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MICROBIOLOGIA LABORATORIAL

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Prof Maria Luisa Bertelle Faron
MEIOS DE CULTURA
Os meios de cultura destinam-se ao cultivo
artificial dos microrganismos.
Alm dos principais nutrientes necessrios
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Alm dos principais nutrientes necessrios
eles devem oferecer tambm todas as
outras condies indispensveis ao
desenvolvimento dos microrganismos, como
por exemplo, pH, atividade de gua, agentes
inibidores a flora de associao, etc.
CLASSIFICAO
QUANTO CONSISTNCIA:
SLIDOS
Usa-se normalmente o Agar, pois este no
decomposto pelas bactrias, por no ser
alimento, e se funde por volta de 49C.
Ex.: Agar Nutriente
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Ex.: Agar Nutriente
Agar Nutriente em placa de Petri
CLASSIFICAO
QUANTO CONSISTNCIA
Possuem uma baixa
porcentagem de agar
SEMI SLIDOS
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porcentagem de agar
(0,4%). So usados para
verificar a motilidade das
bactrias.
Ex: Agar motilidade
Agar Motilidade
CLASSIFICAO
QUANTO CONSISTNCIA
No Seletivos
Agem como diluentes iniciais, permitindo a manuteno e
moderado desenvolvimento de um ou mais
microrganismos.
LQUIDOS (CALDOS DE ENRIQUECIMENTO)
gua Peptonada (protena semi
hidrolisada). Diluente para
homogeneizao e diluio de
amostras para anlise.
Caldo BHI (caldo infuso crebro
corao) .Meio de enriquecimento e
manuteno para uso geral.
CLASSIFICAO
QUANTO CONSISTNCIA
Seletivos
Possuem nutrientes bsicos para o desenvolvimento do
microrganismo desejado, e agentes seletivos capazes de inibir o
desenvolvimento dos contaminantes. Devem recuperar unidades
ou dezenas do microrganismo em estudo.
LQUIDOS (CALDOS DE ENRIQUECIMENTO)
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Caldo Rappaport
Para Salmonella
Caldo Lauril Sulfato Triptose
Deteco presuntiva de
coliformes totais, Fecais e
E. coli pelo mtodo de NMP.
Caldo EC
Para Coliformes
ou dezenas do microrganismo em estudo.
CLASSIFICAO
QUANTO COMPOSIO
SIMPLES
So destinados ao cultivo de microrganismos pouco
exigentes de agentes nutritivos. Servem de base para
outros meios, como tambm para conservao e
transporte de cepas de bactrias. transporte de cepas de bactrias.
Agar TSA/TSB (gar Tripticase de Soja)
CLASSIFICAO
QUANTO COMPOSIO
ENRIQUECIDOS
So meios com bases simples adicionados de
substncias que vo melhorar o seu valor
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nutritivo. So usados para o cultivo de
microrganismos mais exigentes. Como
substncias enriquecedoras so usados: extrato
de carne, extrato de levedura, hidratos de carbono
como glicose, sacarose, arabinose, etc.
CLASSIFICAO
QUANTO FINALIDADE
So meios destinados a
facilitar o isolamento de
certos microrganismos que
esto em determinados
materiais em quantidade
reduzida ou acompanham
DE ENRIQUECIMENTO
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reduzida ou acompanham
uma flora de associao rica.
So meios lquidos na maioria
das vezes e agem
favorecendo a recuperao
dos microrganismos a serem
isolados e inibindo
freqentemente a outra flora.
Caldo Fraser- Listria
CLASSIFICAO
QUANTO FINALIDADE
DIFERENCIAIS
EMB (E.coli - lactose (+))
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So os meios que diferem as espcies de bactrias, pelo
comportamento bioqumico. Ex.: EMB (eosina-metileno-blue).
Possui em sua composio: lactose, agar e corantes (eosina e
azul de metileno indicadores de pH).
As bactrias lactose (+) fermentam o acar produzindo cido
ltico, baixando o pH do meio e precipitando os corantes.
