Polmeros bacterianos biodegradables:

Polihidroxialcanoatos (PHAs)
1. Polmeros biodegradables
Los plsticos son polmeros orgnicos generalmente de origen
petroqumico, cuyo peso molecular vara entre 10
4
a 10
6
Da y debido a su
estructura pueden ser manipulados y moldeados con facilidad. resentan
resistencia qumica !cidos, lcalis y disolventes" y mecnica, son
impermeables, tienen una alta relaci#n resistencia$densidad, e%celentes
propiedades para el aislamiento t&rmico y el&ctrico y pueden ser transparentes
y coloridos. 'stas caractersticas asociadas a su ba(o costo de producci#n
)acen que el uso de los plsticos est& generali*ado !Dantas, +00,".
-eg.n su origen, las mol&culas de los plsticos pueden ser naturales,
como la celulosa, cera, cauc)o natural, o sint&ticas como el polietileno y el
nylon. Los plsticos sint&ticos se clasifican seg.n el proceso de polimeri*aci#n
en polmeros de condensaci#n y de adici#n. Las reacciones de condensaci#n
producen diferentes longitudes de polmeros !nylon, poliuretanos y poli&steres"
y peque/as cantidades de subproductos como agua, amoniaco y etilenglicol.
Las reacciones de adici#n producen longitudes especficas de polmeros
!polietileno, polipropileno, policloruro de vinilo y poliestireno" y ning.n
subproducto. -eg.n la forma en que son procesados, los plsticos pueden ser
termoplsticos o termoestables. Los termoplsticos formados por polmeros
lineales o ramificados pueden fundirse, se ablandan cuando se calientan y se
endurecen al enfriarse. or el contrario, la mayora de los plsticos formados
por polmeros entrecru*ados son termoestables y ganan dure*a cuando se
calientan.
-eg.n el 0onse(o 1acional del 2mbiente, 03124, !+006" ms del 50 6
de los plsticos e%istentes en el mercado, son termoplsticos, entre los que se
incluyen el polietileno tereftalato, '7 !envases de gaseosa", polietileno de alta
densidad, '2D !botellas de detergentes, productos alimenticios, tubos,
(uguetes", cloruro de polivinilo, 80 !muebles de (ardn, tubos de ca/os,
*apatillas", polietileno de ba(a densidad, '9D !bolsas para basura,
contenedores fle%ibles", polipropileno, !envases de yogurt, margarina y
lec)e, pie*as de autom#viles". Los termoestables se endurecen mediante un
fraguado, no se pueden volver a fundir ni a moldear y constituyen el +0 6 de
los plsticos, como el poliuretano, : !revestimientos, acabados, colc)ones,
1
asientos de ve)culos", epo%y !ad)esivos, embarcaciones, componentes
el&ctricos" y fen#licos !)ornos, tostadores, placas de circuitos".
'l mayor porcenta(e de los plsticos se utili*a para embala(es por lo que
tienen una vida .til muy corta y despu&s son descartados en grandes
cantidades, acumulndose en los vertederos municipales. uesto que durante
periodos relativamente largos no se )a producido alguna biodegradaci#n
significativa de estos materiales, se )a pensado en los polmeros naturales
para sustituirlos. Dado que cualquier sustancia de origen biol#gico puede ser
degradada por uno o varios microorganismos, la utili*aci#n generali*ada de
plsticos biol#gicos podra resolver el problema ambiental de los petroplsticos
!4adigan et al., +004".
Los plsticos biodegradables pueden ser divididos en tres categoras; los
sinteti*ados qumicamente, los que contienen amidas adicionadas a su
estructura y los poli)idro%ialcanoatos !<2s". 'ntre los primeros estn el cido
poliglic#lico o cido polilctico=alco)ol polivinlico o poli !#%ido de etileno" y la
poli=e=caprolactona que son susceptibles a la degradaci#n en*imtica
microbiana, pero su aplicaci#n comercial es reducida porque no presentan
propiedades mecnicas como los plsticos de origen petroqumico. 'n el
segundo grupo estn los plsticos que tienen un grupo amida como agente de
carga o ligando, e(emplo, el amido=polietileno y los microorganismos degradan
fcilmente la amida quebrando la matri* polim&rica> sin embargo, algunos de
los fragmentos de estos polmeros permanecen en al ambiente por largos
perodos. Los poli)idro%ialcanoatos !<2s", pertenecen al tercer grupo, son de
origen microbiano, totalmente biodegradables, presentan caractersticas
seme(antes a los plsticos derivados del petr#leo y pueden ser producidos a
partir de recursos renovables !De 2lmeida et al., +004> Dantas, +00,".
2. Definicin de polihidroxialcanoatos (PHAs)
'n la literatura se encuentran muc)as definiciones de los <2, algunas
de las cuales se presentan a continuaci#n. Los <2s son mol&culas que
muestran propiedades similares a las de algunos plsticos comunes como el
polipropileno pero que son reciclables y fciles de degradar por muc)os
microorganismos en un tiempo promedio de 6 a 1+ meses frente a los plsticos
derivados del petr#leo que tardan desde 40 )asta +00 a/os en degradarse
!?ranco et al., +00@". 7ambi&n son definidos como simples macromol&culas
sinteti*adas por muc)as bacterias Aram positivas y Aram negativas y
acumuladas en grnulos !cuerpos de inclusi#n" )asta niveles del 506 !2vila,
+00B" o ms del @0 6 del peso seco !De 2lmeida et al., +004", normalmente
ba(o condiciones de privaci#n nutricional de elementos como nitr#geno,
2
f#sforo, a*ufre, o%geno, magnesio y en presencia de un e%ceso de fuente de
carbono.
Los <2s son una familia de )omopoli&steres o )eteropoli&steres
biol#gicos #pticamente activos, que contienen unidades del mon#mero cido
!C"=)idro%ialcanoico. La acumulaci#n de <2s en las c&lulas microbianas
puede representar entre D0 a 50 6 de su masa seca> sin embargo, en
condiciones optimi*adas de cultivo o con uso de la ingeniera gen&tica se
puede alcan*ar <2s en ms del @0 6 de la masa bacteriana y pueden ser
producidos utili*ando como fuente de carbono materias primas como el
acetato, cido 4=)idro%ibutirico, celulosa, glicerol, lignina, metano, aceite
mineral y sacarosa entre otros !Dantas, +00,".
Los <2s son poli&steres isotcticos de origen bacteriano obtenidos
mediante fermentaci#n aerobia en un medio de cultivo rico en )idratos de
carbono ba(o condiciones de estr&s nutricional. Los carbo)idratos provienen de
fuentes naturales renovables como glucosa, sacarosa o bien desec)os de la
industria alimentaria como mosto de uva u olivo, mela*a de ca/a de a*.car,
etc. -i durante el crecimiento, la bacteria detecta falta o reducci#n de alg.n
nutriente !1, , -, 4g, E, 3
+
", entonces genera una reserva de energa
mediante la acumulaci#n en el citoplasma de <2s en forma de grnulos
!<ermida y Da*, +004". or su origen de fuentes renovables y por el )ec)o de
ser biodegradables se denominan Fpolmeros doblemente verdesG !Co*sa et
al., +004".
Los <2s son una serie de poli&steres sinteti*ados y acumulados por
algunos g&neros bacterianos como material de reserva de carbono y energa
cuando el medio de cultivo se encuentra desbalanceado con limitaci#n de
nutrientes como nitr#geno, f#sforo, a*ufre, magnesio, potasio u o%geno y con
e%ceso de fuente de carbono o con limitaciones fsicas como temperatura no
adecuada para el crecimiento. -on considerados como candidatos para el
reempla*o de los polmeros de origen qumico, debido a que son sinteti*ados
por microorganismos a partir de sustratos agrcolas y tienen la posibilidad de
ser degradados a di#%ido de carbono y agua en aerobiosis o metano en
anaerobiosis, en )bitats diversos como suelo, mar, agua estancadas y aguas
residuales !9arbosa et al., +00,".
'%isten tres clases de polmeros producidos intracelularmente en los
microorganismos, gluc#geno, poli)idro%ialcanoatos !<2s" y polifosfatos. -#lo
el gluc#geno y los <2s son considerados con polmeros de reserva, mientras
que los polifosfatos son disipadores de energa para balancear el contenido
celular !?ad)il et al., +006". Los <2s tienen funci#n de reserva y asimismo
retardan la degradaci#n de los componentes celulares como los cidos
nucleicos y protenas en perodos de escase* de la fuente de carbono. La
utili*aci#n de los <2s es considerada como una estrategia desarrollada por
las bacterias para incrementar su supervivencia. -on utili*ados como fuente de
3
carbono y energa end#gena en condiciones de escase* de nutrientes, como
fuente de carbono y energa para el enquistamiento !Azotobacter sp." y la
esporulaci#n !Bacillus sp.", como fuente de poder reductor para la degradaci#n
de compuestos t#%icos y como protecci#n de la nitrogenasa de las bacterias
fi(adoras de nitr#geno, puesto que los <2s constituyen reductores en
ausencia de sustratos e%#genos que puedan ser o%idados. 2simismo, los <2s
)an sido detectados como constituyentes de la membrana citoplasmtica en
comple(os con calcio en polifosfatos o asociados a protenas !2vila, +00B".
. Historia
'l primer <2 descubierto fue el poli D=D=)idro%ibutirato, !D<9", un
)omopolmero detectado en Bacillus megaterium, por 4aurice Lemoigne en
1@+D. Desde entonces, una larga variedad de <2s con diferente longitud de
cadena de carbonos y grupos C se )an estudiad, con por lo menos 1,0
diversos componentes de <2s y cinco rutas biosint&ticas diferentes. 'sta
variabilidad en la composici#n depende de la especificidad del sistema de
polimeri*aci#n, de la naturale*a del sustrato suministrado, as como de las
rutas metab#licas que llevan a la formaci#n de los mon#meros.
Los procesos comerciales para la producci#n de <2s fueron desarrollados
inicialmente por H.C.Arace en los a/os 60 y desarrollados ms adelante por
Imperial 0)emical Industries !I0I", en Inglaterra, entre los a/os B0 y 50. Desde
los a/os @0, 4etaboli% Inc. y 4onsanto )an sido las fuer*as impulsoras para la
e%plotaci#n comercial de los polmeros de <2s en 'stados :nidos. -eg.n
Lemos et al. !+006", e%isten cuatro marcas; 9iopol !copolmero de
)idro%ibutirato e )idro%ivalerato", 9iomer !)omopolmero de )idro%ibutirato",
1oda% !copolmero de )idro%ibutirato e )idro%i)e%anoato" y 9iocyde
!)omopolmero de )idro%ibutirato, copolmero de )idro%ibutirato e
)idro%ivalerato".
'n los a/os B0, la empresa I0I desarroll# un proceso para producir a escala
industrial el 9iopol. 'ste poli)idro%ialcanoato es un copolmero de mon#meros
de cuatro y cinco carbonos denominados )idro%ibutirato e )idro%ivalerato,
!<98", respectivamente. -e produca utili*ando la bacteria Ralstonia eutropha
!)oy Cupriavidus necator", cultivada en un medio con glucosa y propionato
como fuente de carbono, alcan*ando rendimientos superiores al 50 6 de peso
seco celular. 2 pesar de su costo relativamente elevado, el 9iopol fue utili*ado
en varias aplicaciones en 2lemania. 2 fines del siglo JJ el precio del petr#leo
disminuy# y de la misma manera el inter&s por los <2s.
4
'n los .ltimos a/os la tendencia se )a revertido !0uadro 1". 2dems de
producirse un aumento en el precio del petr#leo, se )a tomado mayor
conciencia de que las reservas se estn agotando de manera alarmante. or
otro lado, los residuos plsticos se acumulan en grandes cantidades y su
reciclado alivia la situaci#n pero s#lo en parte. 'l reempla*o de los plsticos
derivados del petr#leo por biopolmeros totalmente degradables sera una
soluci#n para los diferentes aspectos de este problema> sin embargo, el precio
de los bioplsticos sigue siendo demasiado alto !De 2lmeida et al., +004".
'n Latinoam&rica poli)idro%ialcanoatos como el !D<9", son producidos por la
empresa brasile/a <2 Industrial -.2. desde el a/o +000, con capacidad inicial
de ,0 t a/o
=1
. Cecientemente copolmeros de D<9 y D=)idroalcanoatos de
cadena media !D <2 mcl" )an sido ob(eto de diferentes patentes. 'stos son
polmeros de gran inter&s puesto que presentan propiedades intermedias entre
polmeros de cadena corta !<2 scl" y de cadena media !<2 mcl" como
elongamiento superior al 600 6 !2vila, +00B".
!"adro 1. rincipales compa/as productoras de polidro%ialcanoatos !<2s"
en el mundo
!ompa#a $bicacin Prod"cto
%ombre
comercial
4etaboli%$:-2
!92-?$2D4"
''::
!D<9"!D<3"!D<9=co=
D<8"
4irel
<9 Industrial, -.2 9rasil !D<9"!D<9=co=D<9" 9iocycle
7ianan 9iologa
4aterial 0o
0)ina
<98 'cogen
9iotec)nology 0o. 2lemania !D<9" 9iomer
4itsubis)i A2-
0)emical
Kap#n !D<9" 9iogreen
L A L Eaneca ''::$Kap#n !D<9=co=D<<%" 1oda%
9io=on Italia <2 4inerv= <2
&. 'str"ct"ra ("mica
5
'structuralmente los <2s son polmeros lineales de !C" =D=)idro%icidos
en los que el grupo carbo%ilo de un mon#mero forma un enlace tipo &ster con el
grupo )idro%ilo del siguiente mon#mero !?iguras 1 y +". 'l radical C puede ser
un tomo de )idr#geno o una cadena de )asta trece tomos de carbono, que
puede contener insaturaciones, cadenas cclicas, grupos aromticos e inclusive
otros tomos como bromo, fl.or o cloro. La naturale*a del radical C determina
la identidad de la unidad monom&rica y (unto con el valor de % !que puede
variar de 600 a D, 000", las propiedades del polmero. -e )an identificado ms
de 100 unidades monom&ricas como constituyentes de estos poli&steres
!Dantas, +00,".
Los <2s son poli&steres alifticos constituidos por mon#meros con 100
y D000 unidades. 0uando CM 0<
D
, se tienen mon#meros de )idro%ibutirato que
dan como resultado el poli=9=)idro%ibutirato !D<9". -i CM 0<
+
=0<
D
, se tienen
mon#meros de )idro%ivalerato que en con(unto constituyen el poli=9=
)idro%ivalerato !<8". 'stos dos compuestos !?iguras D y 4" en forma de
)omopolmeros o )eteropolmeros !?igura ," ocupan los lugares
predominantes de los poli)ro%ialcanoatos comercialmente disponibles en la
actualidad !Civera y 1evre*, +00@".
