Indicaciones generales de uso

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INDICACIONES GENERALES DE USO


Almacenamiento

Los medios de cultivo deshidratados son mezclas de sustancias higroscpicas, sensibles a la
humedad, el calor y la luz. A pesar de que el envase de los medios deshidratados est
protegido contra la luz y la humedad, el almacenamiento debe realizarse en las condiciones
apropiadas indicadas en los botes para conservar sus propiedades iniciales. Se debe evitar en
la medida de los posible, los cambios bruscos de temperatura y una vez abierto el bote, es
necesario mantenerlo cerrado para mantenerlo protegido de la hidratacin. El polvo de los
medios de cultivo deshidratados debe ser homogneo, libre de flculos y deben tener el color
inicial indicado para cada medio. Si hay algn cambio de la apariencia fsica, descartar el
medio.

La mayora de los medios deben ser almacenados a temperatura ambiental entre 2-25C. Para
ciertos medios de cultivo, el almacenamiento debe ser en nevera en un rango de temperatura
de 2-8C. Si no se describe lo contrario, los medios de cultivo de este manual se almacenaran
a 2-25C.

Dependiendo del medio y en condiciones adecuadas los medios de cultivo tienen una fecha de
caducidad de entre 2 y 4 aos. Los medios de cultivo deshidratados no deben consumirse
despus de la fecha de caducidad. Es importante que el stock de los cultivos en polvo sea lo
suficientemente grande para asegurar las aplicaciones necesarias, pero lo suficientemente
pequeo para asegurar la rotacin continua. A pesar de que la mayora de los medios de
cultivo pueden mantenerse en condiciones ambientales durante largos periodos de tiempo, no
todos son estables indefinidamente.

Antes del almacenamiento de los medios de cultivo, se deben revisar las indicaciones de su
etiqueta. En la etiqueta podrn encontrar diferentes smbolos detallados a continuacin:


Mantener protegido de la humedad.


Mantener alejado de la luz


Se indica lmite mximo y mnimo de temperatura




Preparacin

Antes de la preparacin del medio, se debe comprobar que el material que se va a utilizar est
en perfectas condiciones de limpieza. Todo el material debe estar aclarado con agua destilada
o desionizada. Tambin debe comprobarse que el medio no este deteriorado o haya cambiado
de su aspecto inicial. Se debe aadir la cantidad exacta indicada para cada medio en la
cantidad de agua tambin determinada. El agua debe ser destilada o desionizada y no debe
contener cloro, cobre, plomo, ni detergentes que puedan afectar al medio.

La buena disolucin del medio determina la claridad y efectividad del producto final. Es
fundamental obtener una disolucin homognea con la mnima exposicin al calor.

La cantidad de polvo requerida debe ser aadida a la mitad del volumen de agua. Despus de
que el polvo y el agua se mezclen totalmente, aadir el resto del agua, teniendo la precaucin
2C
25C

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de arrastrar todos los restos de la pared del recipiente y remover todo junto con cuidado. En
algunas ocasiones, antes de aadir el polvo, es recomendable calentar el agua a
aproximadamente 50C para mejorar la disolucin.

Dejar reposar la mezcla durante 5 minutos ayuda a obtener una suspensin uniforme. Algunas
de las formulas que no contienen gelatina o agar, se pueden disolver sin calor, sin embargo
existen medios que requieren calor para su disolucin completa y en ocasiones agitacin.
Aplicar calor uniformemente, la ebullicin debe ser lo ms breve posible (normalmente un
minuto o dos son suficientes). Seguir las instrucciones que aparecen en la etiqueta o en la ficha
tcnica para cada medio especfico.

Los medios que contienen agar pueden hervir repentinamente y salirse del recipiente donde se
est preparando. Para evitar lo se debe agitar frecuentemente cuando el medio empiece a
hervir.

Algunos medios, debido a su composicin, presentan una ligera turbidez o precipitacin. Es
fundamental en este tipo de medios que los componentes insolubles se distribuyan lo mejor
posible para que los nutrientes se distribuyan homogneamente.

AJUSTE DE pH

El pH de los medios se ajusta en el momento de la fabricacin, sin embargo, la calidad del
agua utilizada para la hidratacin o la utilizacin de medios no recientes pueden modificar este
parmetro por lo que es aconsejable verificarlo y reajustarlo si fuera necesario.

Para la verificacin del pH, se debe medir una muestra extrada del volumen total del medio
preparado a 25C, tanto en medios lquidos como slidos. En los casos donde se deba
reajustar el pH, se puede utilizar una solucin estril de cido clorhdrico (para acidificar el
medio) o hidrxido sdico (para basificar el medio). En medios slidos, el reajuste de pH debe
ser realizado antes de la solidificacin, por lo que ser necesario utilizar una muestra del
volumen total para la medicin a 25C y otra muestra a 45C para conocer el volumen de cido
clorhdrico o hidrxido sdico que hay que aadir en un volumen conocido.