As UFC (Unidade Formadora de Colnias) das bactrias lactose
(+) apresentam cor escura e as lactose (-) incolores
CLASSIFICAO
QUANTO FINALIDADE
So aqueles que ao mesmo tempo
selecionam e diferenciam as
espcies bacterianas. Ex.: Agar SS
Salmonella.
Possue citrato de sdio, tiossulfato
DIFERENCIAIS e
SELETIVOS
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Possue citrato de sdio, tiossulfato
de Sdio e cloreto frrico que
participam do metabolismo dessa
bactria.
Tambm possui sais biliares que
favorecem o crescimento desse
microrganismo e inibem os
contaminantes, como por exemplo,
os Gram positivos (enterococos).
SS AGAR
CLASSIFICAO
QUANTO FINALIDADE
MEIOS DE
IDENTIFICAO
Identificam os
Indol
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Identificam os
microrganismos
atravs de provas
bioqumicas
especificas.
Ex.: Trplice Agar
Modificado (IAL).
LTD
Fermentao da Sacarose
Glicose
Produo de Gs
Produo de H
2
S
Produo de Urease
Interfase
Lisina descarboxilase
Motilidade
Trplice Agar Modificado (IAL) um meio usado para a
identificao bioqumica das enterobactrias, atravs de
8 reaes especficas (produo de Indol, produo de
LTD L-triptofano desaminase, fermentao de sacarose
e glicose, produo de H
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S, produo de Urease,
Descarboxilao de Lisina e Motilidade).
Dessa maneira podemos identificar primariamente as
enterobacterias veiculadoras de doenas tais como:
13 E.coli Salmonella sp Vibrio cholerae Shigella sp
enterobacterias veiculadoras de doenas tais como:
CLASSIFICAO
QUANTO FINALIDADE
MEIOS DE IDENTIFICAO
Outros meios indicadores so
usados tambm em pesquisas
de microrganismos diversos
AGAR MOTILIDADE
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de microrganismos diversos
como: Listeria monocytogenes,
Staphylococcus aureus,
Bacillus cereus, Clostridium
perfringens, etc.
AGAR PALCAM
PREPARO, DISTRIBUIO
E CONTROLE DOS MEIOS
DE CULTURA
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DE CULTURA
PREPARO DOS MEIOS
DESIDRATADOS:
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- Os meios desidratados so higroscpicos e muito
sensveis a umidade, ao calor e a luz.
- So afetados de maneira adversa por mudanas
drsticas na temperatura, como p.ex., variaes na
temperatura ambiente que podem ocorrer no inverno.
RECONSTITUIO DOS MEIOS
DESIDRATADOS:
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Instrues completas para o preparo do meio so
dadas no rtulo do frasco.
Como regra geral, interessante preparar uma
quantidade suficiente para uma semana.
RECONSTITUIO DOS MEIOS
DESIDRATADOS:
Usar gua destilada, ons txicos como cobre devem
estar ausentes. Verificar os controles de resduos na
vidraria, antes do uso.
Para permitir uma homogeneizao adequada,
preparar o meio em frasco com capacidade igual a
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preparar o meio em frasco com capacidade igual a
duas vezes o volume final do meio. Seguir as
instrues do rtulo da cada produto.
Abrir o frasco do meio de cultura longe de correntes
de ar e umidade. Evitar inalar o p e o contato
prolongado com a pele. Pesar o meio rapidamente de
maneira precisa, sem criar nuvens de poeira.
Fechar novamente o frasco, to logo seja possvel.
RECONSTITUIO DOS MEIOS
DESIDRATADOS:
Meios sem gar geralmente dissolvem-se com uma
leve agitao.
Meios contendo gar devem ser aquecidos antes
da autoclavagem para completa dissoluo. Ferver
o meio sem queim-lo.
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Meios que no podem ser autoclavados estaro
prontos para serem distribudos em placas ou em
outros materiais aps o aquecimento necessrio.
Para o preparo desses meios, usar todo o material
estril.
A maioria dos meios de cultura requer esterilizao
final em autoclave a 121C por 15 minutos.
