Protenas oligomricas y sus aplicaciones

WO 2010122181 A1
Abstract
Las protenas oligomricas comprenden una pluralidad de protenas de fusin y un
marcador, comprendiendo cada protena de fusin un polipptido que comprende un
anticuerpo o un fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo, y un
polipptido que comprende un dominio de oligomerizacin. Dichas protenas oligomricas
pueden utilizarse para detectar, visualizar y localizar dianas de inters.
Claims (OCR text may contain errors)
REIVINDICACIONES
1. Una protena oligomrica que comprende una pluralidad de protenas de fusin, iguales o
diferentes, y un marcador (M), en la que cada protena de fusin comprende:
(b) un polipptido (A) que comprende un anticuerpo o un fragmento funcionalmente
equivalente de dicho anticuerpo; y
(b) un polipptido (B) que comprende un dominio de oligomerizacin.
2. Protena oligomrica segn la reivindicacin 1, en la que dicho marcador (M) es un
fluorforo o un radionucleido.
3. Protena oligomrica segn la reivindicacin 1, en la que dicho polipptido (A)
comprende un anticuerpo que reconoce una diana, o un fragmento funcionalmente
equivalente de dicho anticuerpo que reconoce una diana, en donde dicha diana es un
eptopo o determinante antignico de un antgeno.
4. Pro tena oligomrica segn la reivindicacin 3, en la que dicho antgeno es un antgeno
que se expresa de novo o se sobreexpresa en una alteracin patolgica.
5. Protena oligomrica segn la reivindicacin 1, en la que dicho polipptido (A)
comprende un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un fragmento Fab, F(ab')
2

o Fab', un fragmento Fv de cadena nica (scFv), un diabody o un anticuerpo monodominio
(VHH).
6. Protena oligomrica segn la reivindicacin 1 , en la que dicho dominio de
oligomerizacin presente en dicho polipptido (B) comprende el dominio NCl de colgeno
XVIII o del colgeno XV de mamfero, opcionalmente desprovisto total o parcialmente del
dominio de endostatina (ES).
7. Pro tena oligomrica segn la reivindicacin 1, constituida por 2 ms protenas de
fusin, iguales o diferentes.
8. Un procedimiento para la obtencin de una protena oligomrica segn cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, que comprende poner en contacto una protena oligomrica que
comprende una pluralidad de protenas de fusin, iguales o diferentes, en la que cada
protena de fusin comprende: i) un polipptido (A) que comprende un anticuerpo o un
fragmento funcionalmente equivalente del mismo; y ii) un polipptido (B) que comprende
un dominio de oligomerizacin, con un marcador (M) bajo condiciones que permiten la
unin de dicho marcador (M) a la protena oligomrica.
9. Empleo de una protena oligomrica segn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en un
mtodo para la deteccin, visualizacin o localizacin de una diana.
10. Empleo segn la reivindicacin 9, en el que dicha diana es un antgeno que se expresa
de novo o se sobreexpresa en una alteracin patolgica.
11. Un mtodo para la deteccin, visualizacin o localizacin de una diana que comprende
el empleo de una protena oligomrica segn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
12. Mtodo segn la reivindicacin 11, en el que dicho mtodo se basa en una tcnica de
imagen.
13. Mtodo segn la reivindicacin 11, en el que dicha diana es un antgeno que se expresa
de novo o se sobreexpresa en una alteracin patolgica.
14. Una composicin que comprende una protena oligomrica segn cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, junto con, al menos, un medio apropiado.
15. Una composicin farmacutica que comprende una protena oligomrica segn
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, junto con, al menos, un vehculo
farmacuticamente aceptable.
16. Un kit que comprende una protena oligomrica segn cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7.
17. Empleo de un kit segn la reivindicacin 16, para la deteccin, visualizacin o
localizacin de una diana.
18. Empleo segn la reivindicacin 17, en el que dicha diana es un antgeno que se expresa
de novo o se sobreexpresa en una alteracin patolgica.
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PROTENAS OLIGOMERICAS Y SUS APLICACIONES
CAMPO DE LA INVENCIN
La invencin se relaciona con una protena oligomrica que comprende una pluralidad de
protenas de fusin, iguales o diferentes, y un marcador, en la que cada protena de fusin
comprende un polipptido que comprende un anticuerpo o un fragmento funcionalmente
equivalente de dicho anticuerpo, y un polipptido que comprende un dominio de
oligomerizacin. Dichas protenas oligomricas pueden ser utilizadas para detectar,
visualizar y localizar dianas de inters.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIN
Los procedimientos de imagen en medicina se refieren a tcnicas y procesos no invasivos
usados para crear imgenes del aspecto interno del cuerpo de un animal, para propsitos
clnicos, por ejemplo, procedimientos mdicos para diagnosticar una enfermedad o para
localizar dicha enfermedad. En un sentido amplio, incluye tcnicas tales como ciencias
radiolgicas, endoscopia, termografa mdica y microscopa. Tradicionalmente, los estudios
de laboratorio para evaluar la actividad de las terapias anticancergenas en ratones han
requerido el sacrificio de mltiples animales en cada etapa para proporcionar datos
significativos. Las tcnicas de imagen, sin embargo, permiten una evaluacin precisa del
crecimiento tumoral y a tiempo real en animales de laboratorio, lo que disminuye de forma
considerable el nmero de sujetos requeridos.
La tomografa por emisin de positrones, TEP o PET (por las siglas en ingls de Positrn
Emission Tomography) es una tcnica propia de una especialidad mdica llamada medicina
nuclear y de la radiologa, al combinar imgenes de TAC (ejemplos de imgenes 3D). Se
trata de una tcnica no invasiva de diagnstico e investigacin por imagen capaz de medir
la actividad metablica de los diferentes tejidos del cuerpo humano, especialmente del
sistema nervioso central. Al igual que el resto de tcnicas diagnsticas en Medicina
Nuclear, la TEP se basa en detectar y analizar la distribucin que adopta en el interior del
cuerpo un radioistopo administrado a travs de una inyeccin. La TEP permite, por
ejemplo, localizar los focos de crecimiento celular anormal en todo el organismo, en un
solo estudio e independientemente de la localizacin anatmica donde se presente la
neoplasia (primaria o metastsica), ya que Ia TEP no evala la morfologa de los tejidos,
sino su metabolismo. Por tanto, se ha implantado con mucha fuerza como tcnica
diagnstica en oncologa, adems de otras reas, como son la cardiologa, la neurologa y la
psicobiologa, dada la posibilidad de cuantificar el metabolismo tanto cardiaco como en el
sistema nervioso central. La tcnica de fluorescencia es una tcnica de imagen que permite
estudiar las propiedades de sustancias orgnicas o inorgnicas utilizando el fenmeno de
fluorescencia. En la mayora de los casos, se marca especficamente un componente de
inters en la muestra, con una molcula fluorescente llamada fluorforo. La muestra se
ilumina con luz de una determinada/s longitud/es de onda, que es absorbida por los fluor
foros, originando una emisin de luz a longitudes de onda mayores (o a diferente color que
la luz absorbida). La cantidad y la longitud de onda de la energa emitida dependen del
fluorforo y del entorno qumico del fluorforo. Entre los fluor foros ms comnmente
utilizados se encuentran la fluorescena isotiocianato (FITC), los derivados de la rodamina
(TRITC), comarina y cianina, los fluorforos "Alexa Fluor" y "DyLight Fluor", la familia
de la cianina (e.g., Cy3, Cy5 y Cy 7).
La tcnica de imagen por fluorescencia in vivo es igual que la microscopa de
fluorescencia, difiere nicamente en que trabaja a nivel macroscpico. Los objetos para
imagen por fluorescencia son el cuerpo completo de (pequeos) animales. Molculas que
absorben en la regin del infrarrojo cercano (NIR), 700-1.000 nm, pueden ser utilizadas
para visualizar e investigar dianas moleculares in vivo, ya que la mayora de los tejidos
generan poca fluorescencia NIR. Los fluorforos orgnicos NIR ms comunes son las
polimetinas (e.g., pentametina y heptametina). Las sondas utilizadas para imagen por
fluorescencia in vivo pueden ser dirigidas o no dirigidas. Las dirigidas tienen la ventaja de
que se pueden dirigir especficamente a un tejido diana. De esta manera, las sondas se unen
a sus dianas, mientras que las no unidas se eliminan de la circulacin. Esta aproximacin es
muy til para realizar imgenes de tumores in vivo, ya que en cncer, normalmente se
sobreexpresan ciertos receptores de superficie. Un ejemplo de sondas dirigidas pueden ser
molculas de anticuerpos conjugadas con cianinas o "quantum dots". Tambin se pueden
utilizar molculas ms pequeas dirigidas, en lugar de anticuerpos, por ejemplo cido flico
conjugado con un fluorocromo NIR que proporciona imgenes de macrfagos activados
implicados en enfermedades inflamatorias de articulaciones. Dichas molculas iran
dirigidas al receptor de cido flico. Dentro del grupo de las sondas dirigidas, los
anticuerpos presentan la ventaja de su rpido aislamiento y que tienen una alta afinidad por
virtualmente, cualquier antgeno.
Por otra parte, diferentes ensayos sistemticos in vivo han proporcionado una confirmacin
de que el tamao es un parmetro importante en frmaco cintica y biodistribucin de
molculas de anticuerpos monoclonales. As, parece ser que molculas grandes de IgG (150
kDa) que reconocen antgenos de superficie expresados por las clulas tumorales penetran
en los tumores slidos muy lentamente, con una distribucin no uniforme, y tienen una vida
media srica muy larga [Holliger et al. Nature Biotec. 2005; 23: 1126-36]. Por el contrario,
pequeos fragmentos de anticuerpo de cadena nica (scFv) monovalentes, con un tamao
de 25-30 kDa son mucho ms eficientes en la penetracin al tumor, pero son eliminados
demasiado rpido y poseen adems una pobre retencin en el tumor, debido a sus
propiedades de unin monovalente. Un anticuerpo ideal para localizar tumores debera ser
una molcula multivalente de tamao intermedio, que proporcione una penetracin ms
rpida en el tumor, una mayor retencin en el tejido diana y una eliminacin sangunea ms
rpida. Estudios recientes indican que anticuerpos bivalentes, tales como los "diabodies"
(60 kDa), pueden ser ms apropiados para las tcnicas de imagen [Williams et al., 2001;
Cncer Biother. Radiopharm.; 16:25-35]. Los "diabodies" son molculas dimricas no
unidas covalentemente, formadas espontneamente en formato scFv con espaciadores
cortos que conectan la regin variable de los genes. Debido a su pequeo tamao, se
eliminan rpidamente a travs de los rones, limitando, por tanto, su exposicin a la
mdula sea, que es frecuentemente el rgano dosis-limitante con los anticuerpos intactos
radiomarcados. Molculas ms grandes bivalentes, tales como los "minibodies" (dmeros
scFv-CH3) y ScFv
2
-Fc se pueden acumular en tumores y estos ltimos pueden disearse
con un espectro amplio de vidas medias en suero, modulando la interaccin con el receptor
FcRn. Los "minibodies" pueden ser ideales para localizar tumores, ya que penetran mejor y
tienen una eliminacin rpida con lo que consiguen mejores proporciones tumor-sangre que
las inmunoglobulinas intactas (150 kDa) o los fragmentos Fab
2
(110 kDa). Sin embargo, a
pesar de los buenos resultados obtenidos con estos formatos en varios modelos [Williams et
al, 2001; Cncer Biother. Radiopharm.; 16:25-35 y Adams et al, 1998; Br. J. Cncer
77:1405-12], an existen algunas limitaciones que necesitan ser solucionadas con el fin de
obtener las mayores ventajas de la capacidad de localizacin de estos anticuerpos
recombinantes. Una de las limitaciones es su limitada flexibilidad, y, otra, la necesidad de
que el segundo antgeno est orientado de manera precisa en un rea estrictamente definida
una vez que el anticuerpo se una al primer antgeno. De esta manera, los antgenos unidos
deberan encontrarse casi opuestos al "diabody", y en el caso del "minibody", en una
pequea rea circular, que, en algunos casos impide la unin del segundo antgeno. Esto
implica que parte de la afinidad observada depende principalmente de la unin y de la
capacidad de volverse a unir ("rebinding"), y no de la unin simultnea a diferentes
molculas del antgeno.
Existe, por tanto, la necesidad de desarrollar reactivos para diagnstico por imagen,
basados en anticuerpos, que permitan la deteccin, visualizacin o localizacin de una
diana de inters, tal como un antgeno asociado con una alteracin patolgica, que superen
la totalidad o parte de los inconvenientes previamente mencionados.
COMPENDIO DE LA INVENCIN
Los inventores han desarrollado un nuevo formato de anticuerpo, en forma de protena
oligomrica que comprende una pluralidad de protenas de fusin, comprendiendo cada
protena de fusin un dominio de unin de un anticuerpo o de un fragmento funcionalmente
equivalente del mismo, y un dominio de oligomerizacin, marcada posteriormente con un
marcador adecuado para su aplicacin en tcnicas de diagnstico por imagen. Dichas
protenas oligomricas pueden ser utilizadas para detectar, visualizar o localizar una diana
de inters, tal como un antgeno asociado con una alteracin patolgica.