-eg.n la composici#n de los mon#meros en la cadena, los <2s pueden
ser clasificados en )omopolmeros !un tipo de mon#mero" y copolmeros !ms
de un tipo de mon#mero". Dantas !+00," menciona que dependiendo del
n.mero de tomos de carbono presentes en la cadena de un mon#mero, se
distinguen tres grupos de <2s, de cadena corta !D a , tomos", cadena
media !6 a 14 tomos" y cadena larga !ms de 14 tomos". or su parte,
Cevelo et al., !+00B", consideran dos clases !?iguras 6 y B"; <2s de
cadena corta !D a , tomos de carbono" o <2s=scl !s)ort c)ain lengt)", con
cidos D=)idro%ibutrico !D<9" y D=)idro%ival&rico !D<8" y polmeros de cadena
media !6 a 14 tomos de carbono" o <2s=mcl !medium c)ain lengt)", que
contienen mon#meros de 06 !D=)idro%i)e%anoato a 014 !D=
)idro%itetradecanoato". Los <2s= scl son encontrados en Cupriavidus necator,
Alcaligenes latus, Azotobacter vinelandii, A. chrococcum y Methylobacterium
organophilum entre otras bacterias, mientras que los <2s=mcl son
encontrados en Pseudomonas oleovorans, P. aeruginosa y otras
Pseudomonas fluorescentes.
La investigaci#n sobre <9, demuestra que la naturale*a qumica e%acta
y, por tanto, tambi&n las propiedades qumicas del polmero producido por una
bacteria puede ser controlada variando el sustrato utili*ado para su cultivo. or
e(emplo, en algunas bacterias el acetato y el butirato determinan la producci#n
de poli=9=)idro%ibutirato, !04", mientras que el caproato !cido graso de seis
carbonos" lleva a la producci#n de un polmero que contiene 06, y el valeriato
!cinco carbonos" a un polmero que contiene 0,. 7ambi&n pueden sinteti*arse
6
copolmeros que contienen varias unidades de mon#meros que se repiten de
manera alterna !4adigan et al., +004".
)ig"ra 1. ?#rmula estructural general de los poli)idro%ialcanoatos !Dantas,
+00,".
)ig"ra 2. ?#rmula general de los poli)idro%ialcanoatos y algunos
miembros representativos !0osta, +00,".
nM1 CM)idr#geno oli !D=)idro%ipropionato"
CM metil oli !D=)idro%ibutirato" !D<9"
CM etil oli !D )idro%ivalerato" !D<8"
CM propil oli !D= )idro%i)e%anoato" !D<0"
CMnonil oli !D=)idro%idodecanoato"
nM+ CM)idr#geno oli !4=)idro%ibutirato" !4<9"
7
O
R O
x
CH CH
2
C
=
O
R O
x
O
R O
100 - 30000
CH (CH
2
)

n
C
CMmetil oli !4=)idro%ivalerato" !4<8"
1MD CM)idr#geno oli !,=)idro%ivalerato" !,<8"
CMmetil oli !,=)idro%il)e%anoato"
1M4 CM)e%il oli !6=)idro%i)e%anoato"
)ig"ra . !D<9", poli)idro%ibutirato; poli !D=)idro%ibutirato", 3 !D<9".
8
O
CH
3
O
x
CH CH
2
C
O
CH
2
CH
3
O
x
CH CH
2
C
)ig"ra &. <8, poli)idro%ivalerato; poli !D=)idro%ivalerato". 3 !D<8".
)ig"ra *. 'structura qumica de copolmero butirato=valerato <98;
!D<9=co=D<8"> b1, carbonilo !0M0"> 9+, metileno !0<
+
"> 9D,
metino !0<"> 94, metilo !0<
D
" en la unidad !D<9"> 81,
carbonilo !0M0", 8+, metileno !0<
+
"> 8D, metino !0<"> 84,
metileno !0<
+
">8,, metilo !0<
D
" en !D<8" !7rong et al., +006".
9
O
CH
3
O
x
CH CH
2
C
O CH
CH
2
CH
3
CH
2
O
C
B3
B4
B2 B1 V1 V2 V3
V4 V5
x
CM <.0<
D
0
+
<
,
, nM 1=D
)ig"ra +. <2 de cadena corta !s)ort side c)ain", termoplstico.
CM0
D
<
B
a 0
1D
<+B, n M1=4
)ig"ra ,. <2 de cadena mediana !medium side c)ain", elastom&rico.
*. !aractersticas fsicas
10
O
R O
x
CH (CH
2
)

n
C
O
R O
x
CH (CH
2
)

n
C
La masa molecular de los <2s vara dependiendo del microorganismo
productor, pero en promedio est en el orden de , 000 a 1 000 000 Da
!+ % l0
D
a D % 10
6
Da". Las propiedades fsicas y mecnicas como rigide*,
ductibilidad, punto de fusi#n, temperatura de transici#n vtrea y resistencia a los
solventes orgnicos varan considerablemente en funci#n de su composici#n
monom&rica !Dantas, +00,". Los polmeros de cadena corta !scl" son duros y
quebradi*os, mientras que los de cadena media !mcl" son fle%ibles y tienen un
punto ms ba(o de cristalinidad por lo que cada polmero tiene diferentes
aplicaciones. Los <2 scl son catalogados como termoplsticos, mientras que
los <2 mcl, por tener cristalinidad y punto de fusi#n menores son reconocidos
como elast#meros. Los <2 mcl tienen un elongamiento para ruptura mayor
que 1006, mientras que los <2 scl poseen un elongamiento para ruptura
menor que , 6. La incorporaci#n de unidades de valerianatos, !&steres del
cido pentanoico, D<8"al D<8 permite aumentar la fle%ibilidad y resistencia al
impacto, alcan*ndose un valor de ,0 6 en elongamiento para ruptura !2vila,
+00@".
Los <2s son polmeros termoplsticos o elastom&ricos, con alto grado
de polimeri*aci#n de )asta D0 000 y un grado de cristalinidad que oscila entre
,, a 50 6. 0onforme se incrementa la cadena o el n.mero de co=mon#meros
la estabilidad aumenta. rcticamente todos son #pticamente activos debido a
la presencia de un carbono quiral en la posici#n 9 de la estructura del
mon#mero. -on estables ante los rayos :8 y en contraste con otros
bioplsticos como los cidos polilcticos !L2" tienen una mnima
permeabilidad al agua.
La temperatura de fusi#n !7m" y la temperatura de transici#n vtrea !7g"
de los <2, estn ntimamente relacionadas con la estructura de los
mon#meros y la cantidad de comon#meros en los copolmeros -u temperatura
de fusi#n parcial es superior a los 150 N0 y se tornan altamente viscosos y
moldeables en temperaturas cercanas o mayores a su punto de fusi#n. De esta
misma manera, la 7m y la 7g se incrementan conforme aumenta la masa
molecular en el caso de los <2 de ba(o peso molecular pero el
comportamiento se invierte en los <2 con elevado peso molecular. Los
)omopolmeros como el <9 son materiales muy cristalinos y rgidos pero los
)eteropolmeros de )idro%ibutirato=)idro%ivalerato son ms d.ctiles y
resistentes. La adici#n de mon#meros de )idro%ivalerato disminuye el punto de
fusi#n pero aumenta su biodegradabilidad. Los copolmeros <98 se forman
cuando se utili*an me*clas de sustratos como glucosa y valerato !<ermida y
Da*, +004> Dantas, +00,".
11
Las dos clases de <2s ms comunes son el )omopolmero
poli)idro%ibutirato !D<9" y el copolmero de poli)idro%ivalerato conocido como
poli)idro%ibutirato=valerato !<98". 'l !D<9" tienen propiedades similares al
polipropileno, puede ser procesado por t&cnicas de e%trusi#n e inyecci#n, es
altamente cristalino y muy frgil, mientras que el copolmero <98 es menos
cristalino, ms fle%ible y fcil de procesar. :n nombre comercial de este
copolmero es 9iopol y se obtiene agregando cido propi#nico. 'l ms
ampliamente estudiado es el !D<9", que presenta unidades repetidas de
cido D=)idro%ibutirico, todas en la configuraci#n D !=", debido a la
estereospecificidad de las en*imas involucradas en la sntesis, lo que lo )ace
totalmente cristalino y frgil. La masa molecular del !D<9" bacteriano vara
entre 10
D
a D % 10
6
Da, con una polidispersidad en torno a +. Las densidades
del polmero amorfo y cristalino respectivamente son de 1,15 y 1,+6 g $cm
D
. 's
soluble en cloroformo y en )idrocarburos )alogenados, presenta poca
resistencia frente a los cidos y las bases, pero es muy resistente a la radiaci#n
ultravioleta.
La temperatura de transici#n vtrea del !D<9" es de , y la de fusi#n es
1B, N0, cerca del punto de degradaci#n t&rmica !+00 N0", lo cual restringe su
procesamiento. resenta propiedades mecnicas similares a las del
polipropileno !"> sin embargo, sus aplicaciones son limitadas. 'n el m#dulo
de Ooung se encuentra entre D,, a 4,0> su resistencia a la tracci#n es de 40
4a, la capacidad de elongaci#n es de , 6 inferior a la del , por lo que es
muy frgil, caracterstica que puede ser atribuida a la ruptura y degradaci#n de
las cadenas polim&ricas y la formaci#n de ra(aduras en las esferulitas durante
el proceso de e%tracci#n del polmero. Dentro de la c&lula, e%iste en estado
lquido y amorfo> sin embargo, despu&s de la e%tracci#n de la c&lula por
solventes orgnicos, el !D<9" se convierte en estado altamente cristalino !,,=
,5 6" lo que le da bastante dure*a, pero a su ve* lo )ace un material muy
quebradi*o. La incorporaci#n de mon#meros !D<8" en el polmero conduce a
una disminuci#n en la cristalinidad y punto de fusi#n, con una disminuci#n de
la rigide* y un incremento en la dure*a, )aciendo a poli !)idro%ibutirato=co=
)idro%ivalerato !<98"!D<9=co=D<8"y otros copolmeros relacionados ms
adecuados para aplicaciones comerciales !<ermida y Da*, +004".
Dependiendo de la longitud de la cadena lateral en las unidades
monom&ricas del polmero <2 !una propiedad que puede a(ustarse
modificando la composici#n del medio de crecimiento o por modificaci#n
gen&tica de la bacteria productora", pueden asegurarse <2s con diversos
puntos de fusi#n, cristalinidad, fle%ibilidad y resistencia a la tensi#n !4adigan et
al., +004". 'n el cuadro + se observa una comparaci#n de algunas
propiedades entre el polipropileno, un )omopolmero poli)idro%ibutirato !<9" y
12
un )eteropolmero )idro%ibutirato=)idro%ivalerato !<98" en contraste con los
polmeros de cadena corta como el <9 o el <98, los <2s de cadena
mediana son menos cristalinos y ms elsticos.
!"adro 2. 0omparaci#n de algunas propiedades entre poli&steres sint&ticos
!polipropileno" y poli)idro%ialcanoatos !Dantas, +00,"
Propiedad
Polipropileno P(H-) PH-. (2/ 0 H.)
4asa molecular % 10
D
Da
+,+=B,0 1,0=5,0
Densidad !g.cm
D
"
0,@0=0,@4 1,+D=1,+,
7emperatura de
fusi#n !N0"
1B0=156 1B1=15+ 14,
7emperatura de
transici#n vtrea !N0"
4, 4=10
0ristalinidad !6"
6,=B0 6,=50 ,6
Distribuci#n de masa
molecular
,,+=1+,0 +,+=D,0
4#dulo de Ooung !Aa"
!?uer*a de tensi#n"
1,B D,,=4,0 1,+
Cesistencia a tracci#n
!4a"
D, 40
'%tensi#n )asta quiebre
!6"
400 ,=5 ,0
Cesistencias a radiaci#n 9a(a 2lta
13
ultravioleta
Cesistencia a solventes
2lta 9a(a
ermeabilidad de
o%geno !cm
D
.m
+
.atm
=1
d
=
1
"
1B00 4,
9iodegradabilidad
1ula 9uena 4uy buena
+. 1rganismos ("e sinteti2an PHAs
Los <2 son poli&steres termoplsticos sinteti*ados por diversos
organismos, incluyendo procariotas y algunas plantas, ba(o determinadas
condiciones de crecimiento. -i bien e%isten reportes sobre la producci#n de
<2s en plantas, las c&lulas vegetales obtienen rendimientos menores al 10 6,
mientras que algunas bacterias logran acumular estos biopolmeros de manera
que )asta 50 a @06 del peso seco es atribuible al <2, convirti&ndolas en
candidatos id#neas para la producci#n de <2s a nivel industrial !Civera y
1evre*, +00@".
Los <2s son producidos por una gran variedad de procariotas !0uadro
D", siendo acumulados en forma de grnulos en el citoplasma, visibles el
microscopio #ptico de contraste de fases debido a su elevada refractividad
!Dantas, +00,". Las bacterias aerobias, anaerobias, )eter#trofas y
fotosint&ticas acumulan <2s. Las bacterias nitrofi(adoras en particular,
acumulan estos polmeros como estrategia de supervivencia y de regulaci#n
del metabolismo energ&tico tanto en simbiosis como en vida libre.
-e )a detectado la acumulaci#n de <2s en cerca de D00 especies
bacterianas> sin embargo, el porcenta(e de acumulaci#n en muc)as de ellas es
muy ba(o, por lo cual se rec)a*an ante la imposibilidad de industriali*ar el
proceso> no obstante, especies como Cupriavidus necator !Ralstonia eutropha",
Methylobacterium spp. Alcaligenes latus, Pseudomonas oleovorans, P. putida,
P. denitrificans, P.aeruginosa, Bacillus megaterium, Halomonas boliviensis,
Azospirillum brasilense, scherichia coli recombinante y Azotobacter vinelandii
)an sido investigadas ampliamente !9arbosa et al., +00,". 7ambi&n son
consideradas especies de los g&neros Agrobacterium, Actinobacillus,
Mesorhizobium, Rhodobacter, Methylocistis, !eptothri", Rhizobium, Halomonas
y #phaerotilus $2vila, +00B> Au*mn y Au*, +005%.
14
'%isten g&neros de bacterias que sinteti*an el polmero .nicamente en la
fase estacionaria de crecimiento, por limitaci#n de un nutriente en presencia de
una fuente de carbono en e%ceso, por e(emplo; C. necator, P. oleovorans,
Azotobacter bei&erinc'ii, y Azospirillum brasilense. 3tras bacterias acumulan
<2s durante su crecimiento, sin necesidad que se agote un nutriente
esencial, e(emplo; Mesorhizobium plurifarium, Alcaligenes latus, Pseudomonas
putida, Halofera" mediterranei, Azotobacter chroococcum, los mutantes de
Azotobacter vinelandii y las cepas recombinantes de . coli $Lasala et al.,
+004, 0)en et al., +006> Choi et al., ())*".