Esterilizacin

Los medios de cultivo contienen diferentes organismos que proceden de las diferentes materias
primas y de los recipientes utilizados. Estos organismos deben ser eliminados antes de la
inoculacin para evitar falsos resultados. Existe una gran variedad de mtodos de esterilizacin
pero el ms utilizado es la esterilizacin por calor.

Las clulas vegetativas se eliminan rpidamente y a temperaturas alrededor de los 60C
durante 5-10 minutos, sin embargo, para la eliminacin de las esporas se necesitan una
temperatura de 121C durante 15 minutos.

Para la esterilizacin del medio seguir las instrucciones de preparacin de la etiqueta de cada
medio. En general, estas instrucciones son para volumen de medio pequeo. Para volmenes
ms grandes, es necesario incrementar el tiempo de esterilizacin. Hay que tener en cuenta
que aunque el tiempo de esterilizacin incremente, la temperatura utilizada se debe mantener.
En este caso, se deben hacer estudios de validacin para determinar cual es el ciclo necesario
para cada volumen.

Los medios que contienen carbohidratos no deben ser autoclavados a una temperatura que
exceda los 116-118C. En todos los casos se debe evitar el sobrecalentamiento.

En algunos medios lquidos, el calentamiento puede dar lugar a perdida de actividad de
algunos componentes. En estos casos se debe esterilizar por filtracin. La muestra se pasa a
travs de unos filtros en lo que se quedan retenidos los microorganismos, la eficacia de estos

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sistemas depende del tamao del poro del filtro o bien de su carga elctrica; a pH ptimo la
mayora de las bacterias tienen una carga de superficie negativa por lo que la filtracin ser
ms eficaz cuando ms positiva sea la carga del filtro.

Incorporacin de los Suplementos

Debido a que la mayora de los suplementos tienen algn compuesto termosensible, el medio
tiene que haberse enfriado a una temperatura de entre 45-50C. En el caso de los medios
slidos, es importante que no se enfre en exceso ya que si empieza a solidificar, el suplemento
no podr homogeneizarse bien en el medio.

En general, los suplementos estn liofilizados. La reconstitucin de los mismos debe ser
realizada con la sustancia indicada en cada caso. En el caso de que el suplemento deba ser
reconstituido con agua, se debe usar agua destilada estril.

El suplemento reconstituido debe aadirse cuando la suspensin este a temperatura ambiente.
(25C). Si se encuentra a una temperatura menor, la adicin del suplemento puede formar
grumos debido a la diferencia de temperatura del medio y del suplemento, provocando una
mala homogenizacin del suplemento.

Despus de la adicin del suplemento es fundamental realizar una buena homogenizacin.

Verter en placas

Antes de verter el agar en placas, se debe esperar a que el medio tenga una temperatura de
45-50C. Si la temperatura es ms alta, se puede formar una formacin excesiva de agua
condensada en las placas.

Antes de verter el medio en placas, se debe mezclar para la correcta homogenizacin. El
volumen en placas de 90 mm puede variar entre 15-20 ml, para generar una capa de 2-3 mm
de agar, a no ser que en las instrucciones de preparacin se indique una cantidad especfica.
Las placas se deben dejar enfriar a temperatura ambiente, en una superficie horizontal con la
tapa de la placa puesta. No se deben mover las placas hasta que solidifiquen. Se debe tener la
precaucin de evitar la formacin de burbujas en la superficie del agar. Una vez que las placas
estn solidificadas. Mantener en posicin invertida.

Conservacin de los medios preparados

Los ms recomendable es preparar el medio cuando se va a emplear, si esto no fuera posible,
es imprescindible que el medio preparado se mantenga en refrigeracin a 2-8C, apartado de la
luz. La refrigeracin favorece la deshidratacin del medio, por lo que antes de la utilizacin del
medio se debe observar si existe evidencia de deshidratacin. Se debe evitar la condensacin
ya que el depsito de gotas puede causar la alteracin del medio.

Recalentamiento

El recalentamiento del medio se debe hacer poniendo el frasco o tubo con la tapa cerrada en
bao mara, microondas o en autoclave en vapor fuerte. En medios que han sido esterilizados,
el recalentamiento debe ser el mnimo para evitar que el medio pierda calidad. Los medios
refundidos tienen una cierta tendencia al oscurecimiento o precipitacin, que aumenta cuando
se mantienen fundidos durante largos periodos de tiempo. El sobrecalentamiento debe ser
evitado. Nunca refundir el agar ms de una vez.





