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Dezembrc, 2003

TransIcrmac de P|antas
MihisIrio da AgriculIura,
Pecuaria e AbasIecimehIo
Documentos 102
Transformao de Plantas
Planaltina, DF
2003
ISSN 1517-5111
Dezembro, 2003
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria
Embrapa Cerrados
Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento
Solange Rocha Monteiro de Andrade
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1
a
edio
1
a
impresso (2003): tiragem 100 exemplares
Todos os direitos reservados.
A reproduo no-autorizada desta publicao, no todo ou em
parte, constitui violao dos direitos autorais (Lei n 9.610).
CIP-Brasil. Catalogao na publicao.
Embrapa Cerrados.
Embrapa 2003
Andrade, Solange Rocha Monteiro de.
Transformao de plantas / Solange Rocha Monteiro de Castro.
Planaltina, DF : Embrapa Cerrados, 2003.
28 p. (Documentos / Embrapa Cerrados, ISSN 1517-5111; 102)
1. Melhoramento vegetal. 2. Transformao de plantas.
3. Transformao gentica. I. Ttulo. II. Srie.
631.5233 - CDD 21
A553t
Autora
Solange Rocha Monteiro de Andrade
Bil., Doutora em Gentica e Melhoramento de Plantas
Embrapa Cerrados
solange@cpac.embrapa.br
Apresentao
A transformao de plantas uma ferramenta com alto potencial para aplicao
no melhoramento vegetal e em outras reas, como na medicina e na nutracutica.
Os mtodos de transformao permitem a obteno de cultivares com novas
caractersticas, nem sempre possveis de serem alcanadas por mtodos
convencionais.
Alguns exemplos de cultivares com essas caractersticas so o milho e o algodo
Bt, resistentes aos insetos; a soja RR, tolerante ao herbicida glifosato; o arroz
dourado, com maior contedo de -caroteno, visando diminuir a deficincia de
vitamina A. Todos esses materiais j esto disponveis aos produtores.
Entretanto, as pesquisas continuam e novos transgnicos esto sendo
desenvolvidos contendo outras caractersticas como melhoria da qualidade
nutricional e produo de biofrmacos.
A polmica a respeito das plantas transgnicas ocorre, principalmente, devido ao
desconhecimento da populao sobre o assunto. A publicao de documentos
relativos a transgnicos evidenciando os mtodos e suas aplicaes
fundamental para informar a populao e diminuir essa polmica. A Embrapa,
com a publicao dos livros Cultura de Tecidos e Transformao Gentica de
Plantas, tem ajudado nesse sentido. No entanto, ainda existe a necessidade de
publicaes de carter mais bsico, visando atingir o pblico leigo, mas curioso
sobre o assunto.
Esta publicao teve como objetivo apresentar os conceitos bsicos da
transformao de plantas, explicando cada um deles de forma clara e concisa,
alm de descrever cada etapa do processo, sua aplicao e a utilizao de
transgnicos no mundo.
Roberto Teixeira Alves
Chefe-Geral da Embrapa Cerrados
Sumrio
Introduo .................................................................................... 9
Etapas da Transformao .............................................................. 10
Identificao, clonagem e isolamento do gene ............................... 10
Mtodos de Transformao ........................................................... 13
Transformao indireta ............................................................. 13
Transformao via Agrobacterium.......................................... 13
Transformao direta ............................................................... 16
Biolstica ............................................................................ 16
Eletroporao ..................................................................... 19
Outras metodologias ............................................................ 20
Microinjeo....................................................................... 20
Transformao de Plen ....................................................... 21
Lipossomos ........................................................................ 21
Histrico da Comercializao de Transgnicos no Mundo ..................... 21
Aspectos Futuros ......................................................................... 23
Referncias Bibliogrficas .............................................................. 23
Abstract .................................................................................... 28
Transformao de Plantas
Solange Rocha Monteiro de Andrade
Introduo
Durante sculos o homem, por meio de cruzamentos intra-especficos, vem
manipulando geneticamente plantas para obter cultivares com caractersticas
superiores aos genitores. No entanto, os mtodos convencionais de
melhoramento apresentam limitaes como a ligao gnica, a incompatibilidade
sexual, alm de longos perodos de seleo para a obteno da expresso da
caracterstica desejada. O desenvolvimento de mtodos de transformao gerou
possibilidades de grandes avanos no melhoramento vegetal, pois, oferece a
oportunidade de introduzir genes de origem vegetal, animal ou microrganismo
em cultivares elites, quebrando barreiras interespecficas impossveis no mtodo
convencional, diminuindo o efeito das ligaes gnicas e o tempo de obteno
de novas cultivares.
A transformao gentica a transferncia controlada de genes para o genoma
de um organismo vivo por via no sexual (TORRES et al., 2000). Pode-se
definir plantas transgnicas como aquelas que apresentam genes diferentes do
genoma original obtidos por tcnicas de engenharia gentica (GANDER;
MARCELLINO, 1997; TORRES et al., 2000). A obteno de plantas
transgnicas abre novo caminho a ser explorado no melhoramento vegetal e
tambm permite estudos de desenvolvimento e crescimento vegetal,
metabolismo, bioqumica, regulao e expresso de genes. As plantas
10
Transformao de Plantas
transgnicas podem ser utilizadas para extrao de produtos medicinais, vacinas
transgnicas e produo de anticorpos e metablitos de interesse especfico
(BRASILEIRO; DUSI, 1999).
