm
2

Ohm cm
2

113

Figura 37. Diagramas de Bode para el sistema de referencia ajustados al inicio de la
prueba electroqumica con el programa ZView. Experimental (-); Ajuste (-).

Con los valores de cada componente del circuito (resistencia, elemento de fase constante
y resistencia), se obtuvieron porcentajes de error muy bajos (Figura 38), por lo que se dice
que el grado de confiabilidad del circuito equivalente es satisfactorio, por lo menos al
inicio de la prueba.

10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
Frequency (Hz)
|
Z
|
0 h..z
FitResult
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
-75
-50
-25
0
Frequency (Hz)
t
h
e
t
a
114

al tiempo de inicio de la prueba, estimados mediante el programa ZView.

Asmismo, se prob el circuito equivalente a la mitad de la prueba electroqumica a las
384 h. El diagrama de Nyquist simulado muestra una buena aproximacin a los resultados
experimentales (Figura 39).

Figura 39. Diagrama de Nyquist para el sistema de referencia empleando el
programa ZView a la mitad de la prueba electroqumica.Experimental(-);Ajuste(-).
Rs EFC
Rtc
Rs Free() 3.503 0.018046 0.51516
EFC-T Free() 0.00020875 1.7448E-6 0.83583
EFC-P Free() 0.88858 0.00152 0.17106
Rtc Free() 1026 8.1555 0.79488
Chi-Squared: 0.00091165
Weighted Sum of Squares: 0.082048
Data File: C:\Users\Oswaldo\Documents\Anlisis Electroqumico\EIS\PROBLEMA MODIFICADO\EIS\0 h..z
Circuit Model File: C:\Users\Oswaldo\Documents\Anlisis Electroqumico\EIS\PROBLEMA MODIFICADO\EIS\20070307 inicio.mdl
0 2500 5000 7500 10000
-10000
-7500
-5000
-2500
0
Z'
Z
'
'
384 h..z
FitResult
Ohm cm
2

Ohm cm
2

115

El acoplamiento dado en los diagramas de Bode (Figura 40), muestra un ajuste adecuado
en la fase intermedia de la prueba electroqumica, de tal forma que para este perodo fue
til el modelo de circuito equivalente.

Figura 40. Diagramas de Bode para el sistema de referencia utilizando el programa
ZView a la mitad de la tcnica electroqumica.

Se emple el modelo de circuito equivalente (Figura 35) en los diagramas de Nyquist
(Figura 39) y Bode (Figura 40) en el intervalo intermedio de la determinacin, permitiendo
estimar los valores representativos del sistema electroqumico (Figura 41).

10
-1
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
5
Frequency (Hz)
|
Z
|
384 h..z
FitResult
10
-1
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
-100
-75
-50
-25
0
Frequency (Hz)
t
h
e
t
a
116

al tiempo intermedio de la tcnica electroqumica.

Para finalizar el estudio del proceso electroqumico del sistema de referencia; en la ltima
etapa (792 h) nuevamente se recurri a la simulacin con el circuito elctrico (Figura 35).
Los diagramas de Nyquist (Figura 42) y de Bode (Figura 43), muestran una respuesta que
se ajusta aceptablemente a los resultados experimentales.

Rs EFC
Rtc
Rs Free() 3.577 0.030045 0.83995
EFC-T Free() 0.00032956 2.2771E-6 0.69095
EFC-P Free() 0.87116 0.0016052 0.18426
Rtc Free() 23938 829.35 3.4646
Circuit Model File: C:\Users\Oswaldo\Documents\Anlisis Electroqumico\EIS\PROBLEMA MODIFICADO\EIS\20070320 mitad.mdl
117

Figura 42. Diagrama de Nyquist para el sistema de referencia al final de la
determinacin electroqumica correspondiente al ajuste con el programa ZView.
Experimental (-); Ajuste (-).

0 5000 10000 15000
-15000
-10000
-5000
0
Z'
Z
'
'
792 h..z
FitResult
Ohm cm
2

Ohm cm
2

118

Figura 43. Diagramas de Bode para el sistema de referencia al final de la
determinacin electroqumica ajustados mediante el programa ZView.

El ajuste de los diagramas de impedancia en la ltima etapa de la medicin electroqumica
proporcion los valores de cada elemento usado en el circuito equivalente (Figura 44);
con lo que se pudo caracterizar todo el comportamiento seguido en el ensayo
espectroscpico.

10
-1
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
5
Frequency (Hz)
|
Z
|
792 h..z
FitResult
10
-1
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
-100
-75
-50
-25
0
Frequency (Hz)
t
h
e
t
a
119

al tiempo final de la determinacin electroqumica.

De manera general, en las Figuras 33 y 34 se puede visualizar la trayectoria que sigui el
espectro de impedancia para el acero al carbn API XL 52 expuesto al medio de cultivo
Postgate C en condiciones estriles por un lapso de 792 h. De modo particular, en las
Figuras 36 y 37 se aprecia el comportamiento al inicio de la prueba, en las Figuras 39 y 40
se muestra la conducta seguida al intermedio del ensayo electroqumico y en las Figuras
42 y 43 se evala el final del proceso electroqumico. Cada Figura que engloba la prueba
electroqumica del sistema de referencia present un comportamiento particular, el cual
bsicamente va incrementando los valores de impedancia imaginaria y real y, con esto, se
establecieron las condiciones reales del sistema a un tiempo e indirectamente se va
registrando el fenmeno de corrosin.
Con base en las caractersticas utilizadas en la medicin electroqumica, se pudo modelar
un circuito equivalente, el cual representa las condiciones fsicas de este ensayo, ya que
permiti simular ante una seal elctrica la respuesta generada del conjunto acero al
carbn API XL 52-medio de cultivo Postgate C. Para tal simulacin se emplearon tres
elementos de un circuito elctrico, los cuales esquematizan paso a paso el proceso de
corrosin. El primer componente del circuito equivalente es una resistencia, llamada
resistencia de la solucin (Rs), la cual confiere a la solucin la habilidad de oponerse al
flujo de corriente que pasa por ella; el segundo componente del circuito equivalente es
un tipo de capacitor, denominado elemento de fase constante (EFC), el cual representa a
la capacitancia de la doble capa presente entre la solucin y el metal, por lo que este
elemento almacena la carga elctrica en un determinado punto del circuito, adems de
que permite compensar las desviaciones que se presentan en el sistema (semicrculos
imperfectos); y el tercer componente del circuito equivalente es una resistencia, asociada
Rs EFC
Rtc
Rs Free() 3.508 0.014954 0.42628
EFC-T Free() 0.00035983 1.2391E-6 0.34436
EFC-P Free() 0.88037 0.00082951 0.094223
Rtc Free() 33241 704.77 2.1202
Circuit Model File: C:\Users\Oswaldo\Documents\Anlisis Electroqumico\EIS\PROBLEMA MODIFICADO\EIS\20070327 final.mdl
120