Efectivamente, tal y como se ilustra en el Ej emplo 1 , dichas protenas oligomricas son
agentes efectivos para la localizacin de depsitos tumorales in vivo. En una realizacin
particular, los inventores han generado varias protenas trimricas, en ocasiones
identificadas como "trimerbodies", una especfica frente al hapteno NIP, otra frente al
antgeno carcinoembrionario (CEA) humano, y otra que reconoce un eptopo de la laminina
asociado a angiognesis, y las han caracterizado tanto in vitro como in vivo. Se ha
estudiado en detalle su estabilidad, su especificidad y afinidad y sus propiedades de
localizacin tumoral, observndose que todas ellas eran multivalentes y posean una
excelente caracterstica de unin al antgeno, lo que les proporciona una elevada afinidad
funcional (avidez). Asimismo, los trimerbodies anti-CEA conjugados qumicamente con un
marcador fluorescente mostraron una eficiente localizacin del tumor en un modelo
experimental de carcinoma colorrectal humano en ratones y los trimerbodies anti- laminina
mostraron una localizacin excelente en varios tipos de cncer humano, incluyendo
fibrosarcomas y carcinomas. Estos resultados demuestran el potencial de este nuevo
formato de anticuerpo para aplicaciones teraputicas y diagnsticas. Por tanto, en un
aspecto, la invencin se relaciona con una protena oligomrica que comprende una
pluralidad de protenas de fusin, iguales o diferentes, y un marcador (M), en la que cada
protena de fusin comprende:
(a) un polipptido (A) que comprende un anticuerpo o un fragmento funcionalmente
equivalente de dicho anticuerpo; y (a) un polipptido (B) que comprende un dominio de
oligomerizacin.
En otro aspecto, la invencin se relaciona con un procedimiento para la obtencin de dicha
protena oligomrica.
En otro aspecto, la invencin se relaciona con el empleo de dicha protena oligomrica, en
un mtodo para la deteccin, visualizacin o localizacin de una diana. Un mtodo para la
deteccin, visualizacin o localizacin de una diana que comprende el empleo de dicha
protena oligomrica constituye un aspecto adicional de esta invencin.
En otro aspecto, la invencin se relaciona con una composicin que comprende dicha
protena oligomrica y un medio apropiado.
En otro aspecto, la invencin se relaciona con una composicin farmacutica que
comprende dicha protena oligomrica y un vehculo farmacuticamente aceptable.
En otro aspecto, la invencin se relaciona con un kit que comprende dicha protena
oligomrica. El empleo de dicho kit para la deteccin, visualizacin o localizacin de una
diana constituye un aspecto adicional de esta invencin. BREVE DESCRIPCIN DE LAS
FIGURAS
La Figura 1 describe la caracterizacin molecular de los trimerbodies purificados. (A) Perfil
de elucin del experimento de filtracin en gel de las construcciones L36 [L36 trimerbody
(lneas ms oscura) y L36 scFv (lnea ms clara)]. Los volmenes de exclusin (V
0
) y total
(V
T
) estn indicados. Los volmenes de elucin de marcadores de peso molecular
seleccionados se indican con flechas, as como sus correspondientes pesos moleculares.
Para que quede de manera clara, la absorbancia de ambos cromatogramas se ha escalado y
movido de posicin en la figura. (B) La funcionalidad de los trimerbodies purificados se
demostr por ELISA en placas tapizadas con albmina srica bovina (BSA), laminina-1
murina, hapteno NIP conjugados con BSA (NIPio-BSA) y CEA humano; y (C) mediante
citometra de flujo en clulas tumorales CEA-negativas y CEA-positivas. Se muestran
control de isotipo (histograma gris), trimerbody anti-CEA (lnea slida) y trimerbody anti-
NIP (lnea de puntos). (D) Anlisis de la interaccin del scFv B 1.8 y del trimerbody B 1.8
a NIP
10
- BSA utilizando BIAcore. Las curvas muestran los datos obtenidos tras la
sustraccin de la respuesta de unin a una superficie de referencia tapizada con BSA (1900
UR), para eliminar los efectos de la unin no especfica. Tambin se muestran sensogramas
representativos que corresponden con las curvas de unin de afinidad ajustadas de los
trimerbodies scFv Bl .8 y trimerbody Bl .8 (dil. 1200 y 800 nM) en buffer HBS-EP
inyectado sobre las mismas celdas que anteriormente.
La Figura 2 describe actividades de unin de molculas de trimerbody mono- especficas y
bi-especficas. Se comparan sobrenadantes de clulas 293T transfectadas con pEGFP-Nl,
pCR3.1-L36-NCl
ES"
, pCEP4-B1.8-NCl
ES"
con sobrenadantes de clulas 293T
transfectadas con pCR3.1-L36-NCl
ES"
y pCEP4-B1.8-NCl
ES"
, utilizando ELISA directo
(A), usando placas tapizadas con BSA, conjugados NIPio-BSA y laminina-1, y por ELISA
sandwich (B) utilizando placas tapizadas con laminina.
La Figura 3 describe la estabilidad de las molculas de trimerbody en suero. Los
trimerbodies L36 purificados se incubaron en suero humano o de ratn a 37
0
C, tal y como
se detalla en el Ejemplo 1 (materiales y mtodos) y la funcionalidad de las mezclas de
reaccin se analizaron por ELISA.
La Figura 4 describe la localizacin de anticuerpos conjugados con un fluorforo (cianina 5
; Cy5) en un modelo de cncer gstrico (C E A-positivo) experimental en ratones desnudos.
Imgenes de infrarrojo cercano en ratones desnudos portadores de un carcinoma gstrico
MKN45 subcutneos (s.c). Imgenes ventral (A, C) y dorsal (B, D) tomadas 3, 24 y 48h
tras la inyeccin intravenosa (i.v.) con trimerbodies (Bl.8, MFE-23 yL36) marcados con
Cy5 (A, B), o scFv L36 marcados con Cy5 (C, D). b: bladder, t: tumor.
La Figura 5 describe la localizacin de trimerbodies conjugados con un fluorforo (cianina
5; Cy5) en varios modelos de cncer humano (CE A-negativo) experimental en ratones
desnudos. Imgenes de infrarrojo cercano de ratones desnudos portadores de fibrosarcomas
HT 1080 humanos s.c. (A) o carcinomas de cervix (HeLa) humanos s.c. (B). Las imgenes
fueron tomadas 3, 24 y 48h tras la inyeccin intravenosa (i.v.) con trimerbodies marcados
con Cy5.
La Figura 6 describe un modelo estructural de trimerbody. Vista lateral (A) y superior (B)
del modelo molecular del trimerbody de anti-laminina L36.
DESCRIPCIN DETALLADA DE LA INVENCIN Definiciones
Tal como aqu se utiliza, el trmino "diana" incluye una parte de una macromolcula que es
reconocida por un anticuerpo; en una realizacin particular, dicha diana es un eptopo o
determinante antignico de un antgeno. Un "antgeno", tal como aqu se utiliza, se refiere a
una sustancia que induce la generacin de anticuerpos y puede generar una respuesta
inmune. Los antgenos, habitualmente, son protenas o polisacridos, e incluyen partes de
clulas, bacterias, virus y otros microorganismos. Atendiendo a su origen, un antgeno
puede ser (i) exgeno, es decir, un antgeno que ha entrado en el cuerpo de un sujeto desde
el exterior, por ejemplo, mediante inhalacin, ingestin, inyeccin, etc.; (ii) endgeno, es
decir, un antgeno generado en el interior celular como resultado del metabolismo celular
normal o debido a una infeccin intracelular, e.g., bacteriana, vrica, etc., incluyendo
antgenos xenognicos (heterlogos), autlogos e idiomticos o alognicos (homlogos); o
(iii) autoantgeno, es decir, una protena (o un complejo de protenas) normal que es
reconocida por el sistema inmune de un sujeto que padece una enfermedad autoinmune.
Una clase especialmente importante de antgenos tumorales (o neoantgenos), es decir,
antgenos que son presentados por molculas del complejo mayoritario de
histocompatibilidad de tipo I (MHC I) o de tipo II (MHC II) sobre la superficie de clulas
tumorales; cuando dichos antgenos tumorales son presentados nicamente por clulas
tumorales pero no por clulas normales se denominan "antgenos especficos de tumor"
(TSA, del ingls "tumor-specific antigen") y, en general, proceden de una mutacin
especfica del tumor; alternativamente, los antgenos tumorales que son presentados tanto
por clulas tumorales como por clulas normales se denominan "antgenos asociados a
tumor" (TAA, del ingls "tumor-associated antigen") y, en general, proceden de una
mutacin especfica del tumor.
El trmino "anticuerpo", tal como aqu se utiliza, se refiere a una inmunoglobulina, o a un
fragmento de la misma, con capacidad de unin a un antgeno e incluye todo tipo de
anticuerpos, e.g., anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, etc., as como
fragmentos de anticuerpos tales como fragmentos Fab, F(ab')
2
, Fab', fragmentos Fv de
cadena nica (scFv, del ingls single chain Fv), anticuerpos monodominio (V
HH
),
diabodies, etc. En una realizacin particular de la invencin, dicho anticuerpo es un
fragmento de un anticuerpo, tal como, por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')
2
, Fab', scFv o
V
HH
, los cuales pueden producirse directamente mediante clulas hospedadoras
recombinantes. En una realizacin particular y preferida, el anticuerpo es un scFv.
Un fragmento "Fv" es un fragmento de anticuerpo mnimo que contiene un sitio completo
de reconocimiento del antgeno y de unin al antgeno. Esta regin est formada por un
dominio variable de una cadena pesada (VH) y un dominio variable de una cadena ligera
(VL) asociados no covalentemente.
Los fragmentos "scFv" comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo, formando una
cadena polipeptdica nica (VH-VL). Preferiblemente, el polipptido Fv comprende
adicionalmente un polipptido conector (linker) entre los dominios VH y VL (VH- linker-
VL) que permite al scFv formar la estructura deseada para la unin al antgeno.
Informacin adicional sobre scFv puede encontrarse en "The Pharmacology of Monoclonal
Antibodies", vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, N. Y., pgs. 269-315
(1994).
El trmino "diabodies" se refiere a un fragmento de anticuerpo con dos sitios de unin al
antgeno, comprendiendo una VH conectada a una VL en la misma cadena polipeptdica
(VH- linker- VL). Mediante el uso de un conector que sea demasiado corto como para
permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son
forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena, y crear dos sitios
de unin al antgeno.
El trmino "V
HH
", tal como aqu se utiliza se refiere anticuerpos monodominio [Nguyen et
al, Adv. Immunol. (2001), 79:261-96.; Nguyen et al, Embo J. (2000), 19 (5):921-30.;
Sheriff & Constantine, Nat. Struct. Biol. (1996), 3 (9):733-6). En especies de camlidos
(camellos, dromedarios, llamas, etc.) una parte de sus anticuerpos carece de cadena ligera,
estando la zona de reconocimiento de los antgenos constituida nicamente por el dominio
VH [Desmyter et al., J. Biol. Chem. (2002), 277 (26):23645- 50]. Este dominio VH se
diferencia de los dominios VH de otros anticuerpos en que sus zonas de reconocimiento del
antgeno estn formadas por bucles de mayor tamao. As, a los dominios VH de
anticuerpos de camlidos se les denomina V
HH
. Este dominio (V
HH
) de aproximadamente
15 kDa puede expresarse en el periplasma de E. coli manteniendo la capacidad de unin a
su antgeno. Los V
HH
son molculas ms estables que los scFv, y al contrario que stos
raramente agregan. Al igual que los dominios VL y VH de ratn, los dominios V
HH
poseen
un enlace S-S intramolecular que estabiliza su estructura terciaria y es necesario para su
correcto plegamiento [Desmyter et al, J. Biol. Chem. (2002), 277 (26):23645-50].
El trmino "marcador", tal como aqu se utiliza, se refiere a cualquier tipo de molcula que
indica la existencia de un proceso qumico, fsico o biolgico, que se puede introducir en un
organismo con el fin de examinar alguna propiedad. Los mareajes pueden ser radiactivos o
no radiactivos. El mareaje radiactivo o isotpico se ha empleado con ms frecuencia,
aunque va siendo desplazado progresivamente por los mtodos no radiactivos. Aunque no
existe consenso acerca del mareaje ideal, en la mayora de los casos se hace con
32
P. Puesto
que la corta vida media de este istopo (14 das) crea dificultades en la preparacin,
comercializacin y uso rutinario de los ensayos, se utilizan tambin otras alternativas (
35
S,
3
H,
125
I,
14
C, etc.). En cuanto a los marcadores no radiactivos, en funcin del marcador
empleado, la deteccin se hace por fluorometra o aadiendo un sustrato especfico cuya
transformacin enzimtica por la enzima marcadora puede detectarse por alguno de los
siguientes principios: (i) espectrofotometra: medida de la absorcin de luz por los
productos de la reaccin, bien solubles o insolubles, en el ultravioleta o el visible
(colorimetra), (ii) fluorometra: medida de la luz emitida por productos de la reaccin que
poseen un molcula fluorescente, o (iii) quimioluminiscencia: medida de luz emitida como
consecuencia de reacciones con esta caracterstica. Estos y otros procedimientos se pueden
aplicar a la deteccin de protenas, antgenos o pequeos ligandos.
En concreto, la fluorometra se puede utilizar para mareaje in vivo. De esta manera, se
puede marcar especficamente un componente de inters en una muestra, con una molcula
fluorescente, llamada fluorforo. Uno de los fluor foros ms comnmente utilizados es la
fluorescena isotiocianato (FITC), un reactivo derivado de la fluorescena, que se acopla
qumicamente a otras molculas para crear nuevas molculas fluorescentes para una
variedad de aplicaciones. Otros fluorforos histricamente muy utilizados son los derivados
de la rodamina (TRITC), comarina y cianina. Nuevas generaciones de fluorforos incluyen
el "Alexa Fluor" y los "DyLight Fluor", ms fotoestables, ms brillantes y menos sensibles
a cambios de pH que otros marcadores conocidos. Dentro de la familia de la cianina, se
incluyen los marcadores Cy3, Cy5, Cy5.5 y Cy7, que son reactivos fluorescentes solubles
en agua. Los marcadores Cy3 son amarillo -naranja (excitacin a 550 nm
aproximadamente, emisin a aproximadamente 570 nm), mientras que los Cy5 son
fluorescentes en la regin del rojo (aproximadamente a 650/670 nm). Normalmente son
sintetizados con grupos reactivos en una o en ambas cadenas laterales de nitrgeno, de
manera que pueden ser acoplados qumicamente, tanto a cidos nucleicos como a protenas,
siendo ampliamente usados en tcnicas de diagnstico por imagen. Por otra parte, dentro de
los fluorforos orgnicos para el infrarrojo cercano (NIR), los ms comunes son las
polimetinas de frmula general (I)

(I) donde
Ri y R
2
, independientemente entre s, representan alquilo C
1
-C
10
, sulfoalquilo
C1-C10, cicloalquilo C
3
-C
10
, alcoxilo C
1
-C
10
, o arilo;
R
3
y R
4
, independientemente entre s, representan sulfoalquilo C
1
-C
10
, haloalquilo C
1
-C
10
, o
hidroxicarbonilalquilo C
1
-C
10
;
Y es C, O, S; y n es un nmero entero comprendido entre 1 y 10.
