Nicols Cataldo Pablo Fagndez Vernica Lpez Natalia Bobba - Lourdes Lebrato

Prctico 6: Inhibicin por sustrato, sistema xantina

oxidasa/xantina

Objetivo:
Estudiar la velocidad de reaccin de un sistema enzimtico con inhibicin por sustrato y
calcular los parmetros cinticos.
Resultados:
En este prctico se midi la velocidad de reaccin de la enzima xantina oxidasa (EC 1.2.3.2).
Esta enzima participa en las fases finales del catabolismo de las purinas en mamferos,
catalizando la oxidacin de la xantina a cido rico a expensas de la reduccin de oxgeno, y
presenta un fenmeno de inhibicin por sustrato cuando las concentraciones de xantina son
elevadas. Dicha inhibicin provoca que la enzima presente una cintica que viene definida
segn la siguiente ecuacin:


[]
[]
[]

Este fenmeno puede ser verificado de varias formas. Una de ellas es evaluar la velocidad de
aparicin de cido rico a concentraciones crecientes de xantina; sin embargo, este absorbe
en la regin ultravioleta del espectro y por tanto requiere de un espectrofotmetro capaz de
medir en dicha regin. Un modo alternativo es llevar a cabo la reaccin en presencia de
diclorofenolindofenol (DCFIF), quien podr reemplazar al oxgeno al actuar como agente
oxidante. El DCFIF es de color azul y absorbe en el espectro visible con un mximo a 600 nm,
pero al reducirse pasa a una forma incolora; de este modo, la actividad enzimtica de la
xantina oxidasa puede ser evaluada al estudiar la desaparicin del agente oxidante, observada
cmo un descenso en la absorbancia a 600 nm. El siguiente esquema resume lo anterior:



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En el prctico se utilizaron concentraciones fijas de xantina oxidasa (1.5 M) y DCFIF (0,04
mM), y concentraciones crecientes de xantina (5 M, 7.5 M, 10 M, 50 M, 100 M, 500 M,
1 mM, 2 mM, 3 mM y 4 mM). Para cada condicin se midieron los valores de absorbancia a
600 nm cada 10-20 segundos, durante 2-3 minutos, por duplicado, de modo de estudiar la
disminucin de la concentracin de DCFIF oxidado a lo largo del tiempo (va relacin de
Lambert-Beer). Luego, a partir de los grficos de concentracin de DCFIF oxidado en funcin
del tiempo se obtuvieron los valores de velocidad inicial catalizada por la enzima
(representada por la pendiente del ajuste lineal de los datos). En la Figura 1 se detallan los
valores de velocidad inicial obtenidos en presencia de concentraciones crecientes de xantina y
el grfico correspondiente.


El grfico de la Figura 1 muestra un comportamiento tpico de un sistema enzimtico con
inhibicin por sustrato, acorde a lo esperado. La lnea en el grfico representa el ajuste a la
ecuacin definida anteriormente, y a partir de este fue entonces posible obtener los
parmetros cinticos Vmax = (2.07 0.09) x 10-6 M.min-1, K
M
= (1 0.1) x 10-4 M y K
i
= (34
4) x 10-4 M.
En caso de no contar con un programa capaz de realizar el ajuste no lineal del grfico
presentado en la Figura 1, los parmetros an pueden determinarse mediante los mtodos de
ajuste lineal. Entre ellos se destacan los grficos de Lineweaver-Burk, de Dixon y de Hill.