a la resistencia de la transferencia de carga (Rtc), la cual esta relacionada con los procesos
de intercambio iones-electrones en la superficie del metal.
Para corroborar la calidad en el ajuste del circuito equivalente empleado en el proceso de
la prueba electroqumica, se compararon los porcentajes de error atribuidos a las
diferentes etapas de la medicin, teniendo como principal fuente de error la resistencia a
la transferencia de carga que se fue incrementando a partir de la mitad del ensayo
electroqumico, lo cual se puede justificar por la creacin de una pelcula de productos de
corrosin, que en este caso son diferentes xidos de hierro; es por tal razn, que los
porcentajes varan a lo largo del proceso electroqumico, sin embargo, el porcentaje de
error global es pequeo (del orden de 3.5%) y tomando como base esto, se dice que el
ajuste hecho a los espectros de impedancia con ayuda del programa ZView fueron los
adecuados, permitiendo entender el proceso de corrosin.
De acuerdo con el circuito equivalente empleado en la prueba electroqumica para el
sistema de referencia expuesto a medio de cultivo Postgate C y acero al carbn API XL 52,
se pudo recabar informacin de los componentes que formaron parte del circuito
elctrico a lo largo del proceso electroqumico, los cuales se muestran en la Tabla 11.

121

equivalente durante el ensayo electroqumico con el sistema de referencia.

Tiempo
(h)
Rs
(Ohm cm
2
)
EFC-T
(F cm
2
)
Rtc
(Ohm cm
2
)
Rp
(Ohm cm
2
)
Vcorr
(mpy)
0 3.503 0.00020875 1026 1029.503 11.57872974
24 3.534 0.00012521 2583 2586.534 4.608614076
48 3.531 0.00013423 3689 3692.531 3.228229364
120 3.616 0.00020029 4032 4035.616 2.953783759
144 3.622 0.00024612 4201 4204.622 2.835055565
168 3.611 0.00028104 4560 4563.611 2.612040553
192 3.591 0.00021987 4730 4733.591 2.518243972
216 3.614 0.00026350 4742 4745.614 2.511864007
312 3.590 0.00032530 22548 22551.59 0.528580779
336 3.611 0.00032584 23060 23063.611 0.516846083
360 3.441 0.00046448 23142 23145.441 0.515018789
384 3.577 0.00032956 23938 23941.577 0.497892724
456 3.58 0.00033397 26572 26575.58 0.448544754
480 3.451 0.00042564 26752 26755.451 0.445529287
504 3.452 0.00041232 27019 27022.452 0.441127141
528 3.441 0.00041950 27129 27132.441 0.439338908
552 3.457 0.00039474 27791 27794.457 0.428874613
624 3.469 0.00038694 30522 30525.469 0.390504631
648 3.508 0.00035026 31241 31244.508 0.381517833
672 3.477 0.00037414 33133 33136.477 0.359734591
792 3.508 0.00035983 33241 33244.508 0.358565601

En la Tabla 11 se muestran los valores para la Rs que son asociados a la resistencia de la
solucin, los cuales fueron constantes. En lo que respecta al elemento de fase constante
(EFC), se observaron cambios en los datos reportados, ya que al ir transcurriendo la
prueba electroqumica stos se iban incrementando hasta alcanzar un equilibrio, lo que
est estrechamente vinculado con la formacin de productos de corrosin establecidos en
la interfase acero al carbn API XL 52 y el medio de cultivo. Asmismo se consider el
factor que utiliza el EFC, por lo que se conoci la heterogeneidad de la pelcula formada
por los productos de corrosin, indicando posiblemente una superficie rugosa, ratificando
el comportamiento no ideal de un capacitor. Por ltimo, se not un aumento
considerable en las cifras de la resistencia a la transferencia de carga (Rtc) despus de las
122

216 h; al inicio se atribuye al proceso de oxidacin del hierro o a la reduccin de los iones
presentes en el medio de cultivo, dndole una capacidad de activacin al metal y, para los
tiempos posteriores, la pelcula formada por los productos de corrosin empez a tener
un efecto positivo en el sistema de referencia, ya que constituy una barrera en la
interfase acero al carbn API XL 52-pelcula contra el fenmeno de corrosin, provocando
una disminucin en la velocidad de corrosin (Figura 45).
Con todos estos resultados (Tabla 11) se pudo evaluar la resistencia a la polarizacin (Rp),
en donde la Rp se vio favorecida en los primeros tiempos y, conforme avanzaba la
determinacin electroqumica, las Rp iban decayendo debido a que estn en funcin de la
Rs y la Rtc.
De acuerdo con los resultados obtenidos del anlisis electroqumico se puede conocer la
velocidad de corrosin en milsimas de pulgada por ao (Tabla 11) para el sistema de
referencia.
En la Figura 45 se aprecia la tendencia de la velocidad de corrosin que origin el sistema
de referencia al someterse a las pruebas electroqumicas.