Entre las polimetinas ms tiles se encuentran las cianinas pentametina (n = 1) y
heptametina (n= 2) que comprenden un grupo benzoxazol, benzotiazol, indolil, 2- quino lin
4-quinolin.
Protena oligomrica de la invencin
En otro aspecto, la invencin se relaciona con una protena oligomrica, en adelante
protena oligomrica de la invencin, que comprende una pluralidad de protenas de fusin,
iguales o diferentes, y un marcador (M), en la que cada protena de fusin comprende:
(a) un polipptido (A) que comprende un anticuerpo o un fragmento funcionalmente
equivalente de dicho anticuerpo; y
(b) un polipptido (B) que comprende un dominio de oligomerizacin. El marcador (M)
presente en dicha protena oligomrica de la invencin puede ser prcticamente cualquier
marcador; no obstante, para sus aplicaciones en tcnicas de diagnstico por imagen dicho
marcador (M) es un marcador adecuado para dichas tcnicas, por ejemplo, (i) un fluorforo,
tal como un fluorforo para diagnstico por imagen por fluorescencia en la zona cercana al
infrarrojo, e.g. Cy5, Cy7 etc.; (ii) un radionucleido para radioinmunoescintigrafa
[compuestos que emiten partculas gamma: 99mTc,
111
In,
131
I, renio 186 (
186
Re)] o para
tomografa por emisin de positrones (TEP) (marcador TEP); etc. En una realizacin
particular, dicho marcador (M) es un fluorro, tal como Cy5, Cy7, etc., o un marcador TEP,
tal como
64
Cu,
68
Ga,
18
F,
86
Y,
76
Br,
89
Zr,
124
I, etc. En general, el uso en clnica humana de
anticuerpos recombinantes con fines diagnstico requiere el empleo de marcadores tipo
TEP ("inmuno-TEP"), los cuales, por sus caractersticas, permitirn detectar lesiones
pequeas, incluyendo micrometstasis, localizadas en zonas profundas; alternativamente,
para detectar lesiones ms superficiales, se podran utilizar fluorforos, e.g., marcadores
fluorescentes NIR, en localizaciones ms accesibles, por ejemplo, piel, fondo de ojo, etc.
[Wu & Olafsen. Cncer J. (2008). May-Jun; 14(3):191-7; van Dongen GA et al. (2007).
Oncologist. Dec; 12(12):1379-89.
La protena oligomrica de la invencin comprende una pluralidad de protenas de fusin,
iguales o diferentes, y un marcador (M), comprendiendo cada una de dichas protenas de
fusin comprende un polipptido (A) que comprende un anticuerpo o un fragmento
funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo; y un polipptido (B) que comprende un
dominio de oligomerizacin.
En una realizacin particular, dicha protena oligomrica de la invencin comprende una
pluralidad de protenas de fusin iguales; en cuyo caso, cada una de dichas protenas de
fusin comprende un mismo polipptido (A) que comprende un anticuerpo o un fragmento
funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo; y un mismo polipptido (B) que
comprende un dominio de oligomerizacin.
En otra realizacin particular, dicha protena oligomrica de la invencin comprende una
pluralidad de protenas de fusin diferentes, por ejemplo, dos o ms protenas de fusin
diferentes. En este caso, una de dichas protenas de fusin comprende un polipptido (Al)
que comprende un anticuerpo (1) o un fragmento funcionalmente equivalente de dicho
anticuerpo (1); y un polipptido (B) que comprende un dominio de oligomerizacin, y otra
de dichas protenas de fusin comprende un polipptido (A2) que comprende un anticuerpo
(2) o un fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo (2); y un polipptido
(B) que comprende un dominio de oligomerizacin, en donde dichos anticuerpos (1) y (2)
son diferentes. El nmero total de protenas de fusin presentes en la protena oligomrica
de la invencin depender del dominio de oligomerizacin, dependiendo del dominio de
oligomerizacin siendo posible prcticamente cualquier combinacin entre dichas protenas
de fusin iguales o diferentes, siempre y cuando el dominio de oligomerizacin se
mantenga. El hecho de que la protena oligomrica de la invencin comprenda dos o ms
protenas de fusin diferentes permite reconocer e interaccionar con dos o ms dianas (e.g.,
antgenos) diferentes. A modo ilustrativo, no limitativo, la protena oligomrica de la
invencin puede contener dos protenas de fusin diferentes entre s, tal como se ha
mencionado previamente; o, alternativamente, dos protenas de fusin iguales entre s y una
protena de fusin diferente; o, alternativamente, dos protenas de fusin iguales entre s y
otros dos protenas de fusin diferentes pero iguales entre s; o, alternativamente, dos
protenas de fusin iguales entre s y otros dos protenas de fusin diferentes entre s y
diferentes a las dos protenas de fusin iguales; o, alternativamente, tres protenas de fusin
diferentes entre s; etc.; en general, cualquier combinacin de protenas de fusin que
comprendan un polipptido (A) que comprende un anticuerpo o un fragmento
funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo, y un polipptido (B) que comprende un
dominio de oligomerizacin, en las que se mantenga dicho dominio de oligomerizacin.
La protena oligomrica de la invencin comprende dos o ms protenas de fusin, iguales
o diferentes; por tanto, puede reconocer e interaccionar con una nica diana (antgeno), o,
alternativamente, con dos o ms dianas (e.g., antgenos) diferentes, lo que la convierte en
un reactivo muy verstil monoespecfico (es decir, cuando reconoce a una nica diana o
antgeno), o multiespecfico (es decir, cuando reconoce a ms de una diana o antgeno, e.g.,
biespecfico, si reconoce dos dianas o antgenos diferentes, triespecficos, si reconoce tres
dianas o antgenos diferentes, etc. El polipptido (A) comprende un anticuerpo o un
fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo. Dicho anticuerpo, o fragmento
funcionalmente equivalente, reconoce una diana, tal como un eptopo o determinante
antignico de un antgeno; en una realizacin particular, dicho antgeno es un antgeno
tumoral, tal como CEA (Begent RH et al. Nat Med. (1996) Sep; 2(9):979-84), o un
antgeno no tumoral que se expresa en reas de angiognesis activas en el microambiente
peritumoral, tal como el dominio EDB de la fibronectina (Ebbinghaus C et al. Curr Pharm
Des. (2004); 10(13):1537-49).
En una realizacin particular, el polipptido (A) comprende un anticuerpo que reconoce
una diana o un fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo que reconoce
dicha diana. Prcticamente cualquier anticuerpo, o fragmento funcionalmente equivalente
del mismo, que reconozca una diana puede ser utilizado en la presente invencin, por
ejemplo, un anticuerpo monoclonal (AcM) o un anticuerpo policlonal (AcP);
alternativamente, dicho polipptido (A) puede contener un fragmento funcionalmente
equivalente de un anticuerpo, tal como un fragmento de anticuerpo que mantiene la
capacidad de reconocimiento de la diana reconocida por el anticuerpo completo del que
deriva, e.g., un scFv, un anticuerpo biespecfico o diabody que reconoce dicha diana o bien
en su formato recombinante completo (Fab + Fc), o un anticuerpo monodominio V
HH

preferentemente, un scFv (Ejemplo 1).
En una realizacin particular, el polipptido (A) comprende un anticuerpo que reconoce
una diana o un fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo que reconoce
dicha diana. Prcticamente cualquier anticuerpo, o fragmento funcionalmente equivalente
del mismo, que reconozca una diana puede ser utilizado en la presente invencin, por ej
emplo, un anticuerpo monoclonal AcM o policlonal AcP; alternativamente, dicho
polipptido (A) puede contener un fragmento funcionalmente equivalente de un anticuerpo,
tal como un fragmento de anticuerpo que mantiene la capacidad de reconocimiento de la
diana reconocida por el anticuerpo completo del que deriva, e.g., un scFv, un anticuerpo
biespecfico o diabody que reconoce dicha diana o bien en su formato recombinante
completo (Fab + Fc), preferentemente, un scFv (Ejemplo 1).
En una realizacin particular, dicho polipptido (A) comprende un scFv recombinante
derivado del AcM L36 anti-laminina (Ejemplo 1) [scFv L36] que contiene la regin
variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal L36 fusionada, a travs de un
espaciador, tal como un pptido que comprende la secuencia (Gly-Ser)
4
(o una secuencia de
tipo Gly-Ser-Pro-Gly, o bien comprende la secuencia Leu-Glu-Gly-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-
Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Ala-Ser-Gly-Ser), a la regin variable de la cadena ligera
(VL) del AcM L36 y cuya secuencia ya ha sido descrita [Sanz L et al. Cncer Immunology
and Immunotherapy, 2001 Dec; 50(10)557- 65], en donde el extremo 3' de la secuencia
codificante de VH est unido al extremo 5' de la secuencia codificante de dicho linker y el
extremo 3 ' de la secuencia de nucletidos codificante de dicho linker est unido al extremo
5 ' de la secuencia codificante de VL. El AcM L36 reconoce lamininas de diferentes
especies de animales, por ejemplo, de ratn, rata, humanos, etc., ya que interacciona con
una regin que est muy conservada entre diferentes especies de animales [Sanz L et al.
EMBO J 2003, VoI. 22(7):1508-1517]. En otra realizacin particular, dicho polipptido (A)
comprende un scFv recombinante derivado del AcM Bl .8 especfico del hapteno NIP
(Ejemplo 1) que contiene la regin variable de la cadena pesada (VH) del AcM B 1.8
fusionada, a travs de un espaciador, a la regin variable de la cadena ligera (VL) del AcM
Bl .8; en una realizacin particular, dicho espaciador comprende una secuencia de tipo Gly-
Ser-Pro- GIy, o de tipo (Gly-Ser)4, o bien comprende la secuencia Leu-Glu-Gly-Ala-Gly-
Gly- Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Ala-Ser-Gly-Ser.
En otra realizacin particular, dicho polipptido (A) comprende un scFv recombinante
derivado del AcM MFE23 especfico del antgeno carcino embrionario (CEA) humano
(Ejemplo 1) que contiene la regin variable de la cadena pesada (VH) del AcM MFE23
fusionada, a travs de un espaciador, a la regin variable de la cadena ligera (VL) del AcM
MFE23; en una realizacin particular, dicho espaciador comprende una secuencia de tipo
Gly-Ser-Pro-Gly, o de tipo (Gly-Ser)
4
, o bien comprende la secuencia Leu-Glu-Gly-Ala-
Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Asp- Gly-Ala-Ser-Gly-Ser.
Dicho polipptido (A) puede reconocer y unirse a una diana, e.g., presente en un antgeno
tumoral, y, como resultado de esa unin, localizar la diana (antgeno) y permitir su
visualizacin mediante tcnicas de imagen apropiadas (e.g., fluorescencia, TEP, etc.)
debido a la presencia del marcador (M) en la protena oligomrica de la invencin.
El polipptido (B) comprende un dominio de oligomerizacin. Dicho dominio de
oligomerizacin puede ser prcticamente cualquier dominio que permite la formacin de
oligmeros, por ejemplo, dmeros, trmeros, tetrmeros, etc., de pptidos o protenas,
susceptible de ser expresado de forma recombinante y de formar un oligmero proteico de
la protena que lo comprende. No obstante, en una realizacin particular, dicho dominio de
oligomerizacin es un dominio de trimerizacin, tal como el dominio de trimerizacin del
dominio NCl de colgeno XVIII o del colgeno XV de mamfero. Como es conocido, dicho
dominio NC l del colgeno XVIII (y del colgeno XV) comprende un dominio de
trimerizacin y el dominio endostatina (ES) unidos por unos pptidos bisagra. Por tanto, en
una realizacin particular, la protena de fusin presente en la protena oligomrica de la
invencin comprende un polipptido (B) que comprende el dominio NCl del colgeno XV
o el dominio NCl del colgeno XVIII que contiene el dominio de trimerizacin pero al que
se le ha eliminado el dominio de ES (NC 1
ES"
) as como la totalidad o parte de los pptidos
bisagras existentes entre dichos dominios. Las secuencias de dichos dominios NCl de
colgeno XV y de colgeno XVIII son conocidas; a modo ilustrativo, la secuencia del
dominio NCl del colgeno XVIII ha sido descrita previamente por Sasaki et al. [Sasaki et
al. Structure, function and tissue forms of the C-terminal globular domain of collagen
XVIII containing the angiogenesis inhibitor endostatin. EMBO J. 1998 Aug 3;17(15):4249-
56].
Por tanto, a modo ilustrativo, en una realizacin particular, la invencin proporciona una
protena oligomrica de la invencin que comprende un marcador (M) y una pluralidad de
protenas de fusin, iguales o diferentes, en donde cada protena de fusin comprende:
(i) un polipptido (A) que comprende un anticuerpo o un fragmento funcionalmente
equivalente del mismo; y
(ii) un polipptido (B) que comprende el dominio NC1
ES"
de colgeno XVIII de mamfero.