Xantina (M) V (M.min)


5.00 x 10
-6
6.3395 x 10
-8

5.00 x 10
-6
6.5854 x 10
-8

7.50 x 10
-6
1.0244 x 10
-7

7.50 x 10
-6
1.2439 x 10
-7

1.00 x 10
-5
1.2196 x 10
-7

1.00 x 10
-5
1.1941 x 10
-7

5.00 x 10
-5
4.5746 x 10
-7

5.00 x 10
-5
5.479 x 10
-7

1.00 x 10
-4
8.6195 x 10
-7

1.00 x 10
-4
8.9122 x 10
-7

5.00 x 10
-4
1.4819 x 10
-6

5.00 x 10
-4
1.3967 x 10
-6

1.00 x 10
-3
1.442 x 10
-6

1.00 x 10
-3
1.4605 x 10
-6

2.00 x 10
-3
1.1786 x 10
-6

2.00 x 10
-3
1.2451 x 10
-6

3.00 x 10
-3
1.1546 x 10
-6

3.00 x 10
-3
1.1016 x 10
-6

4.00 x 10
-3
1.1395 x 10
-6

4.00 x 10
-3
1.0136 x 10
-6
Figura 1. Tabla de valores de Velocidad inicial de reaccin (M.min
-1
) en funcin de la concentracin de
xantina (M) y grfico correspondiente
0.000 0.002 0.004
0.0000000
0.0000007
0.0000014
v

(
M
.
m
i
n
-
1
)
Xantina (M)
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Grfico de Lineweaver-Burk: 1/v vs. 1/[xantina]
Se desprecian los valores obtenidos a altas concentraciones de sustrato y se obtiene una recta
cuya interseccin con el eje y representa el valor 1/Vmax y cuya interseccin con el eje x
representa el valor -1/K
M
. La recta obtenida fue: y = (72 2)*x + (5 2) x 10
5
, de la cual se
obtuvieron los valores Vmax = (2.0 0.8) x 10-6 M. min
-1
y K
M
= (1.4 0.6) x 10-4 M.

Grfico de Dixon: 1/v vs. [xantina]
Se desprecian los valores obtenidos a bajas concentraciones de sustrato y la interseccin del
ajuste lineal con el eje x representa el valor -K
i
. La recta obtenida fue: y = (8.7 0.8) x 10
7
*x +
(6.3 0.2) x 10
5
, de la cual se obtuvo K
i
= (72 0.7) x 10
-4
M

0,0
2,0x10
-3
4,0x10
-3
600000
800000
1000000
1200000
1
/
v

(
M
-
1
.
m
i
n
)
[xantina] (M)

Figura 3. Determinacin de parmetros cinticos mediante grfico de Dixon: 1/v vs.
0,0
5,0x10
4
1,0x10
5
1,5x10
5
2,0x10
5
0,0
5,0x10
6
1,0x10
7
1,5x10
7
1
/
v

(
M
-
1
.
m
i
n
)
1/[xantina] (M
-1
)

Figura 2. Determinacin de parmetros cinticos mediante grfico de Lineweaver-Burk:
1/v vs. 1/[xantina]
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[xantina]
Grfico de Hill: Ln (V
max
v) vs. Ln [xantina]
Se observan dos tendencias lineales, una de pendiente positiva a valores bajos de
concentracin de sustrato, cuya interseccin con el eje x representa el valor Ln K
M
; y otra de
pendiente negativa a valores altos de concentracin de sustrato, cuya interseccin con el eje x
representa el valor Ln K
i.
Las rectas obtenidas fueron y = (0.94 0.03)*x + (8.1 0.3), de
pendiente positiva, de la cual se obtuvo K
M
= (1.84 0.09) x 10
-4
M, y por otro lado y = -(0.7
0.1)*x + -(4.4 0.8), de pendiente negativa, de la cual se obtuvo K
i
= (25 0.6) x 10
-4
M

-13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5
-4
-3
-2
-1
0
1
L
n
(
v
/
(
V
m
a
x
-
v
)
)
Ln([xantina])

Figura 4. Determinacin de parmetros cinticos mediante grfico de Hill: Ln (V
max
v)
vs. Ln [xantina]

La Tabla 1 resume los valores de los parmetros cinticos obtenidos mediante el ajuste no
lineal y los ajustes lineales recin descritos:
Ajuste no lineal Lineweaver-Burk Dixon Hill
Vmax (M.min
-1
) (2.07 0.09) x 10
-6
(2.0 0.8) x 10
-6
- -
K
M
(M) (1 0.1) x 10
-4
(1.4 0.6) x 10
-4
- (1.84 0.09) x 10
-4