As etapas de transformao consistem na identificao do gene de interesse, seu
isolamento e clonagem, introduo em clulas ou tecidos vegetais, seleo in
vitro de clulas transformadas, regenerao de plantas transgnicas, anlises
moleculares, avaliao em casa de vegetao e campo (Figura 1). Embora a
manipulao do DNA abra diversas frentes para o melhoramento, vrios fatores
podem afetar o sucesso da obteno das plantas transformadas, como: a
integrao do DNA no genoma hospedeiro, a expresso, a herana e a
estabilidade desse DNA exgeno; problemas de regenerao do explante;
disponibilidade de genes de interesse e aspectos relacionados biossegurana
(BRASILEIRO; DUSI, 1999).
Existem diversos mtodos de transformao, porm, a escolha depende da
espcie a ser transformada, do tipo de explante utilizado (clula, tecido,
protoplastos), da capacidade de regenerao do explante, da disponibilidade de
materiais. Entre os principais mtodos esto:
1) transformao mediada por Agrobacterium;
2) biolstica;
3) eletroporao.
Etapas da Transformao
Identificao, clonagem e isolamento do gene
A identificao e a localizao de genes de interesse na agricultura so um dos
entraves para a obteno de transgnicos. Programas de seqenciamento de
genomas de diversas espcies vegetais, animais e microrganismos tm sido
realizados em todo o mundo com o intuito de identific-los. No entanto, ainda
pequeno o conhecimento dos genes relacionados ao aumento de produtividade,
resistncia a estresses biticos e abiticos, qualidade nutricional e outras
caractersticas de interesse.
11
Transformao de Plantas
Figura 1. Etapas da transformao: Identificao dos genes, isolamento, clonagem,
transformao gentica e avaliao da transformao.
Identificao
do gene
de interesse
Isolamento
Clonagem
Enzimas de
restrio
Insero do
gene
Multiplicao
do gene
Transformao
Testes finais
Bactria incubada
com clulas vegetais
Transferncia do
gene para o
genoma da planta
insero do gene
no plasmdio Ti
DNA adsorvido em
Micropartculas
Clulas bombardeadas
e insero do gene
no genoma da planta
Clulas selecionadas
para o transgene
Clulas transformadas
selecionadas por
um marcador
Anlises
moleculares
Anlise
da prognie
Planta transgnica
regenerada de uma
clula transformada
Replicao do
gene
Agrobacterium
A
Bombardeamento
B
Seleo das clulas
contendo o
transgene
C
Gene de interresse
Testes em casa de
vegetao e no campo
1 2 3 5 6 7 8
12
Transformao de Plantas
Nesta primeira etapa (Figura 2) que precede clonagem (amplificao em
bactrias vetores), necessria uma srie de modificaes do gene antes que
seja utilizado por um mtodo de transformao. Nesse processo, empregam-se
tcnicas de engenharia gentica nas quais enzimas de restries e DNA ligases
so amplamente empregadas como ferramentas para manipular o DNA. Essas
enzimas so capazes de cortar o DNA de diferentes origens e, por meio da unio
dos fragmentos resultantes gerar molculas novas, denominadas de DNA
recombinante. Existe uma especificidade das enzimas de restrio, pois o DNA
sempre cortado em locais precisos (em determinada seqncia de bases), e
reconhece o stio de corte do DNA em qualquer espcie, tanto vrus, quanto
plantas ou animais (GANDER; MARCELLINO, 1997; DELU FILHO et al., 1999).
+
Enzimas de
restrio
Multiplicao do
plasmdio
Multiplicao da
bactria
Transformao da
bactria
Insero do
gene
Plasmdio
recombinante
Figura 2. Isolamento e
clonagem do gene.
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Transformao de Plantas
Geralmente, o gene assim obtido contm uma seqncia promotora o gene de
interesse uma seqncia terminadora e um gene marcador de seleo (Figura
3). A seqncia promotora necessria para a correta expresso do gene, pois
as enzimas responsveis pela transcrio do gene reconhecem essa regio e se
acoplam a ela para que ocorra o processo. A seqncia terminadora importante
para finalizar o processo de transcrio do gene. E, para seleo das clulas
transformadas, preciso um marcador de seleo, em geral, um gene de
resistncia a antibiticos ou a herbicidas.
Figura 3. Esquema da construo de um gene para transformao gentica.
Mtodos de Transformao
Transformao indireta
A transformao indireta consiste no uso de um vetor, como a Agrobacterium,
para intermediar a transferncia de DNA.