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Controles de calidad

Materias primas y fabricacin

Los controles de las materias primas es sumamente importante para posteriormente tener un
medio deshidratado de calidad. Es por ello que se deben hacer pruebas de compatibilidad con
otros ingredientes, de rendimiento y realizar pruebas fsico-qumicas. Algunos de los
constituyentes bsicos de los medios de cultivo son productos naturales y como consecuencia,
existe la posibilidad de que haya pequeas variaciones de sus caractersticas de lote a lote. Es
por ello que, adems de realizar los mismos controles que al resto de materias primas, se hace
un riguroso estudio para garantizar que los medios de cultivo tengan una reproductividad de
lote a lote.

Todas las fases de produccin se desarrollan de acuerdo a los controles de calidad internos
entre los que se encuentran mantenimiento, limpieza y calibracin de los equipos, control de
almacn y almacenamiento.

Tras la fabricacin, se controlan la apariencia, homogeneidad y humedad y se prepara el medio
para comprobar que todas las caractersticas tales como apariencia, pH, caractersticas fsico
qumicas y crecimiento sean correctos. Todos los controles se hacen en paralelo con un lote de
referencia aprobado anteriormente que permita que todos los lotes sean uniformes.

Controles de cal idad del cliente

Los medios de cultivo deben mantener las caractersticas indicadas en la etiqueta y el control
de calidad si el medio ha sido preparado adecuadamente. Para asegurar su calidad, se deben
hacer controles de cada lote para comprobar que todos los parmetros son correctos. Se debe
comprobar:

o pH: Todos los medios de cultivo deshidratados son fabricados de acuerdo a los valores
de pH indicados en la etiqueta. A pesar de esto, se debe verificar despus de la
esterilizacin, que el pH del medio concuerda con el correcto. La medicin del pH debe
ser realizada a una temperatura de 25C. Si fuera necesario, este pH se puede ajustar
antes de que el medio solidifique. Se debe evitar el exceso de ajuste de pH, ya que
esto puede alterar la composicin qumica del medio.

o Esterilidad: Se debe verificar que el medio este estril, incubando una muestra
significativa de las placas preparadas y dejando incubar a la temperatura indicada para
cada medio.

o Caractersticas fsico qumicas. Se debe observar el color del medio, la transparencia,
la existencia de partculas extraas.

o Crecimiento/inhibicin de organismos clave.


Posibles fallos

Cambio en el pH:

o El medio de cultivo estaba caducado o deteriorado
o Almacenamiento inadecuado
o Agua impura
o Pesada incorrecta
o Residuos en los recipientes utilizados o utilizacin de cristal alcalino
o Falta de homogenizacin
o Sobrecalentamiento
o Esterilizacin prolongada

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o pH medido a temperatura por encima de los 25C
o Recalentamientos repetidos

Solubilidad:
Precipitacin (en ocasiones la precipitacin puede ser parte esencial del medio, xej.
Bismuto Sulfite Agar)
o El medio de cultivo estaba caducado o deteriorado
o Almacenamiento inadecuado
o Agua impura
o Pesada incorrecta
o Residuos en los recipientes utilizados
o Agitacin insuficiente
o Falta de homogenizacin

Turbidez
o El medio de cultivo estaba caducado o deteriorado
o Almacenamiento inadecuado
o No se ha utilizado el agua adecuada
o Falta de homogenizacin
o pH incorrecto
o Disolucin incompleta
o Sobrecalentamiento
o Prdida de agua del medio preparado debido a la evaporacin

Ennegrecimi ento
o El medio de cultivo estaba caducado o deteriorado
o Pesada incorrecta
o Agitacin insuficiente
o Sobrecalentamiento
o pH incorrecto
o Recalentamientos repetidos

Gel Hidrolizado
o El medio de cultivo estaba caducado o deteriorado
o Pesada incorrecta
o Agitacin insuficiente
o Falta de homogenizacin
o Sobrecalentamiento
o Hidrlisis cida del agar
o Agar demasiado diluido
o Recalentamientos repetidos

Creci miento escaso
Debido a los medios de cultivo
o El medio de cultivo estaba caducado o deteriorado
o Pesada inadecuada
o Disolucin incompleta
o Sobrecalentamiento
o Recalentamientos repetidos
o Agar demasiado diluido

Debido a los suplementos
o El suplemento estaba caducado o deteriorado
o Mala reconstitucin del suplemento
o Adiccin de una concentracin menor de la requerida
o Mala homogeneizacin del suplemento con el medio de cultivo

