UNIDAD 10:

PROCESOS BSICOS
EN CITOLOGA
(CITOPREPARACIN)
Blanca Vicente
1. Introdu!"n
#. Pr$%&r&!"n d$ '& (u$)tr& %&r& $' $)tud!o !to'"*!o
+. ,!-&!"n
3.1 Tipos de fijadores
.. T!n!"n
4.1 Coloraciones extemporneas
4.2 Coloraciones especiales: tincin con anaranjado de acridina
/. A)%$to) 01)!o) )o0r$ '& !nt$r%r$t&!"n d$ $2t$n)!on$)
$n !to'o*3&
UNIDAD 10: PROCESOS BSICOS EN
CITOLOGA (CITOPREPARACIN)
1. Introdu!"n
La Citologa permite examinar grupos
celulares procedentes de diferentes partes
del organismo.
Obtencin de muestras citolgicas es muy
senc|||a, econm|ca y segura para el
paciente.
Calidad de una preparacin citolgica
depende de:
Actuacin del tcnico en la obtencin !"abilidad,
experiencia, instrumental, "ora, #ona$%y
procesamiento de la muestra, como del en&o,
recepcin e integridad de la informacin !informe
citolgico% 'ue lle&a asociada.
1. Introdu!"n. 45todo d$ %r$%&r&!"n d$ (u$)tr&)
Mtodo d|recto:
(uestra es r|ca en c|u|as
!poco l'uido%: )*O+,-.
+oma de muestra:
.uncin aspiracin con agu/a
fina !.AA)%
"ttp:00111.c"ospab.es0area2
medica0anapat0&ideo2paaf."tm
*aspados con esp3tulas,
cuc"arillas y asas de platino o
los escobillones de algodn.
Mtodo |nd|recto:
(uestras l'uidas necesitamos concentrar
la poblacin celular !por e/emplo
centrifugando%
+oma de muestra:
.lacas de petri para la recogida de esputos
)rascos y sondas para orina
Aparatos de exploracin como
broncoscopios, gastroenteroscopios... 'ue
"abitualmente &an pro&istos de
mecanismos de la&ado, inyeccin y
aspiracin o recogida de ese l'uido de
la&ado.
"ttp:00escuela.med.puc.cl0publ0patologiageneral0.atol2456."tml
4. ,n&estigacin de las c|u|as at|p|cas en las secrec|ones ||qu|das o
derrames
5. ,n&estigacin de c|u|as at|p|cas despus de un escobillonado o
raspado con instrumentos di&ersos de una mucosa o una lesin
de piel.
7. Citodiagnstico despus de una c|topunc|n, es decir, despus de
una puncin "ec"a con agu/a fina para recoger l'uido tisular
recogiendo clulas en suspensin y no un fragmento del te/ido.
8. Citodiagnstico de pie#a operatoria !9|ntraoperator|a9 o 9intra9%
no fi/ada.
1. Introdu!"n. E)tud!o) !to'"*!o)
:eteccin preco#
o exfoliati&a
Citlogo con gran
experiencia
-e estudian poblaciones de clulas: densidad,
co"esin, la diferenciacin, e ndice citolgico
de malignidad 'ue puede inter&enir en el
pronstico y las indicaciones teraputicas de
los tumores.
#. Pr$%&r&!"n d$ '& (u$)tr&
%&r& $' $)tud!o !to'"*!o
1ICS DL MULS1kAS SLG0N SU kCCLDLNCIA
(uestras procedentes de lquidos fisiolgicos
(uestras procedentes de lquidos y fluidos patolgicos: l'uido
de derrames !pleural, peritoneal, contenido de un 'uiste%,
expectorac|n bron'uial, l'uido procedente del |avados de
esfago, estmago, coln,... ; las procedentes de
c|topunc|ones como por e/emplo: la puncin de mdula sea,
la puncin "ep3tica...
(uestra procedentes de frotis legrados como por e/emplo: el
frotis &aginal y el cepillado bron'uial.
Piezas operatorias.
#. Pr$%&r&!"n d$ '& (u$)tr& %&r& $' $)tud!o !to'"*!o
kLAkACICN GLNLkAL DL LA MULS1kA
4. Frotis fijados:
)rotis extendidos, fi/ados con citospray !e identificados% por el clnico
inmediatamente despus de la obtencin.
<n el laboratorio: tincin de .apanicolaou.