Transformao via Agrobacterium
As bactrias do gnero Agrobacterium so fitopatgenos com a capacidade
natural de transferir DNA para algumas espcies de dicotiledneas, induzindo a
formao de um tumor conhecido como galha-da-coroa (crown gall) ou a
sndrome da raiz em cabeleira (hairy root). Para haver a infeco necessrio
algum tipo de ferimento, por meio do qual a agrobactria vai reconhecer a planta
e iniciar a transferncia do DNA. Fitopatologistas descobriram que, mesmo
depois da desinfeco das plantas, os sintomas permaneciam, sugerindo a
presena de um fator determinante nas plantas infectadas. Mais tarde, esse fator
foi identificado como um fragmento do DNA oriundo da agrobactria,
denominado T-DNA ou DNA de transferncia. Esse fragmento era integrado ao
genoma vegetal e se expressava de maneira estvel. Assim, foi descoberto e, por
meio de manipulao gentica, desenvolvido o primeiro mtodo de
transformao (Figura 4) (CHILTON et al., 1977, 1982; HERRERA-ESTRELLA
et al., 1993; WHITE, 1993; BRASILEIRO, 1993; VAN SLUYS, 1999).
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Transformao de Plantas
Figura 4. Transformao por Agrobacterium.
Adaptado de Arago et al. (1998).
Plasmdios bacterianos so seqncias de DNA de fita dupla, com formato
circular, que apresentam duplicao autnoma e carregam alguns genes.
O T-DNA faz parte do DNA plasmidial da agrobactria e, por meio da engenharia
gentica, foi possvel sua manipulao para a integrao de genes de interesse.
Essa manipulao consiste, basicamente, na deleo dos genes oncognicos
(que causam o tumor) do T-DNA e a manuteno dos genes relacionados
transferncia e replicao do plasmdio, isto , a regio vir e as extremidades
do T-DNA. Com isso, produzem-se linhagens desarmadas, ou seja, ainda
virulentas, mas no mais patognicas. Assim, genes de interesse podem ser
introduzidos dentro da planta atravs de ligao com a regio desarmada do
T-DNA em substituio regio T-DNA original (CHILTON et al., 1977, 1982;
WALDEN et al., 1990; HOOYKAAS; BEIJERBERGEN, 1994; ZUPAN;
ZAMBRYSKI, 1995).
As bactrias da espcie Agrobacterium tumefaciens apresentam o plasmdio tipo
T
i
(tumor-inducing) e as da espcie Agrobacterium rhizogenes, o plasmdio R
i
(root-inducing). Tanto o plasmdio T
i
(pT
i
) quanto o R
i
(pR
i
) podem ser
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Transformao de Plantas
integrados ao genoma da planta, sendo o sistema pT
i
o mais conhecido e
efetivo, pois abrange maior nmero de espcies hospedeiras (BRASILEIRO,
1993; GANDER; MARCELLINO, 1997; VAN SLUYS, 1999).
Embora aparentemente simples, essa tcnica possui algumas limitaes. A
principal refere-se ao tipo de hospedeiro. A Agrobacterium pode colonizar amplo
espectro de espcies de dicotiledneas, porm, coloniza poucas espcies de
monocotiledneas. Mesmo entre as dicotiledneas, a susceptibilidade difere
muito entre as espcies e dentro delas, variando em funo da interao com o
hospedeiro. A razo dessa limitao no bem conhecida, mas pode ser devida
ausncia de stios de reconhecimento para a bactria na superfcie da planta ou
inibio da induo dos genes de transferncia (genes vir), ou ao efeito inibitrio
do balano hormonal de auxinas e citocininas das monocotiledneas (GRANT
et al., 1993). Portanto, uma etapa inicial importante para obteno de
transformantes por meio de Agrobacterium a determinao da melhor
combinao patgeno-hospedeiro para determinada espcie (DRAPER
et al., 1988; LACORTE; MANSUR, 1993).
Estudos mais recentes relatam a susceptibilidade de espcies consideradas
recalcitrantes Agrobacterium, como: o milho, o arroz e o feijoeiro
(BRASILEIRO; LACORTE, 1998). Segundo Trick e Finer (1997), tanto a bactria
quanto o tecido-alvo podem ser manipulados para obter a transformao dessas
plantas. Modificaes no vetor binrio da Agrobacterium capacitaram a
transformao eficiente do arroz e do milho. A adio de antioxidantes no meio
de co-cultivo aumentou as taxas de transformao pela reduo da resposta
hipersensvel, assim como, diferentes mtodos de ferimento do tecido-alvo
tambm tm sido empregados para aumentar a infeco por Agrobacterium
(GODWIN et al., 1992; SONGSTAD et al., 1995).
Havendo interesse em ajustar a interao entre Agrobacterium e um hospedeiro
no qual no existem descries prvias de transferncia do T-DNA, deve-se levar
em considerao os seguintes fatores: a) cepa da bactria; b) gentipo do
hospedeiro e fisiologia do explante; c) condies de co-cultivo; d) marcadores de
seleo utilizados. Parmetros-chave para a transferncia por Agrobacterium
incluem o gentipo da bactria e da planta; tratamento com indutores dos genes
vir (acetoceringona, extrato de clulas feridas, clulas alimentadoras, acares),
pH, temperatura, concentrao das clulas, condies de luminosidade, durao
do tempo de co-cultivo, tipo de explante, qualidade da pr-cultura, tratamento
com fito-hormnios (GODWIN et al., 1992; GRANT et al., 1993; BIRCH,
1997).