No obstante, cualquier otro dominio similar al dominio NC 1 de colgeno XVIII que
comprenda un dominio de oligomerizacin puede ser utilizado en la puesta en prctica de la
presente invencin, con el fin de generar la protena oligomrica de la invencin.
Debido a la presencia del dominio de oligomerizacin en la protena de fusin presente en
la protena oligomrica de la invencin, la protena oligomrica de la invencin puede estar
constituida por 2 ms, por ejemplo, 3, 4, 5, o ms protenas de fusin, iguales o diferentes
entre s, dando lugar a dmeros, trmeros, tetrmeros, pentmeros, etc. de las protenas de
fusin proporcionadas por esta invencin. En una realizacin particular, dicha protena
oligomrica de la invencin es un trmero y comprende 3 protenas de fusin
proporcionadas por esta invencin; dado que dichas protenas de fusin incorporan un
anticuerpo o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo, dichos trmeros han sido
denominados por los inventores con el nombre genrico de "trimerbody" (singular) o
"trimerbodies" (plural). En una realizacin ms concreta, dicha protena oligomrica de la
invencin es un trmero y comprende 3 protenas de fusin iguales proporcionadas por esta
invencin; en otra realizacin ms concreta, dicha protena oligomrica de la invencin es
un trmero y comprende 3 protenas de fusin proporcionadas por esta invencin, de las
cuales dos son iguales entre s y la otra es diferente; y, en otra realizacin ms concreta,
dicha protena oligomrica de la invencin es un trmero y comprende 3 protenas de fusin
diferentes proporcionadas por esta invencin.
La protena de fusin proporcionada por esta invencin puede contener, adems, si se
desea, un tercer polipptido (C) que comprende la secuencia de aminocidos de un pptido
de unin flexible entre dichos polipptidos (A) y (B) y/o un pptido (D) para facilitar el
aislamiento o purificacin de la protena de fusin.
Dicho polipptido (C) puede comprender prcticamente cualquier secuencia peptdica que
defina un pptido de unin flexible. Ejemplos ilustrativos de pptidos de unin flexibles
incluyen secuencias de tipo Gly-Ser-Pro-Gly o la secuencia (Gly-Ser)
4
. No obstante, en una
realizacin particular, dicho pptido de unin flexible comprende la secuencia Leu-Glu-
Gly-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Ala-Ser-Gly-
Ser. Asimismo, con el fin de facilitar el aislamiento y purificacin de la protena de fusin
de la invencin, dicha protena de fusin puede contener, si se desea, un pptido (D)
susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento o purificacin de la protena de fusin,
tal como un pptido etiqueta ("tag"). Dicho pptido (D) puede estar situado en cualquier
posicin de la protena de fusin que no altere la funcionalidad de ninguno de los
polipptidos (A) y (B); a modo ilustrativo, no limitativo, dicho pptido (D) puede estar
situado a continuacin del polipptido (B). Prcticamente cualquier pptido o secuencia
peptdica que permita el aislamiento o purificacin de la protena de fusin puede ser
utilizado, por ejemplo, secuencias de polihistidina, secuencias peptdicas susceptibles de ser
reconocidas por anticuerpos que pueden servir para purificar la protena de fusin resultante
por cromatografa de inmunoafinidad, tales como pptidos etiqueta, por ejemplo, eptopos
derivados de la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe, C-myc, FLAG, V5, etc.
La protena oligomrica de la invencin puede obtenerse mediante un procedimiento que
comprende poner en contacto una protena oligomrica que comprende una pluralidad de
protenas de fusin, en la que cada protena de fusin comprende:
(i) un polipptido (A) que comprende un anticuerpo o un fragmento funcionalmente
equivalente del mismo; y
(ii) un po lip pti do (B ) que comprende un dominio de oligomerizacin, con un marcador
(M) bajo condiciones que permiten la unin de dicho marcador (M) a la protena
oligomrica. Dicho procedimiento constituye un aspecto adicional de esta invencin.
Las caractersticas de dichos polipptidos (A) y (B) as como las del marcador (M) ya han
sido definidas previamente. Las condiciones que permiten la unin de dicho marcador (M)
a dicha protena oligomrica dependen del marcador (M) elegido y de la protena
oligomrica y, en general, son conocidas por los tcnicos en la materia.
La protena oligomrica de la invencin, debido a sus caractersticas propias, puede ser
utilizada en numerosas aplicaciones, por ejemplo, en la visualizacin de antgenos mediante
tcnicas de imagen, tanto in vitro como in vivo (e.g., fluorescencia, TEP, etc.), en la
localizacin de antgenos, etc., en general, en la identificacin de alteraciones patolgicas
asociadas con la neoexpresin o sobreexpresin de antgenos, e.g., patologas inflamatorias
(e.g., integrinas, etc.), patologas vasculares (e.g., placas de ateroma, etc.), patologas
tumorales, etc. En una realizacin particular, dichos antgenos son antgenos tumorales.
Por tanto, en otro aspecto, la invencin se relaciona con el empleo de una protena
oligomrica de la invencin, en un mtodo para la deteccin, visualizacin o localizacin
de una diana, tal como un antgeno, mediante una tcnica apropiada, por ejemplo, una
tcnica de imagen. En una realizacin particular dicha diana es un antgeno que se expresa
de novo (es decir, que en condiciones normales no se expresa pero que en una alteracin
patolgica se expresa) o sobreexpresa (es decir, que en condiciones normales se expresa en
un nivel basal y su expresin aumenta en caso de una alteracin patolgica), por ejemplo,
en patologas inflamatorias, vasculares, tumorales, etc. En una realizacin particular, dicha
diana es un antgeno tumoral. Alternativamente, en otro aspecto, la invencin se relaciona
con un mtodo para la deteccin, visualizacin o localizacin de una diana, tal como un
antgeno, mediante una tcnica apropiada, por ejemplo, una tcnica de imagen, que
comprende el empleo de una protena oligomrica de la invencin. En una realizacin
particular dicha diana es un antgeno que se expresa de novo o se sobreexpresa en una
alteracin patolgica, por ejemplo, en patologas inflamatorias, vasculares, tumorales, etc.
En una realizacin particular, dicha diana es un antgeno tumoral. Para su empleo en dichas
aplicaciones, la protena oligomrica de la invencin se encontrar en un medio apropiado y
adecuado para su administracin.
Por tanto, en otro aspecto, la invencin se relaciona con una composicin que comprende
una protena oligomrica de la invencin junto con, al menos, un medio apropiado, tal
como un medio que no altera a la estabilidad de dicha protena oligomrica de la invencin,
por ejemplo, PBS, solucin salina fisiolgica, etc. Alternativamente, dicha protena
oligomrica de la invencin puede encontrarse en un medio constituido por un sistema de
suministro y liberacin de compuestos, por ejemplo, un vector viral o no viral (e.g.,
nanopartculas a base de polmeros biocompatibles, liposomas, etc.). Dichos vectores son,
en general, conocidos por los tcnicos en la materia.
Para sus aplicaciones in vivo, dicho medio debe ser farmacuticamente aceptable. Por
tanto, en otro aspecto, la invencin se relaciona con una composicin farmacutica que
comprende una protena oligomrica de la invencin junto con, al menos, un vehculo
farmacuticamente aceptable. En una realizacin particular, la composicin farmacutica
de la invencin comprende, al menos, una protena oligomrica de la invencin en una
cantidad eficaz. En el sentido utilizado en esta descripcin, la expresin "cantidad eficaz"
se refiere a la cantidad de protena oligomrica de la invencin calculada para producir el
efecto deseado y, en general, vendr determinada, entre otras causas, por las caractersticas
propias de la protena oligomrica, la diana (antgeno) a visualizar o localizar, etc. La
composicin farmacutica proporcionada por esta invencin puede ser administrada por
cualquier forma de administracin apropiada, por ejemplo, por va parenteral. Los
vehculos que pueden utilizarse en la elaboracin de la composicin farmacutica
proporcionada por esta invencin dependern, entre otras cosas, de la forma de
administracin de dicha composicin farmacutica. Una revisin de las distintas formas de
administracin de principios activos, de los excipientes a utilizar y de sus procedimientos
de fabricacin puede encontrarse en el Tratado de Farmacia Galnica, C. Faul i Trillo,
Luzn 5, S.A. de Ediciones, 1993.
Las protenas oligomricas de la invencin pueden aislarse y, si se desea, purificarse,
fcilmente, por mtodos convencionales conocidos por los tcnicos en la materia, por
ejemplo, mediante cromatografa de afinidad. En general, la protena oligomrica de la
invencin es oligomrica en solucin y posee una excelente estabilidad y capacidad de
unin a la diana (antgeno), reconociendo con alta eficiencia tanto antgenos purificados
inmovilizados sobre una placa como antgenos expresados o sobreexpresados en
alteraciones patolgicas (e.g., en la superficie de una clula tumoral). Las protenas
oligomricas de la invencin poseen una seal de unin mayor que el anticuerpo
monomrico (que constituye una unidad estructural de la misma) y, aparentemente, una
disociacin menor, consistente con la unin multivalente al antgeno. De hecho, se ha
calculado que una protena oligomrica de la invencin (e.g., la protena oligomrica anti-
NIP - Ejemplo 1) tiene una afinidad funcional por el antgeno muy superior (NIP-BSA)
unas 100 veces mayor que su versin monovalente. Este resultado sugiere, aunque no se
desea estar vinculado por ninguna teora, que esta ganancia de afinidad podra ser debida al
efecto de avidez de un segundo sitio de combinacin en la molcula de la protena
oligomrica de la invencin. La presencia de al menos dos sitios de unin funcionales en
una sola molcula de una protena oligomrica de la invencin ha sido posteriormente
demostrada mediante la generacin de protenas de oligomricas de la invencin
biespecficas (Ejemplos 1); efectivamente, protenas oligomricas (trimerbodies)
biespecficas anti-laminina y anti-NIP estables fueron fcilmente producidos por co-
expresin de dos construcciones diferentes de protenas oligomricas de la invencin en
clulas humanas.
Esta ganancia en afinidad a travs de la avidez convierte a las protenas oligomricas de la
invencin en unos reactivos muy atractivos para tcnicas de imagen in vzvo como agentes
alternativos, y preferidos, a los anticuerpos dimricos (diabodies y minibodies). Como es
conocido, para una completa avidez en anticuerpos multivalentes dirigidos a molculas
unidas a la superficie, los sitios de unin del antgeno deben apuntar hacia la misma
direccin; si la unin mltiple simultnea no es posible estricamente, entonces la ganancia
aparente en afinidad funcional es probable que sea menor y debida nicamente al efecto de
unin aumentado, que es dependiente en tasas de difusin y la concentracin del antgeno
de superficie. El anlisis del modelo de las protenas oligomricas de la invencin, en
particular en su formato trimrico (trimerbody), sugiere una estructura con forma de trpode
con los dominios scFv orientados hacia fuera. La flexibilidad entre los sitios de unin al
antgeno es otro aspecto importante en el diseo de anticuerpos multivalentes, requeridos
para el entrecruzamiento de receptores de superficie, bien en la misma clula o en
adyacentes. En este sentido, el espaciador flexible presente en algunas realizaciones
particulares de esta invencin permite numerosas geometras de unin. Cuando una
interaccin antgeno-anticuerpo ocurre, la posibilidad de establecer una segunda interaccin
depende de la valencia, orientacin y flexibilidad del sitio de unin del antgeno. Segn los
clculos de los inventores, en una molcula de una protena oligomrica de la invencin, tal
como un trmero (trimerbody), los scFv que permanecen sin interaccionar tienen un rea de
influencia unas 1 1 veces mayor, aproximadamente, que otros formatos bivalentes, tales
como los diabodies y los minibodies, aumentando la probabilidad de una segunda
interaccin efectiva. La flexibilidad de las protenas oligomricas de la invencin
constituye tambin una ventaja frente a otras estructuras ms compactas o rgidas de otros
formatos (e.g., collabody), ya que aumenta la accesibilidad de los scFv, que es un
parmetro crtico para la localizacin de las dianas in vivo.
Por tanto, la multimerizacin de las construcciones scFv presenta numerosas ventajas para
las aplicaciones in vivo frente a otros anticuerpos recombinantes (diabodies y minibodies)
que han mostrado su potencial como agentes de localizacin in vivo. Las protenas
oligomricas de la invencin son molculas multivalentes de tamao intermedio que
presentan una alta estabilidad en condiciones fisiolgicas. El potencial de dichas protenas
oligomricas de la invencin, en particular de unos trmeros (trimerbodies) para la
localizacin in vivo se ha estudiado en modelos experimentales de cncer humano en
ratones desnudos (Ejemplo 1). En otro aspecto, la invencin se relaciona con un kit que
comprende una protena oligomrica de la invencin. El empleo de dicho kit para la
deteccin, visualizacin o localizacin de una diana, e.g., un antgeno, mediante una tcnica
apropiada, por ejemplo, una tcnica de imagen. En una realizacin particular dicha diana es
un antgeno que se expresa de novo o se sobreexpresa en una alteracin patolgica, por
ejemplo, en patologas inflamatorias, vasculares, tumorales, etc. En una realizacin
particular, dicha diana es un antgeno tumoral.