C. necator produce <2s de cadena corta !unidades 0D a 0,". 2dems
del )omopolmero <9, puede producir polmeros que contienen varias
porciones de numerosos mon#meros 0D a 0, diferentes. La naturale*a y
proporci#n de estos mon#meros estn influenciados por la fuente de carbono
suministrada en el medio de cultivo !0uadro D".or e(emplo, cuando se
suministra cido propi#nico o cido pentanoico, se obtiene un copolmero
aleatorio que contiene mon#meros tanto de D=)idro%ibutirato !D<9" como
D=)idro%ivalerato !D<8".
!"adro . ?uente de carbono, compuesto limitante y tipo de <2 producido
por diferentes bacterias !Dantas +00,> Civera y 1evre*, +00@"
-acteria )"ente de ! !omp"esto limitante 3ipo de PHA
Alcaligenes latus
-avia de maple 2monio !D<9"
Azotobacter vinelandii
2gua residual 3%geno <98
Azospirillum
brasiliense
2monio, carbono,
o%geno, magnesio
Bacillus cereus
Alucosa -ulfato de potasio !D<9"
B. megaterium
Alucosa -ulfato de potasio !D<9=co=D<8"
B. subtilis -ulfato de potasio !D<9"
15
B. thuringiensis
0aldo nutritivo -ulfato de potasio <9, <98
Bacillus spp.
0ado nutritivo,sucrosa,
alcanoatos
-ulfato de potasio <9, <98
Cupriavidus necator
9utricoPval&rico
2ceite de soya
2monio
!D<9=co=D<8"
!D<9=co=D<<%"
. coli recombinante
Alucosa, fructosa,
suero de lec)e
!D<9", !D<D"
Halomonas boliviensis
2lmid#n )idroli*ado <9
Hypomicrobium sp.
0arbono
Methylobacterium sp.
4etano !D<9"
Pseudomonas sp.
2monio,fierro,sulfato,
magnesio,
manganeso.
P. aeruginosa
Alucosa <ierro, magnesio !D<9"
P. oleovorans 2cido octanoico
2monio, fosfato,
magnesio,
sulfato
!D<3"
P. stutzeri
Alucosa <ierro, magnesio !D<9"
Rhodopseudomonas
palustris
00+, acetato !D<9"
Rhodosporillum
rubrum
2cetato
2monio, fosfato,
sulfato de potasio
!D<9"
Rhodobacter
sphaeroides
2monio, fosfato,
sulfato de potasio
Rhizobium +R#,-(
2monio, magnesio,
o%geno
#.cerevisiae recomb. Alucosa !D<9"
!D<9"M poli !D=)idro%ibutirato"> !D<8"M poli !D=)idro%ivalerato"> !D<<%" M poli
!D=)idro%il)e%anoato"> !D<3"M poli !D=)idro%ialcanoato"> !D<D" M poli
!D=)idro%idecanoato".
Los primeros reportes de la formaci#n de <2 mcl por Pseudomonas
fueron en P. oleovorans, describiendo la producci#n del polmero con D=
)idro%ioctanoato por la asimilaci#n de cidos grasos de cadena corta y cadena
larga> sin embargo, la sntesis de <2 mcl es a)ora considerada pertinente no
s#lo para P. oleovorans, sino tambi&n para todas las Pseudomonas
fluorescentes. 4uc)as especies productoras pueden sinteti*ar estos polmeros
con varios grupos funcionales como )al#genos, alquilos ramificados, fenilos,
feno%ilos, oleofinas y &steres, cuando son cultivadas con sustratos que tienen
las estructuras qumicas correspondientes y se )a determinado que estos
grupos funcionales pueden me(orar las propiedades fsicas de los <2 mcl
!2vila, +00B".
16
?ranco et al. !+00@", detectaron <2s en actinomicetos aislados de
suelos ri*osf&ricos y observaron el mayor rendimiento, O p$%, !+B,45 6 en peso
seco", en una cepa identificada como #treptomyces subrutilus. or su parte,
Azotobacter sp. ?25 es una bacteria productora de <9, aislada de muestras
de suelo y puede utili*ar sacarosa o mela*a de ca/a. 2dems este
microorganismo no forma cpsula, lo cual significa que no deriva la fuente
carbonada para la sntesis de e%opolisacridos.
Los productores naturales de <2s como Azotobacter sp. ?25 se )an
adaptado a la acumulaci#n de este polmero durante su evoluci#n, pero
normalmente tienen un tiempo de generaci#n largo y temperaturas de
crecimiento relativamente ba(as. 2dems son difciles de lisar y poseen
en*imas que degradan el polmero acumulado. . coli no tiene la capacidad de
sinteti*ar o degradar <2, pero crece rpido y es fcil de lisar. -e )an
e%presado los genes p)a de varias especies bacterianas en . coli,
obteni&ndose buenos rendimientos del polmero. 2simismo, al no poseer
en*imas que degradan a los <2, . coli permite la acumulaci#n del polmero
de alto peso molecular.
Los genes necesarios para la sntesis de <9 en Azotobacter sp. ?25,
p)a2, p)a9 y p)a0 )an sido clonados y caracteri*ados en el laboratorio y
transferidos a una cepa de . coli, para lo cual se construy# un plsmido
recombinante introduciendo los genes de Azotobacter sp. ?25 ba(o la
regulaci#n del promotor lactosa en un vector de e%presi#n de alto n.mero de
copias. 'ste plsmido se transfiri# a . coli y permiti# la obtenci#n de <2 en
la cepa recombinante a partir de glucosa. 'sta cepa bacteriana tambi&n
degrada lactosa por lo que se anali*# la producci#n del polmero utili*ando
lactosa y tambi&n lactosuero en un medio salino, obteni&ndose <2s en ambos
casos !De 2lmeida et al., +004".
,. -iosntesis
La biosntesis de !D<9" o de otros <2s se inicia con el transporte
facilitado y difusi#n pasiva de una fuente de carbono )acia el citoplasma, para
ser convertida en un tio&ster !coen*ima 2" de un )idro%ialcanoico, que puede
ser utili*ado como sustrato por la <2 sintetasa y a trav&s de varios caminos
anab#licos o catab#licos se forma un poli&ster por acci#n de la en*ima
sintetasa. Independientemente de la fuente de nutriente utili*ada, la sntesis de
<2s depende de la formaci#n de acetil=0o2, un intermediario en las vas
17
degradativas de los carbo)idratos y del ciclo de Erebs. Durante el crecimiento
vegetativo, el acetil 0o2 sigue el ciclo del cido tricarbo%lico y es o%idado
)asta di#%ido de carbono y agua generando energa en forma de 27 y A7.
'n ausencia de restricciones nutricionales, el nivel de 0o2-< se incrementa y
el acetil=0o2 sigue el ciclo de Erebs. 0uando el crecimiento es limitado por los
nutrientes el nivel de 0o2-< se reduce y se favorece la sntesis de <2s
!Dantas, +00,".
'%isten cuatro rutas metab#licas para la sntesis de <2s, relacionadas
con el tipo de microorganismo productor, el sustrato fuente de carbono y el tipo
de <2 producido. 7res de estas rutas pueden ser utili*adas para la sntesis de
!D<9". 'n la primera ruta C. necator utili*a sustratos como carbo)idratos,
piruvato o acetato para la sntesis inicial de acetil=0o2. 'n el mecanismo de
sntesis de <2s de cadena corta !0D a 0,", intervienen bsicamente tres
en*imas Q=cetoacil=0o2 tiolasa, acetoacetil=0o2 reductasa y !D<9"
polimerasa.
'n el primer paso de la biosntesis, las cetotiolasas catali*an la adici#n
reversible de un grupo acetil a una mol&cula de acetil= 0o2. Dependiendo de la
especificidad por el sustrato e%isten dos grupos de Q=cetoacil=0o2 tiolasas. 'l
primer grupo consiste en tiolasas con una amplia especificidad por el Q
=cetoacil=0o2 en un rango de 04 a 016, son involucradas en la degradaci#n
de cidos grasos y estn locali*adas en el citoplasma de procariotas y en
mitocondrias y pero%isomas de c&lulas vegetales y de mamferos. 'l segundo
grupo de tiolasas est considerado como biosint&tico, tiene un estrec)o rango
de especificidad por el tama/o de la cadena de 0D a 0, y presentan dos sitios
activos de cistena. Inicialmente en la reacci#n, un sitio activo con cistena
ataca una mol&cula de acetil=0o2 para formar el intermediario acetil=-=en*ima.
2 continuaci#n, una segunda cistena deprotona otra mol&cula de acetil=0o2,
resultando una mol&cula inactiva de acetil=0o2 que es capa* de atacar el
comple(o acetil=-=en*ima y formar de esta manera acetoacetil=0o2.
'n el segundo paso de la biosntesis, una acetoacetil=0o2 reductasa que
es una !C"=D )idro%iacil=0o2 des)idrogenasa dependiente de 12D< reduce
!de manera reversible" las mol&culas de acetoacetil=0o2 en D !=" = D=
)idro%ibutiril=0o2 !reacci#n estereoselectiva". 'n C. necator se )an encontrado
dos tipos de acetoacetil= 0o2 reductasas con diferente estereospecificidad a
sustratos y coen*imas. La en*ima 12D< dependiente es activa con sustratos D
!=" y L !P", en tanto que la 12D< dependiente y estereospecfica solo se
activa con sustratos de cadena 04 a 06 !D !=" D=)idro%iacil=0o2.
18
'n el tercer paso, la !D<9" polimerasa o sintetasa catali*a la reacci#n
de polimeri*aci#n entre mol&culas de )idro%ibutirato, formndose el <9
!?iguras 5,@ y 10", como un polmero de l0
,
a l0
6
unidades de mon#meros y
se acumula en los grnulos, conteniendo cada uno apro%imadamente 1000
cadenas de polmero. La actividad de polimeri*aci#n de la sintetasa se basa en
la formaci#n de enlaces &ster con un residuo de cistena como sitio activo. -e
presume que el rol de la <2 polimerasa en la transferencia de mon#meros en
la cadena, incluye alg.n control en el peso molecular del polmero producido, lo
cual es una caracterstica tpica de cada microorganismo. 'l gen p)a0 es
esencial para la actividad de la sintetasa de la cual se distinguen dos formas;
una activa en las c&lulas que acumulan <2 y una forma no activa en las
c&lulas que no estn acumulando y donde el p)a0 es ms susceptible a la
degradaci#n. Durante el crecimiento no limitado predomina la forma soluble.
0uando cambian las condiciones del medio con limitaci#n de nutriente se
favorece la formaci#n de <2 y aparece la forma asociada a los grnulos de
<2, desapareciendo la forma soluble.
+ acetil R 0o2 S acetoacetil=0o2 S D )idro%ibutiril=0o2 S !D<9" P
0o2 -<
0o2-<
12D< 12D
P
P <
P
'n la segunda ruta, Rhodopseudomonas rubrum utili*a sustratos como
acetato y an)drido carb#nico. 'l acetoacetil=0o2 formado por la 9=cetotiolasa
es reducido por una reductasa 12D< dependiente, originando -=D=)idro%ibutil=
0o2, el cual es convertido a C=D=)idro%ibutil=0o2 por dos enol=0o2
)idratasas. 'l .ltimo paso de la polimeri*aci#n es catali*ado por la !D<9"
sintetasa.
19
La tercera ruta de biosntesis de <2s es observada en la mayora de
especies de Pseudomonas grupo I !P. olevorans", utili*ando sustratos como
cidos grasos !?igura 11" y sustancias que pueden ser convertidas en alcanos
o cidos alcanoicos. 'stos cidos son activados por una tioquinasa y son
normalmente degradados va Q=o%idaci#n, resultando en la formaci#n de acetil=
0o2 o propionil=0o2. 'l !D<9" puede ser formado a partir de acetil=0o2
como en la primera ruta y los copolmeros pueden ser formados a partir de
acetil=0o2 ms propionil=0o2. Los intermediarios de la ruta de Q=o%idaci#n
pueden ser direccionados a la sntesis de !D<9" u otros <2s de cadena
media. :na coen*ima tio&ster de un cido D=cetoalcanoico con cuatro o ms
tomos de carbono puede ser reducida a su correspondiente tioester C=D=
)idro%iacil=0o2 por una D=cetoacil=0o2 reductasa. 7ambi&n pueden ser
utili*ados otros intermediarios como los tio&steres -=D=)idro%iacil=0o2 y enoil
0o2, a trav&s de la conversi#n a sus correspondientes tio&steres C=D=
)idro%iacil=0o2 que servir de sustrato para las <2 sintetasas !?igura 11".
:na cuarta ruta, est presente en todas las especies de Pseudomonas
pertenecientes al grupo II !P. aeruginosa", utili*ando sustratos como gluconato
o acetato para la sntesis de <2s de cadena corta.
20
21
Azucares
Acetil CoA
Acetil - en!i"#
Aceto#cetil - CoA
(R) 3 $i%&oxi'(ti&il - CoA
)HB
*A+)H ,
H
,
*A+)
,
CoAH
P (3HB) polimerasa o sintetasa
Acetoacetil CoA
reductasa
B cetoacil CoA tiolasa
Acetil CoA
CoAH
)ig"ra 4. Diagrama de flu(o que presenta las etapas de la sntesis de
<9 por Cupriavidus necator a partir de carbo)idratos, piruvato
o acetato.
22
)ig"ra 5. -erie de reacciones de la sntesis de <9 en Cupriavidus
necator.
23
24
)ig"ra 1/. 4etabolismo de poli)idro%ibutirato !0)olula,+00,".
25
)ig"ra 11. Cuta metab#lica para la sntesis de poli)idro%ialcanoatos a
partir de cidos grasos !Dantas, +00,".
2vila !+00B", menciona que la biosntesis de <2scl involucra dos rutas
metab#licas diferentes, dependiendo del sustrato empleado, la primera est
mediada por el uso de mon#meros generados durante la o%idaci#n de cidos
grasos como el enoil=0o2, por lo que no implica a las en*imas tiolasa y
reductasa. -e produce <2 principalmente con mon#meros de D=
)idro%ivalerato !D<8", pero tambi&n se encuentran peque/as cantidades de
D<9. La segunda va envuelve el uso de carbo)idratos, por la ruta metilmalonil=
0o2. -e acumula <2 con mon#meros de D<8, con acetil=0o2 y propionil=0o2
como precursores; el succinil=0o2 es convertido a metilmalonil=0o2, el cual es
descarbo%ilado a propionil=0o2. or su parte, el acetil=0o2 proviene de la
glic#lisis. 'ste tipo de va es caracterstica de los actinomicetos.
0uando el microorganismo es cultivado con carbo)idratos como .nica
fuente de carbono, el <2 producido est compuesto principalmente por
mon#meros de 010 y 05. or este motivo se sugiere que estos mon#meros
son derivados de intermediarios de la biosntesis de cidos grasos a partir de
glucosa. -e forman mol&culas de D=)idro%iacil a partir de la condensaci#n de
mol&culas de 2cetil=0o2, va malonil=0o2, para formar el )idr#%ido que ser
incorporado al polmero, que a su ve* es transferido de la 2cyl 0arrier rotein
26
!20" para la coen*ima 2 por la transacilasa para luego reali*ar la reacci#n de
polimeri*aci#n catali*ada por la <2 sintasa.