Figura 45. Velocidad de corrosin para el sistema de referencia calculada
mediante EIE.
123

7.8.2.2. Prueba de EIE para el sistema con C. celerecrescens (problema)
Para llevar a cabo la prueba electroqumica con el cultivo bacteriano se aplicaron las
mismas condiciones que en el sistema de referencia.
El microorganismo junto con el acero al carbn API XL 52 fue sometido al ensayo
electroqumico por 792 h en medio de cultivo Postgate C. Mediante esta asociacin se
gener informacin suficiente para comprender el fenmeno de corrosin originada por la
bacteria.
En el transcurso de la medicin electroqumica se observaron dos patrones de los
espectros de impedancia, lo cual sugiere que la prueba no sigui un mismo
comportamiento. El primero de ellos es muy similar al observado en el sistema de
referencia, ya que se da un incremento en las magnitudes tanto imaginarias como reales
y, en el segundo, ya no es tan evidente el avance de las magnitudes, sino por el contrario,
los espectros forman una lnea inclinada casi recta, con pendientes aproximadas entre los
45 y 55. Por lo general, cuando se presenta este tipo de variaciones en los sistemas, es
atribuible a una transferencia de masa y, con base en esto, se supone que el sistema con
el microorganismo es controlado por un fenmeno de difusin. Siguiendo la misma
dinmica que en el sistema de referencia, en la Figura 46 se aprecian los diagramas de
Nyquist para el anlisis electroqumico en tres diferentes intervalos, al principio, en medio
y final del ensayo.

124

Figura 46. Diagramas de Nyquist para el metal expuesto al microorganismo y al
medio de cultivo.

En la Figura 46 se distinguen los espectros de impedancia a lo largo de la prueba
electroqumica, teniendo que para la etapa de inicio se observ una Z'' -428.08 cm
2
y
Z' 301.04 cm
2
, las cuales fueron aumentando hasta las 120h y posteriormente
disminuyeron a magnitudes de Z'' -167.34 cm
2
y Z' 77.116 cm
2
a la mitad y al final de
Z'' -95.803 cm
2
y Z' 53.916 cm
2
, lo cual refleja una modificacin evidente causada por
la bacteria en la interfase de acero al carbn API XL 52 - medio de cultivo Postgate C. Para
los primeros tiempos (antes de 120 h), el avance de las magnitudes expres un efecto
protector sobre la superficie del cupn de acero al carbn API XL 52 ante el proceso de
oxidacin, ya que se estaba creando una pelcula de productos de corrosin; sin embargo,
en los tiempos subsiguientes las magnitudes disminuyeron debido a que en la interfase
metal-medio de cultivo la pelcula formada por los productos de corrosin ya no ejerca
ningn efecto, debido a que se estaba gestionando otro tipo de pelcula, conocida como
biopelcula, es por tal razn que mientras el cupn se iba colonizando las Z''y Z' iban
aminorando y de esta forma se propici la corrosin. Una vez colonizado o cubierto el
cupn por el microorganismo se origin una nueva interfase, compuesta por el acero al
carbn-biopelcula-medio de cultivo y es por eso que se involucr una nueva variable al
sistema relacionada con el proceso de difusin.
0 100 200 300 400 500
-500
-400
-300
-200
-100
0
Z'
Z
'
'
0 h..z
384 h..z
792 h..z
Ohm cm
2

Ohm cm
2

125

Figura 47. Diagramas de Bode para el metal expuesto al microorganismo y al
medio de cultivo.
En los diagramas de Bode (Figura 47), se distingue que en el de ngulo de fase se aprecian
tres mximos, en los cuales uno de ellos si est bien definido y los otros dos no, esto es
claro debido a que se present el fenmeno de difusin, es por ello que se alcanzan a
cerrar los valles en las amplitudes de las ondas y para el de mdulo se observan tres
pendientes asociadas a tres constantes de tiempo, en donde cada una de ellas representa
una etapa del proceso electroqumico, siendo ms evidente que dos de ellas son muy
similares. Por lo tanto, se originan dos etapas en la interfase del cupn-biopelcula-medio
de cultivo y es justificable debido a que a medida que la prueba electroqumica se
desarrolla la parte lineal de la frecuencia tarda en desaparecer.
Durante la prueba electroqumica se produjeron dos tendencias en los espectros de
impedancia, las cuales se analizaron mediante el programa Zview. La simulacin arroj
diversos prototipos de circuitos equivalentes, pero acotando y definiendo las constantes,
se consigui el circuito equivalente apropiado para el proceso dando una representacin
fsica al sistema electroqumico.

10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
Frequency (Hz)
|
Z
|
0 h..z
384 h..z
792 h..z
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
-75
-50
-25
0
Frequency (Hz)
t
h
e
t
a
126

Para la primera etapa del estudio electroqumico, el modelo del circuito equivalente
(Figura 48) que present un mejor ajuste a los datos experimentales, se compone de una
resistencia (Rs) y de un arreglo en paralelo de un elemento de fase constante (EFC) y de
una resistencia (Rtc); y, bsicamente, es el mismo modelo que se utiliz en el sistema de
referencia.

del sistema con el microorganismo en su primera etapa.

Para la segunda etapa del estudio electroqumico fue necesario aadir un nuevo
elemento, el elemento de Warburg (W), el cual est en serie con la resistencia a la
transferencia de carga (Rtc). Con esta nueva adaptacin al modelo del circuito
equivalente (Figura 49), se observ un adecuado ajuste a los datos experimentales, por lo
que el circuito equivalente empleado es el siguiente:

del sistema con el microorganismo en su segunda etapa.

El modelo de circuito equivalente (Figura 49) que contempla el elemento de Warburg, se
rige por el fenmeno de difusin, debido a la formacin de la biopelcula sobre el acero al
carbn API XL 52.
Rs EFC
Rtc
Rtc Free() 1126 N/A N/A
Data File:
Circuit Model File: C:\Users\Oswaldo\Documents\Anlisis Electroqumico\EIS\BLANCO\Segundo blanco\Blanco final final.mdl
Rs EFC
Rtc W
Rtc Free() 307.6 N/A N/A
W-R Free() 3198 N/A N/A
W-T Free() 393.4 N/A N/A
W-P Free() 1.005 N/A N/A
Data File: C:\Users\Oswaldo\Documents\Electroqumica\BLANCO\Segundo Blanco\EIS\20070313.z
Circuit Model File: C:\Users\Oswaldo\Documents\Anlisis Electroqumico\EIS\PROBLEMA MODIFICADO 2\EIS\prueba para (4) 20070313.mdl
127

Al inicio de la medicin electroqumica se ajustaron los datos experimentales con el
primer modelo de circuito equivalente propuesto para esta determinacin, de tal forma
que se obtuvo el diagrama de Nyquist (Figura 50) representativo para este intervalo.