El kit de la invencin es un producto que contiene los diferentes productos (e.g., protena
oligomrica de la invencin, reactivos adicionales, etc.) formando la composicin
empaquetada de modo que permita su transporte, almacenamiento y su empleo. Los kits de
la invencin pueden contener de este modo una o ms suspensiones, jeringuillas, etc., as
como medios para reconstituir la protena oligomrica de la invencin en caso de que esta
estuviera en forma liofilizada. Otros componentes que pueden estar presentes en el kit de la
invencin es un envase que permite mantener las formulaciones de la invencin dentro de
determinados lmites. Los materiales adecuados para preparar tales envases incluyen vidrio,
plstico, polietileno, polipropileno, policarbonato y similares, botellas, viales, papel,
bolsitas y similares. Adicionalmente, el kit de la invencin puede contener instrucciones
para su empleo. Dichas instrucciones se pueden encontrar en forma de material impreso o
en forma de soporte electrnico que puede almacenar las instrucciones tal que puedan ser
ledas por un sujeto, tal como medios de almacenamiento electrnico (discos magnticos,
cintas y similares), medios pticos (CD-ROM, DVD) y similares. Los medios pueden
adicional o alternativamente contener sitios Web en Internet proporcionando dichas
instrucciones.
Protena de fusin [polipptido ( A)-polipptido (B)I
La protena oligomrica de la invencin comprende una pluralidad de protenas de fusin
(iguales o diferentes), dependiendo del dominio de oligomerizacin presente en el
polipptido (B), y cada protena de fusin comprende:
(a) un polipptido (A) que comprende un anticuerpo o un fragmento funcionalmente
equivalente de dicho anticuerpo; y
(b) un polipptido (B) que comprende un dominio de oligomerizacin. Adicionalmente, si
se desea, dicha protena de fusin puede incluir un polipptido (C) que comprende la
secuencia de aminocidos de un pptido de unin flexible entre dichos polipptidos (A) y
(B) y/o un pptido (D) para facilitar el aislamiento o purificacin de la protena de fusin.
Las caractersticas de dichos polipptidos (A), (B), (C) y (D) ya han sido descritas
previamente, al igual que la posibilidad de que dichas protenas de fusin sean iguales o
diferentes.
La protena de fusin proporcionada por la invencin puede ser obtenida por mtodos
convencionales. A modo ilustrativo, dicha pro tena de fusin puede obtenerse mediante la
fusin de dichos polipptidos, obtenidos bien por mtodos de sntesis qumica de pptidos o
bien mediante la tecnologa del ADN recombinante. Alternativamente, dicha protena de
fusin proporcionada por esta invencin puede obtenerse por mediante el empleo de la
tecnologa del ADN recombinante, para lo cual se generarn las construcciones gnicas,
cassettes de expresin y vectores correspondientes. En general, cuando las protenas de
fusin son iguales, pueden obtenerse mediante incorporacin del ADN que codifica dicha
protena de fusin en una clula husped apropiada (e.g., bacterias, levaduras, clulas
animales, etc.). Alternativamente, cuando las protenas de fusin son diferentes, pueden
obtenerse, en general, mediante incorporacin de los ADN que codifican dichas protenas
de fusin en una clula husped apropiada, en donde los distintos ADN pueden formar
parte de la misma construccin gnica o de construcciones gnicas diferentes (e.g.,
mediante co- transformacin o co-transfeccin de clulas husped apropiadas).
Por tanto, en otro aspecto, la invencin se relaciona con una construccin gnica, en
adelante construccin gnica de la invencin, que comprende, al menos: a) una primera
secuencia de cido nucleico (A'), que comprende la secuencia de nucletidos que codifica
un polipptido (A), en donde dicho polipptido (A) comprende un anticuerpo o un
fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo; y b) una segunda secuencia de
cido nucleico (B') que codifica un polipptido (B) que comprende un dominio de
oligomerizacin, en donde el extremo 3' de dicha primera secuencia de cido nucleico (A')
est unido al extremo 5' de dicha segunda secuencia de cido nucleico (B'), o,
alternativamente, el extremo 5 ' de dicha primera secuencia de cido nucleico (A') est
unido al extremo 3 ' de dicha segunda secuencia de cido nucleico (B').
La secuencia de cido nucleico (A') comprende la secuencia de nucletidos que codifica un
polipptido (A) que comprende un anticuerpo que reconoce una diana o un fragmento
funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo que reconoce dicha diana. Ejemplos
ilustrativos de dicha diana incluyen un eptopo o determinante antignico de un antgeno,
por ejemplo, un antgeno que se expresa de novo o se sobreexpresa en una alteracin
patolgica, por ejemplo, en patologas inflamatorias, vasculares, tumorales, etc. En una
realizacin particular, dicha diana es un antgeno tumoral.
Por tanto, en una realizacin particular, la secuencia de cido nucleico (A') codifica un
polipptido (A) que comprende un anticuerpo, o un fragmento funcionalmente equivalente
del mismo, que reconoce una diana concreta. Prcticamente cualquier anticuerpo, o
fragmento funcionalmente equivalente del mismo, que reconozca una diana puede ser
utilizado en la presente invencin, e.g., un AcM, un AcP, un scFv, un anticuerpo
biespecfico o diabody, un V
HH
, etc. En una realizacin particular, dicha secuencia de cido
nucleico (A') codifica un polipptido (A) que comprende un scFv recombinante derivado
del AcM L36 anti-laminina [scFv L36], o un scFv recombinante derivado del AcM Bl.8
especfico del hapteno NIP, o un scFv recombinante derivado del AcM MFE23 especfico
del antgeno carcinoembrionario (CEA) humano (Ejemplo 1).
En caso de que la protena oligomrica de la invencin comprenda una pluralidad de
protenas de fusin diferentes, por ejemplo, dos o ms protenas de fusin diferentes, cada
una de ellas estara codificada por la correspondiente secuencia de ADN, las cuales podran
estar en una nica construccin gnica o en construcciones gnicas diferentes.
La secuencia de cido nucleico (B') comprende la secuencia de nucletidos que codifica un
polipptido (B) que comprende un dominio de oligomerizacin. Como se ha mencionado
previamente, un dominio de oligomerizacin permite la formacin de oligmeros (e.g.,
dmeros, trmeros, tetrmeros, etc., de pptidos o protenas). Prcticamente cualquier
dominio de oligomerizacin, por ejemplo, un dominio de dimerizacin, trimerizacin,
tetramerizacin, etc., presente en distintas protenas, tanto de origen eucaritico como
procaritico, susceptible de ser expresado de forma recombinante y de formar un oligmero
proteico de la protena que lo comprende puede ser utilizado en la presente invencin. En
una realizacin particular, dicho dominio de oligomerizacin es un dominio de
trimerizacin, tal como el dominio de trimerizacin del dominio NCl de colgeno XVIII o
del colgeno XV; en una realizacin concreta, dicho dominio de oligomerizacin es el
dominio de trimerizacin del dominio NCl de colgeno XVIII o del colgeno XV al que se
la ha eliminado la totalidad o parte del dominio de ES. Por tanto, en una realizacin
particular y preferida, la secuencia de cido nucleico (B') comprende la secuencia de
nucletidos que codifica el dominio NCl de colgeno XVIII de mamfero o el dominio NCl
del colgeno XV de mamfero, en el que, opcionalmente, se ha eliminado la totalidad o
parte del dominio de ES. Las secuencias de dichos dominios NCl de colgeno XV y XVIII
son conocidas; a modo ilustrativo, la secuencia del dominio NC l del colgeno XVIII ha
sido descrita previamente por Sasaki et al. [Sasaki et al. Structure, function and tissue forms
of the C- terminal globular domain of collagen XVIII containing the angiogenesis inhibitor
endostatin. EMBO J. 1998 Aug 3;17(15):4249-56].
En la construccin gnica de la invencin, el extremo 3 ' de dicha secuencia de cido
nucleico (A') est unido, en una realizacin particular, al extremo 5 ' de dicha secuencia de
cido nucleico (B'); alternativamente, en otra realizacin particular, el extremo 5 ' de dicha
secuencia de cido nucleico (A') est unido al extremo 3 ' de dicha secuencia de cido
nucleico (B').
En general, la secuencia de cido nucleico (A') no se fusiona directamente a la secuencia de
cido nucleico (B') sino que resulta ventajoso introducir un pptido de unin flexible (o
pptido espaciador) entre los polipptidos codificados por dichas secuencias de cido
nucleico (A') y (B'). Por tanto, si se desea, la construccin gnica de la invencin tambin
puede contener, adems, una tercera secuencia de cido nucleico (C) que contiene la
secuencia de nucletidos que codifica para un pptido de unin flexible situada entre dichas
secuencias de cido nucleico (A') y (B'). En una realizacin particular, el extremo 5' de
dicha secuencia de cido nucleico (C) est unido al extremo 3' de dicha secuencia de cido
nucleico (A') y el extremo 3' de dicha secuencia de cido nucleico (C) est unido al extremo
5' de dicha secuencia de cido nucleico (B'); alternativamente, en otra realizacin
particular, el extremo 3' de dicha secuencia de cido nucleico (C) est unido al extremo 5 '
de dicha secuencia de cido nucleico (A') y el extremo 5 ' de dicha secuencia de cido
nucleico (C) est unido al extremo 3' de dicha secuencia de cido nucleico (B').
Ventajosamente, dicho pptido espaciador (C) es un pptido con flexibilidad estructural.
Prcticamente, cualquier pptido con flexibilidad estructural puede ser utilizado. A modo
ilustrativo, dicho pptido flexible puede contener repeticiones de restos de aminocidos, en
particular de restos de GIy y Ser o cualquier otra repeticin de restos de aminocidos
adecuada. Prcticamente cualquier secuencia peptdica que defina un pptido de unin
flexible puede ser utilizada en la presente invencin. Ejemplos ilustrativos de pptidos de
unin flexibles incluyen secuencias de tipo Gly-Ser-Pro-Gly (GSPG) o la secuencia (Gly-
Ser)
4
. No obstante, en una realizacin particular, dicho pptido de unin flexible
comprende la secuencia Leu-Glu-Gly-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly- Ser-Ser-Gly-Ser-Asp-
Gly-Ala-Ser-Gly-Ser. Por tanto, en una realizacin particular, la construccin gnica de la
invencin comprende, adems de dichas secuencias de cido nucleico (A) y (B) una tercera
secuencia de cido nucleico (C) que comprende la secuencia de nucletidos que codifica
para el pptido Leu-Glu-Gly-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly- Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Ala-Ser-
Gly-Ser. La longitud y composicin del pptido espaciador puede variar; no obstante, en
una realizacin particular, se ajustar (mayor o menor longitud, mayor o menor rigidez) en
funcin de la naturaleza de la diana (antgeno) reconocida por el anticuerpo para conseguir
las mejores propiedades funcionales.
Asimismo, con el fin de facilitar el aislamiento y purificacin de la protena de fusin
obtenida mediante la presente invencin, la construccin gnica de la invencin puede
contener, si se desea, una secuencia de cido nucleico que codifica un pptido susceptible
de ser utilizado con fines de aislamiento o purificacin de la protena de fusin. Por tanto,
en una realizacin particular, la construccin gnica de la invencin incluye, si se desea,
una secuencia de cido nucleico (D') que contiene la secuencia de nucletidos que codifica
un pptido susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento o purificacin, conocido
como pptido etiqueta ("tag"). Dicha secuencia de cido nucleico (D') puede estar situada
en cualquier posicin que no altere la funcionalidad de ninguno de los polipptidos [(A) y
(B)] expresados por dichas secuencias de cidos nucleicos (A') y (B'). A modo simplemente
ilustrativo, no limitativo, dicha secuencia de cido nucleico (D') puede estar situada aguas
abajo del extremo 3' de dicha secuencia de cido nucleico (B'). Prcticamente cualquier
pptido o secuencia peptdica que permita el aislamiento o purificacin de la protena de
fusin puede ser utilizado, por ejemplo, una cola de histidinas (e.g., 6 restos de His), una
secuencias peptdica susceptible de ser reconocida por un anticuerpo que pueden servir para
purificar la protena de fusin resultante por cromatografa de inmunoafinidad, tales como
pptidos etiqueta, etc., por ejemplo, eptopos derivados de la hemaglutinina (HA) del virus
de la gripe, C-myc, FLAG, V5, etc.
La construccin gnica de la invencin puede obtenerse mediante el empleo de tcnicas
ampliamente conocidas en el estado de la tcnica [Sambrook et al, "Molecular cloning, a
Laboratory Manual", 2
nd
ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989 VoI 1-3].
Dicha construccin gnica de la invencin puede incorporar, operativamente unida, una
secuencia reguladora de la expresin de las secuencias de nucletidos que codifican para
los polipptidos codificados por las secuencias de cido nucleico (A') y (B'), constituyendo
de este modo un cassette de expresin. Tal como se utiliza en esta descripcin, la expresin
"operativamente unida" significa que los polipptidos codificados por las secuencias de
cido nucleico (A') y (B'), y, en su caso (C), son expresados en el marco de lectura correcto
bajo el control de las secuencias de control o reguladoras de expresin.
Por tanto, en otro aspecto, la invencin proporciona un cassette de expresin que
comprende la construccin gnica de la invencin operativamente unida a una secuencia de
control de expresin de la secuencia de nucletidos que codifica la protena de fusin
proporcionada por esta invencin que comprende un polipptido (A) que comprende un
anticuerpo o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo y un polipptido (B) que
comprende un dominio de oligomerizacin. Las secuencias de control son secuencias que
controlan y regulan la transcripcin y, en su caso, la traduccin de dicha protena de fusin,
e incluyen secuencias promotoras, secuencias codificantes para reguladores
transcripcionales, secuencias de unin a ribosomas (RBS) y/o secuencias terminadoras de
transcripcin. En una realizacin particular, dicha secuencia de control de expresin es
funcional en clulas y organismos procariotas, por ejemplo, bacterias, etc., mientras que en
otra realizacin particular, dicha secuencia de control de expresin es funcional en clulas y
organismos eucariotas, por ejemplo, clulas de insecto, clulas vegetales, clulas de
mamfero, etc. Ejemplos ilustrativos de promotores que pueden estar presentes en el
cassette de expresin proporcionado por esta invencin incluyen el promotor de
citomegalovirus humano (hCMV), etc.