0uando la fuente de carbono est constituida por cidos grasos de 06 a
01+, los mon#meros de <2s tienen la misma longitud que el sustrato
disponible o tienen dos, cuatro o seis tomos menos. 0uando se administran
cidos grasos de 01D=015, la composici#n del <2 no est relacionada con la
longitud del sustrato, puesto que el mon#mero ms largo insertado tiene 11 a
1+ carbonos, aunque es dependiente para configuraciones como
insaturaciones. 0uando se utili*an los cidos )eptadecanoico u octadecanoico,
no se observa acumulaci#n de <2s, puesto que esta fuente de carbono no
permite el crecimiento de los microorganismos. 0omo los intermediarios de la
o%idaci#n de los cidos grasos presentan una conformaci#n !-"=D=)idro%iacil=
0o2, se necesita un paso adicional para transformarlos a !D"=D=)idro%iacil=0o2,
puesto que la polimerasa para <2mcl presenta especificidad para este tipo de
mon#meros> por lo tanto en*imas como una !C"=especfica enoil=0o2
)idratasa, una )idro%iacil=0o2 epimerasa y una D=cetoacil reductasa )an sido
postuladas para unir la Q=o%idaci#n con la biosntesis de <2s.
'n Azotobacter sp. al igual que en C. necator, el polmero <2 se
sinteti*a mediante un camino metab#lico que involucra tres en*imas, una
cetotiolasa que condensa dos mol&culas de acetil=0o2 para formar acetoacetil=
0o2, una acetoacetil=0o2 reductasa que convierte este compuesto en D=
)idro%ibutiril=0oa y una sintetasa que polimeri*a los mon#meros !De 2lmeida et
al., +004".
'n Azospirillum sp. el metabolismo de <9 es un proceso cclico, donde
la proporci#n entre reacciones biosint&ticas y degradativas est determinada
por las condiciones de crecimiento. La va para la producci#n de <9 consiste
de tres reacciones bsicas a partir de acetil=0o2. rimero, la condensaci#n de
dos mol&culas de acetil=0o2 en acetoacetil=0o2 por la en*ima Q=cetoacil=0o2
tiolasa !codificada por el gen p))2". La segunda reacci#n es la reducci#n de
!C"=D )idro%ibutiril=0o2 por la des)idrogenasa acetoacetil=0o2 dependiente de
12D< !gen p))9", siendo un proceso reversible y en la tercera reacci#n, los
mon#meros de !C"=D=)idro%ibutiril=0o2 son polimeri*ados para formar poli !D=
)idro%ibutirato" por la polimerasa !D<9", codificada por el gen p))0. 'sta
en*ima mayormente conocida como <9 polimerasa determina la composici#n
del polmero resultante adems de estar estrec)amente relacionada al nivel de
la producci#n, largo de la cadena y polidispersidad del <9 generado, as
como en la variaci#n de la composici#n de los copolmeros !0)olula, +00,".
27
La disponibilidad de acetil=0o2 y 12D< son los factores ms
importantes que afectan la biosntesis de <9 tanto en C. necator como en su
recombinante . coli. La va de las pentosas fosfatadas !" tambi&n genera
12D<> sin embargo, su poder reductor es dirigido en su mayora a la
formaci#n de cidos nucleicos y aminocidos. La funci#n primaria de la va
'ntner=Doudoroff !'D" en . coli es cataboli*ar la fuente de carbono y la
e%presi#n del oper#n de la va es inducida ba(o condiciones de fermentaci#n de
gluconato. 2 trav&s de esta va una mol&cula de 12D<, 12D< y 27 es
producida por mol de glucosa y dos moles de 27 y dos moles de 12D< son
producidos a trav&s de la va 'mbden= 4eyer)of=arnas !'4". 9a(o
condiciones de acumulaci#n de <9, las c&lulas prefieren la va 'D ya que
permite la formaci#n de 12D< que es requerido para la formaci#n del
biopolmero. 8ariando los flu(os metab#licos intracelulares en c&lulas
transformadas de . coli, que pueden acumular <9 )asta en un B5 6, se
observ# que una cantidad significativa fue dirigida a la producci#n de <9, en
comparaci#n con una cepa silvestre no productora donde la va 'D fue muy
activa, con un decremento proporcional del ciclo de Erebs, de la via y de la
sntesis celular, cuando se incrementaba el contenido de <9 !0)olula, +00,".
Aeneralmente, el <9 es sinteti*ado en una va similar a la de los cidos
grasos e%cepto que; 1" los intermediarios de <9 son derivados de 0o2 y no
de protenas acarreadoras, +" la sntesis de <9 es especfica para el
estereois#mero D !="=D=)idro%ibutirato y, en muc)os casos, por 12D<, D" las
en*imas involucradas en la sntesis de <9 no se ensamblan en un comple(o,
y 4" la polimeri*aci#n del )idrobutirato produce grnulos de <9 en la interfase
del citoplasma !7rotsenTo y 9elova, mencionados por 0)olula, +00,".
4. )ormacin de gr6n"los
Los grnulos de <2s tienen un dimetro tpico entre 0,1 y 0,5 um !Dan
et al.,+005" y poseen una membrana como cobertura de cerca de + nm de
grosor, compuesta por lpidos y protenas, representando el 0,, y + 6
respectivamente del peso del grnulo. arece que el n.mero de grnulos por
c&lula es fi(ado en los estados tempranos de la acumulaci#n del polmero y
durante la acumulaci#n, la c&lula pierde su conformaci#n tpicamente cilndrica
para acomodar polmero adicional, )asta el punto en que la sntesis de <2s
disminuye. 'l cese en la acumulaci#n de polmero puede deberse a la cantidad
acumulada, puesto que al alcan*ar su porcenta(e m%imo de reserva, la <2
polimerasa permanece activa, lo que sugiere que una constricci#n fsica opera
e impide que la c&lula acomode ms polmero dentro de ella, a pesar de la
disponibilidad de sustrato y de la polimerasa activa.
28
2vila !+00B", menciona que la formaci#n de los grnulos puede seguir
cuatro pasos; a" La polimerasa soluble act.a con concentraciones cada ve*
mayores de D=)idro%ibutiril=0o2 en el citoplasma. Durante la fase lag los
olig#meros de )idro%ibutiril !<9" son formados y se mantienen unidos con la
en*ima. b" 'stos olig#meros de <9 forman micelas que aumentan en tama/o e
)idrofobicidad. 0onsecuentemente estas pelculas proveen una uni#n de dos
fases, con la polimerasa en la interfase. c" La en*ima entonces procede
rpidamente con la sntesis de !D<9" dentro del grnulo en crecimiento, lo
cual precisa de una superficie disponible. d" 'ventualmente las micelas
coalescen formando grandes grnulos que pueden ser fcilmente visuali*ados
en el microscopio de contraste de fases !?igura 1+".
)ig"ra 12. 4ecanismo propuesto para la formaci#n de grnulos de <2s
!2vila, +00B".
La )a es una protena de uni#n de <2 que determina el tama/o de los
grnulos. 'sta protena parece que est involucrada en el mantenimiento de las
condiciones #ptimas para la sntesis de <2 y la formaci#n de los grnulos>
act.a de manera similar a las oleosinas de las plantas productoras de aceites y
mantiene la integridad de los cuerpos oleosos previniendo su coalescencia. Las
inclusiones de !D<9" en el citoplasma bacteriano son amorfas, insolubles en
el agua y se observan en forma de esferulitas cuyas superficies son regiones
dinmicas en donde se encuentran las protenas involucradas en la formaci#n y
estabili*aci#n de las inclusiones. 2dems tambi&n estn presentes lpidos y
fosfolpidos.
29
5. 7eg"lacin n"tricional de la sntesis de PHAs
Desde el punto de vista nutricional, los <2s, se acumulan en respuesta a
un factor nutricional limitante, como puede ser falta de nitr#geno, f#sforo,
magnesio o del o%geno y en presencia de un e%ceso de la fuente de carbono
y energa.
'n C. necator que es la bacteria ms estudiada al respecto, el control de
esta ruta se lleva a cabo a nivel de las actividades de las en*imas biosint&ticas.
'l principal blanco de la regulaci#n es la condensaci#n de acetil=0o2, mediada
por la Q=cetotiolasa. 'ste paso se in)ibe por el 0o2 libre, generado
principalmente en el ciclo de Erebs, eliminndose esta in)ibici#n cuando se
incrementa la concentraci#n de acetil=0o2. 2s la relaci#n acetil=0o2$0o2
controla la actividad de la primera en*ima de esta ruta biosint&tica y, como
consecuencia, el destino de acetil=0o2 )acia el ciclo de Erebs o )acia la
biosntesis de <9. or su parte, la limitaci#n de o%geno aumenta la relaci#n
12D<$12D por no e%istir un aceptor final de electrones en la cadena
respiratoria llevando a la formaci#n de !D<9". 0uando e%iste limitaci#n de
nitr#geno, las c&lulas no producen protenas y se acumula el 27 cuyo e%ceso
provoca una disminuci#n de la fosforilaci#n o%idativa y as mimo acumulaci#n
de las en*imas reducidas !12D<" que permiten la formaci#n de !D<9" cuya
va metab#lica reo%ida estas coen*imas. De esta forma las condiciones
necesarias para la sntesis de <2s son elevada concentraci#n de 12D<,
ba(a concentraci#n de 0o2 y elevada concentraci#n de acetil 0o2.
La ruta biosint&tica de <2s en .coli recombinante tiene varias vas que
compiten por los sustratos e incluyen la formaci#n de cido ctrico, cido
ac&tico, etanol y sntesis de cidos grasos !?igura 1D". or tanto, la cantidad de
acetil 0o2 disponible para la sntesis de !D<9" es dependiente del estatus
metab#lico celular. 'n un medio comple(o, un mayor n.mero de precursores
como aminocidos y vitaminas estn disponibles para la sntesis de
macromol&culas, lo cual genera una disponibilidad de acetil=0o2 para la va de
<2s. or el contrario, en un medio definido, e%iste menos disponibilidad de
acetil=0o2, por cuanto este compuesto se debe utili*ar para la sntesis de
precursores en otras rutas metab#licas. La regeneraci#n del 12D< tambi&n
es importante debido a que la segunda en*ima en la sntesis de <2s,
!reductasa" lo requiere como cofactor. La sntesis de aminocidos tambi&n
requiere 12D<, por e(emplo se necesitan 5 moles de 12D< para la sntesis
de 1 mol de metionina a partir del o%alacetato. 'sta puede ser otra ra*#n para
la menor acumulaci#n de !D<9" en un medio definido en el cual los
aminocidos deben ser sinteti*ados. 2simismo, es conocido que la Q=
cetotiolasa es in)ibida por las mol&culas libres de 0o2. Las c&lulas operan el
30
ciclo de Erebs intensivamente para cubrir los requerimientos biosint&ticos en un
medio definido lo cual de(a libre mol&culas de 0o2 por acci#n de la primera
en*ima del ciclo, citrato sintetasa. 7odo esto ocasiona una ba(a acumulaci#n de
!D<9" en un medio definido o semidefinido comparado con los medios
comple(os.
'n Azospirillum brasilense se )a observado que la acumulaci#n de <9
aumenta drsticamente al final del crecimiento e%ponencial, siempre y cuando
la fuente de carbono no sea un factor limitante y se observa que en la fase
estacionaria el contenido de <9 disminuye !0)olula, +00,".
)ig"ra 1. 8as metab#licas que compiten con la sntesis de <2s en
scherichia coli recombinante
31
-l(co.#
)i&(/#to 0#ct#to
Acetil CoA
Acetil ) Acet#to
Acet#l%e$i%o
1t#nol
2nte.i. %e 3ci%o. 4&#.o.
Aceto#cetil- CoA
3 $i%&oxi'(ti&il- CoA
)oli (3 3ci%o $i%&oxi'(t2&ico)
Ciclo %e
5&e'.
1/. 7eg"lacin gen8tica de la biosntesis de PHAs
'n C. necator las en*imas biosint&ticas de <2s son sinteti*adas
constitutivamente y su regulaci#n es a nivel en*imtico, con la 0o2 como
mol&cula clave reguladora. Las fasinas son protenas estructurales asociadas a
los grnulos de <2s que impiden que otras protenas puedan asociarse
inespecficamente por lo que se relacionan con su tama/o y pure*a. Las
fasinas !p)a" se consideran protenas claves en la formaci#n de grnulos de
<2s, relacionadas con las protenas represoras de fasinas !p)aC", que se
unen a la regi#n promotora de pha bloqueando la e%presi#n de pha en
ausencia de <2 y se despla*an en presencia del mismo, por lo que 0o2 es
considerado un importante regulador de fasina y biosntesis de <2s.
'n C. necator y A. vinelandii e%iste una relaci#n de la acumulaci#n de
los poli&steres intracelulares con el sistema de regulaci#n metab#lica conocido
como 7- !sistema fosfotransferasa de a*.car", ya que mutaciones en genes
que constituyen este sistema se manifiestan en una menor acumulaci#n de
<9 en estas bacterias. La sntesis de <9 en A. vinelandii est controlada a
nivel postranscripcional. 0uando el o%geno es limitado, se incrementa la
actividad de la Q=cetotiolasa que cataboli*a el primer paso de la sntesis del
polmero> sin embargo, tambi&n e%iste una regulaci#n a nivel transcripcional por
la protena activadora p)bC.
'l oper#n <2 de Acinetobacter sp. tambi&n se transcribe
constitutivamente y e%iste una inducci#n adicional por medio de un activador
transcripcional llamado phoB que se une a promotores del regul#n p)o,
inducida por la limitaci#n de fosfato. 'n P. aeruginosa, la regulaci#n del <2
ocurre a nivel transcripcional por un mecanismo que requiere un factor cuando
crece con glutamato pero no con octanato.
11. Prod"ccin de polihidroxialcanoatos
0erca de D00 especies de bacterias pueden sinteti*ar <2s !0uadro 4">
sin embargo, solo algunas )an sido utili*adas para la producci#n a gran escala
!C.necator, Alcaligenes latus, Azospirillum brasilense, Azotobacter vinelandii,
Pseudomonas oleovorans algunos metil#trofos y scherichia coli
recombinante". 0ada bacteria requiere condiciones de crecimiento especficas
para la sntesis de <2, pero pueden ser divididas en dos grupos; uno que
requiere condiciones limitantes de alg.n nutriente esencial como carbono o
nitr#geno para poder incrementar la eficiencia de la producci#n de <2s, por
e(emplo C. necator, P. oleovorans y algunos metil#trofos y un segundo grupo
32
conformado por los que no requieren estas condiciones y acumulan <2s
durante el crecimiento, por e(emplo A. vinelandii, A. latus y . coli recombinante
!?ranco et al., +00@".