</emplos: -ecreciones de mama, citologas por cepillado$
2. Frotis secados al aire:
)rotis extendidos por el clnico inmediatamente despus de la obtencin y secados
al aire.
+incin de *omano1s=y:
La preparacin se calienta a 44>C durante unos 7> min y se ti?e con una me#cla
recin preparada de a#ul de metileno saturada !una parte% y de eosina al 4@ !dos
partes%.
Los nAcleos celulares se ti?en de &ioleta
Las clulas sanguneas de ro/o.
.lasmodium: se ti?en de a#ul.
Muestras no fijadas ni secadas al aire:
(uestras frescas 'ue llegan al laboratorio l'uidas o semislidas
!suspensin celular m3s o menos densa%.
<l tcnico especialista en el laboratorio de citologa las procesa !orina,
esputos, LC*, cual'uier l'uido de puncin de un derrame...%
#. Pr$%&r&!"n d$ '& (u$)tr& %&r& $' $)tud!o !to'"*!o
Lk1LNSICN DIkLC1A
+cnica rudimentaria.
Btil para muestras mucosas !esputo, l'uido de aspecto
mucoso, aspirado bron'uial...%.
4C ,dentificar 5 o m3s portas: <ti'ueta o rotular sobre
#ona esmerilada.
5C Obser&ar la muestra y anotar su aspecto
macroscpico.
7C -e seleccionan a'uellas partes de la muestra 'ue son
representati&as de la misma y0o las de apariencia
patolgica.
8C -e deben colocar las partes seleccionadas sobre un
porta y extenderlas con otro "asta conseguir frotis
uniformes. +ambin se pude "acer con el asa de platino
pre&iamente esterili#ada. A &eces es necesario
seleccionar bien la #ona del porta a utili#ar, como por
e/emplo en la triple toma.
DC Los portas preparados pueden introducirse en la
solucin fi/adora, como el etanol al EF@ en la tincin de
.apanicolau, o se de/a secar al aire, si se &an a te?ir con
*omano1s=y, (ayGHrIn1aldGHiemsa o :iffGJuic=.
"ttp:001115.uca.es0dept0enfermeria0HK,A-@5>.*AC+,
CA-0guia1eb0acti&idades0consulta0marcott."tm
CLN1kIIUGACICN
Btil para muestras seromucosas y grandes
&olAmenes de l'uidos serosos !li'uido 'ustico
y procedentes de la&ados%.
4C Anotar el aspecto mucoso de la muestra.
5C Agitar la muestra para despus resuspender
las clulas 'ue contiene y &erter igual cantidad
en dos tubos de centrifuga.
7C -e centrifuga a una &elocidad de 5>>>r.p.m.,
durante D min, una &e# centrifugado se decanta
el sobrenadante, se me#cla el sedimento con
unas gotas de sobrenadante para resuspender
las clulas y se deposita con una pipeta pasteur
una gota de este sedimento sobre un porta
pre&iamente identificado.
8C *eali#ar una extensin directa de la muestra
con otro porta o citocentrifugarla.
DC )i/ar r3pidamente con la solucin fi/adora.
#. Pr$%&r&!"n d$ '& (u$)tr& %&r& $' $)tud!o !to'"*!o
CI1CCLN1kIIUGACICN
Centrfuga cytospin. Btil y r3pida para muestras con celularidad suspendida en
un gran &olumen de l'uido como los la&ados bron'uiales y g3stricos, l'uidos
pleural y peritoneal...
4C ,ntroducir una pe'ue?a cantidad de muestra en un tubo de centrfuga
especial, con forma de cono, el cual presenta un pe'ue?o orificio, 'ue se
encuentra situado en un filtro.
5C Lustamente pegado a ese filtro colocamos un portaob/eto, perfectamente
identificado. :ebemos reali#ar esta misma operacin dos &eces, para a la "ora
de centrifugar colocarlas enfrentadas para compensar el peso de la centrifuga.
7C <stas pe'ue?as alcuotas de muestra las "acemos girar lateralmente a 4>>>G
4D>> rpmdurante D minutos.
8C Kna &e# transcurrido el tiempo, retiramos el portaob/eto, r3pidamente del
filtro, y obtenemos en l un acAmulo de todo el material celular contenido en la
muestra.