16
Transformao de Plantas
Outro ponto limitante da tcnica a capacidade de regenerao do tecido
transformado. A eficincia da transferncia via Agrobacterium varia drasticamente
para diferentes espcies vegetais, cultivares ou tecidos. freqente obter
culturas de clulas in vitro com alta capacidade de transformao, porm, elas
no so competentes, isto , no so capazes de regenerar novas plantas. Como
exemplo, podem-se citar clulas derivadas de protoplastos ou suspenses bem
estabelecidas de cultura celular de tecido. Essa ampla variao na eficincia pode
ser devida ao regime de cultura de tecido, s condies nas quais as plantas
esto crescendo ou mesmo cepa de Agrobacterium utilizada (DRAPER et al.,
1988; HOOYKAAS, 1995).
Por fim, o tamanho e a complexidade do plasmdio T
i
tambm interferem nessa
capacidade de transformao. Genes destinados transferncia so,
primeiramente, manipulados in vitro e, em seguida, incorporados em um simples
plasmdio transportador (sistema co-integrativo) ou, num plasmdio mais
complexo e sofisticado e com maior limite de hospedeiros (sistema binrio)
(DRAPER et al., 1988).
No entanto, as vantagens relacionadas habilidade natural da Agrobacterium em
transferir seqncias definidas de DNA podem ser exploradas com o intuito de
desenvolver novas variedades de plantas transformadas. Alm do mais, depois
da transformao e obteno de plantas adultas, os novos genes integrados ao
genoma hospedeiro so transmitidos s prognies seguindo uma herana
mendeliana.
Transformao direta
Com o intuito de obter mtodos de transformao independentes do gentipo,
vrias tcnicas de transferncia direta de DNA foram desenvolvidas. A
transformao direta consiste no uso de mtodos qumicos ou fsicos e,
atualmente, as duas principais so a biolstica e a eletroporao.
Biolstica
A biolstica tambm conhecida como gene gun (arma de genes), acelerao de
partculas ou bombardeamento com micropartculas (CHRISTOU, 1992; DE
BLOCK, 1993; BIRCH, 1997). O mtodo descrito pelo grupo do Dr. Sanford da
Universidade de Cornell (KLEIN et al., 1987; SANFORD et al., 1987), consiste
em bombardear clulas ou tecidos com micropartculas de tungstnio ou ouro
carregando o DNA exgeno, lanadas a partir de um acelerador e por meio de
uma cmara especial em condio de vcuo (Figura 5). O mecanismo visa
penetrar na parede celular e na membrana plasmtica as duas principais barreiras
transferncia direta de DNA (SANFORD, 1990).
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Transformao de Plantas
Figura 5. Transformao por bombardeamento de micropartculas.
A: Desenho esquemtico do aparelho de bombardeamento por presso de gs;
B: Protocolo de transformao por bombardeamento de micropartculas.
Adaptado de Arago et al. (1998).
A
Tubo de acelerao de gs
Disco de ruptura
Membrana carreadora
Tela de reteno
micropartculas adsorvidas com DNA
Tecido-alvo
Suporte da placa
Fonte de explante
Planta transgnica
em casa de vegetao
Explantes
Bombardeamento
com micropartculas
com DNA adsorvido
Co-cultivo em
meio slido
Meio de induo de brotos
com agentes de seleo
Meio de enraizamento
B
d
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Transformao de Plantas
As micropartculas (0,2 a 4 mm de dimetro) cobertas com seqncias de cidos
nuclicos a velocidades superiores a 1.500 km.h
-1
penetram na parede e na
membrana celular de maneira no letal, localizando-se aleatoriamente nas
organelas celulares. Uma vez dentro da clula, o DNA precipitado sobre as
partculas dissociado delas atravs da ao do lquido celular e integrado ao
genoma do organismo a ser modificado (POTRYKUS, 1990; SANFORD, 1990;
RECH; ARAGO, 1998).
O processo consiste numa fonte que produz uma onda de choque para acelerar
as partculas. Essa onda pode ser gerada por exploso qumica (plvora seca),
descarga de hlio a alta presso ou pela vaporizao de uma gota de gua
(SANFORD et al., 1987; SANFORD et al., 1991; CHRISTOU, 1995).
Diferentes sistemas foram desenvolvidos com intuito de acelerar as partculas; no
entanto, os sistemas que utilizam gs hlio sob alta presso e descarga eltrica
tm demonstrado maior eficincia na obteno dos transformantes (RECH;
ARAGO, 1998; LACORTE et al., 1999).
Nesse processo efetivo e simples, podem-se bombardear embries, hipoctilos,
cotildones, discos foliares, calos ou suspenses celulares. Virtualmente,
qualquer tipo de clula ou tecido pode ser utilizado para transformao. ,
tambm, um mtodo til na introduo e expresso de genes em animais in vivo,
e na induo da resposta imune utilizando DNA, por meio do processo deno-
minado imunizao gentica (RECH; ARAGO, 1998; LACORTE et al., 1999).
