Faculdade Unio de Goyazes

Prof. Dndo. Rodrigo I. Medeiros

CROMATOGRAFIA
Teoria destinada ao 1 perodo de Biomedicina.
um mtodo fsico-qumico de separao dos componentes de uma
mistura. Baseia-se nas diferentes distribuies desses componentes em duas
fases! "ma fase estacion#ria $que permanece parada% e uma fase m&'e( $que
se mo'imenta no sistema%. Durante a passagem da fase m&'e( os
componentes sero se(eti'amente arrastados por e(a e ao mesmo tempo
retidos pe(a fase estacion#ria) ocasionando diferentes migraes e diferentes
posies dos componentes da mistura.
CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA (CCD)
*onsiste na separao dos componentes de uma mistura atra's da
migrao diferencia( desses componentes quando arrastados pe(a fase m&'e(
$so('ente% sobre uma camada de(gada de adsor'ente. +ferece separao em
bre'e espao de tempo) 'ers#ti() apresenta grande reprodutibi(idade) de
f#ci( e,ecuo. Por todas estas 'antagens) indispens#'e( em (aborat&rios que
rea(i-am an#(ise de subst.ncias org.nicas e organomet#(icas. mais usada na
separao de subst.ncias /idrof&bicas.
Classificao de acordo com o mecanismo de separao esta cromatografia
c(assificada) de um modo gera() como sendo uma cromatografia de
0D1+R23+. De acordo com o estado fsico das duas fases tambm
c(assificada como uma cromatografia (quida-s&(ida.
Mecanis!o de se"a#ao dos co!"onen$es est# fundamentado no
fen4meno de 0D1+R23+) que o dep&sito ou a reteno se(eti'a de
subst.ncias sobre a superfcie de s&(idos finamente di'ididos) por efeitos de
foras e(etrost#ticas. +s adsor'entes mais usados so! a s(ica $1i+
5
% e a
a(umina $0(
5
+
6
%. 0 s(ica um s&(ido) a(tamente poroso) e um dos
adsor'entes mais uti(i-ados em cromatografia. 7,istem '#rios tipos no
mercado. 0(guns tipos 8Merc9:! s(ica 8;: - apresenta em sua composio
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subst.ncias ag(utinantes $<= a <>? de gesso ou < a 6? de amido% com o
ob@eti'o de fi,ar o adsor'ente sobre a p(aca de 'idroA s(ica 8B:- no contm
ag(utinantes. usada em cromatografia de co(unaA s(ica 8C:- contm
subst.ncia f(uorescentesA s(ica 8P:- para uso em camadas Preparati'as.
%#e"a#ao das "lacas para a preparao das p(acas de'e-se primeiramente
assegurar a comp(eta (impe-a das mesmas. 0 quantidade de adsor'ente
$espessura da camada% de'e ser de! =)6 a =)>mm - qua(itati'aA =)D a <)= ou
6)=mm - preparati'a. 0 re(ao quantidade de amostraEespessura da camada
de adsor'ente importante. *omo suporte para a camada de adsor'ente
podemos uti(i-ar p(acas de 'idro de taman/os 'ariados! 5)>,F)>cmA
<=)=,5=)=cmA 5=)=,5=)=cm.
7,istem '#rias formas de se preparar uma p(aca cromatogr#fica) sendo
a mais usada a que uti(i-a espa(/adores do adsor'ente. Ca--se uma suspenso
do adsor'ente com um so('ente adequado e mantendo-se a p(aca na
/ori-onta() transfere-se a suspenso para a superfcie da p(aca) espa(/ando-se
de maneira bem uniforme. Dei,a-se em repouso por a(guns minutos e ento
fa--se a ati'ao das p(acas. 0 ati'ao consiste em dei,ar a camada de
adsor'ente seca $(i're do so('ente usado na suspenso%. + tempo e a
temperatura para isso dependem do adsor'ente e da ati'idade dese@ada. 0
camada de s(ica ati'ada dei,ando-se as p(acas na estufa $<=> - <<=G*% por
6= - D=H. Para conser'#-(as secas as mesmas de'em ser guardadas em
dessecadores.
Fase !&'el o so('ente ou mistura de so('entes tem pape( fundamenta( na
separao de misturas. 7ntende-se que e,iste uma competio entre as
mo(cu(as da fase m&'e( e da amostra) pe(a superfcie do adsor'ente. Portanto)
a esco(/a da fase m&'e( tem que considerar a nature-a qumica das
subst.ncias a serem separadas e a po(aridade da fase m&'e(. De'e-se tomar
como base a 8srie e(uotr&pica 8 dos so('entes $so('entes em ordem de
po(aridade%. + poder de e(uio est# diretamente re(acionado com a po(aridade.
1rie e(uotr&pica $no fina(%.
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A"licao das a!os$#as na c#o!a$o(#afia em gera( usam-se so(ues de
=)< a <)=?. Pode-se uti(i-ar micropipetas ou microseringas) que permitem
determinar a quantidade de subst.ncias co(ocada nas p(acas. Iuando no
e,igida a quantidade de amostra pode-se usar capi(ares de 'idro. 0s gotas
de'em ser ap(icadas <)> a <)=cm acima da borda inferior da p(aca $ponto de
partida%.