K
i
(M) (34 4) x 10
-4
- (72 0.7) x 10
-4
(25 0.6) x 10
-4


Como se puede apreciar en la Tabla 1, los valores de Vmax y K
M
obtenidos a partir del ajuste no
lineal y de los ajustes resultan muy similares. No es el caso de los valores de K
i
de los que
podra decirse presentan una diferencia significativa, siendo el valor obtenido a partir del
grfico de Dixon el ms alejado al obtenido mediante el ajuste lineal. La mejor aproximacin
del grfico de Hill puede deberse a que este ltimo utiliza la escala logartmica, lo que conduce
a un error experimental menor en la determinacin de K
i
en base a la interseccin de la recta
con el eje x.
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Posteriormente se analiz la variacin de la velocidad de reaccin en funcin de de
concentraciones variables de enzima, a dos concentraciones fijas de sustrato (xantina). Los
resultados se muestran en el grfico de la Figura 4.

0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10 0.11
0.0000000
0.0000005
0.0000010
0.0000015
0.0000020
10 M
100 M

v

(
M
.
m
i
n
-
1
)
[Xantina Oxidasa] (M)

Figura 4. Velocidad de reaccin en funcin de concentracin de xantina oxidasa a dos
concentraciones fijas de xantina (10 M y 100 M)

En este grfico se puede observar que a medida que aumentamos la cantidad de enzima, la
velocidad aumenta de forma lineal, como era de esperarse.
El ensayo realizado a [xantina] = 100M ocurre en condiciones de Vmax (ver Figura 1), y dado
que

[], la pendiente del grfico representar el valor de Kcat de la enzima, a

saber (1.77 0.09) x 10
-5
min
-1

A una [xantina] = 10M, estamos por debajo de la Km de la enzima. Dado que v =
kcat[E]
T
[xantina]/(Km + [xantina]), el grafico de v vs [E] representa una recta, cuya pendiente
corresponde a kcat[xantina]/(Km + [xantina]), si [xantina] es muy baja, se puede simplificar la
pendiente a kcat[xantina]/Km.
Conociendo Vmax es posible calcular la actividad por mL de enzima, segn lo siguiente:
Vmax = 2.07x10
-6
M.min
-1
= 2.07 M.min
-1
, dado que el volumen total de la reaccin fue de 3
ml podemos determinar que se convierten 6.21mol.min
-1
, y dado que se emplearon en el
ensayo 100l de enzima, dividiendo por esta cantidad obtenemos una actividad de 62.1 U.ml
-1




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En cuanto a posibles mecanismos capaces de explicar el tipo de inhibicin observado, se
pueden establecer diversas hiptesis. La xantina oxidasa cataliza la oxidacin de xantina o
hipoxantina a cido rico mediante un mecanismo de ping-pong, en donde el factor clave es el
transporte electrnico: primero del sustrato a la enzima, y luego de la enzima reducida al O
2
.
Por lo tanto, si dicha cadena de transporte electrnico ve disminuido su flujo en alguno de
estos dos pasos, la velocidad de catlisis se ver claramente afectada. Podra ocurrir que el
exceso de sustrato diera lugar a la unin de ms de una molcula al sitio activo al mismo
tiempo, y que la formacin de dicho complejo influyera negativamente en el transporte
electrnico, por algn impedimento de tipo estrico u otro. Asimismo, el exceso de sustrato
podra resultar en una sobrerreduccin a nivel de alguno de los 3 centros redox presentes en
el sitio activo, lo cual podra enlentecer la cadena de transporte electrnico llevando a una
disminucin o prdida total de la actividad cataltica. Teniendo en cuenta lo anterior, y
sabiendo que los centros redox del sitio activo (Fe-S, FAD y Mo) poseen metales de transicin,
podran realizarse experimentos de resonancia paramagntica electrnica (EPR), en donde son
activas las especies que poseen electrones desapareados, para estudiar como se ve afectado
su estado de oxidacin por el exceso de sustrato.