A grande vantagem da biolstica que ela permite a transformao de clulas,
tecidos e espcies de forma direta, simples e rpida, sendo aplicvel para
transferncia de genes a espcies em que os outros mtodos so falhos. A
eficincia na obteno de transformantes estveis cerca de 1 a 5% dos
transformantes transientes (SANFORD, 1990; POTRYKUS, 1990).
O explante bombardeado tem de ser criteriosamente selecionado. Para isso
utiliza-se um gene-reprter que possa ser facilmente detectado. Esse cuidado
deve ser tomado, pois, s vezes, so obtidas quimeras dos genes introduzidos
devido ao bombardeamento randmico de um pequeno nmero de clulas num
sistema mltiplo (SANFORD, 1990). Outra desvantagem refere-se ao nmero de
cpias, pois freqente a integrao de cpias mltiplas, em geral, fortemente
ligadas. Essas cpias podem estar fragmentadas com os genes e vetores em
19
Transformao de Plantas
diferentes posies no genoma, o que pode alterar ou silenciar a expresso dos
genes exgenos (SANFORD, 1990; DE BLOCK, 1993).
Eletroporao
A eletroporao um mtodo desenvolvido como alternativa transformao via
Agrobacterium, foi inicialmente proposto para transformao de cereais e,
posteriormente, a metodologia foi extendida a outras espcies vegetais. Esse
mtodo consiste no emprego de pulsos eltricos curtos de alta voltagem que
modificam, temporariamente, a estrutura da membrana plasmtica, induzindo a
formao de poros ao longo de sua superfcie. Dessa maneira, possvel
aumentar a permeabilidade da membrana, possibilitando a entrada do gene
exgeno (Figura 6) (LINDSEY; JONES, 1990; POTRYKUS, 1990;
SONGSTADT et al., 1995; JONES, 1995).
A carga imposta sobre a membrana plasmtica resulta em foras eletrostticas
que levam compresso e formao de poros nessa membrana. Aumentando a
fora do campo, observa-se sua formao primeiramente no equador do
protoplasma. O nmero e o tamanho dos poros podem aumentar at as
membranas estarem irreversivelmente danificadas. No entanto, as condies de
eletroporao precisam ser escolhidas de modo que a formao de poros seja
reversvel e haja recuperao dos protoplastos depois do tratamento (JONES,
1995).
Figura 6. Transformao por eletroporao.
20
Transformao de Plantas
Os parmetros timos de qualquer tipo particular de protoplasto so
determinados empiricamente e dependem do dimetro; qualidade (sobrevivncia
a altas voltagens, fase do ciclo da clula); fonte (por exemplo, clulas do
mesfilo ou de uma suspenso celular); meio de eletroporao (pH,
condutividade eltrica, poder do tampo); estado fisiolgico e composio da
membrana; forma do DNA introduzido (superenrolado, lineares ou relaxados); e
do plasmdio utilizado. Em geral, o nmero de pulsos eltricos consecutivos a
ser administrado, bem como sua intensidade e durao devem inviabilizar 50%
das clulas (DL50), pois, assim considera-se que dessa maneira a formao dos
poros e a absoro de material exgeno seriam maximizadas (JONES, 1995).
Na eletroporao possvel introduzir molculas de vrios tamanhos em
protoplastos ou clulas intactas, como por exemplo, DNA e RNA. Alm disso,
esse mtodo, pode ser utilizado para a extrao de metablitos secundrios de
uma suspenso celular (POTRYKUS, 1990).
As limitaes referentes a esse mtodo so: obteno de protoplastos,
regenerao do material transformado, tampo de transferncia que pode afetar a
eficincia da transferncia do gene, bem como a sobrevivncia do protoplasto
(POTRYKUS, 1990). No entanto, os mtodos esto sendo aprimorados para
transformao de clulas intactas ou digeridas parcialmente. A parede celular,
embora no impea a permeabilidade da membrana uma barreira para as
molculas maiores que 5 kb (LINDSEY; JONES, 1990).
Outras metodologias
Microinjeo
A microinjeo um processo preciso e especfico para a introduo de
macromolculas dentro de uma clula ou compartimentos especficos dela, de
maneira no letal. As clulas podem estar intactas ou desprovidas parcial ou
totalmente de suas paredes celulares. Para introduo do material exgeno,
utilizam-se microscpio, micromanipuladores (micropipetas de vidro e
microseringas), cmara assptica que no sofra vibraes, com temperatura e
umidade relativa controlada (NEUHAUS; SPANGENBERG, 1990; POTRYKUS,
1990; NEUHAUS, 1995).
As principais vantagens do mtodo so: a introduo de macromolculas dentro
da clula ou de um compartimento celular de maneira precisa; a possibilidade de
controlar o volume introduzido na clula e a alta freqncia de transformao
21
Transformao de Plantas
(15% a 26%). A desvantagem do mtodo ser trabalhosa, requerer
instrumentos caros e grande habilidade de manuseio. um mtodo que consome
muito tempo, no sendo indicado quando se deseja um grande nmero de
transformantes. Por essa razo, a microinjeo pouco utilizada para
transformao vegetal (NEUHAUS; SPANGENBERG, 1990; POTRYKUS, 1990;
NEUHAUS, 1995; BRASILEIRO; DUSI, 1999).