Re'elado#es c#o!a$o(#)ficos so agentes fsicos $u(tra'io(eta) por e,emp(o%
ou qumicos $'apores de iodo) B
5
1+
J
) por e,emp(o% que tornam 'is'eis as
subst.ncias separadas.
Cons$an$es c#o!a$o(#)ficas so caractersticas reprodu-'eis em um dado
sistema cromatogr#fico. Por e,emp(o Rf $Rate of f(oK% que a re(ao de
des(ocamento dados pe(a re(ao de des(ocamento do so(uto pe(o
des(ocamento do so('ente.
1rie e(uotr&pica
- pentano
- ter de petr&(eo
- cic(o/e,ano
- ben-eno
- c(orof&rmio
- ter et(ico aumento da po(aridade
- acetato de eti(a
- acetona
- propano(
- etano(
- metano(
- #gua
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CROMATOGRAFIA EM COLU*A
+s mtodos cromatogr#ficos (quido-s&(ido $adsoro% podem ser
rea(i-ados numa co(una rec/eada com um s&(ido $fase estacion#ria% e uma
fase m&'e( (quida) onde a adsoro ocorrer# entre as superfcies das fases
m&'e( e estacion#ria. Dependendo do taman/o da co(una usada) faci(mente
ap(icada para fins preparati'os) de'endo ser monitorada) principa(mente por
cromatografia em camada de(gada.
1eparao de pigmentos 'egetais
A!os$#a Preparar a amostra) fer'endo >=g de fo(/as de espinafre) das quais
foram remo'idas as ner'uras centrais) em <== mL de #gua desti(ada) por <-5
minutos. Resfriar rapidamente e decantar o (quido. 1ecar as fo(/as com pape(
absor'ente e co(oc#-(as em um a(mofari- com uma mistura de ter de petr&(eo
$6=-D=
o
*% e acetona $M=!5=%) triturando para obter uma so(uo 'erde que
decantada em um tubo de ensaio.
"ti(i-ar ter de petr&(eo $6=-D=
o
*% e acetona como fases m&'eis) a(umina
$ma(/a de 5==-J==% como fase estacion#ria e uma co(una de 'idro) de
apro,imadamente =)> , <> cm) pro'ida de torneira.
%#e"a#ao da coluna Iuanto mais uniforme for o enc/imento da co(una
maior ser# a sua eficiNncia. Durante o enc/imento o ar pode ficar retido entre
as partcu(as) para e'itar que isso ocorra de'e-se agitar o adsor'ente num
frasco) com a fase m&'e() at a constituio de uma pasta) a qua( ser#
co(ocada dentro da co(una) @# contendo <E6 da fase m&'e(. Oesta operao
acompan/ada por 'ibrao da co(una e) dei,ando o materia( assentar
gradua(mente) obtm-se uma ra-o#'e( /omogeneidade no enc/imento. De'e-
se e'itar dei,ar a co(una secar durante o enc/imento ou a e(uio) porque
aparecem rac/aduras na co(una) o que pre@udicar# a separao
cromatogr#fica.
0 co(una) de a(tura de apro,imadamente D cm) ser# preenc/ida com
uma suspenso de a(umina 5g em ter de petr&(eo.
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O+s, Oo <G perodo so abordados aspectos te&ricos e pr#ticos em
apresentao com figuras e fotos em 8data s/oK: pe(o docente. 0 0ti'idade
pr#tica de cromatografia) condicionada P condies tcnicas especficas) ser#
rea(i-ada no 5G perodo na discip(ina de Iumica ;era( e +rg.nica.
%#ocedi!en$o e-"e#i!en$al (5G perodo)
a) Cromatografia em coluna
"ti(i-ar um conta-gotas para transferir uma poro da amostra para o topo
da co(una e abrir a torneira at a so(uo atingir o n'e( do rec/eio. Iniciar a
e(uio com ter de petr&(eo. *o(etar a banda amare(a quando esta comear a
sair da co(una. Mudar a fase m&'e( para acetona e co(etar a banda 'erde.
0 so(uo amare(ada contm uma mistura de carotenos) enquanto que a
so(uo de co(orao 'erde contm uma mistura de c(orofi(as. 0s so(ues
assim separadas sero ana(isadas por cromatografia em camada de(gada.
b) Cromatografia em camada delgada
0p(icar com au,(io de um capi(ar as duas so(ues de pigmentos na
e,tremidade de uma p(aca de s(ica-ge( ati'ada. Repetir o mesmo procedimento
em uma segunda p(aca. Dei,ar secar as duas p(acas e co(ocar a primeira na
cuba 0 e a segunda na cuba B) as duas cubas cromatogr#ficas @# de'ero
conter as seguintes fases m&'eis!
*uba 0 Q fase m&'e(! acetonaEter de petr&(eo <!J
*uba B Q fase m&'e(! acetonaEter de petr&(eo <!<<
Tampar as cubas e aguardar at o solvente atingir 1 cm antes do topo da placa,
retirar as placas das cubas, deixar secar e revel-las com luz ultravioleta e com vapores
de iodo.