Figura 50. Diagrama de Nyquist para el sistema con el microorganismo ajustado
con el programa Zview para la primera etapa de la prueba electroqumica.
Con los diagramas de Bode (Figura 51) y con el diagrama de Nyquist, se deduce que el
ajuste hecho mediante el circuito equivalente propuesto para esta etapa de la medicin
electroqumica es satisfactorio.
0 100 200 300 400 500
-500
-400
-300
-200
-100
0
Z'
Z
'
'
0 h..z
FitResult
Ohm cm
2

Ohm cm
2

128

Figura 51. Diagramas de Bode para el sistema con el microorganismo ajustados por
medio del programa ZView al inicio de la prueba electroqumica.

Por medio del modelo del circuito equivalente (Figura 50) empleado en este lapso (inicio),
se obtienen valores de los elementos fsicos aplicados y se puede apreciar que el circuito
equivalente complace con los requisitos establecidos para ste, los cuales son los mismos
que se consideraron para el sistema de referencia, donde la Rs representaba la resistencia
a la solucin o al medio de cultivo, el EFC que se asociaba a la capacitancia de la doble
capa presente entre el medio de cultivo y el cupn de acero al carbn API XL 52 y la Rtc
que manifestaba la resistencia que se daba a la transferencia de carga entre los productos
de corrosin formados en la interfase.
10
-1
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
Frequency (Hz)
|
Z
|
0 h..z
FitResult
10
-1
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
-75
-50
-25
0
Frequency (Hz)
t
h
e
t
a
129

en los primeros tiempos de la determinacin generados por el programa ZView.
Conforme transcurre la prueba electroqumica, el primer modelo del circuito elctrico no
cumple con el acoplamiento de los espectros de impedancia, por lo que se emplea el
segundo modelo planteado.
Haciendo uso del modelo de circuito equivalente propuesto para el segundo perodo del
anlisis electroqumico, el diagrama de Nyquist (Figura 53) y los diagramas de Bode (Figura
54), crearon una respuesta apropiada con los espectros de impedancia generados en esta
fase.

Rs EFC
Rtc
Rs Free() 9.193 0.060159 0.6544
EFC-T Free() 0.0092484 7.9806E-5 0.86292
EFC-P Free() 0.91639 0.0042527 0.46407
Rtc Free() 1126 33.423 2.9683
Data File: C:\Users\Oswaldo\Documents\Electroqumica\BLANCO\Segundo Blanco original\EIS\20070409.z
Circuit Model File: C:\Users\Oswaldo\Documents\Anlisis Electroqumico\EIS\BLANCO FINAL\Segundo blanco\CE 20070409.mdl
Mode: Run Fitting / Selected Points (0 - 60)
130

Figura 53. Diagrama de Nyquist para el sistema con el microorganismo empleando
el programa Zview a la mitad de la prueba electroqumica.

0 50 100 150 200
-200
-150
-100
-50
0
Z'
Z
'
'
384 h..z
FitResult
Ohm cm
2

Ohm cm
2

131

Figura 54. Diagramas de Bode para el sistema con el microorganismo con el
programa ZView a la mitad de la prueba electroqumica.

Como se puede apreciar, el modelo propuesto para la segunda ruta de la medicin
electroqumica ajusta perfectamente con los espectros de impedancia, por tal razn, se
dice que el diagrama de Nyquist (Figura 53) y los diagramas de Bode (Figura 54) mostraron
una buena correlacin.
El modelo de circuito equivalente establecido para la segunda etapa del ensayo
electroqumico (Figura 49), mostr un adecuado ajuste de los espectros de impedancia, y,
por lo tanto, se pudieron analizar y simular el resto de los espectros obtenidos en la
determinacin espectroscpica.
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
Frequency (Hz)
|
Z
|
384 h.
FitResult
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
-75
-50
-25
0
Frequency (Hz)
t
h
e
t
a
132

a la mitad de la tcnica aplicando el programa ZView

Los datos obtenidos para la parte final de la prueba electroqumica dieron una clara idea
del curso que tom dicho ensayo; por lo que el diagrama de Nyquist (Figura 56) y los de
Bode (Figura 57) permitieron corroborar el efecto electroqumico.

133

Figura 56. Diagrama de Nyquist para el sistema con el microorganismo
correspondientes al ajuste con el programa ZView al final de la prueba
electroqumica.

0 25 50 75 100
-100
-75
-50
-25
0
Z'
Z
'
'
792 h..z
FitResult
Ohm cm
2

Ohm cm
2

134

Figura 57. Diagramas de Bode para el sistema con el microorganismo usando el
programa ZView al final de la prueba electroqumica.
El modelo de circuito equivalente (Figura 58), expone el ltimo paso realizado en la
examinacin electroqumica.

al final de la determinacin valorados con el programa ZView.
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
Frequency (Hz)
|
Z
|
792 h..z
FitResult
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
-75
-50
-25
0
Frequency (Hz)
t
h
e
t
a
135

Finalizado el estudio electroqumico, se puede observar en las Figuras 46 y 47 el
comportamiento que present el sistema problema; claramente se distingue que el metal
de acero al carbn API XL 52 expuesto a C. celerecrescens y al medio de cultivo Postgate C
tom un rumbo diferente, probablemente se deba a la presencia de la bacteria, cuya
actividad metablica favorece la corrosin.
En las Figuras 50 y 51 se aprecia que se origin un fenmeno de corrosin simple, el cual
considera un circuito elctrico sencillo conformado por una Rs, un EFC y una Rtc; y
posteriormente (Figuras 53, 54, 56 y 57) se da un proceso de corrosin compuesto, ya que
se involucra a un nuevo elemento, el elemento de Warburg, que est relacionado con el
efecto de la difusin, debido a la induccin de biopelculas en la superficie del metal.
Con la simulacin se pudieron modelar los circuitos elctricos ms convenientes para el
ensayo electroqumico y as dar una explicacin fsica el fenmeno de corrosin inducida
por la bacteria. En el tipo de corrosin inducida por el microorganismo se emplearon
cuatro elementos para el planteamiento del circuito elctrico; los tres primeros son los
mismos que se emplearon en el sistema de referencia y, por consecuencia, tienen el
mismo significado fsico y, el ltimo elemento requerido para darle una estructura lgica
al circuito elctrico y al proceso de corrosin, es el elemento de Warburg (W), el cual
describe un proceso a travs de una interfase donde una de las fronteras obstruye las
especies en difusin.
El porcentaje de error aumenta al introducir el elemento de Warburg al sistema, sin
embargo, se mantuvo un porcentaje menor al 10%. Los porcentajes de error para la
prueba electroqumica son: 4.95% al inicio, 9.38% a la mitad y 9.71% al final de la
medicin electroqumica, generando un porcentaje de error global del sistema
electroqumico para el microorganismo de 8.01%. Por tal motivo, se establece que el
sistema de corrosin inducida por el microorganismo propuesto, es satisfactorio.
Los circuitos elctricos empleados durante el anlisis electroqumico para el sistema con
C. celerecrescens expuesto al medio de cultivo Postgate C y a acero al carbn API XL 52,
permitieron conocer los valores de los componentes que formaron parte del circuito
elctrico, dichos valores se presentan en la Tabla 12.