DC A"ora con la ayuda de otro portaob/eto, reali#amos un extendido de la
muestra, el cual lo fi/amos, o lo de/amos secar al aire, segAn el procedimiento
'ue &ayamos a seguir despus.
http:]]www.conganat.org]10co
ngreso]traba[o.asp?|d_traba[o=
164S&t|po=3
#. Pr$%&r&!"n d$ '& (u$)tr& %&r& $' $)tud!o !to'"*!o
IIL1kCS DL MLM8kANA
Concentra clulas en l'uidos de ba/a densidad celular
!orina, LC*, sino&ial...%
kescatan mayor nmero de c|u|as que |a
c|tocentr|fugac|n.
+ipos: m||||pore !acetato de celulosa% y nucleopore
!policarbonato%.
<l e'uipo de filtracin consta de embudo, soporte del
filtro, contenedor del l'uido a desec"ar y bomba de
&aco. -e reali#a una filtracin con la muestra y
posteriormente se exam|na e| f||tro.
Citologa filtros -( !4 5 a D micras, cada cm
5
de
superficie contiene millones de poros capilares 'ue
ocupan m3s del 6> @ del &olumen total%
<ste filtrado no necesita ningAn fraccionamiento del
l'uido y no "ay 'ue extraer el sedimento y colocarlo
sobre el portaob/etosM ello permite una estimacin
cuantitati&a de las clulas cancerosas en un &olumen de
l'uido dado, pero en cambio pueden "aber
superposiciones celulares molestas y la membrana
filtrante experimentar una desecacin r3pida.
)i/acin: Anicamente con alco"ol etlico de graduacin
media pues el alco"ol absoluto, el ter o la acetona
pro&ocaran la disolucin del filtro.
<l filtro con la muestra su/eto con una pin#a se coloca
sobre un portaob/etos y se ti?e.
NKCL<O.O*<
E6E4PLOS DE PREPARACIN DE ALGUNAS 4UESTRAS
CkINA
4. *ecoger 4>> mL de orina en un recipiente estril.
4O orina de la ma?ana, otros, practicar e/ercicios al enfermo especialmente en caso de tumor &esical ya 'ue la agitacin de la
orina contra la pared pro&oca una descamacin importante%.
-i se sospec"a de un tumor de urter, pel&is renal o ri?n es preferible recoger la orina por cateterismo uretral.
5. Centrifugar unos 4> mL a 4D>> rpm durante D minutos,
7. <xamen del sedimento: cantidad de cristales !se eliminan a/ustando el pP%M los "emates se "emoli#an con actico al D@.
8. :ecantar el l'uido sobrante y aspirar el sedimento con una pipeta pasteur, si el sedimento es escaso "ay 'ue usar otra tcnica de
concentracin como es la citocentrifugacin.
D. <xtender el sedimento sobre un portaob/eto .
F. )i/ar inmediatamente durante 4D segundos.
Q. .roceder a la tcnica de tincin !.apanicolaou%.
SANGkL
-e eliminan los "emates por "emlisis, por sedimentacin acelerada o por centrifugacin fraccionada.
1cn|ca de Sea|: se basa en la diferente densidad de las clulas cancergenas y los linfocitos por una parte y los eritrocitos y .(N por otra.
-e usa como medio de separacin una me#cla de diferentes siliconas de densidad 4, >QD, donde las clulas cancerosas y linfocitos se
acumulan en la superficie de la silicona y los .(N y eritrocitos se acumulan por deba/o de la silicona.
SLCkLCICNLS kCS11ICAS.
-e obtienen por masa[e de |a prstata en e| po|o |nfer|or ya 'ue esta regin es frecuentemente el lugar de predileccin del desarrollo del
c3ncer.
Pay 'ue "acer ligera presin con el dedo en el polo inferior y abstenerse de apretar las &esculas seminales a fin de e&itar la descamacin
de clulas de este origen. +erminado el masa/e se "ar3 presin sobre la uretra "asta el orificio del meato uretral para conducir las
secreciones.
Kna &e# recogidas se depositan sobre las portas para asegurar la ad"esin de las clulas. Cada gota es comprimida entre 5 portas 'ue son
separados por desli#amiento y fi/ados inmediatamente.
DLkkAMLS LLUkALLS, ASCI1ICCS C LkICkDICCS.
:eben recogerse en frascos 'ue contengan anticoagulante.
-e centrifuga la muestra a 5>>> rpm durante 4> minutos y se extiende el sedimento sobre dos portas, los cuales ser3n te?idos uno con la
tcnica de .apanicolaou y otro con la tcnica de (ay HrInd1ald Hiemsa.
LIUIDC CLIALCkkAUIDLC.