ESTERILIZAO DOS MEIOS DE
CULTURA:
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Esterilizao em autoclave
VERIFICAO DA ESTERILIZAO:
Os indicadores biolgicos de esterilizao
indicam a capacidade da autoclave de destruir
esporos bacterianos.
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B. subtillis
B. stearothermophillus
MORTE MICROBIANA E FORMAS DE
DESTRUIO DE MICRORGANIMOS
Morte microrganismo perde a capacidade de se
reproduzir
Agentes de destruio microbiana - inibi ou destroem os
microrganismos : microrganismos :
- Lesando sua membrana citoplasmtica
- Alterando seu metabolismo celular
- Alterando as protenas e cidos nuclicos (DNA e RNAde
sua clula.
Mtodos de controle e
destruio dos microrganismos
ASSEPSIA: processo usado para
eliminar microrganismos patognicos
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eliminar microrganismos patognicos
das superfcies, equipamentos e
manipuladores.
Mtodos de controle e destruio
dos Microrganismos
A assepsia engloba as seguintes etapas:
Degermao a remoo de microrganismos da
pele por meio de limpeza mecnica (sabes,
detergentes ou escovagem) aplicada sobre tecidos
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detergentes ou escovagem) aplicada sobre tecidos
vivos.
Desinfeco - destruio dos microrganismos
patognicos e/ou inativao dos vrus, no
necessariamente destruindo os esporos. A
desinfeco aplicada em pisos, paredes, superfcies,
equipamentos, mveis e utenslios.
Mtodos de controle e destruio
dos microrganismos
DESINFESTAO: a exterminao ou destruio
de insetos, roedores ou outros que transmitam
contaminaes ao homem, a outros animais ou ao
meio
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ESTERILIZAO e DESCONTAMINAO: a
eliminao total dos microrganismos, de seus
esporos, bem como a inativao completa dos vrus.
A esterilizao aplicada nos instrumentais,
vidrarias e no ar ambiente (ultra-violeta).
Meios de destruio microbiana
Meios Meios Meios Meios fsicos fsicos fsicos fsicos:
- Calor seco: (ar quente circulante) produzido por:
estufas ou forno de Pasteur - esteriliza materiais,
vidrarias instrumentos 180C/1 hora morte por
oxidao do material celular. Vantagem: material sai
seco.
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seco.
- Calor mido sob presso: - autoclave esteriliza a
121C a uma presso de 15 libras num tempo de 15
a 30 minutos - morte por coagulao do material
celular. (desnaturao protena, inativao
enzimtica, desorganizao dos lipdeos e alterao
dos cidos nuclicos). mais eficiente que o calor
seco.
Meios de destruio microbiana
- Radiao ultravioleta: reduz microrganismos de
reas de processamento, laboratrios, cmaras de
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reas de processamento, laboratrios, cmaras de
repicagem, etc. para isso usada lmpadas que
emitem radiao ultravioleta, que provoca radiaes
letais ou modificaes qumicas irreversveis no
DNA da clula.
Meios qumicos de destruio
microrganismos
Sanificantes qumicos: visa reduzir os
microrganismos a nveis seguros de
superfcies e utenslios.
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superfcies e utenslios.
Principais sanificantes: cloro, iodo,
desinfetantes fenlicos, clorhexidina, lcool
70%, lcool iodado.
METODOLOGIA
MICROBIOLGICA
MTODOS DE AVALIAO QUANTITATIVA
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MTODOS DE AVALIAO QUANTITATIVA
E CARACTERIZAO DAS BACTRIAS E
FUNGOS
Os principais mtodos de
semeadura podem ser:
Em placas - meios slidos (Contagem
padro em placas).
Em tubos mltiplos meios lquidos
(NMP = Nmero Mais Provvel).
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(NMP = Nmero Mais Provvel).
Tais mtodos tm sido usados para
determinar as populaes microbiolgicas
viveis em alimentos e gua. Eles nos do
resultados reais.