136

equivalente durante el ensayo electroqumico en el sistema que incluye al
microorganismo.

Tiempo
(h)
Rs
(Ohm cm
2
)
EFC-T
(F cm
2
)
Rtc
(Ohm cm
2
)
W1-R
(Ohmcm
2
)
W1-T
( cm
2
)
Rp
(Ohm cm
2
)
Vcorr
(mpy)
0 9.193 0.0092484 1126 NA NA 1135.20225 10.5006284
24 9.138 0.00925138 2987 NA NA 2996.14725 3.97855512
48 9.073 0.00925752 4592 NA NA 4601.08226 2.59076807
120 8.892 0.0092692 7962.4 NA NA 7971.30127 1.49540666
144 8.829 0.0092199 13794 NA NA 13802.8382 0.86361492
168 8.724 0.0092024 17850.8 NA NA 17859.5332 0.66744953
192 8.515 0.0091886 24184.5 NA NA 24193.0242 0.49271794
216 8.637 0.0089964 30189.2 NA NA 30197.846 0.3947413
312 8.363 0.0087723 723.8 27368 456.7 28100.1718 0.42420869
336 8.372 0.0086539 721.1 23251 475 23980.4807 0.49708499
360 8.307 0.0084323 689.8 20552 474.9 21250.1154 0.56095399
384 8.239 0.0082444 644.1 16568 474.8 17220.3472 0.69222396
456 8.529 0.0079122 607.1 6356 455.6 6971.63691 1.70983331
480 8.474 0.0074109 526.5 3758 455.1 4292.98141 2.77670361
504 8.57 0.0029828 351.7 3662 392.7 4022.27298 2.9635823
528 8.533 0.003766 374 3563 392.9 3945.53677 3.02122061
552 8.338 0.0072263 492.4 3184 454.9 3684.74523 3.23505053
624 8.379 0.0069617 470.5 3099 454 3577.88596 3.33167047
648 8.152 0.0023474 307.6 3198 393.4 3513.75435 3.39247876
672 8.609 0.0044372 380.4 2571 413.6 2960.01344 4.0271226
792 8.523 0.0065998 447 1999 410.2 2454.5296 4.85646496

En la Tabla 12, se encuentran los valores de la resistencia a la solucin, Rs, los cuales no
variaron; asmismo se expone el elemento de fase constante, EFC, cuyos resultados se
pueden atribuir al efecto dado en la doble capa, en donde se presenciaron alteraciones
debido a que se cre una nueva interfase, compuesta por el cupn de acero al carbn
API XL 52 - la pelcula de los productos de corrosin-la biopelcula generada por
C. celerecrescens - medio de cultivo Postagte C, dotndola de propiedades
semiconductoras que al ir evolucionando se torna altamente conductora, lo cual explica el
proceso de corrosin y, ya que esta unin es ms compleja, el fenmeno de corrosin se
llev a frecuencias intermedias y con el factor que considera el EFC se pudo conocer que
la biopelcula se adhiri de manera heterognea, generando una superficie activa para la
corrosin. Tambin se verific la responsabilidad de la resistencia a la transferencia de
carga, Rtc, asociada al mecanismo que se deriv de la interfase, la cual va disminuyendo
en funcin del tiempo; es por eso que un componente de la interfase, la biopelcula, se
137

vuelve ms activo impidiendo la transferencia de iones; de igual forma se estudi el
proceso de difusin, W1-R, que se present a bajas frecuencias, explicando el porqu los
componentes qumicos involucrados en el sistema tardan en difundirse a travs de la
interfase.
Con base en los resultados obtenidos (Tabla 12) se calcul la Rp, resistencia a la
polarizacin y, como era de esperarse, en los primeros tiempos se mostr un aumento
seguido de una disminucin que posteriormente se transform en un incremento, todo
esto se justifica, ya que la Rp depende de la Rs, Rtc y de la W1-R, permitiendo conocer la
velocidad de corrosin para el sistema que consider la participacin de C. celerecrescens
(Tabla 12).
Reuniendo todos los datos del anlisis electroqumico se obtuvo la velocidad de corrosin
del acero al carbn API XL 52 ocasionada por el microorganismo (Tabla 12) expuesto al
medio de cultivo Postagate C.
En la Figura 59, se visualiza el comportamiento dado por el microorganismo en trminos
de velocidad de corrosin a lo largo del ensayo electroqumico.

138

Figura 59. Velocidad de corrosin para el sistema con C. celerecrescens expuesto
al medio de cultivo Postgate C y a acero al carbn API XL 52 determinada mediante
EIE.

En la Figura 60 se trazan en forma comparativa los perfiles de la velocidad de corrosin del
sistema de referencia y del problema, donde se puede observar que el sistema de
referencia evidenci velocidades de corrosin muy bajas (despus de 200 h), casi cercanas
a 0 mpy, por lo que se dice que el medio de cultivo, despus de este tiempo, no es
agresivo para la superficie metlica de acero al carbn API XL 52; sin embargo, el sistema
que incluy a C. celerecrescens report velocidades de corrosin altas, aproximadamente
de 4 mpy, de tal forma que la bacteria contribuy a que se dieran las condiciones para el
fenmeno de biocorrosin

139

Figura 60. Velocidad de corrosin para los sistemas de referencia y con el
microorganismo, expuestos a acero al carbn API XL 52 y al medio de cultivo
Postgate C.