Transformao de Plen
Por esse mtodo, o plen maduro embebido em soluo com DNA e efetua-se
a polinizao das flores femininas da planta. Detectam-se os transformantes logo
na fase inicial da plntula mediante o emprego de um gene marcador. Porm,
um mtodo de baixa eficincia, difcil de reproduzir e necessita mais estudos para
aumentar a eficincia (POTRYKUS, 1990; BRASILEIRO; DUSI, 1999).
Lipossomos
Esse mtodo baseia-se na utilizao de vesculas lipdicas artificiais como
veculos para introduo de partculas ou material exgeno dentro de
protoplastos. A vescula visa proteger o DNA que se encarrega do ataque de
endonucleases. O mtodo requer a digesto da parede celular e incubao desses
protoplastos com lipossomos na presena de agentes fusognicos como o PEG
ou o PVA com lavagem subseqente em elevado pH saturado em ons de clcio
(CABOCHE, 1990; BRASILEIRO; DUSI, 1999).
Embora parea haver maior dificuldade de incorporao de molculas maiores, o
mtodo pode ser empregado para encapsular e introduzir plasmdios e DNAs
recombinantes e RNA viral em protoplastos. No entanto, apresenta baixa eficin-
cia de transformao estvel (CABOCHE, 1990; BRASILEIRO; DUSI, 1999).
Histrico da Comercializao de
Transgnicos no Mundo
Em 1986, nos EUA e na Frana, foi liberado o primeiro teste em campo de um
vegetal transgnico. Era uma variedade de tabaco contendo um gene de
resistncia a herbicida (JAMES; KRATTIGER, 1996). A partir desse evento,
vrios pases iniciaram seus testes, em campo, com vegetais transgnicos e, no
perodo de 1986 a 1995, foram conduzidos 3500 testes, em 34 pases, com
56 culturas. A maioria dos estudos foi conduzida nos EUA, Canad, Frana,
Inglaterra, Holanda, Blgica, Argentina, Itlia, China, Alemanha, Austrlia, Chile e
22
Transformao de Plantas
Mxico. As principais culturas estudadas foram: milho, tomate, soja, canola,
batata e algodo, e as caractersticas introduzidas foram tolerncia a herbicida,
resistncia a insetos, qualidade de produtos e resistncia a vrus (JAMES;
KRATTIGER, 1996).
O primeiro pas a comercializar transgnicos foi a China quando liberou, no incio
dos anos 90, o plantio e a comercializao do tabaco resistente a vrus seguido
pelo tomate resistente a vrus (JAMES, 1997). O tomate longa vida (Flavr
Savr
TM
) da Calgene foi, em 1994, o primeiro transgnico aprovado
comercialmente nos EUA. Esse processo evoluiu rapidamente e, em 1996,
aproximadamente 2,8 milhes de hectares de sete culturas (tabaco, algodo,
soja, milho, canola, tomate, batata) estavam sendo plantados em seis pases
(USA, China, Canad, Argentina, Austrlia, Mxico) (JAMES, 1997).
Em 2003, a rea plantada com transgnicos foi de 67,7 milhes de hectares,
incluindo os trs milhes de hectares de soja plantados no Brasil; isso equivale
ao crescimento mundial de 40 vezes de 1996 a 2003 (Figura 7). O plantio
ocorre principalmente nos pases desenvolvidos, entretanto, est havendo
aumento substancial de plantio em pases em desenvolvimento (Figura 7). Dos
quatro principais pases produtores de OGMs (Figura 8) dois so industrializados
(EUA e Canad) e dois so pases em desenvolvimento (Argentina e China),
sendo que os pases em desenvolvimento foram responsveis pela ampliao de
cerca de 30% da rea plantada em 2003 (JAMES, 2003).
Figura 7. Crescimento do plantio de transgnicos no mundo de 1996 a 2003.
Fonte: Adaptado de James (2003).
23
Transformao de Plantas
Figura 8. Crescimento do plantio de transgnicos nos principais pases produtores.
Fonte: Adaptado de James (2003).
Aspectos Futuros
Os mtodos de transformao abrem novas fronteiras para o melhoramento de
plantas, uma vez que, permitem a reduo no tempo de obteno de variedades
com novas caractersticas, bem como a transferncia de caractersticas de
interesse entre espcies que, em geral, so sexualmente incompatveis. Em
outras palavras, as barreiras naturais entre as espcies podem ser derrubadas, o
que oferece a possibilidade de obter novas variedades na forma de plantas
transgnicas. Alm disso, possvel, com os mtodos da biologia molecular
moderna, isolar e manipular genes especficos, o que no acontece no
melhoramento clssico, em que o melhorista obrigado a trabalhar com genomas
inteiros.
Referncias Bibliogrficas
BIRCH, R. G. Plant transformation: problems and strategies for practical
application. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology,
Palo Alto, v. 48, p. 297-326, 1997.