Otros factores

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o Los organismos utilizados para el control del medio estaban daados
o Malas condiciones de cultivo

Color anormal del medio
o El medio de cultivo estaba caducado o deteriorado
o Agua impura
o Residuos en los recipientes utilizados
o Sobrecalentamiento
o pH incorrecto en el caso de que el medio lleve indicadores de pH

Toxicidad
o Residuos en los recipientes utilizados
o Agua impura

Contaminacin
o Esterilizacin insuficiente o inapropiada
o Fallos en la adiccin de suplementos o aditivos

Otros posibles errores en la preparacin de los medios
o El proceso de enfriamiento despus de la esterilizacin debe ser lento ya que un
enfriamiento brusco puede dar lugar a una prdida de las caractersticas del medio.
o Los medios que contienen tampones fosfatados y glucosa u otro carbohidrato pueden
oscurecer si existe sobrecalentamiento. Tambin puede aparecer un precipitado en
estos medios cuando se usa un agua de baja calidad
o Un fenmeno comn del sobrecalentamiento es la reaccin de Maillard, que causa una
decoloracin del medio y prdida de la calidad nutricional del medio. Esta reaccin es
causado normalmente por la reduccin de los azcares que interactan con los
aminocidos procedentes de las protenas. En estos casos los carbohidratos deben ser
esterilizados por separado.

Seguridad

Los medios de cultivo deben ser utilizados slo para Diagnostico in vitro. Las directrices de
preparacin deben ser ledas y seguidas escrupulosamente.

Los medios de cultivo deshidratados pueden contener sustancias peligrosas o txicas. Una
excesiva concentracin de polvo en el lugar de trabajo puede reducir la visibilidad y se pueden
depositar en ojos, odos o tracto respiratorio. La inhalacin de estas sustancias en altas
concentraciones puede ser perjudicial provocando irritacin de la nariz, garganta y tracto
respiratorio. por lo que es recomendable llevar mascarilla en el momento de utilizacin de los
medios deshidratados y proteccin en los ojos. Tambin es recomendable el uso de guantes.

Algunas de las sustancias peligrosas utilizadas en los medios de cultivo son: Acetamida,
Acriflavina, Sales Biliares, Verde Brillante, Cetrimida, Cloranfenicol, Cicloheximida, Dicloran,
Cloruro de Litio, Verde Malaquita, Rosa Bengal, Azida Sdica, Tergitol

Nunca se debe calentar un recipiente totalmente cerrado, ya que este puede explotar. Al
calentar un recipiente abierto, la abertura de debe dirigir en una direccin en la que si se
produce alguna salpicadura o proyeccin, no provoque lesin a alguien prximo o a uno mismo.

Si durante el cultivo se utiliza un mechero de gas (por ejemplo un mechero Bunsen),
asegurarse de que no haya cerca productos inflamables. Nunca se debe utilizar una llama
directa para calentar.

El medio ya cultivado debe ser autoclavado a 121C durante 30 minutos antes de su desecho
definitivo. Se debe hacer lo mismo con el material de laboratorio antes del lavado y nuevo uso.


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Los residuos txicos que se originen deben ser depositarlos en los contenedores especiales
que estn destinados para su recogida al igual que los productos de vidrio. Los productos
slidos tales como el agar no deben tirarse por el desage ya que se puede atascar el
sumidero.

Para ms informacin sobre seguridad existen a su disposicin MSDS

GUIA RAPIDA DE UTILIZACIN

Abreviaturas usadas

APHA American Public Health Association
AOAC Official Methods of Analysis of AOAC International
ATCC American Type Culture Collection
BAM Bacteriological Analytical Manual
CECT Coleccin Espaola de Cultivos Tipo (Spanish Type Culture Collection)
DEV Deutsches Einheitverfahren zur Wasser-, Abwasser-, und Schlammuntersuchung (German
Methods for the examinations of Water, Wastewater and Sludge
EP European Pharmacopeia
ISO International Organization for Standarization
NCCLS National Commitee of Clinical Laboratory Standards
NCTC National Collection of Type Cultures
USP United States Pharmacopeia
WHO World Health Organization

Informacin adicional para usuarios

o Estos productos son para uso profesional exclusivamente y deben ser utilizados slo
por personal capacitado o cualificado. No deben ser utilizados para anlisis auto
administrados por los pacientes.
o Las decisiones e interpretacin del diagnstico debe ser realizado por personal
capacitado o cualificado.
o No utilizar los medios preparados si muestran evidencia de contaminacin microbiana,
decoloracin, deshidratacin, grietas o cualquier otro signo de deterioro.
o Se deben seguir los protocolos estndar de extraccin, transporte y procesamiento de
muestras