140

7.9. Microscopa electrnica de barrido ambiental (MEBA)
Con base en los resultados obtenidos de las pruebas electroqumicas, se deduce que las
interacciones que se dieron entre C. celerecrescens y el cupn de acero al carbn API XL 52
fueron sumamente importantes para la integridad del cupn.
Por medio de la microscopia electrnica de barrido ambiental se pudieron observar
diversas micrografas representativas para el proceso de corrosin y para el fenmeno de
biocorrosin (Figura 61), tambin se aprovecharon estas imgenes para realizar un anlisis
por energa dispersiva de rayos-X (EDAX), el cual consisti en un microanlisis sobre la
superficie de los cupones de acero al carbn API XL 52, tanto para el sistema de referencia
(Figura 62) como para el del microorganismo (Figura 63), en donde se aprecian los
productos de corrosin generados.
Fue evidente, como se aprecia en la Figura 63, que la bacteria gener un dao irreparable
en la superficie del cupn de acero al carbn API XL 52, ya que en el microanlisis se
observaron modificaciones de la composicin qumica en la superficie del acero, es por
ello que a la bacteria se le considera como un agente agresor.

141

Figura 61. Observacin microscpica del sistema de referencia (R), de la biopelcula
(P) y de la corrosin (C) (una vez eliminada la biopelcula) de los cupones metlicos
obtenidos al finalizar los ensayos electroqumicos.

R

P

C
142

electroqumica al trmino del ensayo espectroscpico del sistema de referencia.

143

electroqumica al trmino de la determinacin espectroscpica para el sistema con
C. celerecrescens.

144

CAPTULO 8
CONCLUSIONES
145

8. Conclusiones

Se demostr, bioqumicamente, que las cepas de bacterias esporuladas aisladas
con un ao de diferencia de un gasoducto, pertenecen al gnero Clostridium y a la
especie celerecrescens.

Por secuenciacin del 16S rDNA y comparacin en la base de datos del GeneBank
se corrobor que ambas cepas son Clostridium celerecrescens con un 99% de
homologa (nmero de acceso X71848).

Por tcnicas moleculares utilizadas en este estudio, especficamente ARDRA
(Anlisis de restriccin del 16S rDNA amplificado) y RAPD (Anlisis del DNA
polimrfico amplificado aleatoriamente), se demostr que no hay diferencia entre
las dos cepas aisladas, es decir que se trata de la misma cepa que ha persistido en
el gasoducto.

No se detectaron plsmidos en la cepa.

La cepa de C. celerecrescens es productora de cido actico y acido butrico.

Se demostr que los cidos orgnicos producidos por la cepa contribuyen
moderadamente al proceso de corrosin de acero al carbn API XL 52.

La mayor velocidad de corrosin se obtuvo cuando la bacteria form una
biopelcula en la superficie del cupn corrosimtrico, siendo de 5.48, 5.05 y 4.85
mpy cuando se mide por gravimetra, por resistencia a la polarizacin (Rp) y por
espectroscopa de impedancia electroqumica (EIE), respectivamente.

Por microscopa electrnica de barrido se visualiz que el tipo de corrosin
ocasionada por la bacteria fue uniforme y localizado.

146

CAPTULO 9
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158

CAPTULO 10
ANEXO
PRUEBAS ELECTROQUMICAS
159

10. Pruebas electroqumicas
10.1. Medicin de potencial-tiempo
Para que haya una transformacin electroqumica neta, es decir, para que se produzca
una reaccin, se necesita combinar dos elementos, por ejemplo, un metal sumergido en
una solucin tiende a reaccionar con el electrolito y as acumula una carga positiva o
negativa, de tal forma que alcanza un valor de potencial conocido como potencial de
corrosin (E
corr
), el cual es el potencial mixto entre los potenciales andico y catdico. Por
lo que la reaccin electroqumica se divide en dos o ms reacciones parciales de oxidacin
y reduccin, tal es el caso que se presenta, durante la corrosin de un material metlico,
donde las velocidades totales de oxidacin y reduccin deben ser equivalentes, de modo
que el proceso global de corrosin se verifica a un potencial intermedio entre los
potenciales andicos y catdicos (Gonzlez, 1989).
Es importante indicar que aunque E
corr
es muy til, su anlisis debe complementarse con
otras tcnicas electroqumicas para corroborar los mecanismos de corrosin (Padilla y col.,
2004).
10.2. Resistencia a la polarizacin (Rp)
La tcnica de resistencia a la polarizacin es una prueba rpida y fcil que permite
determinar la velocidad de corrosin instantnea de un sistema. Para determinar la Rp se
emplea el procedimiento descrito por la ASTM G 59-91, el cual hace referencia a un
barrido potenciodinmico en las proximidades del potencial de corrosin (E
corr
).
El mtodo de resistencia a la polarizacin se fundamenta en la teora del potencial mixto y
en conceptos bsicos desarrollados por Stern y Geary en 1957 (Fontana, 1986). Tales
fusiones demostraron que existe una relacin lineal entre el potencial aplicado (mV) o
sobrepotencial () y la densidad de corriente total (
neta
) aplicada a potenciales poco
alejados del potencial de corrosin (0.020 V) (Cottis y Turgoose, 1999).
La medicin de la velocidad de corrosin es actualmente equivalente a la determinacin
de los procesos electroqumicos cinticos de la corrosin. La frmula fundamental que
describe la cintica de las reacciones electroqumicas es la ecuacin de Butler-Volmer.

160

10.2.1. Ecuacin de Butler Volmer
De acuerdo a la teora del potencial mixto de la corrosin en ausencia de potenciales
externos aplicados, los procesos de oxidacin y reduccin ocurren simultneamente en la
interfase metal/electrolito, y no puede haber acumulacin de la carga elctrica neta. Bajo
estas circunstancias la corriente medida neta es cero, por ejemplo la corriente de
corrosin no se puede medir directamente.
Para determinar la cintica electroqumica de corrosin, una perturbacin por un
potencial de polarizacin externo es aplicada al electrodo, V, necesario para cambiar el
sistema de corrosin al potencial de corrosin V
corr
. Si las reacciones andicas y catdicas
en el electrodo de trabajo son totalmente controladas por activacin, y el potencial de
corrosin est lejos de los potenciales de equilibrio de las reacciones andicas y catdicas,
la ecuacin de Butler and Volmer puede ser aplicada.