Ventajosamente, dicho cassette de expresin comprende, adems, un marcador o gen que
codifica para un motivo o para un fenotipo que permita la seleccin de la clula
hospedadora transformada con dicho cassette de expresin. Ejemplos ilustrativos de dichos
marcadores que podran estar presentes en el cassette de expresin de la invencin incluyen
genes de resistencia a antibiticos, genes de resistencia a compuestos txicos, y, en general,
todos aquellos que permitan seleccionar a las plantas transformadas genticamente.
La construccin gnica de la invencin, o el cassette de expresin proporcionado por esta
invencin, pueden ser insertados en un vector apropiado. Por tanto, en otro aspecto, la
invencin se relaciona con un vector, tal como un vector de expresin, que comprende
dicha construccin de gnica de la invencin o dicho cassette de expresin. La eleccin del
vector depender de la clula hospedadora en la que se va a introducir posteriormente. A
modo ilustrativo, el vector donde se introduce dicha secuencia de cido nucleico puede ser
un plsmido o un vector que, cuando se introduce en una clula hospedadora, se integra o
no en el genoma de dicha clula. La obtencin de dicho vector puede realizarse por
mtodos convencionales conocidos por los tcnicos en la materia [Sambrook et al., 1989,
citado supra]. En una realizacin particular, dicho vector recombinante es un vector til
para transformar clulas animales. Dicho vector puede ser utilizado para transformar,
transfectar o infectar clulas susceptibles de ser transformadas, transfectadas o infectadas
por dicho vector. Dichas clulas pueden ser procariotas o eucariotas. Por tanto, en otro
aspecto, la invencin se relaciona con una clula hospedadora transformada, transfectada o
infectada con un vector proporcionado por esta invencin. Dicha clula transformada,
transfectada o infectada comprende, por tanto, una construccin gnica de la invencin, o
bien dicho cassette de expresin o vector proporcionado por esta invencin. Clulas
transformadas, transfectadas o infectadas pueden ser obtenidas por mtodos convencionales
conocidos por los tcnicos en la materia [Sambrook et al., 1989, citado supra]. En una
realizacin particular, dicha clula hospedadora es una clula animal transformada,
transfectada o infectada con un vector apropiado, siendo dicha clula animal transformada,
transfectada o infectada capaz de expresar la protena de fusin proporcionada por esta
invencin, por lo que dichos vectores pueden utilizarse para la expresin en clulas
animales de la protena de fusin proporcionada por esta invencin.
La construccin gnica de la invencin puede ser utilizada para producir dichas protenas
de fusin que comprenden un polipptido (A) que comprende un anticuerpo o un fragmento
funcionalmente equivalente del mismo y un polipptido (B) que comprende un dominio de
oligomerizacin.
Por tanto, en otro aspecto, la invencin se relaciona con un mtodo para producir dicha
protena de fusin proporcionada por esta invencin que comprende crecer una clula u
organismo proporcionado por esta invencin bajo condiciones que permiten la produccin
de dicha protena de fusin. Las condiciones para optimizar el cultivo de dicha clula u
organismo dependern de la clula u organismo utilizado. Si se desea, el mtodo para
producir un producto de inters proporcionado por esta invencin incluye, adems, el
aislamiento y purificacin de dicha protena de fusin. El experto en la materia entender
que, si la protena oligomrica de la invencin contiene dos o ms protenas de fusin
diferentes, dichas protenas de fusin diferentes pueden expresarse, si se desea, en una
clula husped apropiada mediante co- transformacin, co-transfeccin o co-infeccin
utilizando los vectores que contienen las secuencias codificantes apropiadas.
El siguiente Ejemplo sirve para ilustrar la invencin y no debe ser considerado como
limitativo del alcance de la misma.
EJEMPLO 1
Localizacin y visualizacin in vivo de tumores mediante protenas oligomricas que
comprenden fragmentos de anticuerpos y secuencias derivadas de colgeno
I. MATERIALES Y MTODOS
Anticuerpos y reactivos
Los anticuerpos monoclonales (AcMs) utilizados incluyeron el AcM 9E10 (Abcam,
Cambridge, R. Unido) especfico de c-myc humano, y el AcM NCRC23 (AbD
Serotec, Kidlington, R. Unido) especfico del antgeno carcinoembrionario (CEA) humano.
Los anticuerpos policlonales (AcPs) utilizados incluyeron un anticuerpo (Ac) de conejo
anti-albmina de suero bovina (BSA); un Ac de cabra anti-IgG de conejo conjugado con
peroxidasa de rbano picante (HRP); y un Ac de cabra anti-IgG de ratn, especfico del
dominio constante de la IgG (Fc), conjugado con HRP, todos ellos proporcionados por
Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EEUU). La laminina-1 purificada a partir
del tumor murino EHS (Engelbreth-Holm-Swarm) se obtuvo de Becton Dickinson Labware
(Bedford, MA, USA). El CEA humano y la BSA fueron proporcionados por Sigma-
Aldrich. Para la generacin de conjugados de BSA con el hapteno 4-hidroxi-5-iodo-3-
nitrofenil (NIP) (Sigma-Aldrich) en una relacin molar 10: 1 (NIPio:BSA) se sigui un
protocolo anteriormente descrito [Reth, M. et al.
(1979). Eur. J. Immunol. 9:1004-1013].
Clulas y condiciones de cultivo Las clulas HEK-293 (clulas epiteliales de rion
embrionario humano; CRL-
1573), y sus clulas derivadas 293T (CRL-11268), as como las clulas HT-1080
(fibrosarcoma humano; CCL- 121), MKN45 (adeno carcinoma gstrico humano; JCRB-
0254); y HeLa (carcinoma de crvix humano; CCL-2) fueron cultivadas en medio Dulbecco
modificado por Eagle (DMEM) suplementado con 10% (v/v) de suero bovino fetal (SBF)
inactivado por calor (todos de Invitrogen, Carlsbad, CA), en adelante medio DMEM
completo (DCM). Las clulas HeLa
CEA
(Compte, M. et al. 2007; Cncer Gene Ther.
14:380-388) se cultivaron en DCM suplementado con 750 g/ml de G418 (Invitrogen).
Construccin de los vectores de expresin
Los vectores de expresin pCR3. 1-L36 y pCR3.1-L36-NCl
ES"
fueron construidos
siguiendo protocolos conocidos [Sanz L et al. (2002). Gene Ther. 9:1049- 1053; Sanz L et
al. (2001). Cncer Immunol. Immunother. 50:557-565].
El plsmido pVOMl .C23 que contiene el gen que codifica el Ac MFE-23 (anti- CEA
humano) en formato de fragmento variable de cadena nica (scFv), fue proporcionado por
el Dr. R. E. Hawkins (University of Manchester, UK). El cassette de expresin del Ac
MFE-23 se digiri con HindIII y Notl y se clon en el vector pCEP4.6xHis-myc [Sanz, L.
et al. (2002). Gene Ther. 9:1049-1053] para generar el plsmido pCEP4-MFE-23.
El plsmido pCEP4-B1.8 que contiene el gen que codifica el Ac B 1.8 (anti-NIP) en
formato scFv y las etiquetas (tags) peptdicas de polihistidina (6 His) y c-myc fue
construido siguiendo un procedimiento ya descrito [Sanz, L. et al. (2002), citado supra].
Para generar los plsmidos pCEP4-MFE-23-NCl
ES~
y pCEP4-B1.8-NCl
ES~
, el fragmento de
252 pares de bases (pb) derivado del plsmido pCR3.1-L36-NCl
ES"
, obtenido por digestin
con Notl, se clon en los plsmidos pCEP4-MFE-23 o pCEP4- B 1.8 respectivamente.
Transfecciones celulares y purificacin de anticuerpos recombinantes
Las clulas HEK-293 y sus clulas derivadas 293T fueron transfectadas con Superfect
segn las recomendaciones del fabricante (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany). Para la
obtencin de lneas celulares (transfectantes) estables, las clulas HEK-293 transfectadas
con los vectores pCR3.1-L36 y pCR3.1-L36-NCl
ES"
, respectivamente, se seleccionaron en
DCM suplementado con 0,5 mg/ml de neomicina (G418) (Promega). Las clulas HEK-293
transfectadas con los vectores pCEP4-MFE- 23-NCl
ES~
y pCEP4-B1.8-NCl
ES~
,
respectivamente, se seleccionaron en DCM suplementado con 100 g/ml de higromicina B
(Invitrogen). Los sobrenadantes de las poblaciones celulares transfectadas se analizaron
para determinar la expresin de protenas por ELISA, SDS-PAGE y transferencia Western
utilizando el AcM anti-myc. Los transfectantes estables de las clulas HEK-293 se
utilizaron para obtener medio condicionado libre de suero (MCLS) (aproximadamente 1
litro) que fue concentrado (xlO) con un filtro de 10.000 MWCO Vivaflow 50 (Vivascience
AG, Hannover, Germany), dializado frente a tampn fosfato salino (PBS) (pH 7,4) y
cargado en una columna HisTrap HP de 1 mi utilizando el sistema KTA Prime plus (GE
Healthcare, Uppsala, Suecia). Las protenas (anticuerpos) recombinantes purificadas se
dializaron frente a PBS, se analizaron mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras y
no- reductoras, y se almacenaron a -2O
0
C hasta su uso.
Cromatografa analtica de filtracin en gel Los anlisis se realizaron utilizando columnas
Superdex 200 10/300GL (GE
Healthcare) equilibradas con PBS (pH 7,4) en un equipo KTA FPLC (GE Healthcare).
Las muestras (100 l) de protenas recombinantes purificadas, en una concentracin
comprendida ente 0,5 y 1,0 mg/ml, se inyectaron en la columna y se eluyeron con una
velocidad de flujo de 0,5 ml/minuto. La columna se calibr con marcadores de peso
molecular que comprendan desde 16 kDa hasta 655 kDa (GE Healthcare). El azul dextrano
se utiliz como volumen de exclusin.
ELISA
La capacidad de reconocimiento y unin de las protenas recombinantes (trmeros de
anticuerpos (scFv) - en ocasiones identificadas en esta descripcin como
"trimerbodies") purificadas [L36, MFE23 o Bl.8] a laminina-1 murina, CEA humano o
conjugados NIP
I0
-BSA, fue estudiada mediante ELISA [Sanz, L. et al. 2003; EMBO J.,
22:1508-17]. La multivalencia de los trimerbodies se estudi mediante ELISA utilizando el
sobrenadante de las clulas 293T transfectadas bien con un slo vector (pCR3.1-L36-
NCl
ES"
o pCEP4-B1.8-NCl
ES~
) o bien con 2 vectores (pCR3.1-L36-
NC1
ES"
y pCEP4-B1.8-NCl
ES"
). Placas de 96 pocilios Maxisorp (NUNC Brand
Products, Roskilde, Dinamarca) fueron recubiertas con laminina (0,5 g/pocillo) mediante
una incubacin de 16 horas a 4
0
C en PBS (10 g/ml); posteriormente, y, despus de lavar
las placas con PBS y se bloquearlas con 200 l de PBS-5% de leche en polvo desnatada, y
se aadieron 100 l de sobrenadante procedente de clulas 293T transfectadas bien con un
slo vector (pCR3.1-L36-NCl
ES"
o pCEP4-B1.8-NCl
ES~
) o bien con 2 vectores (pCR3.1-
L36-NCl
ES"
y pCEP4-B1.8-NCl
ES~
) durante 1 hora a temperatura ambiente. Al cabo de 3
lavados, se aadieron 100 l de NIPio-BSA (10 g/ml), incubndose durante 1 hora a
temperatura ambiente. Posteriormente, tras 3 lavados, se aadieron 100 l del Ac de conejo
anti-BSA (1 :1.000) en 0,05% Tween-20- PBS. Tras tres nuevos lavados, se aadieron 100
l del Ac de cabra anti-IgG de conejo conjugado con HRP durante 1 hora a temperatura
ambiente, tras lo cual, las placas se lavaron y revelaron.
Citometra de flujo, deteccin de antgenos en la superficie celular
La expresin de CEA en las lneas tumorales HeLa y HeLa
CEA
y la unin de los anticuerpos
recombinantes (trimerbodies) se analiz siguiendo un protocolo ya descrito
[Blanco B et al, (2003). J. Immunol. 171 :1070-1077] mediante inmuno fluorescencia
indirecta. Brevemente, las clulas se incubaron con AcM anti-CEA humano (5 g/ml), o
con los trimerbodies purificados (anti-NIP o anti-CEA, 10 g/ml) y el AcM 9E10 (4 g/ml)
en 100 l durante 45 minutos. Tras lavado, las clulas fueron tratadas con las diluciones
apropiadas de Ac de cabra anti-IgG de ratn conjugado con FITC (Sigma-
Aldrich). Los estudios se realizaron en un citmetro EPICS XL (Coulter Electronics).
Estudios de afinidad mediante resonancia de plasmen superficie
Todos los estudios de afinidad mediante resonancia de plasmn de superficie (SPR, del
ingls "Surface Plasmon Resonance") se realizaron a temperatura ambiente utilizando un
sistema Biacore 3000 (GE Healthcare). Se utilizaron chips sensores de dextrano
carboximetilado (CM5) (GE Healthcare) y tampn HBS-EP (HEPES 0,01 M; pH 7,4; NaCl
0,15 M; EDTA 3 mM; Surfactante P
20
0,005%) previamente filtrado a travs de un filtro de
0,22 m y desgasificado antes de su uso. Las protenas recombinantes (trimerbodies) se
disolvieron en acetato sdico 10 mM (pH 4,5). El conjugado NIPio-BSA se inmoviliz
directamente sobre la superficie del chip sensor siguiendo las instrucciones del fabricante
en celdas de flujo independiente a, aproximadamente, 100, 1.800 y 8.500 unidades de
resonancia (US). La BSA, utilizada como control negativo de la interaccin, se inmoviliz
a 1.900 UR sobre la celda de flujo de referencia. Despus de cada experimento, las
superficies se regeneraron con HCl 30 mM, permitiendo la vuelta de las seales de
resonancia a niveles bsales. Los anlisis se realizaron por duplicado.