Os meios e as condies ideais para determinar a
contagem variam de um microrganismo para outro
(tempo e temperatura de incubao).
Microrganismos mesfilos
10C a 45C, sendo a temperatura ideal em torno
de 30C a 35C com tempo de incubao de 48
horas
Microrganismos termfilos
20C a 37C sendo capazes de se multiplicar a
50C - 55C com tempo de incubao de 48
horas
Microrganismos psicotrficos
Abaixo de 7C sendo a temperatura tima de
crescimento em torno de 20C a 30C com
perodo de incubao de 7 a 10 dias
Microrganismos Termo-Resistentes Microrganismos Termo-Resistentes
(Termotolerantes)
44,5C 45,5C ou mais com perodo de
incubao de 24 horas
SEMEADURA EM PLACAS:
Superfcie: (Surface ou Spread plate)
Aps o preparo,
distribuio em placas
de Petri, incubao e
devidos controles, o
meio de cultura estar
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meio de cultura estar
liberado para uso.
Proceder as diluies
seriadas da amostra
com auxlio de pipetes
bacteriolgicas.
SEMEADURA EM PLACAS:
Verter 0,1ml de cada
diluio sobre o
meio.
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Com auxlio da
Ala de Drigalsky
ou do Basto em L,
espalhar todo o
material sobre a
superfcie do meio
de cultura at o total de cultura at o total
esgotamento do
mesmo.
Incubar (tempo e temperatura indicados).
Deixar secar por 15 minutos e incubar as placas na posio
invertida
EXEMPLOS DE SEMEADURA DE
SUPERFCIE:
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Semeadura de superfcie: usada para contagem em meios especficos,
slidos (BP, MYP, etc). o meio especfico no caso tambm usado para
isolamennto e pr identificao do microrganismos, para isso trabalha-se
com alquotas menores (0,1ml). Pode-se tambm semear em superfcie
com ala de platina.
Desvantagem: carregar muito as placas com semeaduras sem critrio,
pode crescer "melecas" e nenhuma colnia isolada.
Agar Baird Parker:
Pesquisa de S.aureus
Agar MYP (Mossel):
Pesquisa de B.cereus
SEMEADURA EM PLACAS
Profundidade: (Pour Plate)
Preparar as diluies necessrias da
amostra;
Pipet-las nas placas correspondentes com
auxlio de pipetas bacteriolgicas;
Verter o meio de cultura fundido e resfriado Verter o meio de cultura fundido e resfriado
(44-46C) e homogeneizar;
Deixar solidificar o Agar e incubar as placas
invertidas (tempo e temperatura indicados).
A contagem considerada entre 30-300
UFCs (Unidades Formadoras de Colnias).
Expresso dos resultados =
n de UFC x Diluio utilizada = UFC/g ou ml.
EXEMPLOS DE SEMEADURA DE
PROFUNDIDADE:
Agar Nutriente ou PCA (Plate Count Agar):
Contagem Total de Aerbios Mesfilos Viveis.
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IMPORTANTE: O Mtodo de Semeadura de Profundidade deve ser
acompanhado de um controle branco, uma placa aberta com o
meio de cultura usado, durante toda semeadura
EXEMPLOS DE SEMEADURA DE
PROFUNDIDADE:
Agar OGAY ou Agar PDA (Potato Dextrose Agar):
Contagem Total de Bolores e Leveduras.
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Semeadura em profundidade: a quantidade de inculo grande (1mL) e
por isso deve ser homogeneizada juntamente com o meio de cultura,
fundido e resfriado.
Desvantagem: pode haver contaminao cruzada ambiental durante o
processo.
Bolores
Leveduras
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
Barbosa, H. R. & Torres, B. B. Microbiologia bsica, Atheneu, 1999.
Franco, B. D. G. M. & Landgraf, M. Microbiologia dos alimentos. Atheneu,
1996.
40
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Forsythe, S. J. Microbiologia da segurana alimentar. Artmed, 2002.
Tortora, G. J., Funke, B. R. & Case, C. L. Microbiologia. Artmed, 6. edio,
2000.