<s centrifugado y el sedimento es extendido y te?ido.
+. ,!-&!"n. Tipos de fijadores
IIIADCkLS ALCCnCLICCS: !des"idratando las clulas y coagulando las protenas%
*3pidos pero &ol3tiles e inflamables.
Los m3s usados son:
<tanol EF@ R fi/ador de eleccin cuando la tincin posterior es apan|co|au
4C Ba?o de etanol al EF@ durante 4D G 5>min !se puede conser&arse indefinidamente tapado en el
frigorfico%
-e puede a?adir 3cido actico al 5SD@ para romper los "emates
(etanol al 4>>@
.ropanol e isopropanol al E>@
(e#cla de alco"olGter a partes iguales: da unos excelentes resultados sobre todo tipo de materiales pero en
la actualidad est3 en desuso por las peligrosas caractersticas fsico G 'umicas del ter 'ue es muy inflamable
y &ol3til.
LIUIDC DL CAkNC: formado por etlico puro, cloroformo y 3cido actico.
CI1CSkA: )i/ador en forma de aerosol: Alco"ol isoproplicoGpolietilglicol !protege de la desecacin%
Con este spray se pul&eri#a toda la superficie del porta de forma r3pida y sencilla, se debe aplicar a 5D G 7> cm
de distancia de la muestra. -e aplica al material citolgico inmediatamente despus de su extensin en el porta.
-imple y proporciona buenos resultados, se recomienda sobre todo cuando las extensiones deben ser en&iadas
a otros laboratorios para su tincin !extensiones ginecolgicas, cepillados orofarngeos, esof3gicos,
bron'uiales...%. .or el contrario debe e&itarse su uso en extendidos de materiales l'uidos reali#ados en el
propio laboratorio y en los "em3ticos para no pro&ocar agrupamientos de los "emates.
Antes de te?ir debe extraerse el c|tospray mediante pases suces|vos de S - 10 m|nutos cada uno por etano| a|
96 .
La extensin puede ser te?ida inmediatamente despus de rociarla !soluble en agua% con lo 'ue se acorta el
tiempo total del proceso.
SLCADC AL AIkL SIN IIIAk: (ay HrInd1ald Hiemsa !no se &e bien la cromatina nuclear y se usa en
citologas "ematolgicas%
.. TINCIN
.ara ello se emplean distintos colorantes, si bien, actualmente
se prefieren como tinciones de rutina en citologa las de
car3cter policrom3tico, 'ue permiten distinguir distintos
matices !eosinofilia, basofilia y anfofilia% en las estructuras
celulares a te?ir. Los fundamentales son la nematox|||na 'ue
ti?e bien los nAcleos y Los|na para te?ir citoplasmas. .ero "ay
muc"os m3s colorantes como el Crange G, verde |uz, Iucs|na...
Kn colorante debe colorear las clulas, no decolorarse con los
disol&entes "abitualmente empleados y slo decolorarse
mnimamente tras largo tiempo de almacenamiento.
<n Citologa es muy importante la calidad de la tincin del
nc|eo ya 'ue la distincin entre clulas benignas y malignas se
basa en la morfologa nuclear.
La tincin del citoplasma proporciona informacin adicional
respecto al origen y maduracin de la clula.
Pay muc"os mtodos de tincin, el m3s recomendable y usado
en citologa exfoliati&a es el de .apanicolaou.
Visuali#acin ptima de las clulas.
:iferenciacin de los constituyentes celulares.
:estacar estructura nuclear y citoplasma.
.. TINCIN
.apanicolaou en 4E5D
<n Citologa exfoliati&a, especialmente en Citologa Hinecolgica.
+incin diferencial o policroma:
Pematoxilina de Parris !colorante nuclear a#ul%: sin acidificar con 3cido
actico
+res colorantes b3sicos !o me#clas%:naran/a H, &erde lu#, pardo Birsmar=,
eosina...
Naran/a H y solucin de eosina alco"lica !<A, 'ue tambin contiene &erde lu# y
pardo Birsmar=% R colorante del citoplasma 'ue contiene 'ueratina: naran/as,
por e/emplo en las clulas del carcinoma epidermoide.
Comercialmente diluidos: me#clas <A G 7F, <A G D> y <A T FD
</: en muestras ginecolgicas con frecuencia gruesas donde es preferible
emplear LA - 6S !menos &erde lu# y no colorea tan intensamente el fondo de la
preparacin%. +ambin facilita la distincin entre adenocarcinoma de endocr&ix
!citoplasma ros3ceo% y adenocarcinoma endometrial !citoplasma a#ulado%.