Para los anlisis cinticos se utiliz una celda de flujo con cantidades pequeas de NIPio-
BSA (aproximadamente 100 UR) con el fin de minimizar los efectos de transporte de masa
y re-unin. Las muestras individuales, constituidas por scFv o trimerbodies purificados, se
pasaron sobre la superficie del chip a una velocidad de flujo de 20 l/minuto y se midieron
las velocidades de asociacin/disociacin. Los cambios en el ndice de refraccin se
eliminaron mediante la sustraccin de las respuestas de los chips de referencia y la
respuesta media de un control negativo se rest a todos los sensogramas. Los resultados
cinticos se obtuvieron utilizando el software BIAevaluation v4.1, proporcionado con el
biosensor, y los datos cinticos se ajustaron a un modelo de interaccin de Langmuir 1 :1.
Modelado comparativo de protenas
La estructura del dominio de unin del anticuerpo L36 en formato scFv (scFv L36) fue
modelada mediante modelado comparativo utilizando como molde la estructura 2GHW.B
obtenida del Protein Data Bank (PDB) [Berman, H. M. et al. 2000; Nucleic Acids Res.
28:235-42]. La estructura del subdominio de trimerizacin NCl del extremo amino terminal
del colgeno XVIII murino fue obtenido a partir de ModBase [Pieper, U. et a l. 2004,
Nucleic Acids Res.; 32:D217-22]. Ambos dominios se encuentran unidos por un espaciador
de 21 aminocidos para formar un monmero del anticuerpo L36 en formato trimerbody.
Las coordenadas de los monmeros restantes se obtuvieron mediante la aplicacin de un eje
triple de simetra de rotacin. El modelo del trimerbody L36 se form mediante la suma de
las coordenadas de los tres monmeros. La estructura fue optimizada con GROMACS [Van
Der Spoel, D. et al. 2005; J. Comput. Chem.; 26:1701-18] y su energa evaluada con
DFIRE [Zhou, H. et al. 2002; Prot. Sci., 11 : 2714-26]. Con el objetivo de comparar los
valores de DFIRE entre el monmero y el trmero, las energas fueron normalizadas
dividindolas por la longitud de la secuencia. Ensayos de estabilidad en presencia de suero
Para determinar si el trimerbody mantena su capacidad funcional en suero, 500 ng de
trimerbody L36 purificado se incubaron a 37
0
C, durante 72 horas, con 12,5% de suero
murino de ratones BALB/c (Haran Ibrica, Barcelona, Espaa). Se retiraron muestras para
su anlisis a las 3 h, 24 h y 72 h contadas desde el comienzo de la incubacin y se
congelaron hasta que se complet la totalidad del estudio. Como control, se congel
inmediatamente un segundo conjunto de muestras expuestas al suero para representar el
tiempo "cero". A continuacin, se analiz la capacidad de los trimerbodies de retener su
unin funcional a laminina murina por ELISA.
Conjugacin de anticuerpos recombinantes con daina 5 scFv L36 y los trimerbodies
purificados se marcaron con el fluorocromo Cianina 5 (Cy5) NHS esteres siguiendo las
instrucciones del fabricante (GE Healthcare). La reaccin de mareaje se realiz a
temperatura ambiente durante 30 minutos, aadiendo 200 l de una solucin de Cy5 (2
mg/ml) en dimetilsulfxido (DMSO). Las molculas de Cy5 no unidas se eliminaron
mediante cromatografa de exclusin en Sephadex G25- M (columnas PD-IO, GE
Healthcare) y se concentraron en un filtro 10.000 MWCO Vivaspin 500 (Vivascience) a
aproximadamente 1 mg/ml. La relacin (molar) de Cy5 a anticuerpo (Cy5: anticuerpo),
calculada segn el procedimiento descrito por Birchler y col. (Birchler, M. et al. 1999; J.
Immunol. Methods; 231 :239-48), era prxima a 1 :1. La funcionalidad de los Acs
conjugados con Cy5 fue verificada mediante ELISA frente a los antgenos especficos.
Ensayos de localizacin de tumores en ratones portadores con anticuerpos recombinantes
mediante imagen molecular - Inmunofotodeteccin infrarroja en ratones portadores de
tumores
Se implantaron subcutneamente (s.c.) clulas MKN45, HT 1080 o HeLa (1-
2x10
6
) en la regin dorsal de ratones hembra atmicos desnudos nu/nu de 6 semanas Hsd
(ratones atmicos Nude-Foxi"" - Haran Ibrica). Las dimensiones de los nodulos se
utilizaron para calcular el volumen tumoral utilizando la frmula: (anchura)
2
x
(longitud) x 0,52. Cuando los tumores alcanzaron un tamao apropiado (0,2-0,4 cm ), se
administraron por va intravenosa (i.v.), en la vena de la cola, 100 l de una solucin de
anticuerpo recombinante purificado en formato trimerbody marcado con Cy5 en PBS (5
mg/kg). Las imgenes de fluorescencia in vivo se tomaron a diversos tiempos (3, 24 y 48
horas) despus de la administracin i.v. del anticuerpo marcado, con un sistema
Hamamatsu dotado de una cmara digital de alta resolucin con dispositivos de cargas
acopladas (CCD) ORCA-2BT (Hamamatsu Photonics). Para el anlisis y procesamiento de
las imgenes se emple el software Wasabi (Hamamatsu Photonics). Los protocolos
utilizados para la manipulacin de animales que a continuacin se detallan, han sido
aprobados por el por el Comit de tica Animal del Hospital Universitario Puerta de
Hierro.
II. RESULTADOS
Diseo y expresin de las construcciones trimricas Los anlisis estructurales del dominio
NCl del colgeno XVIII murino sugieren que consiste en tres segmentos: un dominio de
trimerizacin amino terminal implicado en el autoensamblaje de los homotrmeros; una
regin flexible sensible a proteasas; y un dominio compacto carboxiterminal de endostatina
(ES) [Sasaki, T. et al. 1998; EMBO J. 17:4249-56]. Los investigadores han demostrado
previamente que un Ac recombinante conteniendo el scFv L36 anti-laminina fusionado al
dominio amino terminal NC l del colgeno XVIII murino era producido y secretado en
forma funcionalmente activa por clulas HEK-293 [Snchez- Ar valo, LV et al. (2006).
Int. J. Cncer 119:455-462]. Adems, para proporcionar la suficiente flexibilidad espacial
al scFv situado en la regin amino terminal, se insert un conector artificial de 21
aminocidos [Snchez-Arvalo, LV et al. (2006), citado supra].
La naturaleza trimrica de la protena de fusin scFv-NCl fue demostrada por
ultracentrifugacin [Snchez-Arvalo, LV et al. (2006), citado supra] y cromatografa
analtica de filtracin en gel (Figura IA). La elucin del scFv L36 mediante cromatografa
analtica de filtracin en gel pone de manifiesto que es un monmero. La calibracin de la
columna segn los marcadores utilizados proporciona un peso molecular de 24,2 kDa,
acorde con el terico (26,9 kDa). Por el contrario, la elucin de la fusin scFv L36-NC1 se
corresponde con un peso molecular de 109,3 kDa, indicando su naturaleza trimrica (el
peso terico del trmero es de 111,4 kDa), acorde con los datos anteriores de
ultracentrifugacin [Snchez-Arvalo, LV et al. (2006), citado supra]. Este formato de
anticuerpo trimrico ha sido designado como "trimerbody".
En la presente invencin, se ha ampliado el concepto mediante el diseo de trimerbodies
con especificidades diferentes para el hapteno NIP o el CEA humano. Los genes
codificantes de los scFvs derivados de los Acs anti-NIP (B 1.8) y anti-CEA humano
(MFE23) se ensamblaron de forma similar y se expresaron como protenas solubles en
clulas HEK-293 en forma funcionalmente activa. Las protenas recombinantes fueron
purificadas mediante columnas de afinidad (IMAC) y el rendimiento de las mismas fue
superior al 95%, segn se verific en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE). Tanto los
trimerbodies Bl.8 como MFE-23 eluyeron de la columna con picos nicos (datos no
mostrados) comparables a los mostrados en la
Figura IA.
Estudios de unin a su antgeno
La funcionalidad de los trimerbodies purificados se demostr mediante ELISA frente a los
antgenos inmovilizados conjugados NIP-BSA (NIPio-BSA), laminina EHS murina y CEA
humano (Figura IB). Su capacidad para detectar a su antgeno en un contexto celular fue
investigada mediante el mareaje por inmuno fluorescencia de clulas tumorales humanas
que expresan el antgeno CEA en su superficie celular. La fluorescencia se observ tras la
incubacin con el trimerbody MFE-23, seguido de reaccin con el AcM anti-myc y
deteccin con el Ac de cabra anti-IgG de ratn conjugado con FITC. Por el contrario, la
incubacin de clulas que expresan CEA (CEA
+
) con el trimerbody B 1.8 o la incubacin
con clulas HeLa que no expresan CEA (CEA ) con el trimerbody MFE-23 no mostr
fluorescencia alguna (Figura IC). Estos resultados indican que los trimerbodies no slo
reconocen al antgeno inmovilizado, sino que tambin reconocen el antgeno nativo
expresado en la superficie de clulas tumorales.
Los ensayos de SPR sirvieron para determinar la influencia del formato de scFv o de
trimerbody sobre la funcionalidad del Ac Bl.8. Se compararon las cinticas de unin de
cada formato de Ac utilizando tres densidades diferentes del NIPio-BSA inmovilizado
sobre la superficie del chip. Se utiliz BSA acoplado a dextrano como referencia de
inespecificidad. Para comparar las respuestas de unin durante los procesos de asociacin-
disociacin, se inyectaron varias concentraciones de Ac B 1.8 (desde 9 a 1.200 nM para el
scFv y de 6 a 800 nM para el trimerbody). Bajo estas condiciones, solo el trimerbody
alcanz la saturacin de la superficie del antgeno, mientras que el scFv se uni lentamente
y con una disociacin aparente ms rpida. Los sensogramas indican que el trimerbody
tiene una mayor capacidad de unin que su versin monovalente (Figura ID).
Para los estudios cinticos, se utiliz un chip recubierto con aproximadamente 100 UR de
NIPio-BSA. En estos ensayos, el scFv Bl.8 se comport de forma muy diferente al
trimerbody Bl.8, con cocientes de asociacin ms lentos y de disociacin ms rpidos. Las
constantes cinticas de asociacin (k
a
) y de disociacin (ka) se determinaron mediante
ajuste simultneo utilizando el modelo de interaccin Langmuir 1 :1. Para el scFv B 1.8, las
constantes cinticas de asociacin (k
a
) y de disociacin (ka) aparentes fueron k
a
: 1,0 x 10
4

1,7 x 10
2
M
'
V
1
y k
d
: 2 x 10
~3
4 x 10
"5
s
"1
(Chi
2
= 0,189). Utilizando K
D
= kd/k
a
, la
constante de disociacin en equilibrio para scFv Bl.8, se estim en 2 x 10
"7
M.
Dependiendo de la concentracin de Ac utilizado en cada ensayo, el trimerbody inyectado
en condiciones de baja densidad de NIPio-BSA inmovilizado podra probablemente unirse
de forma mono- y multivalente, e incluso las constantes cinticas de unin aparentes
podran incluir efectos de avidez por unin multivalente. Usando un modelo de interaccin
1 :1 en el que las fases de asociacin y disociacin se tratan de forma separada para cada
concentracin, se ajustaron los resultados experimentales para la unin de B 1.8 trivalente.
Los datos de las curvas con valores de resonancia que se aproximan a R
max
seran prximos
a los obtenidos para la unin monovalente. En este caso, a medida que la concentracin del
trimerbody B 1.8 aumentaba, la k
a
disminuy de 4 x 10
5
M
-1
S
"1
(12,5 nM trimerbody) a 2 x
10
4
M
-1
S
"1
(800 nM trimerbody). Estos cambios son compatibles con los cambios en la
proporcin de anticuerpo que se une al ligando de forma mono- o multivalente, ya que una
aproximacin a la saturacin de la superficie conduce a una proporcin mayor de unin de
anticuerpo monovalente. La ka aparente tiene un rango ms estrecho, de 6 x 10
"4
(12,5 nM)
a 9 x 10
"4
(800 nM). Considerando que a 12,5 nM, la mayor parte de los trimerbodies puede
unirse de forma bi- o multivalente, la afinidad funcional del trimerbody calculada para esa
concentracin podra ser K
D
(k
d
/k
a
) de 1,5 x 10
"9
M o superior.
Para asegurar que al menos hay dos sitios activos de unin en una misma molcula de
trimerbody, clulas 293T fueron transfectadas con los plsmidos codificantes de
trimerbodies L36, Bl .8 o con ambos plsmidos en una co-transfeccin. Ensayos de
transferencia Western pusieron de manifiesto que ambos trimerbodies eran expresados en el
sobrenadante de las clulas y que se unan a sus antgenos respectivos, y que la cantidad de
trimerbody era ms alta en clulas 293T co-transfectadas (con ambos plsmidos) que en
clulas 293T monotransfectadas (datos no mostrados). El medio condicionado de las
clulas 293T monotransfectadas unidas a NIPiO-BSA o laminina, as como el medio
condicionado de las clulas 293T co-transfectadas reconocen ambos antgenos (Figura 2A).