Los procesos para la producci#n de <2s se reali*an en su mayora en
fermentaci#n sumergida, principalmente en cultivos alimentados o fed batc)
obteniendo una elevada concentraci#n de biomasa !necesaria para una
elevada productividad", que conduce a la formaci#n del polmero. Las
fermentaciones continuas permiten una alta productividad pero s#lo cuando el
cultivo puede ser mantenido estable sin contaminaci#n. Los estudios en
fermentadores muestran la influencia del tipo y concentraci#n de la fuente de
carbono as como de los niveles de aireaci#n sobre el &%ito productivo.
33
!"adro &. roducci#n de poli)idro%ialcanoatos en diversas bacterias
Bacteria PHA Fuente de carbono
Tiempo
(h)
Concentracin
celular (gL
-1
)
Conc
PHA
(gL
-1
)
Rendimiento
p!"
(gg-1)
Contenido
PHA (#)
p!$
Rendimient
o
$!"
(g g
-1
)
Producti%idad
(g&L
-1
&h-
1
)
Re'erencia
Cupriavidus
necator
P(3HB) Glucosa 50 164 121 76,0 2,42
Lee et al., 1995
Cupriavidus
necator
P(3HB) Glucosa 49 124 92 74,0 1,87
Lee et al., 1995
Cupriavidus
necator
P(3HB) C02 / H2
Etaol
Glucosa
Glucosa
H!"#ol!$a"o
%a"!oca
&o#ta "e so'a(
40
50
59
85,00
63,50
164,0
67,1
106,0
61,5
47,0
121,0
47,6
61,9
72,80
74,0
76,0
72,1
57,5
1,54
0.94
2,42
1,23
0,99
)atas, 2005
34
%ela$a 36 126,0 94,8
0,00065
32,8
Cupriavidus
necator
P(3HB) C*2 40 85,0 61,5 72,0 1,54
Lee et al.,1995
Cupriavidus
necator
P(3HB)+co+
P(3H,)
Glucosa+
-#o-!.!co
46 158,0 117 74,0 2,55
Lee et al., 1995
Cupriavidus
necator
P(3HB)+co+
P(3H,)
Glucosa+
-#o-!.!co
39 113,0 64,0 56,5 1,64
Lee et al., 1995
Cupriavidus
necator
P(3HB)
/#uctosa
Glucosa
0,284
0,1 a 0,3
66,2
76,0
0,1245
Ba#0osa
et al.,2005
Cupriavidus
necator
P(3HB)
1l%!". "e
-a-a
saca#!2!ca"o
68 179,0 94,0
0,22
53,0
0,46
1,47
Haas et al,, 2008
Cupriavidus
necator
P(3HB) Glucosa 68 181,0 99,0 55,0
Haas et al., 2008
Cupriavidus
necator
P(3HB) Glucosa 36 13,45 8,11
45,33
60,0
0.42
0,135
El 3a'e" et al.,
2009
Alcaligenes latus
P(3HB) 3aca#osa 18 145,0 71,4 50,0 3,9
/!4le#, 2006
Alcaliges latus P(3HB)
P(3HB/3H,)
3aca#osa
3uc#osa+ 4,65
16,2
2,0 43,0
2,6
0,3
Lee et al., 1995
35
-#o-!.!co
Azospirillum
brasilense
Azospirillum
brasilense
P(3HB)
P(3HB)
&o%ate
&o%ate
36
24
1,67
1,95
0,16
1,20
9,6
5a#t6e$
et al.,2004
Azospirillum
brasilense
P(3HB) 4,0 0,36 17,0
Azotobacter
vinelandii
P(3HB) Glucosa 47 40,1 32,0 79,8 0,68
Lee et al.,1995
Azotobacter
vinelandii
P(3HB/3H,)
Bete##a7a(8c!"o
-etao!co
19+
22
59+71
Lee et al.,1995
Chromobacterium
violaceum
P(3H,) 1c!"o 9al:#!co 39,5 24,5 62,0
/!4le#, 2006
Haloferax
mediterranei
PHB,
1l%!".
;!"#ol!$a"o.
39,4 20,0
1+1,7
50,8
<!ll et al., 2006
Haloferax
mediterranei
Glucosa 85,5 23,0 27,0
&!7 et al., 2006
Haloferax
mediterranei
PHB, Pa=a "e a##o$+
al%!". %a6$
;!"#ol!$a"a"o
140,0 77,8 55,6 &!7 et al., 2006
36
1l%!". %a6$
;!"#ol!$a"o
Glucosa
62,6
85,8
24,2
23,0
38,7
27,0
Haloferax
mediterranei
P(3HB)+co+
3H,)
P(3HB)+co+
3H,)
3ue#o
;!"#ol!$a"o
-uero )idroli*ado
31,5
12,2
14,7
0,29
0,20
72,8
87,5
0,09
0,14
>olle# et al.,
2007
Haloferax
mediterranei
P(3HB)+co+
3H,)
Glucosa 117 85,0 48,6
&!7 et al., 2006
Halomonas
boliviensis
P(3HB) Glucosa 27 0,346 48,7
Klebsiella
aerogenes
P(3HB) ?es!"uos 32 37,0 24,0 65,0 0,75
Lee et al.,1995
Methylobacterium
organophylum
P(3HB) 5etaol 70 250,0 130 52,0 1,36
37
Rhizobium tropici P(3HB)
3aca#osa
3aca#osa
saca#osa
36
36
36
4,02
3,58
1,82
18,83
19,84
18,55
/#aco et al.,
2009
Mesorhizobium
plurifarium
P(3HB)
&o%ate
Lactosa
3aca#osa
5a!tol
5ela$a
Glucosa
48
48
48
48
48
48
0,724
0,716
0,971
0,967
1,152
1,169
0,299
0,279
0,361
0,336
0,146
0,192
41,32
39,07
37,27
34,82
12,68
11,05
Lasala, 2004
Methylobacterium
extoruens
P(3HB) 5etaol 170 233,0 149 64,0 0,88
Lee et al., 1995
Methilobacterium
extoruens
P(3HB) 5etaol 121 223,0 136,0 61,0 1,12
Lee et al., 1995
!aracoccus
denitrificans
P(3HB/3H,)
5etaol(alco;ol
+ a%6l!co
120 9,0 2,34 26,0 0,02
Lee et al., 1995
!seudomonas
fluorescens
5ela$a 150 3,39 3,34 98,5
?a%6#e$ et al,
!seudomonas
oleovorans
P(3HH+co+
3H*)
+octao 11,6 2,9 25,0 0,58
Lee et al., 1995
!seudomonas
oleovorans
P(3HH+co+
3H*)
+ octao 38 37,1 12,1 33,0 0,32
Lee et al., 1995
38
!seudomonas
oleovorans
P(3HH/3H*) +octao 2,25 1,05 46,7 0,09
Lee et al., 1995
!seudomonas
oleovorans
P(3HH/3H*) +octao 45 41,8 15,5 37,1 0,34
Lee et al., 1995
!seudomonas
putida
PH1s+%cl 1c!"o ole!co 69 30,22 13,52
0,102
44,9 0,188
5a#su"! et al., 2007
"scherichia coli
#eco%0.
P(3HB) Glucosa 39 101,4 81,2 80,1 2,08
Klebsiella
aerogenes #eco%0.
P(3HB) 5ela$a 32 37,0 24,0 65,0 0,75
39
La estrategia actual en la producci#n de <2s es reali*ar lotes
alimentados o fed batc) para alcan*ar elevadas densidades celulares en una
primera etapa, evitando adems la posible in)ibici#n por el sustrato. 'n una
segunda etapa se reducen los niveles de suministro de o%geno !o se fuer*a
otra condici#n de estr&s apropiada" para alcan*ar la acumulaci#n del producto.
'n esta etapa la concentraci#n de biomasa permanece constante. '%isten dos
maneras para alcan*ar la formaci#n de <2s en las bacterias. 'l proceso en
paralelo se )a demostrado en Rhodospirillum rubrum y P. oleovorans> sin
embargo, durante el crecimiento celular parte del polmero formado inicialmente
se pierde debido a que se utili*a como sustrato en el mantenimiento del
metabolismo celular. 'n el proceso en serie, primero las bacterias se cultivan
con una fuente de carbono para obtener biomasa celular y luego se elimina un
nutriente esencial en el medio, a la ve* que se a/ade un sustrato para la
formaci#n del polmero. 'ste es convertido directamente en polmero y el
crecimiento celular es mnimo. 'ste proceso se usa en la producci#n de <2s
a gran escala con C. necator.
2unque la fermentaci#n sumergida es la ms generali*ada para la
producci#n de <2s, la fermentaci#n en estado s#lido !?'-" es una alternativa
viable. 's un proceso caracteri*ado por la ausencia total de agua libre en el
material s#lido impregnado con el medio de crecimiento microbiano. 'n
muc)os casos el sustrato sirve tambi&n de soporte para el crecimiento de los
microorganismos. 'l desarrollo de &stos puede ser tanto en la superficie del
material s#lido como en el caso de bacterias y levaduras as como en la parte
interna, como los )ongos filamentosos que atraviesan el material.
:na de las venta(as de la fermentaci#n en estado s#lido es la posibilidad
de la utili*aci#n de fuentes de nutrientes de ba(o costo como los subproductos
o residuos agroindustriales. 2simismo, la purificaci#n de los productos se
facilita por estar ms concentrados en medios s#lidos. Los sustratos utili*ados
en ?'- pueden ser divididos en tres grupos, seg.n el compuesto principal que
constituye la fuente de carbono; los que presentan almid#n !arro*, camote,
yuca", los que presentan celulosa o lignocelulosa !maderas" y los que tienen
a*.cares solubles como fuente de carbono !forra(es, pulpa de frutas". Dantas
!+00," investig# la producci#n de !D<9" por fermentaci#n en estado s#lido de
C. necator en residuos de e%tracto de aceite de soya y una soluci#n de mela*a,
a D0 N0 durante D6 )oras de fermentaci#n, obteniendo 0,6, mg del polmero
por gramo de sustrato.
Lee et al. !1@@," reali*aron un revisi#n de la producci#n de <2s en
diversas bacterias como C. necator, A. latus, A. vinelandii, metil#trofos,
Pseudomonas sp.y el recombinante . coli.
40
11.1 Cupriavidus necator
'l copolmero !D<9=co=D<8" sinteti*ado por C. necator es producido
industrialmente por Imperial 0)emical Industries y comerciali*ado ba(o la marca
registrada 9iopol U. 'l costo estimado basado en la producci#n de ,00 000 Tg
de polmero al a/o es apro%imadamente 1, d#lares por Tg. Los dos
contribuyentes principales al costo de producci#n son la fuente de carbono
asociada a la materia prima !sacarosa, glucosa, propionato" y la e%tracci#n del
polmero de las bacterias
C. necator, anteriomente Hydrogenomonas eutropha, Alcaligenes
eutrophus, Ralstonia eutropha y .autersia eutropha produce <9 y
poli)idro%ibutirato=valerato. La mayora de traba(os de investigaci#n utili*an
cepas mutantes, capaces de crecer sobre glucosa> sin embargo, la cepa nativa
crece en fructosa. Industrialmente una mutante de C. necator produce !D<9"
y !D<9=co=D<8" a partir de glucosa y una me*cla de glucosa=cido propi#nico
en cultivo alimentado respectivamente. Las bacterias se cultivan en medio con
glucosa y determinada cantidad de fosfato )asta alcan*ar la biomasa requerida
y despu&s de 60 )oras de iniciada la fermentaci#n se limita el fosfato con
adici#n constante de glucosa para mantener una concentraci#n entre 10 a +0
gL
=1
. 'n el cultivo alimentado, despu&s de ,0 )oras se alcan*an 1+1 gL
=1
de
!D<9", con un acumulaci#n de B0 a 50 6 y una productividad de +,4+ g$L.).
Las operaciones para la producci#n de !D<9=co=D<8" son similares a las
descritas anteriormente, pero la alimentaci#n se reali*a con glucosa y cido
propi#nico. 1ormalmente el copolmero contiene 0=D0 6 de cido D
)idro%ival&rico, valor que puede ser incrementado a ms de @0 6 con cidos
butrico y pentanoico.
'l etanol tambi&n )a sido considerado como sustrato para la producci#n
de !D<9" por una mutante de C. necator. 2simismo el copolmero !D<9=co=
D<8" se obtiene alimentando propanol y etanol ba(o limitaciones de nitr#geno.
De igual manera, se )a reportado el uso de otras fuentes como cido lctico
con una producci#n de ,@ gL
=1
de <2> cido oleico con D+,, g L
=1
, me*cla de
di#%ido de carbono e )idr#geno alcan*ando 5, y 61,, gL
=1
de concentraci#n
celular y !D<9" respectivamente despu&s de 40 )oras y otros sustratos como
cido ac&tico, &steres, glicerol !0uadro ,".
'n un ensayo con C. necator, se reali*aron fermentaciones por lote
alimentado en dos etapas, a escala !D litros" usando tres concentraciones de
41
fructosa !,,10 y 1, gL
=1
". ara el medio de cultivo se reali*# el balance de
materiales siguiendo la metodologa propuesta por Duarte !1@@,", mencionada
por 9arbosa et al. !+00," y en la que se utili*a la siguiente reacci#n;
0
6
<
1+
3
6
P +,514 3
+
P 0,B, 1<
D
M D0<
+
0
0,,
1
0,+,
P 4,14 <
+
0 P D 00
+
0on base en esta ecuaci#n se estableci# la relaci#n 0;1 en 6,5, gramos
de carbono por gramo de nitr#geno y se mantuvo constante en la primera etapa
para obtener una alta concentraci#n celular. 'n la segunda etapa las c&lulas
obtenidas se limitaron en la fuente de nitr#geno para permitir la acumulaci#n
del biopolmero. La me(or concentraci#n para la producci#n de <9 fue , g. L
=1
,
con la que se obtuvo un porcenta(e de acumulaci#n del 66,+ 6, una velocidad
especifica de crecimiento de 0,,1B1 )
=1
y una productividad de 0,1+4, g <9.L
=
1
.)
=1
!9arbosa et al., +00,".