BRASILEIRO, A. C. M. Biologia de Agrobacterium sp. ABCP Notcias, Braslia,
DF, v. 20, p. 2-6, 1993.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003
Ano
Total
USA
Argentina
Canad
China
H
e
c
t
a
r
e
s

(
m
i
l
h

e
s
)
24
Transformao de Plantas
BRASILEIRO, A. C. M.; DUSI, D. M. A. Transformao gentica de plantas.
In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. (Ed.). Cultura de tecidos e
transformao gentica de plantas: volume 2. Braslia, DF: Embrapa-SPI:
Embrapa-CNPH, 1999. p. 679-735.
BRASILEIRO, A. C. M.; LACORTE, C. Interao Agrobacterium-hospedeiro.
In: BRASILEIRO, A. C. M.; CARNEIRO, V. T. C. (Ed.). Manual de transformao
gentica de plantas. Braslia: Embrapa-SPI, 1998. p. 75-92.
CABOCHE, M. Liposome-mediated transfer of nucleic acids in plant protoplasts.
Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 79, p. 173-176, 1990.
CHILTON, M. D.; DRUMMOND, M. H.; MERLO, D. J.; SCIANKY, D.;
MONTOYA, A. L.; GORDON, M. P.; NESTER, E. W. Stable incorporation of
plasmid DNA into higher plants cells: the molecular basis of crown gall
tumorigenesis. Cell, Cambridge, v. 11, p. 263-271, 1977.
CHILTON, M. D.; TEPFER, D. A.; PETTIT, A.; DAVID, C.; CASSE-DELBART,
F.; TEMP, J. Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into genomes of the
host-plant root cells. Nature, London, v. 295, p. 432-434, 1982.
CHRISTOU, P. Genetic transformation of crops using microprojectile
bombardment. Plant Journal, Oxford, v. 2, p. 275-281, 1992.
CHRISTOU, P. Strategies for variety-independent genetic transformation for
important cereals, legumes and woody species utilizing particle bombardment.
Euphytica, Wagnigen, v. 85, p. 13-27, 1995.
DE BLOCK, M. The cell biology of plant transformation: current state, problems,
prospects and the implications for the plant breeding. Euphytica, Wagnigen,
v. 17, p. 1-14, 1993.
DELU FILHO, N.; CASCARDO, J. C. M.; FONTES, E.P.B. Clonagem molecular e
isolamento de genes de plantas. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J.
A. (Ed.). Cultura de tecidos e transformao gentica de plantas: volume 2.
Braslia: Embrapa-SPI: Embrapa-CNPH, 1999. p. 653-677.
DRAPER, J.; SCOTT, R.; KUMAR, A.; DURY, G. Transformation of plants cells
by DNA-mediated gene transfer. In: DRAPER, J. et al. (Ed). Plant genetic
transformation and gene expression: a laboratory manual. Oxford: Blackwell
Scientific, 1988. p. 161-198.
GANDER, E. S.; MARCELLINO, L. H. Plantas transgnicas. Biotecnologia:
Cincia e Desenvolvimento, Braslia, DF, v. 1, n. 1, p. 34-37, 1997.
25
Transformao de Plantas
GODWIN, I. D.; FORDLLOYD, B. V.; NEWBURY, H. J. In vitro approaches to
extending the host-range of Agrobacterium for plant transformation. Australian
Journal of Botany, Victoria, v. 40, p. 751-763, 1992.
GRANT, J. E.; DOMMISSE, E. M.; CRHISTEY, M. C.; CONNER, A. J. Gene
transfer to plants using Agrobacterium. In: MURRAY, D. R. (Ed.). Advanced
methods in plant breeding and biotechnology. Oxon: CAB. International, 1993.
v. 4, p. 50-73.
HERRERA-ESTRELLA, L.; DEPICKER, A.; Van MONTAGU, M.; SCHELL, J.
Expresion of chimeric genes transfered into plant cells using Ti-plasmid derived
vector. Nature, London, v. 303, p. 209-213, 1993.
HOOYKAAS, P. J. J. Introduction I: Agrobacterium tumefasciens, a natural
vector system. In: POTRYKUS, I.; SPANGENBERG, G. (Ed.). Gene transfer to
plants. Berlim: Springer-Verlag, 1995. p. 3-4.
HOOYKAAS, P. J. J.; BEIJERBERGEN, A. G. M. The virulence system of
Agrobacerium tumefaciens. Annual Review of Phytopathology, Palo Alto, v. 32,
p. 157-179, 1994.
JAMES, C. Global status of transgenic crops in 1997: ISAAA Briefs n. 5.
Ithaca: ISAAA, 1997. p. 31.
JAMES, C. Preview: status of transgenic crops in 2003. ISAAA Briefs n. 30.
Ithaca: ISAAA, 2003. p. 26.
JAMES, C.; KRATTIGER, A. F. Global review of the field testing and
commercialization of transgenic plants: 1986 to 1995: the first decade of crop
biotechnology: ISAAA Briefs n. 1. Ithaca: ISAAA, 1996. p. 31.
JONES, M. G. K. Electroporarion-mediated gene transfer to protoplast an
regeneration of transgenic plants. In: POTRYKUS, I.; SPANGENBERG, G. (Ed.).