(todo alternati&o !extensiones urinarias y de la&ados g3stricos%: (enos t y
citoplasmas menos transparentes
Pematoxilina de Parris acidificada con actico 8Ds y la omisin del la&ado en
solucin clor"drica.
Tincin de Papanicolau:
.. TINCIN
(uestra: material secado al aire en preparaciones de citologa
por puncin aspiracin.
5 coloraciones sucesi&as: la de (ay G HrIn1ald y la de Hiemsa
'ue emplea di&ersas &ariantes de eosinato de a#ur o de
metileno para producir una coloracin policroma m3s brillante
'ue la obtenida con cada uno de los mtodos por separado.
<sta tincin resa|ta deta||es de| c|top|asma como: la presencia
de &acuolas, gr3nulos o mucina y los distintos componentes del
fondo como el col3geno, la mucina... +ambin produce
metacromasia.
Tincin de May- Grnwald- Giemsa o de Pappenheim
..1 COLORACIONES E7TE4PORNEAS
*3pidas: imp en el diagnstico periGoperatorio:
U COLORACIN DE A!L DE !NNA:
U <n 4Ds
(onocroma !alteraciones nucleares%
U COLORACIN DE "IE#$A:
Alco"ol metlico puro de 4G5min V Hiemsa 5 min
U COLORACIONE$ %I&ALE$ CON RO'O NE!&RO AL
()(***+(),**
U COLORACIN %I&AL CON A!L DE #E&ILENO AL (-
AAI
+cnicas "isto'umicas pueden ser
aplicadas a la citologa para la
in&estigacin del glucgeno por el
carmn de Best o el yodo, la
coloracin de mucopolisac3ridos, las
fosfatasas, las grasas, los 3cidos
desoxirribonucleicos y los
ribonucleicos
..# COLORACIONES ESPECIALES: TINCIN
CON ANARAN6ADO DE ACRIDINA
I|uorescenc|a ro[a de| CI1CLASMA DL LAS CLLULAS CANCLkCSAS por su r|queza en ADN.
(aterial fresco o fi/ado.
-olucin madre: Naran/a de acridina al >.4@
-e diluye una parte de dic"a solucin en un tampn de fosfato 404D(
-e necesita una diferenciacin de la fluorescencia del A*N con una disolucin acuosa de CaCl5
)i/acin tras la extensin: durante DG4> minutos en alco"ol o alco"olGter !No formol%
roced|m|ento tcn|co.
1. n|dratac|n del frotis con pases de alco"ol.
5. Aplicacin del colorante de anaran/ado de acridina.
7. La&ado con solucin de tampn fosfato.
4. D|ferenc|ac|n de los nAcleos con la solucin de
cloruro c3lcico "asta 'ue los nAcleos de los di&ersos
tipos apare#can de una coloracin &erde clara
transparente.
D. Las preparaciones son la&adas nue&amente con
tampn fosfato y montadas en "Amedo ba/o un
cubre.
F. Obser&ar al m|croscop|o de f|uorescenc|a.
L(7 (A-+OC,+O- <N NA*ANLA
/. ASPECTOS BSICOS SOBRE LA
INTERPRETACIN DE E7TENSIONES EN
CITOLOGA
.uesta a punto del microscopio.
:etenida lectura de los datos aportados en la "o/a de peticin.
,dentificar el origen de la muestra cuando esta no est consignada.
<xaminar el porta detenidamente y en toda su extensin "aciendo
un barrido del mismo tal como se indica en la imagen y subiendo
los aumentos cuando sea preciso &er con m3s detalle una
determinada #ona de la preparacin.
SLALAk LCS nALLA2GCS DL IN1LkLS:
Aspecto general del extendido:
)ondo y la disposicin de las clulas !aisladas, agrupadas...%
+ama?o y forma celular
Coloracin ad'uirida por la clula, estructuras, cantidad y relacin N0C
Caractersticas del nAcleo !nAmero, forma, tama?o, membrana,
situacin y relacin con el nucleolo%.
Los "alla#gos de inters se deben se?alar para poder locali#arlos con
posterioridad. .ara ello se usa un l3pi# o kC1ULADCk o bien los
ob/eti&os marcadores especiales o el NCNIUS.
"ttp:00111.youtube.com01atc"W&RyB52n1iyX's
Citologa de mama
PAAF