!"adro *. roducci#n de !D<9" por Cupriavidus necator utili*ando diferentes
fuentes de carbono. JM biomasa, Mconcentraci#n de !D<9",
ac.mulo te#rico de !D<9" en la biomasa, Vp M productividad
9"strato 'strategia de
fermentacin
:
(g;<)
P
(g;<)
Ac=m"lo
(0 m;m)
>p
(g;<.H)
L=lcticoP
ac&tico
2limentada B,,0 ,4,5 BD,1 1,D0
00
+
2limentada @1,D 61,@ 6B,5 1,,,
'tanol
2limentada 6D,, 4B,0 B4,0 0,@4
Alucosa
2limentada 164,0 1+1,0 B6,0 +,4+
Alucosa
0ontinua 6B,1 4B,6 B+,1 1,+D
<idroli*ado
de tapioca
2limentada 106,0 61,@ ,B,, 1,0D
2ceite de
soya
2limentada 1+6,0 @4,5 B6,0 0,@@
42
11.2 Alcaligenes latus
'l grupo olymer Aroup etroc)emic Danubia !0D" utili*a A. latus para
producir <9 con sucrosa como fuente de carbono. La sntesis de <9 est
asociada al crecimiento y la limitaci#n de alg.n nutriente no se utili*a para
inducir la acumulaci#n del polmero. 'l proceso de fermentaci#n se reali*a con
A. latus aislado de suelo en 0alifornia y que produce )asta un 50 6 del peso
celular durante un crecimiento ilimitado. 'n un proceso fed batc) ms de 1
tonelada de <9 puede ser obtenido en menos de 1 semana. Las
fermentaciones se reali*an en tanques con agitaci#n pero tambi&n se utili*an
columnas de burbu(as. La fermentaci#n se reali*a en medio sales minerales
con sucrosa o glucosa como fuente de carbono. -i se a/ade cido propi#nico
como precursor se producen copolmeros de <9$<8, as como tambi&n se
producen copolmeros D<9$4<8 !D )idro%ibutirato=co=4 )idro%ivalerato" si se
a/ade 1,4 butanodiol como precursor. Despu&s de la fermentaci#n se
cosec)an las c&lulas y se mantienen en suspensiones acuosas de +00 gL
=1
para el proceso de e%tracci#n. La suspensi#n celular es tratada con solvente
cloruro de metileno, luego se centrifuga y el <9 disuelto y precipitado en el
agua se recupera como un polvo blanco y seco, con @@ 6 de pure*a. La
biomasa es recuperada luego del proceso de e%tracci#n y se puede utili*ar
como me(orador del suelo.
La venta(a de utili*ar A. latus frente a C. necator es su crecimiento ms
rpido, capacidad para utili*ar fuentes de sucrosa baratas !residuos de
remolac)a y ca/a" y la acumulaci#n de !D<9" durante el crecimiento
alcan*ando ms de 60 g L
=1
de !D<9" en cultivos alimentados con una
productividad de )asta +,6 g.L
=1.
)
=1
.
11. Azotobacter vinelandii
'n la d&cada del 60, se observ# la acumulaci#n de <2s en A.
bei&erinc'ii principalmente con limitaci#n de o%geno antes que nitr#geno. 'l
mutante de A. vinelandii acumula ms de B, 6 de !D<9" durante la fase
e%ponencial de crecimiento. La acumulaci#n no depende de la limitaci#n de
o%geno, pero si se observa un me(ora de la eficiencia para convertir la glucosa
a !D<9". -e alcan*a un rendimiento de 0,DD g !D<9" por gramo de glucosa
que es superior a 0,0, obtenido por la cepa salva(e. La adici#n de 0,0, a 0,+ 6
de peptona de pescado, proteosa= peptona o e%tracto de levadura permite
)asta un +, 6 de incremento en el rendimiento, sobre todo en cultivos bien
aireados, sin observarse me(ora del crecimiento celular !0uadro 6". 'l
copolmero !D<9=co=D<8" puede ser sinteti*ado por 2. vinelandii alimentando
con cido val&rico u )eptanoico durante la sntesis del polmero en residuos de
43
remolac)a. 8ariando la concentraci#n de cido val&rico se obtienen
copolmeros con +D 6 de unidades de cido )idro%ival&rico
Las c&lulas del mutante A. vinelandii cultivadas en el medio con peptona
de pescado son frgiles y el !D<9" puede ser e%trado de manera fcil con
amoniaco acuoso 1 1 !p< 11,4", a 4, W0, por 10 minutos. La me*cla del
polmero obtenido tiene @4 6 de !D<9", + 6 de protena y 4 6 de materiales
celulares residuales. -eg.n los resultados, el mutante 2. vinelandii es un buen
candidato para la producci#n de <2s por su capacidad para utili*ar sustratos
baratos y un eficiente proceso de purificaci#n> sin embargo, la productividad
debe ser incrementada me(orando la estrategia de fermentaci#n para alcan*ar
a C. necator o A. latus.
!"adro +. roducci#n de !D<9" por Azotobacter vinelandii cultivado con
diferentes fuentes de nitr#geno
)"ente de
nitrgeno
P (H-)
(g<
?1
)
-iomasa
resid"al
(g<?1)
P(H-)
(0)
1inguna 0,D 1,6 16
eptona de pescado B,, +,6 B4
'%tracto de levadura 6,5 +,, BD
7riptona ,,, +,1 B+
0asaminocidos 4,B +,+ 65
9actopeptona 4,B +,+ 65
'%tracto de carne D,5 1,@ 6B
11.& @etiltrofos
'l metanol es una de los sustratos carbonados ms baratos que se
puede emplear en la producci#n de <2s. 'n un inicio la I0I patent# el proceso
con Methylobacterium organophilum> sin embargo, el ba(o porcenta(e de
polmero acumulado )aca difcil el proceso de recuperaci#n, por cuanto se
deba procesar una mayor cantidad de biomasa. 1o obstante, el ba(o precio del
metanol )a sido atractivo para diversas investigaciones. De esta manera se
obtuvieron 1D6 gL
=1
de !D<9" en un cultivo alimentado con Methylobacterium
e"tor/uens !antes Protomonas e"tor/uens" usando 0,, gL
=1
de metanol como
fuente de carbono, a D0W0 y +,, ppm de o%geno disuelto. -e determin# que el
nitr#geno era requerido a.n en la fase de acumulaci#n a diferencia de C.
necator. 0ontrolando la tasa 0;1 durante el cultivo alimentado la concentraci#n
celular final y !D<9" fue +DD y 14@ gL
=1
respectivamente, en 1B0 )oras, con
44
un rendimiento de 0,+ g de !D<9" por gramo de metanol> sin embargo, la
productividad fue de 0,55 g !D<9" L
=1
)
=1
, inferior a la de C. necator o
A. latus.
M. e"tor/uens y Paracoccus denitrificans )an sido utili*ados para la
producci#n del copolmero !D<9=co=D<8" con metanol y n=alco)ol amlico
como fuentes de carbono en un medio con limitaci#n de nitr#geno. 2simismo
Pseudomonas sp. acumul# ms de ,, 6 de !D<9" en un cultivo alimentado
con limitaci#n de nitr#geno. or lo e%puesto, el uso de los metil#trofos para la
producci#n de <2 parece atractivo por la elevada concentraci#n de <2s que
se puede obtener a partir de un sustrato barato como el metanol, no obstante el
contenido de <2s as como el peso molecular !10
,
" es ms ba(o que el de
Alcaligenes sp. o Azotobacter sp.
11.* Pseudomonas spp.
2lgunas especies de Pseudomonas como P. oleovorans y en general
todas las Pseudomonas fluorescentes sinteti*an <2s de cadena media !6 a
14 carbonos" cuando se les cultiva en cidos alcanoicos de 6 a 10 carbonos
alcan*ando D0 6 de contenido de <2s. 'n un cultivo alimentado de
P.oleovorans, con octano como fuente de carbono y un sistema eficiente de
transferencia de o%geno, con alimentaci#n de magnesio y limitaci#n de amonio
se alcan*# una concentraci#n celular y de <2s de DB,1 y 1+.1 gL
=1
,
respectivamente despu&s de D5 )oras. 2s mismo, el contenido de <2 fue de
DD 6 y la productividad de 0,D+ gL
=1
)
=1
. or su parte, utili*ando cido octanoico
como fuente de carbono y a/adiendo intermitentemente sulfato de amonio y de
magnesio se obtuvieron 41,5 gL
=1
de concentraci#n celular> 1,,, gL
=1
de <2s
y DB,1 6 de contenido, despu&s de 4, )oras. 2 su ve*, con octanol que es
muc)o ms barato que el cido octanoico se alcan*# una concentraci#n de 14
gL
=1
en 40 )oras de fermentaci#n> sin embargo, el proceso de separaci#n fue
muy difcil y una gran cantidad de c&lulas quedaron atrapadas en la capa de
octanol despu&s de la centrifugaci#n.
4arsudi et al. !+00B" cultivaron Pseudomonas putida en cido oleico
para producir <2s de cadena media, alimentando con nitr#geno y carbono y
observaron que la acumulaci#n de <2s se dio tambi&n durante la fase de
crecimiento. Despu&s de )oras se alcan*# una concentraci#n celular de
D0,+ gL
=1
, un contenido de <2 de 44,5 6 y una productividad de 0,155 g$L$).
45
11.+ Escherichia coli recombinante
Los genes de C. necator fueron clonados en . coli en 1@55, alcan*ando
un rendimiento de )asta @0 6 de acumulaci#n de <2s. La producci#n de
!D<9" por . coli recombinante tiene venta(as como su rpido crecimiento,
uso de varios sustratos carbonados, gran acumulaci#n del polmero y la
p&rdida de las depolimerasas. 2dems las purificaci#n del !D<9" parece ser
ms fcil porque las c&lulas acumulan grandes porcenta(es de !D<9" en
grnulos con paredes frgiles que facilitan la e%tracci#n> sin embargo, uno de
los problemas de emplear este recombinante es el uso de o%geno puro para
obtener una elevada densidad celular.
11., 1tros microorganismos
Dong et al. !+006" reali*aron una fermentaci#n fed batc) con Halofera"
mediterranei !aqueobacteria e%tremadamente )al#fila, aerobia,
quimiorgan#trofa" utili*ando glucosa y e%tracto de levadura como fuente de
carbono y nitr#geno respectivamente para la producci#n de <9. Despu&s de
11B )oras, la concentraci#n celular fue de 5,,5 gL
=1
y 45,6 6 de <2,
caracteri*ado como poli !D=)idro%ibutirato=co=D )idro%ivalerato" !D<9=co=D<8
copolimero". or su parte Lee et al. !1@@," informaron que con + 6 de
almid#n como fuente de carbono se alcan*aron 6 gL
=1
de !D<9", 60 6 de
contenido y 0,DD gramos de !D<9" por gramo de sustrato. 2s mismo, debido
a la dificultad para la contaminaci#n el cultivo continuo se pudo reali*ar
durante D meses.
12. Prod"ccin de PHAs A relacin costo?beneficio
2.n cuando las venta(as ecol#gicas de los <2s son notables, una
serie de factores limitan su adopci#n plena como sustitutos de poli&steres
sint&ticos. Los costos de producci#n de <2s son, )asta el momento mayores
que los de la producci#n de poli&steres sint&ticos. ara reducir los costos se
deben aislar cepas con mayor rendimiento y se debe optimi*ar el proceso en
cada operaci#n unitaria; selecci#n de sustratos econ#micos, optimi*aci#n del
proceso de fermentaci#n y optimi*aci#n de la e%tracci#n y purificaci#n del
producto !Civera y 1evre*, +00@> 2rcos y 8argas, +006".
La selecci#n de los microorganismos para producir <2 se basa en
factores como la capacidad de la c&lula para utili*ar fuentes de carbono
baratas, tasa de crecimiento, tasa de sntesis del polmero y cantidad m%ima
de polmero que puede ser acumulada. Los .ltimos tres afectan directamente la
productividad. La clonaci#n de los genes responsables de la biosntesis de
<2 en . coli )a permitido obtener una cepa recombinante que alcan*a 50 a
46
@0 6 de su peso celular seco con una concentraci#n del polmero superior a 50
gL
=1
y una productividad mayor de + gL
=1
.)
=1
en un proceso alimentado
!Dalcanton, +006".
La productividad es definida como la cantidad de <2 producido por
unidad de volumen en una unidad de tiempo. ara una producci#n de una
misma cantidad de <2s por a/o, un proceso con menor productividad
requiere mayor equipamiento. 'l efecto de la productividad sobre los costos de
producci#n fue determinado comparando dos procesos de producci#n de
!D<9" por . coli recombinante con cepas de diferente productividad. ara
una capacidad de producci#n estimada en 100 000 t a/o se observ# que
cuando la productividad se increment# de 1,@5 g.L
=1
.)
=1
a D,+ g.L
=1
.)
=1
, los
costos de producci#n disminuyeron de X,,DB a X 4,4@1 Eg
=1
!D<9".
'l contenido de <2 acumulado afecta la eficiencia del proceso de
e%tracci#n. ara que el proceso sea rentable es necesario que la cepa
bacteriana productora sea capa* de acumular por lo menos 60 6 de su masa
celular en <2s. 'ste criterio elimina a las Aram positivas o aquellas no
capaces de acumular porcenta(es elevados del polmero. 'l rendimiento y la
pure*a del proceso de e%tracci#n son dependientes del contenido de <2. :na
menor cantidad de producto para la digesti#n puede ser utili*ada para separar
los grnulos de <2s de c&lulas con un mayor contenido de polmero. 2s
mismo, un ba(o contenido de <2 lleva a grandes cantidades de sustrato
desperdiciado en otros fines metab#licos. 0omparando un cultivo alimentado
de A. latus con ,0 6 de contenido de !D<9" y un rendimiento de 0,1B g
!D<9" $ g de sacarosa con un proceso en donde se alcan*# 55 6 del
polmero con 0,4+ g de !D<9" $ g de sacarosa, se demostr# que en el primer
caso el costo de e%tracci#n fue de X 4,45 Tg
=1
!D<9" frente a X 0,@+ Tg
=1
!D<9" en el segundo caso !Dalcanton, +006".
1. 9"stratos para la prod"ccin de polihidroxialcanoatos
-e conoce que en la mayora de las bacterias, la producci#n de <2s
est ligada a la escase* de nitr#geno o alg.n otro nutriente en relaci#n a una
abundante fuente de carbono, generalmente mono y disacridos o cidos
grasos. Los <2s pueden ser producidos utili*ando como fuente de carbono
materias primas como acetato, amidas, cido )idro%ibutrico, cido propi#nico,
celulosa, glicerol, lactato, lignina, mela*a, metano, aceite mineral, sacarosa,
suero de queso, triglic&ridos !Dantas, +00,". :na de las reas de oportunidad
para me(orar el proceso de producci#n se centra en encontrar fuentes de
carbono econ#micas, provenientes muc)as veces de material considerado
47
como desec)o o como subproducto abundante que ofrece por si mismo poco
valor !Civera y 1evre*, +00@".
Los aceites de origen vegetal son una buena opci#n para obtenci#n de
<2s, puesto que son una fuente de carbono renovable y econ#mica y muc)os
de los cidos grasos constituyentes de los aceites vegetales son insaturados,
por lo que pueden funcionar como precursores de mon#meros insaturados que
son incorporados al polmero, lo que es esencial para algunos modificaciones
qumicas. 2simismo, el rendimiento te#rico de conversi#n de aceites vegetales
a <2s est en el orden de 1,00 gg
=1
, comparado con el valor de conversi#n
de sacarosa de 0,DD gg
=1
obtenido en la prctica industrial. La producci#n de
<2s en P. aeruginosa y P. putida fue evaluada utili*ando 11 aceites vegetales
!girasol, tungue, mamona, lina*a, palma, arro*, canola, ma*, soya, algod#n y
coco"y 10 combinaciones de &stos. Los valores de <2s acumulados por el
lina(e I7046 fueron significativamente superiores a aquellos observados para
el lina(e I71B1 y alcan*# )asta 60 6 de la masa seca celular. 'l
)idro%ioctanoato !D<3" y D=)idro%idecanoato !D<D" representaron un
porcenta(e mayor que 6, 6 de los mon#meros detectados en el <2 producido
por los dos lina(es bacterianos, utili*ando cualquiera de los aceites !2vila,
+00B".