Gene transfer to plants. Berlim: Springer-Verlag, 1995. p. 88-92.
KLEIN, T.M.; WOLF, E. D.; WU, R.; SANFORD, J. C. High-velocity
microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature, London,
v. 327, p. 70-73, 1987.
LACORTE, C.; ARAGO, F. J. L.; VAINSTEIN, M. H.; RECH, E. L. Biobalstica.
In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. (Ed.). Cultura de tecidos e
transformao gentica de plantas: volume 2. Braslia: Embrapa-SPI: Embrapa-
CNPH, 1999. p. 761-781.
26
Transformao de Plantas
LACORTE, C.; MANSUR, E. Transferncia de genes atravs de Agrobacterium
tumefaciens: avaliao de compatibilidade patogeno-hospediero. ABCP Notcias,
Braslia, v. 21, p. 2-7, 1993.
LINDSEY, K.; JONES, M. G. K. Electroporation of cells. Physiologia Plantarum,
Copenhagen, v. 79, p. 168-172, 1990.
NEUHAUS, G. Introduction V: microinjection into plant cells: methodology and
applications. In: POTRYKUS, I.; SPANGENBERG, G. (Ed.). Gene transfer to
plants. Berlim: Springer-Verlag, 1995. p. 173-175.
NEUHAUS, G.; SPANGENBERG, G. Plant transformation by microinjection
techniques. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 79, p. 213-217, 1990.
POTRYKUS, I. Gene transfer to plants: assessment and perspectives.
Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 79, p. 125-134, 1990.
RECH, E. L.; ARAGO, F. J. L. Biolstica. In: BRASILEIRO, A. C. M.;
CARNEIRO, V. T. de C. (Ed.). Manual de transformao gentica de plantas.
Braslia, DF: Embrapa-SPI, 1998. p. 51-64.
SANFORD, J. C. Biolistic plant transformation. Physiologia Plantarum,
Copenhagen, v. 79, p. 206-209, 1990.
SANFORD, J. C.; DEVIT, M. J.; RUSSEL, J. A.; SMITH, F. D.; HARPENDING,
P. R.; ROY, M. K.; JOHNSTON, S. A. An improved, helium-driven biolistic
device. Technique, v. 3, p. 13-16, 1991.
SANFORD, J. C.; KLEIN, T. M.; WOLF, E. D.; ALLEN, N. Dellivery of
substances into cells tissues using a particle bombardment process. Particulate
Science Technology, v. 5, p. 27-37, 1987.
SONGSTAD, D. D; SOMERS, D. A.; GRIESBACH, R. J. Advances in alternative
DNA delivery techniques. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Hague, v. 40,
p. 1-15, 1995.
TORRES, A. C.; FERREIRA, A. T.; S, F. G.; BUSO, J. A.; CALDAS, L. S.;
NASCIMENTO, A. S.; BRGIDO, M. M.; ROMANO, E. Glossrio de
biotecnologia vegetal. Braslia: Embrapa-CNPH, 2000. p. 128.
TRICK, H. N.; FINER, J. J. SAAT: sonication-assisted Agrobacterium-mediated
transformation. Transgenic Research, Philadelphia, v. 6, p. 329-336, 1997.
27
Transformao de Plantas
VAN SLUYS. Agrobacterium: um vetor natural para transformao em plantas.
In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. (Ed.). Cultura de tecidos e
transformao gentica de plantas: volume 2. Braslia: Embrapa-SPI: Embrapa-
CNPH, 1999. p. 737-759.
WALDEN, R.; KONCZ, C.; SCHELL, J. The use of gene vectors in plant
molecular biology. Methods in Molecular and Cellular Biology, New York, v. 1,
p. 175-194, 1990.
WHITE, F. F. Vectors for gene transfer in higher plants. In: KUNG, S.; WU, R.
(Ed.). Transgenic plants: engineering and utilization. San Diego: Academic Press,
1993. p. 15-48, v. 1.
ZUPAN, J. R.; ZAMBRYSKI, P. Transfer of T-DNA from Agrobacterium to the
plant cell. Plant Physiology, Bethesda, v. 107, p. 1041-1047, 1995.
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Transformao de Plantas
Plant Transformation
Abstract During centuries mankind manipulate plants to obtain cultivars with
superior characteristics. However, conventional methods of plant breeding
present limitations. The development of transformation methods created
possibilities of great progresses in plant breeding because it offers the
opportunity to introduce exogenous genes into superior cultivars to obtain new
varieties. Genetic transformation is the controlled transfer of genes to the target
organism using non sexual methods. Transgenic plants can be defined as those
that present genes different from the original genoma obtained by techniques of
genetic engineering. The transformation stages consist of the identification
isolation, cloning and introduction of the gene into the cells. There are several
transformation methods, and the choice depends on the species to be
transformed, the type of the explant (cell, tissue, protoplasts) and the capacity of
explant regeneration. Among the principal methods are: 1) transformation
mediated by Agrobacterium; 2) biolistic; 3) eletroporation.
Index terms: Agrobacterium, plant transformation, transgenic, biolistic,
eletroporation.

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