En un ensayo de ELISA, medio condicionado de las clulas 293T co-transfectadas (es
decir, doblemente transfectadas), se aadi a placas recubiertas con laminina y, tras lavado,
los trimerbodies unidos a laminina eran capaces de capturar NIPio-BSA soluble (Figura
2B), demostrando su multivalencia. Por el contrario, los trimerbodies en el sobrenadante de
clulas 293T monotransfectadas con el plsmido que codifica el trimerbody L36 eran
incapaces de unirse y capturar NIP
10
- BSA soluble.
Ensayos de estabilidad frente a suero in vitro
Un aspecto muy importante para determinar la potencial aplicacin in vivo de los
fragmentos de Ac diseados es comprobar la estabilidad frente a suero. Los investigadores
han determinado la funcionalidad y la estabilidad estructural del trimerbody L36 tras
incubacin con suero humano y murino a 37
0
C durante periodos prolongados de tiempo
(igual o superiores a 72 horas), mediante ensayos de transferencia Western y ELISA. Tal
como se muestra en la Figura 3, el trimerbody L36 mantiene un 80-90% de su capacidad de
unin a su antgeno tras 72 horas de incubacin.
Ensayos de localizacin especfica de tumores in vivo
Para evaluar la biodistribucin de, y la localizacin especfica de tumores por, los
trimerbodies anti-NIP, anti-CEA y anti- laminina, se utiliz un sistema ptico de imagen
molecular, que permite la evaluacin de la cintica de localizacin del tumor y del
aclaramiento por el Ac en un mismo animal y en diferentes tiempos del ensayo. Los
trimerbodies fueron conjugados con el fluorocromo de emisin cercana al infrarrojo Cy5 e
inyectados por va intravenosa (i.v.) en la vena de la cola de ratones hembra atmicos
desnudos nu/nu portadores de tumores humanos MKN45 (adenocarcinoma gstrico), HT-
1080 (fibrosarcoma), o HeLa (adenocarinoma de crvix) (n =4/grupo). Todos los
trimerbodies mostraron un rpido aclaramiento renal tras la inyeccin i.v., con un mximo
de intensidad de seal a las 3 horas, siendo indetectable a las 48 horas post-inyeccin
(Figuras 4 A y 4C). El trimerbody B 1.8 no mostr localizacin detectable de tumor en
ninguno de los tres tipos de tumores estudiados (Figuras 4B y 5). Se observ una selectiva
y fuerte acumulacin en los tumores que expresan CEA (CEA
+
) del trimerbody MFE-23.
Tras la inyeccin i.v. del trimerbody MFE-23-Cy5, el mximo de seal registrada se
produjo a las 3 horas, decayendo la seal a las 24 horas y mantenindose detectable a las 48
horas (Figura 4B). El trimerbody anti-laminina mostr localizacin especfica de tumor en
todos los modelos estudiados (sean o no tumores que expresasen CEA) (Figuras 4B y 5).
Sin embargo, la cintica de intensidad de seal result diferente al trimerbody MFE- 23,
siendo el mximo de seal a las 24 horas, algo menor que el mximo obtenido por el
trimerbody MFE-23. El scFv anti-laminina tambin mostr localizacin especfica de
tumor pero a un nivel mucho ms bajo que el del trimerbody anti-laminina (Figuras 4B y
4D).
III. DISCUSIN
Estudios previos de los investigadores mostraban la capacidad de las secuencias derivadas
de colgeno de promover la trimerizacin de anticuerpos [Snchez-Arevalo VJ et al. (2006)
Int J Cncer 119:455-462]. En dichos estudios, se mostraba que la fusin del subdominio
NCl N-terminal de colgeno XVIII, responsable de la trimerizacin no- covalente de las
cadenas alfa del colgeno XVIII al extremo C-terminal de un anticuerpo scFv, confiere un
estado trimrico al anticuerpo generado ("trimerbody"). As, se demostr que utilizando un
scFv (L36) que reconoce un eptopo de laminina asociado a angiognesis y que inhibe la
angiognesis y el crecimiento del tumor, el L36 trimrico era ms efectivo que el
correspondiente monomrico en la inhibicin de la morfognesis capilar in vitro, e
inhibiendo el crecimiento del tumor in vivo [Snchez- Arevalo VJ et al. (2006), citado
supra]. Otro grupo investigador [Fan CY et al. (2008). FASEB J 22:3795- 3804] ha
utilizado una aproximacin similar para multimerizar anticuerpos y ha demostrado que un
esqueleto de pptidos cortos similares a colgeno era capaz de promover la trimerizacin de
fragmentos scFv fusionados ("collabody").
En la presente invencin, se presenta una caracterizacin detallada, tanto in vivo como in
vitro de la fusin del anticuerpo-dominio de oligomerizacin, y se extiende el concepto
produciendo molculas anlogas con especificidad frente al hapteno NIP y frente a un
antgeno asociado a tumores (CEA). En particular, se han desarrollado unas protenas
trimricas (trmeros) que comprenden 3 protenas de fusin, comprendiendo cada protena
de fusin un fragmento de un anticuerpo y una secuencia derivada de colgeno que
comprende el dominio de trimerizacin; dichas protenas oligomricas (trmeros) caen
dentro del concepto "trimerbody" acuado en esta descripcin. Todos los trimerbodies se
aislaron en una forma activa a partir de medio condicionado obtenido de clulas HEK293
transfectadas y fueron fcilmente purificados utilizando cromatografa de afinidad por
metal inmovilizado. Los trimerbodies son trimricos en solucin, y poseen una excelente
estabilidad y capacidad de unin al antgeno. Los trimerbodies son muy eficientes
reconociendo antgenos purificados inmovilizados sobre una placa, o expresados en la
superficie de una clula tumoral. Anlisis mediante SPR demostr que el trimerbody tena
una seal de unin mayor que el anticuerpo monomrico y aparentemente una disociacin
menor, consistente con la unin multivalente al antgeno. Los investigadores calcularon que
el trimerbody anti-NIP tiene una afinidad funcional por el antgeno (conjugados NIP-BSA)
unas 100 veces mayor, comparado con la versin monovalente. Este resultado sugiere que
esta ganancia de afinidad podra ser debida al efecto de avidez de un segundo sitio de
combinacin en la molcula de trimerbody. La presencia de al menos dos sitios de unin
funcionales en una sola molcula de trimerbody fue posteriormente demostrada mediante la
generacin de trimerbodies biespecficos. Trimerbodies bifuncionales anti-laminina y anti-
NIP estables fueron fcilmente producidos por co-expresin de dos construcciones
diferentes de trimerbodies en clulas humanas. La ganancia en afinidad a travs de la
avidez hace a los trimerbodies atractivos para tcnicas de imagen in vivo como agentes
alternativos a los anticuerpos dimricos. Se podra, por tanto, especular que los
trimerbodies se preferirn sobre los anticuerpos dimricos (diabodies y minibodies), aunque
esta propiedad puede depender de la estructura y densidad del antgeno reconocido por los
scFv. Para una completa avidez en anticuerpos multivalentes dirigidos a molculas unidas a
la superficie, los sitios de unin del antgeno deben apuntar hacia la misma direccin. Si la
unin mltiple simultnea no es posible estticamente, entonces la ganancia aparente en
afinidad funcional es probable que sea menor y debida nicamente al efecto de unin
aumentado, que es dependiente en tasas de difusin y la concentracin del antgeno de
superficie [Lawrence LJ et al. (1998) FEBS letters 425:479-484]. El anlisis del modelo de
trimerbody sugiere una estructura con forma de trpode con los dominios scFv orientados
hacia fuera (Figura 6). La flexibilidad entre los sitios de unin al antgeno es otro aspecto
importante en el diseo de anticuerpos multivalentes, requeridos para el entre cruz amiento
de receptores de superficie, bien en la misma clula o en adyacentes. El espaciador de 21
residuos, con una longitud mxima de 79,8 si la conformacin es completamente
extendida, es muy flexible, permitiendo numerosas geometras de unin. Cuando una
interaccin antgeno- anticuerpo ocurre, la posibilidad de establecer una segunda
interaccin depende de la valencia, orientacin y flexibilidad del sitio de unin del
antgeno. Segn los clculos de los inventores, en la molcula de trimerbody, los scFv que
permanecen sin interaccionar tienen un rea de influencia unas 11 veces mayor,
aproximadamente, que otros formatos bivalentes, tales como los diabodies y los
minibodies, aumentando la probabilidad de una segunda interaccin efectiva. Uniones
mltiples pueden, efectivamente, reducir las "off rates " aumentando as el tiempo de
retencin del anticuerpo unido al antgeno diana. A este respecto, una ventaja mayor del
trimerbody sobre otros formatos trimricos (como el collabody) es la flexibilidad. La
estructura ms compacta/rgida del collabody reduce la accesibilidad de los scFv, que es un
parmetro crtico para la localizacin de tumores in vivo.
As, la multimerizacin de las construcciones scFv presenta ventajas para las aplicaciones
in vivo. Los anticuerpos recombinantes, tal como los diabodies y minibodies han
demostrado su potencial como agentes de localizacin in vivo [Holliger P et al. (2005) Nat
Biotechnol 23:1126-1136]. Los trimerbodies son molculas multivalentes de tamao
intermedio que presentan una alta estabilidad en condiciones fisiolgicas. El potencial de
los trimerbodies para la localizacin in vivo se estudi en modelos experimentales de
cncer humano en ratones desnudos. Los trimerbodies anti-CEA localizan rpida y
especficamente en los tumores CEA-positivos. La mxima seal en el tumor se alcanzaba a
las 3 horas tras la inyeccin y era lentamente eliminada a lo largo del tiempo. La
fluorescencia era an detectable en el tumor tras 48 horas tras la inyeccin con el
trimerbody. Es de destacar que el anticuerpo trimerbody anti-laminina L36 se localiza en
todos los tumores estudiados independientemente de su estirpe histolgica. El mximo de
absorcin de los trimerbodies anti-laminina fue a las 24 horas tras la administracin del
mismo. A pesar de que los scFv L36 anti-laminina presentaban una acumulacin especfica
en el tumor, la acumulacin en el tumor era menor, probablemente debido a su eliminacin
ms rpida de la sangre (con una vida media menor de 15 minutos) y por su naturaleza
monovalente (que implica bajos tiempos de retencin) [Adams GP et al. (1995). Cncer
Immunol. Immunother. 40:299-306]. Segn resultados previos, el eptopo reconocido por el
anticuerpo L36 est localizado en la parte media del brazo largo de la laminina, en un rea
altamente flexible, que corresponde a un sitio susceptible de proteasas. Los inventores han
postulado que este eptopo es nicamente accesible durante el ensamblaje de la membrana
basal (MB) [Sanz L et al. (2003) EMBO J. 22:1508-1517], donde la laminina intacta
durante el proceso de polimerizacin acta como soporte para el reclutamiento de otros
componentes de la MB [Sasaki T et al. (2004) J. CeIl. Biol. 164:959-963]. La expresin
restringida de este eptopo a situaciones asociadas con la remodelacin de la MB, explicara
la captacin ms lenta de los trimerbodies L36 en comparacin con los trimerbodies
MFE23 que reconocen un antgeno expresado por la clula tumoral. Ms all de sus
aplicaciones diagnsticas, los trimerbodies ofrecen oportunidades teraputicas
prometedoras basadas en la liberacin selectiva de molculas bioactivas en los tejidos
diana. Alguna de las aplicaciones inmediatas de los trimerbodies especficos de antgenos
asociados a tumores (por ejemplo, el receptor 2 del factor de crecimiento epidemial
humano, antgeno especfico de prstata), o dirigidos al estroma tumoral (por ejemplo,
protena de activacin de fibroblasto) incluyen el desarrollo de protenas de fusin con
inhibidores angiognicos [Snchez-Arevalo VJ et al. (2006) Int J Cncer 119:455-462],
citoquinas, enzimas, o receptores truncados, y conjugacin con radionucleidos [Sanz L et
al. (2004) Trends Immunol 25:85-91].
Patent Citations
Cited Patent
Filing
date
Publication
date
Applicant Title
WO1995031540A1
*
May 16,
1995
Nov 23, 1995
Hoppe Hans
Juergen
Trimerising polypeptides,
their manufacture and use
WO2006048252A1
*
Oct 31,
2005
May 11,
2006
Univ Madrid
Autonoma
Multifunctional and
multivalent angiogenesis
inhibitors
EP1798240A1 *
Dec 14,
2006
Jun 20, 2007
Industrial
Technology
Research Institute
Recombinant triplex
scaffold-based
polypeptides
* Cited by examiner
Non-Patent Citations
Reference
1 *
FAN C. ET AL.: 'Production of multivalent protein binders using a self-trimerizing
collagen-like peptide scaffold.' THE FASEB JOURNAL. vol. 22, November 2008,
pages 3795 - 3804
2 *
HOLLIGER P. ET AL.: 'Engineered antibody fragments and the rise of single domains.'
NATURE BIOTECHNOLOGY vol. 23, no. 9, 07 September 2005, pages 1126 - 1136
3 *
KORTT A.A. ET AL.: 'Dimeric and trimeric antibodies: high avidity scFvs for cancer
targeting.' BIOMOLECULAR ENGINEERING. vol. 18, 2001, ISSN 1050-3862 pages
95 - 108
4 *
SNCHEZ-ARVALO V.J. ET AL.: 'Enhanced antiangiogenic therapy with antibody-
collagen XVIII NC1 domain fusion proteins engineered to exploit matrix remodeling
events.' INT. J. CANCER. vol. 119, 2006, pages 455 - 462
* Cited by examiner
Classifications
International Classification C07K14/78, C07K19/00, G01N33/68, C07K16/28
Cooperative Classification G01N33/68, C12N15/62
European Classification G01N33/68, C12N15/62
Legal Events
Date Code Event Description
May 16, 2012 122

Kind code of ref document: A1
Ref document number: 09843588
Country of ref document: EP
Dec 15, 2010 121

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