7ambi&n se )a propuesto la producci#n de <2s en aceite comestible
post utili*ado. Pseudomonas sp. DC+ acumul# )asta un +D,,+ 6 !peso=peso"
de <2s de cadena mediana utili*ando este sustrato como fuente de carbono.
2simismo Arados et al. !+005" investigaron la producci#n de <2s por un
consorcio bacteriano cultivado en cidos grasos voltiles provenientes de la
digesti#n anaerobia de desec)os agrcolas como rastro(os de Hordeum vulgare
FcebadaG, Chenopodium /uinoa FquinuaG, 0lycine ma" FsoyaG, Avena sativa
FavenaG, 1riticum sativum FtrigoG, Medicago sativa FalfalfaG y cascarilla de +ryza
sativa Farro*G, observando una mayor cantidad de c&lulas con grnulos de <2
!)asta @ 6, p$8" en la pa(a de cebada.
'n una revisi#n de traba(os de investigaci#n reali*ada por Civera y
1evre* !+00@" se demostr# el uso de material de desec)o para producir
<2s en varios traba(os como el de 0)o et al. !+001", en el que utili*aron agua
de desec)os de la crian*a de cerdos en la producci#n de <2 por A. vinelandii
2700 ,DB@@. 'ste sustrato es rico en acetato, propionato y butirato y cuando
fue diluido a la mitad, A. vinelandii logr# producir y almacenar <2s )asta un
D4 6 !peso=peso"> sin embargo, la adici#n de +0 gL
=1
de glucosa elev# el
porcenta(e )asta 6D 6. or su parte 8an=7)uoc et al. !+00B", utili*aron residuos
agrcolas para producir <9 con Halomonas boliviensis. Los residuos
consistan en salvado de trigo )idroli*ado que result# en una acumulaci#n de
48
<2s de DD,5 6 y al adicionar acetato de sodio y cido butrico se elev# la
acumulaci#n )asta un ,0 6.
2simismo, se cultiv# Halofera" mediterranei en )idroli*ados de almid#n
de ma*, pa(a de arro* con almid#n de ma* as como suero, obteniendo <2s
en las concentraciones de +0> BB,5 y 1+,+ gL=1, correspondientes a porcenta(es
de acumulaci#n en peso seco !Op$%" de ,0,5> ,,,6 y B+,5 6 respectivamente
!0)en et al., +006> 7ing et al., +006 y Eoller et al., +00B". 'stos investigadores
sugieren la )idr#lisis de los residuos agrcolas lo que acarrea un costo e%tra en
el proceso. 0omo una forma de superar este inconveniente se propone utili*ar
un e%tracto en*imtico crudo de origen microbiano en lugar del uso de en*imas
purificadas !Civera y 1evre*, +00@". or su parte, Camre* et al. !+00,"
reali*aron una fermentaci#n con Pseudomonas fluorescens en biorreactor air
lift con caldo mela*a !10 gL
=1
", obteniendo D,D@ g L
=1
de biomasa despu&s de
1,0 )oras as como D,D4 gL
=1
de <2s, correspondientes a @5,, 6.
3tra forma de abordar la problemtica b.squeda de sustratos
econ#micos consiste en aprovec)ar la materia prima abundante en una regi#n.
Le**a et al. !+00B" mencionados por Civera y 1evre* !+00@" eligieron
Alcaligenes latus para producir <9, usando como fuente de carbono savia de
maple que contiene 10=D0 g L
=1
de sacarosa, es abundante en pases del
)emisferio norte como 0anad y puede representar una fuente renovable de
carbono para la producci#n de <9. -e acumul# )asta BB 6 !peso=peso" de
<9 ba(o concentraciones limitadas de nitr#geno.
La industria tequilera en 4&%ico genera como residuo el baga*o de
agave que es la fibra residual que queda despu&s de cocinar, moler y e%traer el
(ugo fermentable de la pi/a de Agave te/uilana Heber variedad a*ul. -e
considera que el 40 6 del peso total del agave consumido corresponde al
baga*o residual por lo que se generan grandes vol.menes de este desec)o y
su disposici#n constituye un problema ambiental> sin embargo, bacterias
degradadoras de celulosa como Microbulbifer degradans y de la lignina como
#agittula stellata producen <2 y pueden ser la alternativa para reducir los
costos en la obtenci#n de estos polmeros !Aon*les et al., +00,".
'n las plantas de tratamiento de aguas la disposici#n final efectiva de
lodo producido en e%ceso constituye un problema ambiental. La producci#n de
<2s usando el lodo podra ser una soluci#n. -e )a demostrado que el lodo
desarrollado en proceso anaerobios=.aerobios para la remoci#n de f#sforo
produce <2s y ba(o condiciones #ptimas es posible obtener ms del D0 6 de
peso seco del lodo !2rcos y 8argas, +006".
49
1&. Bnfl"encia de los par6metros de c"ltiCo en la prod"ccin de PH-
La viabilidad econ#mica de un metabolito microbiano est determinada
de manera principal por la eficiencia del proceso, velocidad de crecimiento,
formaci#n del producto y el contenido intracelular del polmero por lo que se
debe ma%imi*ar la conversi#n de la fuente de carbono y finalmente la
productividad !2cTermann,1@@5, mencionado por 0)olula, +00,".
La fuente de carbono y nitr#geno en el medio tienen gran efecto en la
sntesis de <9. 'n el g&nero Azospirillum la capacidad de acumular <9 ba(o
condiciones microaeroflicas con o sin nitr#geno se regula principalmente de
dos modos diferentes o complementarias, uno definido por la presi#n de
o%geno disuelto !0
+
" el cual se )a optimi*ado al D0 6 y otro es la relaci#n 0;1
con un valor m%imo de B0, aunque se sabe que en las races de cereales la
relaci#n es de alrededor D0;1 -e )a observado que cuando Azospirillum
brasilense spBes cultivado en un medio con alta presi#n parcial de o%geno y
con cloruro de amonio como fuente de nitr#geno, el contenido de <9 es
menor al 1 6. 'n ausencia de cloruro de amonio y ba(o condiciones de fi(aci#n
de nitr#geno !microaeroflicas" en cultivo en lote, A. brasilense acumula cerca
del B, 6 de su peso seco en <9. 2dicionando cloruro de amonio, el
contenido de <9 disminuye !0)olula, +00,".
0omo material base para la fermentaci#n se utili*an carbo)idratos como
glucosa, sacarosa y fructosa, as como aceites vegetales y glicerina derivada
de la producci#n de biodiesel. -e )a determinado que para una eficiente
producci#n de <2s se debe mantener un valor #ptimo de carbono. ara la
monitori*aci#n en una fermentaci#n con C. necator mutante se utili*aron dos
m&todos; estimaci#n de la tasa de evoluci#n del di#%ido de carbono !0'C"
medida por espectrometra de gases y monitoreo automtico de la
concentraci#n de glucosa en el medio. La concentraci#n se mantuvo en 10=+0
gL
=1
y se utili*# una soluci#n de amoniaco para controlar el p< y suministrar una
fuente de nitr#geno durante la fase de crecimiento celular. 0uando &ste
alcan*# la concentraci#n deseada, se reempla*# la soluci#n de amonio por
1a3< $ E3< para limitar el nitr#geno. -e encontr# que la concentraci#n final
de !D<9" y la productividad se incrementaron cuando la limitaci#n de
nitr#geno se inici# en concentraciones celulares superiores a B0 gL
=1
,
alcan*ando +,4+ g.L
=1
.)
=1
, 164 gL
=1
, 1+1 gL
=1
y B6 6 de productividad,
concentraci#n celular, !D<9" y contenido de <9 respectivamente despu&s
de ,0 )oras de fermentaci#n. or el contrario, con @0 gL
=1
la concentraci#n del
polmero disminuy#. 3tro aspecto a considerar es el nivel de f#sforo o de
nitr#geno en el medio de cultivo, pues al reducirlo casi se duplican los
rendimientos producto$biomasa.
50
Las fuentes nitrogenadas contribuyen fundamentalmente al crecimiento
microbiano ya que en la mayora de los casos contienen aminocidos libres
que pueden ser transportados a la c&lula sin necesidad de ser metaboli*ados,
lo cual sugiere un a)orro de energa y de tiempo para la multiplicaci#n celular.
'ste aspecto )a sido estudiado en la sntesis de <2s, concluy&ndose que en
general la adici#n al medio de cultivo, de determinados aminocidos como la
metionina genera una mayor cantidad de polmero pues en su sntesis se
requieren oc)o mol&culas de 12D<> sin embargo, Lasala et al. !+004"
informaron que M. plurifarium desarroll# muy poco en medios con caseina,
soya, )idroli*ado de levadura y peptona !una absorbancia no mayor de 1,1D M
0,4, g.L
=1
". 2simismo la adici#n de glicina y asparagina no increment# la
biomasa y por lo tanto no (ustifica su uso en el medio de cultivo porque
encarecera la producci#n del polmero.
Cespecto a la fuente de carbono, Mesorhizobium plurifarium en mela*a y
glucosa alcan*# un crecimiento abundante !1,1,+ y 1,16@ gL
=1
", con una
acumulaci#n de <2s de 146,0D y 1@+,0, gL
=1
. or su parte, en sacarosa y
manitol se observ# un crecimiento moderado !0,@B1 y 0,@6B gL
=1
" que condu(o
a mayores contenidos de polmero !D61,@0 y DD6,,1 mgL
=1
" en las c&lulas,
probablemente debido a que velocidades de crecimiento menores siempre
conducen a acumulaciones mayores de <2. 'n este caso )asta 11,0, 6 con
glucosa y DB,+B 6 con sacarosa !Lasala et al.,+00@".
'n cuanto a la 37C !velocidad de transferencia de o%geno", un
incremento se traduce en un aumento de la velocidad especfica de crecimiento
!u", debido a que los microorganismos aerobios en presencia de suficiente
fuente carbonada, la utili*an para el metabolismo energ&tico a trav&s de la
respiraci#n y con ella los procesos de biosntesis con lo cual queda 12D< y
2cetil=0o2 libres. ara Mesorhizonium plurifarium, el punto de cambio parece
estar en un valor de 37C cercano a 16 m4.L
=1
.)
=1
. 'n condiciones con mayor
aireaci#n !37C M+,,65 m4.L
=1
.)
=1
" se observ# un crecimiento inestable, con
ciclos de incremento y p&rdida de biomasa as como en la producci#n de
<2s. :na o%igenaci#n elevada desviara el metabolismo )acia mayores
cuotas de respiraci#n, mayor o%idaci#n del sustrato y por lo tanto menor
disponibilidad de acetil=0o2 para la producci#n del polmero> sin embargo con
ba(os niveles de o%igenaci#n y e%ceso de fuente carbonada, el metabolismo
energ&tico genera elevadas concentraciones de 12D< y acetil=0o2 que deben
ser convertidos en formas osm#ticamente neutras y que no afecten el balance
redo% de las c&lulas, como sucede con los <2s !Lasala et al., +004".
51
4artne* et al.$+004" informaron de una cepa de Azospirillum brasilense
aislada de races de #orghum halepense y productora de 1,, gL
=1
del elemento
ms peque/o de la familia de <2, el poli)idro%ibutirato !<9". Los cultivos
reali*ados a p< inicial de 6,0> 6,5 y B,4 mostraron rendimientos producto
biomasa !Op$%" entre @,6 y B,4 6, alcan*ado el rendimiento m%imo a p< 6,5
para una tasa de crecimiento de 1,6B gL
=1
y

0,16 gL
=1
de <9 en D6 )oras de
cultivo. Dic)a producci#n estuvo influenciada negativamente por altos niveles
de aireaci#n. La velocidad de la formaci#n del producto alcan*# su valor mayor
equivalente a 0,06 mgL
=1
. )
=1
para una 37C de 6,B, y mnimo de 0,0D, mgL
=1
. )
=
1
para +,,65. ara un 37C de 1D,+0 los valores m%imos de O p$% fueron los
ms altos tanto a 45 como a B+ )oras con D00 y 4+0 mg L
=1
respectivamente.
or su parte, ?ranco et al. !+00@", optimi*aron condiciones de fermentaci#n y
aireaci#n para la acumulaci#n de <9 por Rhizobium tropici D, determinando
que los valores m%imos en el rendimiento se lograron con 4B+ r.minuto
=1
y
1,,, vvm, mientras que para la producci#n de <9 estos valores
correspondieron a ,00 r. minuto
=1
y 1 vvm.
ara la producci#n de <2s, el biorreactor 2ir lift tiene m.ltiples venta(as
respecto a la aireaci#n, debido a que las burbu(as de aire ascendente
presentan mayores tiempos de residencia favoreciendo el proceso de
o%igenaci#n del medio de cultivo. or el contrario, el biorreactor 0-7C, provisto
de un sistema de agitaci#n mecnica, compuesto por un impeler unido a un
motor el&ctrico presenta un menor tiempo de residencia de las burbu(as de aire
por lo que se requieren mayores flu(os volum&tricos con el fin de mantener
o%geno disponible. Camre* et al. !+00," estudiaron el desempe/o de dos
tipos de biorreactores en la producci#n de <2 con Pseudomonas fluorescens
y determinaron que en el biorreactor 2ir Lift se alcan*# una concentraci#n
celular m%ima de D,D@ gL
=1
en 1,0 )oras frente a 0,66 gL
=1
despu&s de 16B
)oras, tiempo despu&s del cual se inici# la fase estacionaria de crecimiento y la
producci#n del polmero como un metabolito secundario.
'n cuanto al in#culo, en su mayora, las fermentaciones para la
obtenci#n de <2s se )an reali*ado con valores que oscilan entre 10 a 1+6.
0on 10 6 de in#culo para Cupriavidus necator !9arbosa et al., +00,">
Halofera" mediterranei !0)en at al., +000> 7rong et al., +006", Mesorhizobium
plurifarium !Lasala et al., +004", Pseudomonas fluorescens !Camre* et al.,
+00," y 1+ 6 para Halofera" mediterranei !Eoller et al., +00B". Cespecto a la
temperatura, Dantas !+00," demostr# que tambi&n influye en la producci#n de
!D<9", alcan*ando el mayor rendimiento !0,6, mg del polmero por gramo de
sustrato" a D0 N0 durante D6 )oras de fermentaci#n con C. necator. or su
parte 4arangoni et al. !+001" cultivaron esta bacteria en lactosa )idroli*ada !+0
gL
=1
" y observaron similares valores en la tasa especfica de crecimiento en la
52
primera y segunda fase de la fermentaci#n a D0 N0 !0,++ y 0,0@ )=1" y D4 N0
!0,+, y 0,0@ )=1", concluyendo que debido a que el proceso es e%ot&rmico, la
utili*aci#n de altas temperaturas !es este caso D4 N0" es interesante porque
requiere menos energa para el enfriamiento del fermentador.