Donde:
= Densidad de corriente.
= Densidad de corriente de corrosin.
Coeficientes que relacionan el potencial a travs de la doble capa electroqumica.
Nmero de electrones transferidos en la reaccin andica y catdica.
Constante de Faraday.
Constante de los gases.
Temperatura absoluta.
Sobrepotencial .

La ecuacin anterior desarrollada por Butler (1924) y Volmer (1930) es la frmula
fundamental para determinar las reacciones cinticas electroqumicas. Sin embargo, en
su aplicacin prctica para calcular la corriente de corrosin electroqumica, la ecuacin
ha sido simplificada. Aunque hay otras maneras de simplificar la ecuacin de Buttler-
Volmer, tal como el mtodo de tres puntos las dos formas ms comunes para simplificar la
ecuacin es por la ecuacin de Tafel y Stern-Geary (Bard y Faulkner, 1980).
161

10.2.2. La ecuacin de Tafel
La ecuacin de Tafel, primero planteada empricamente por dicho autor en 1905, puede
ser deducida de la ecuacin de Buttler-Volmer para valores lo suficientemente grandes de
potenciales aplicados.
Para la polarizacin andica, cuando , la siguiente ecuacin es obtenida:

Para la polarizacin catdica, cuando , se tiene:

Las ecuaciones que involucran el sobrepotencial ( y ) tienen la forma de la ecuacin de
Tafel:

Donde a y b son las pendientes de Tafel, para polarizacin andica y para polarizacin
catdica:

162

Sin embargo, el mtodo de Tafel (tambin conocido como mtodo de extrapolacin de
Tafel) tiene una desventaja, ya que es destructivo para la muestra evaluada debido al uso
de altos potenciales de polarizacin. As que el mtodo Tafel puede ser usado para
valores limites para el monitoreo continuo de la corrosin.
La extrapolacin de las curvas de polarizacin ha sido ampliamente usada para medir la
velocidad de corrosin (Emregl y Hayvali, 2004). Sin embargo, algunas de las limitaciones
de la extrapolacin de Tafel para calcular la velocidad de corrosin, pueden ser superadas
con el uso de la resistencia lineal a la polarizacin. A diferencia de la extrapolacin de
Tafel, en la tcnica de polarizacin lineal la superficie del metal es perturbada a bajo
potencial. Como tal, despus de cada experimento las condiciones de la superficie inicial
son restablecidas, sin algn cambio importante en la superficie del metal corrodo.
Adems, las variaciones de la velocidad de corrosin pueden ser determinadas fcilmente
con este mtodo. El clculo de la velocidad de corrosin por la tcnica de resistencia a la
polarizacin est basado en la ecuacin de Stern-Geary (Fontana, 1986).
10.2.3. Ecuacin de Stern y Geary
En 1957, Stern y Geary simplificaron la ecuacin de Buttler-Volmer para valores de
polarizacin bajos ( 10 mV) y desarrollaron su famosa ecuacin, la cual pude ser usada
para medir la polarizacin lineal y determinar la velocidad de corrosin sin daar
significativamente las muestras a estudiar (Singh, 1995).

Donde:
= Densidad de corriente de corrosin.
Pendientes de Tafel andica y catdica.
Resistencia a la polarizacin.
La resistencia a la polarizacin es definida como la tangente a la curva de polarizacin en
el potencial de corrosin.
163

Donde:
y = Sobrepotencial andico y catdico.
y = Densidad de corriente de polarizacin andica y catdica.

Cuando se mide la velocidad de corrosin usando la ecuacin de Stern-Geary, slo
potenciales bajos son aplicados (normalmente 10 mV) para evaluar el sistema. Si se
compara el mtodo de Tafel donde potenciales grandes son empleados, el mtodo de
Stern-Geary obviamente tiene la ventaja debido a que bsicamente es una tcnica no
destructiva.
Los valores (a y c) pueden ser determinados de diferentes formas: de las curvas de
Tafel, por mediciones de prdida de peso y por aproximaciones de curvas no lineales
propuesto por Mansfeld (Mansfeld y Kending, 1981). Pero adems, pueden ser estimados
por mediciones de polarizacin lineal de la ecuacin de Stern-Geary. Para una ms rpida
estimacin de la velocidad de corrosin los valores de las constantes de Tafel, a y c,
pueden ser consideradas prximas a 100 mVdec
-1
. Pourbaix (1973) estableci que si los
valores de a y c son de ~ 100mVdec
-1
, la velocidad de corrosin calculada debe ser
corregida por un factor de correccin de 2.2.
Aunque la polarizacin lineal es un mtodo tradicional para las mediciones
experimentales de los valores de Rp, en algunas circunstancias se ha encontrado que se
puede incurrir en errores en la medicin de la velocidad de corrosin (ASTM G 01-03,
2003). Esto puede ocurrir cuando los valores experimentales de Rp contienen
contribuciones de resistencias hmicas considerables. Se han propuesto diferentes
mtodos para eliminar los efectos de la resistencia hmica, pero un estudio detallado de
estas tcnicas demostr que stos tienen limitaciones y son difciles de aplicar (Pourbaix,
1973).

164

En la prctica, los valores de Rp para un sistema en corrosin se pueden estimar
polarizando la muestra en = 10 a 20 mV desde el E
corr
y se calcula la pendiente de la
grafica en funcin de
neta,
como se muestra en la Figura 63.

Figura 64. Relacin lineal entre la densidad de corriente, , y el sobrepotencial ,
que se obtiene cuando se polariza un sistema de corrosin ( 10 a 20 mV) desde
el E
corr
.