1*. DeteccinD extraccin A c"antificacin de PHAs
Las metodologas para detectar <2s pueden ser reali*adas in vivo as
como in vitro, siendo las .ltimas ms sensibles, capaces de detectar una
cantidad de polmeros 100 veces menor. La detecci#n in vivo se basa en la
utili*aci#n de diferentes tipos de colorantes en las colonias productoras; -udan
1egro 9 para detectar en microscopio #ptico com.n, 2*ul de 1ilo 2 para
detectar en microscopio con receptores de fluorescencia y 8ermel)o de 1ilo
para detectar a trav&s de e%posici#n a lu* ultravioleta. Las metodologas in
vitro adems de detectar la presencia de <2s, permiten caracteri*ar y
cuantificar el polmero, inclusive sus mon#meros. '(emplo la espectrofotometra
de infravermemel)o, cromatografa para resonancia nuclear magn&tica,
espectrometrYa de masas, cromatografa de permeaciZn en gel y colorimetrYa
de barrido diferencial !Aon*les et al., +00,". :na t&cnica ms rpida para
identificar microorganismos productores de <2s consiste en encontrar los
genes que codifican para las tres en*imas necesarias para la sntesis de <2s;
Tetotiolasa, acetoacetil 0o2 reductasa y <2 sintetasa !Cevelo et al., +00B".
ara la detecci#n r[pida de <2s en las c&lulas, las bacterias son
te/idas con -udan 1egro 9, indicando la naturale*a lipdica de los grnulos.
2simismo, los grnulos tambi&n pueden te/irse con 2*ul de 1ilo 2, una
o%a*ina que produce fluorescena naran(a con e%citaci#n a 460 nm !2vila,
+00B". La t&cnica que usa a*ul de 1ilo se basa en el principio que los grnulos
de <9 muestran una fluorescencia fuerte naran(a al ser te/idos. Las c&lulas
de inter&s son e%puestas al a*ul de 1ilo al 10 6 durante 10 minutos, Luego son
observados en longitud de onda de e%citaci#n de 460 nm y son fotografiados
para su registro. 'l gluc#geno y los polifosfatos no se ti/en. 'l colorante a*ul
de 1ilo 2 es especfico para el <9 y no detecta otros <2 e%istentes. Las
placas de etri con bacterias productoras de <2s usando glucosa como
fuente de carbono y suplementadas con a*ul de 1ilo 2 se colocan en la cmara
de lu* ultravioleta en un ambiente oscuro y las colonias brillan !2rcos y 8argas,
+006".
La cuantificaci#n de polmero tipo <2, se lleva a cabo mediante
cromatografa de gases, por espectrofotometra infrarro(a con transformaci#n
de ?ourier y por resonancia magn&tica nuclear !Lassala et al., +004, 2vila,
+00B". 'n la mayora de los estudios reportados se usa cromatografa de
53
gases, empleando un patr#n interno de cido ben*oico que establece los
tiempos de retenci#n mediante los que se informa el tipo de estructura y la
cantidad de carbonos que pueden tener> sin embargo, para usar la
cromatografa de gases, es necesario una despolimeri*aci#n del <2 una ve*
e%trado de la c&lula, formando metil=&steres o propio=&steres, dependiendo si
el m&todo aplicado es metanolisis o propionolisis, respectivamente. 'n el
m&todo espectrofotom&trico, el <9 es despolimeri*ado y des)idratado por
cido sulf.rico )asta cido crot#nico> sin embargo, otros compuestos tambi&n
pueden absorber a +00=+D, nm.
7ambi&n se )a empleado el anlisis espectrosc#pico con Cesonancia
4agn&tica 1uclear !< 14C" con
1D
0 !
1D
0=14C" para el estudio de la
estructura del <2> sin embargo, para <2s con mon#meros saturados e
insaturados de cadena larga la
1D
0=14C es muc)o ms complicada por la
equivalencia de los cambios qumicos de los tomos de carbono y los patrones
prot#nicos del espectro de 14C, lo que dificulta la determinaci#n estructural
!0)en et al., +006 > 2vila , +00B".
Despu&s del cultivo, las c&lulas con <2s son separadas por procesos
convencionales como centrifugaci#n, filtraci#n o floculaci#n=centrifugaci#n.
'nseguida los procesos para la purificaci#n de <2s e%traen el polmero de las
c&lulas bacterianas con el uso de solventes orgnicos !)idrocarburos clorados"
como cloruro de metilo, cloroformo, carbonato de propileno y dicloroetano.
'stos solventes rompen las c&lulas solubili*ando sus componentes, inclusive
los <2s. 7ambi&n se pueden usar compuestos orgnicos polares como la
acetona y el alco)ol. 'stos rompen el material celular pero no el polmero,
de(ando los grnulos de <2s intactos. 2simismo se puede utili*ar una
combinaci#n de los dos procesos. Inicialmente se usa cloroformo, la soluci#n
resultante con el polmero solubili*ado es filtrada para remover los restos. 'l
polmero es precipitado con metanol o etanol, de(ando los lpidos de ba(o peso
molecular en soluci#n !Dantas, +00,".
La empresa Imperial 0)emical Industries utili*a una alternativa a la
e%tracci#n con solventes y consiste en un tratamiento t&rmico de la biomasa
bacteriana para romper las c&lulas y desnaturali*ar los cidos nucleicos. 2
continuaci#n se reali*a un tratamiento en*imtico y lavado con surfactantes
ani#nicos para solubili*ar el material celular no deseado !restos celulares". 3tro
proceso que rompe el material celular utili*a soluciones alcalinas de )ipoclorito
de sodio. Los grnulos de <2 insolubles son separados de la fase acuosa por
centrifugaci#n. 'ste tipo de e%tracci#n puede da/ar los grnulos. 'l
pretratamiento de las c&lulas con surfactantes ayuda a me(orar las
caractersticas del polmero e%trado. 'l )ipoclorito de sodio y cloroformo
54
tambi&n se pueden utili*ar garanti*ando en simultneo una ruptura del material
celular y la migraci#n del polmero )acia la fase orgnica.
1+. Bmportancia de los PHAs en la s"perCiCencia bacteriana
Los <2s son polmeros acumulados por algunas bacterias en grnulos
intracelulares, en condiciones limitantes de nutrientes para el crecimiento y en
e%ceso de fuente de carbono. 0uando &sta se agota, o si el nutriente limitante
es suministrado nuevamente, el <2 es despolimeri*ado y posteriormente
metaboli*ado. La utili*aci#n de los <2s es considerada como una estrategia
desarrollada por las bacterias para incrementar su supervivencia en ambientes
cambiantes. Los <2s son utili*ados como fuente de carbono y energa en
escase* de nutrientes, como fuente de carbono y energa para el
enquistamiento y la esporulaci#n y como fuente de poder reductor para la
degradaci#n de compuestos t#%icos.
7raba(os reali*ados en laboratorio con C. necator y B. megaterium
salva(es y deficientes en la sntesis de <9, demostraron que aquellas cepas
capaces de sinteti*ar el polmero de reserva tenan mayor supervivencia en
agua de ro y mayor capacidad de competencia que sus correspondientes
mutantes. 0onclusiones similares se obtuvieron cuando se anali*# la
supervivencia de B. megaterium utili*ando microcosmos de suelo. 'stos
e%perimentos sugirieron que la sntesis y utili*aci#n del polmero aumentaba la
supervivencia y la capacidad de competencia bacteriana en ambientes
naturales. ara anali*ar el efecto de la degradaci#n de los <2s en la
supervivencia se compar# la supervivencia en agua de ro de una cepa salva(e
de Pseudomonas putida con una cepa mutante en la en*ima <2
depolimerasa. Los resultados demostraron que la incapacidad de degradaci#n
de <2s representa una desventa(a para la supervivencia, tanto en agua de ro
est&ril como en agua de ro con la comunidad bacteriana normal. 2dems se
comprob# que la deficiencia en la capacidad de degradaci#n de <2s tena
efectos negativos sobre el desarrollo de resistencia al estr&s, observando una
menor supervivencia a la e%posici#n al etanol y al estr&s t&rmico despu&s de
varios das de permanencia en agua de ro en las mutantes !de 2lmeida, +004".
0uando A. brasilense forma agregados, las c&lulas acumulan altas
cantidades de <9 en forma de grnulos y la envoltura celular presenta una
capa de electrones bien definida cerca de la membrana e%terna. 'n c&lulas no
agregadas no se observan los grnulos de <9 pero despu&s de +4 )oras la
envoltura celular parece difusa y menos definida, observndose el inicio de la
acumulaci#n de <9 y la formaci#n de una capa delgada de e%opolisacrido
durante la floculaci#n y enquistamiento de A. brasilense -pB.La formaci#n de
55
<9 involucra una des)idrogenasa dependiente de 12D< que compite por los
intermediarios del ciclo del cido tricarbo%lico del sistema de transporte de
electrones !12D<, 12D<, 27 y acetil=0o2". 0uando la acumulaci#n de <9
es interrumpida, )ay ms intermediarios accesibles al ciclo de Erebs> sin
embargo, una mutante <9 negativa mostr# ms agregaci#n que la cepa
silvestre en un medio con un relaci#n alta de 0;1 lo que demostr# que la
producci#n de e%opolisacrido tambi&n compite por el poder reductor. 'sta
mutante con un incremento en la capacidad para ad)erirse a la ra* pero un
decremento en la supervivencia, demostr# el papel del <9 como compuesto
de almac&n de carbono y energa que promueve la supervivencia de la bacteria
cuando las fuentes e%#genas son limitadas.
Ca**aq et al. !+010" detectaron <2s en cepas de Pseudomonas,
Citrobacter, 2lebsiella, scherichia y nterobacter, a trav&s de la tinci#n
lipoflica de -udan 1egro 9 y encontraron una mayor cantidad de grnulos
en las bacterias provenientes de lugares contaminados, sugiriendo la
necesidad de estos grnulos para sobrevivir donde los requerimientos bsicos
de carbono pueden estar cubiertos pero no as los de nitr#geno
1,. Degradacin de PHAs
Los <2s pueden ser totalmente degradados por las bacterias que los
producen y por otras bacterias, )ongos y algas !De 2lmeida et al., +004". Los
microorganismos que degradan los <2s poseen en*imas e%tracelulares como
las depolimerasas e )idrolasas que catali*an la ruptura del polmero en
compuestos solubles en agua que pueden ser procesados por las bacterias y
los )ongos. 7ambi&n pueden ser degradados por un mecanismo no bi#tico de
)idr#lisis qumica especialmente en altos valores de p<.
La tasa de biodegradaci#n vara en funci#n de la poblaci#n microbiana
presente en el ambiente, temperatura, p<, nutrientes presentes en el medio,
cristalinidad, aditivos y rea superficial de los polmeros. Los <2s son s#lidos
insolubles en agua mientras que las depolimerasas son en*imas solubles, por
eso la degradaci#n acontece en una reacci#n )eterog&nea de dos etapas; la
primera es la adsorci#n de la en*ima a la superficie del polmero y la segunda
es la )idr#lisis de las cadenas polim&ricas en el sitio activo de la en*ima. La
)idr#lisis siempre ocurre en una superficie entre las en*imas absorbidas y los
sitios de absorci#n libres. ara un copolmero formado por !D<9=co=4<9" se
)a observado una degradaci#n en + a +, semanas, mientras que para una
pelcula de !D<9" el tiempo vara de 0,, a ,0 semanas !Dantas, +00,".
56
La degradaci#n de los <2s es dependiente de la estructura del
polmero debido a que las depolimerasas son en*imas altamente especficas
en cuanto al sustrato y tambi&n presentan estereoselectividad para unidades
de configuraci#n -. 'l tama/o de la cadena tambi&n influencia disminuyendo la
tasa de degradaci#n y dificultando el crecimiento microbiano debido a un
aumento en la )idrofobicidad.
'n C. necator la degradaci#n de !D<9" se inicia por acci#n de la <2
depolimerasa que forma cido !C"=D=)idro%ibutrico que luego es o%idado por
una des)idrogenasa 12D especfica, originando acetoacetato. osteriormente
&ste es convertido en acetoacetil=0o2 !?igura 14", el cual es un intermediario
com.n de la sntesis y degradaci#n del !D<9" !-aito, et al., 1@@D". 2s mismo
en Azospirillum spp. ba(o condiciones de inanici#n, la sntesis de <2s cesa y
comien*a su degradaci#n. :na depolimerasa unida a la membrana
probablemente degrada el <9 a su mon#mero D !=" 9=)idro%ibutirato, el cual
es o%idado )asta acetoacetato por la des)idrogenasa )idro%ibutirato !93<9=
D<" con la reducci#n de 12D. La acetoacetato succinato 0o2 transferasa
catali*a la transferencia de 0o2 desde succinil 0o2 )asta acetoacetato para
producir acetoacetil 0o2 !0)olula, +00,".
57
)ig"ra 1&. 9iosntesis y degradaci#n de !D<9" en C. necator !1" D=
cetotiolasa, !+"acetil=0o2 reductasa dependiente de 12D<,
!D" acetoacetil=0o2 reductasa dependiente de 12D<,!4" <2
polimerasa,!," <2 depolimerasa, 6" U=D=)idro%ibutirato
des)idrogenasa, !B" acetoacetil=0o2 sintetasa !-aito, et al.,
1@@D".
14. Aplicaciones de los PHAs
Los <2s son termoplsticos y pueden ser procesados por los equipos
tradicionales, utili*ndose mayormente en pelculas, inyecci#n y e%trusi#n. 2s
mismo tienen aplicaciones en el mbito medicinal y farmace.tico, debido a su
biodegradabilidad y solubilidad en el cuerpo )umano.
= 2plicaciones industriales; 7ransportadores biodegradables para la
liberaci#n controlada de fertili*antes, fungicidas, )erbicidas e insecticidas,
redes de pesca, embala(es para alimentos, frascos, recipientes,
emulsificantes, materia prima para la producci#n de tintes, ad)esivos.
= 2plicaciones m&dicas; Arapas, (eringas, suturas, materiales osteosint&ticos
como placas #seas, trasportadores biodegradables para la liberaci#n
controlada de drogas y medicamentos.
= recursores para la sntesis qumica de sustancias #pticamente activas
58
:na de las ms importantes aplicaciones del <9 es como material para
aplicaciones biom&dicas en filamentos de suturas, portadores de drogas y
generaci#n de constructos para el crecimiento celular, debido a que resulta
biocompatible. 's particularmente importante el )ec)o que el producto de la
degradaci#n del <9, es decir D!="=D=)idro%ibutirato es un metabolito
intermediario com.n presente en las c&lulas animales y se )a detectado
tambi&n en grandes cantidades en el plasma sanguneo )umano, lo cual
reafirma su biocompatilidad.
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