165

10.3. Espectroscopa de Impedancia Electroqumica (EIE)
La tcnica de Espectroscopia de Impedancia Electroqumica, es un mtodo electroqumico
utilizado en estudios de corrosin, el cual se basa en el uso de una seal de corriente
alterna (CA) que es aplicada a un electrodo (metal de corrosin) y se determina la
respuesta correspondiente.
En el procedimiento experimental ms comnmente usado, se aplica una pequea seal
de potencial (E) a un electrodo y se mide su respuesta en corriente (I) a diferentes
frecuencias. No obstante, en ciertas circunstancias, es posible aplicar una seal pequea
de corriente y medir la respuesta en potencial del sistema. As, el equipo electrnico
usado procesa las mediciones de potencial-tiempo y corriente-tiempo, dando como
resultado una serie de valores de impedancia correspondientes a cada frecuencia
estudiada. Esta relacin de valores de impedancia y frecuencia se denomina espectro de
impedancias (Cottis y Turgoose, 1999; Mendoza y col., 2003).
En el caso de los estudios de corrosin que utilizan las tcnicas de EIE, los espectros de
impedancia obtenidos suelen ser analizados mediante circuitos elctricos, compuestos por
componentes tales como resistencias (R), capacitancias (C), inductancias (L), etc.,
combinados de tal manera que reproduzcan los espectros de impedancia medidos. Estos
circuitos elctricos son denominados circuitos elctricos equivalentes. (Gonzlez, 1989;
Cottis y Turgoose, 1999; Mendoza y col., 2003).
Es comn referir el comportamiento electroqumico de un sistema simple de corrosin
bajo control por activacin y por corrosin uniforme en superficies homogneas, al
circuito equivalente de Randles (Figura 64).

Figura 65. Circuito equivalente para un proceso de corrosin simple.
166

La Figura 64 involucra: una resistencia (Rs), que se atribuye a la resistencia de la solucin,
resistencia de la pelcula de productos de corrosin, resistencia de los conductores y
resistencia del electrodo. Estos dos ltimos son despreciables con respecto a las dos
primeras resistencias. Rs se coloca en serie porque todas las corrientes durante el
proceso electroqumico deben pasar a travs de sta, y tambin a un capacitor (C),
asociado a la capacitancia de la doble capa, y una resistencia (Rtc), que representa la
resistencia a la transferencia de carga de electrones a travs de la superficie del metal.
Estos elementos se encuentran en paralelo porque la corriente total a travs de la
interfase de trabajo es la suma de la carga del capacitor de la doble capa y la corriente
fardica.
El tratamiento terico de la impedancia de este circuito (Figura 64) representa un
semicrculo con un componente real y uno imaginario (Figura 65), donde la impedancia
puede expresarse como (Silverman, 1986):
Ztotal = [Rs + Rtc / (1 + w
2
C
2
Rtc
2
)] [(j w C Rtc
2
/ (1 + w
2
C
2
Rtc
2
)]
Donde, w representa la velocidad angular y j el componente imaginario

Figura 66. Diagrama de Nyquist para un metal en proceso de corrosin con sus
componentes real e imaginario.
167

En el diagrama de Nyquist (Figura 65) se representa el comportamiento general de esta
ecuacin. A altas frecuencias, el capacitor no produce impedancia y toda la corriente
pasa por el capacitor; la nica impedancia es la resistencia hmica Rs. Conforme w
disminuye, la impedancia total es una combinacin de Rtc y C y se manifiesta en forma de
un semicrculo. A frecuencias muy bajas la C produce impedancias altas y por lo tanto el
flujo de corriente aumenta a travs de Rtc y Rs. Los diagramas de Nyquist permiten
calcular Rs, Rtc y C, adems de otros posibles componentes que controlan un proceso de
corrosin.
La velocidad de una reaccin qumica puede estar fuertemente influenciada por la
difusin de uno o ms reactantes o productos hacia la superficie. La respuesta de
impedancia a un proceso de corrosin dominado por control de difusin frecuentemente
tiene una nica caracterstica conocida como impedancia de Warburg. El diagrama de
Nyquist creado para este fenmeno se representa en la Figura 66.

Figura 66. Diagrama de Nyquist para un proceso gobernado por control de
difusin.
168

El circuito equivalente para este proceso es mostrado en la Figura 67. Donde W es la
impedancia de Warburg y representa un proceso de corrosin gobernado por el
fenmeno de difusin.

Figura 67. Circuito equivalente que modela la impedancia de Warburg.

La impedancia es un trmino que describe la resistencia elctrica (R), utilizada en circuitos de
corriente alterna (CA). En un circuito de corriente directa (CD) la relacin entre la corriente (I) y el
potencial (E) est dada por la Ley de Ohm.

En donde E es en volts, I en amperes y R en ohms. En el caso de una seal alterna la expresin
equivalente es la siguiente.

En donde Z representa la impedancia del circuito, con unidades de ohm. Es necesario hacer notar
que a diferencia de la resistencia, la impedancia de un circuito de CA depende de la frecuencia de
la seal que sea aplicada. La frecuencia (f) de un sistema de CA se expresa en unidades de hertz
(Hz) o nmero de ciclos por segundo (s
-1
).
De esta manera, es posible definir la admitancia (Y) de un circuito de CA. La admitancia es el
recproco de la impedancia y es un parmetro de importancia en los clculos matemticos que
involucra la tcnica y por otra parte, los equipos usados en estudios de EIE miden en realidad la
admitancia.

169

La impedancia de un sistema a cada frecuencia est definida por: la razn entre la amplitud de la
seal de corriente alterna y la amplitud de la seal de potencial alterno y el ngulo de fase. Un
listado de estos parmetros a diferentes frecuencias constituye el espectro de impedancia. El
desarrollo matemtico de la teora que fundamenta la tcnica de EIE permite describir la
impedancia de un sistema en trminos de un componente real y un componente imaginario
(asociado a la raz cuadrada de -1) (Cottis y Turgoose, 1999; Mendoza y col., 2003).
Los mtodos y tcnicas usadas para el estudio de la corrosin estn basados en mediciones
gravimtricas, electroqumicas, pticas y/o cambios en la superficie que ocurren durante los
procesos corrosivos. Sin embargo, cada una de estas tcnicas tienen sus limitaciones y
requerimientos, por lo tanto, el estudio de los procesos corrosivos slo puede ser realizado
mediante el uso de estas tcnicas de manera complementaria (Prez, 2004).

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, Nitrosomonas y Nitrobacter, disminuyen el

produciendo cido ntrico alcanzando un pH entre 3-5, requiere altas

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