Citometra de flujo

Anlisis de una muestra de agua marina conteniendo picoplancton fotosinttico por medio de citometra
de flujo mostrando tres poblaciones diferentes (Prochlorococcus, Synechococcus, ypicoeucariotas)
La citometra de flujo es una tecnologa biofsica basada en la utilizacin de luz lser,
empleada en el recuento y clasificacin de clulas segn sus caractersticas morfolgicas,
presencia debiomarcadores, y en la ingeniera de protenas. En los citmetros de flujo, las
clulas suspendidas en un fluido atraviesan un finsimo tubo transparente sobre el que
incide un delgado rayo de luz lser, la luz transmitida y dispersada por el pasaje de las
clulas a travs del tubo se recoge por medio de unos dispositivos de deteccin,
permitiendo hacer inferencias en cuanto a tamao y complejidad de las clulas. Tambin
permite el anlisis multiparamtrico simultneo de otras caractersticas fsicas y qumicas,
evaluando en promedio ms de dos mil partculas por segundo.
La citometra de flujo es una tcnica utilizada en forma rutinaria en muchos centros de
salud para el diagnstico y seguimiento de muchas enfermedades tales como
las leucemias, granulomatosis crnica, ySIDA; sin embargo tiene muchsimas otras
aplicaciones en investigacin bsica, prctica y ensayos clnicos. Una variante comn de
esta tcnica es la separacin fsica de partculas segn sus propiedades, emplendose por
ejemplo para purificar poblaciones de inters.
ndice
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1 Historia
o 1.1 Origen del nombre de la tcnica
2 Principio
3 Citmetros de flujo
4 Anlisis de datos
o 4.1 Gating
o 4.2 Anlisis computacional
5 Clasificacin de clulas activadas por fluorescencia
6 Marcadores
o 6.1 Marcadores fluorescentes
o 6.2 Puntos cunticos
o 6.3 Marcado isotpico
7 Parmetros usualmente medidos
8 Aplicaciones
9 Vase tambin
10 Bibliografa
11 Referencias
12 Enlaces externos
Historia[editar]
El primer citmetro de flujo basado en la medicin de impedancia, es decir utilizando
el principio Coulter, fue descrito en la patente de Estados Unidos N 2.656.508, expedida
en 1953 a nombre de Wallace H. Coulter. Mack Fulwyler fue el inventor del precursor de
los citmetros de flujo actuales, en particular del tipo separador de clulas.
1
El primer
dispositivo de citometra de flujo basado en fluorescencia (ICP 11) fue desarrollado en
1968 por Wolfgang Ghde de la Universidad de Mnster, y declarado en la patente de
Alemania N 1815352 el 18 de diciembre de 1968.
2
Y comercializado por primera vez en
los aos 1968 y 1969 por la empresa alemana Partec encargada del desarrollo y
produccin a travs de Phywe AG enGttingen. En aquel tiempo los mtodos de absorcin
electromagntica tenan el favor de la comunidad cientfica por sobre los mtodos
fluorescentes.
3
Poco tiempo despus comenz el desarrollo comercial de los citmetros de
flujo, incluyendo elcitofluorgrafo (1971) de la empresa Bio/Physics Systems Inc. (ms
tarde Ortho Diagnostics), el PAS 8000 (1973) de la empresa Partec, y el primer dispositivo
FACS de Becton Dickinson (1974), el ICP 22 (1975) de Partec/Phywe y el Epics de la
Coulter Corporation en 1977/78.
Origen del nombre de la tcnica[editar]
El nombre original de la citometra de flujo era "citofotometra de pulso"
(en Alemn: Impulszytophotometrie), que fue el nombre publicado en la primera patente de
aplicacin prctica de la citometra de flujo fluorescente. Recin en la 5. Conferencia
sobre Citometra Automatizada de la American Engineering Foundation realizada en
Pensacola, Florida en 1976 -ocho aos despus de la presentacin del primer citmetro de
flujo fluorescente (1968)- se acord utilizar el nombre de citometra de flujo, un trmino que
rpidamente gan popularidad.
4

Principio[editar]


Esquema de disposicin de elementos en un citmetro de flujo. Una fuente emisora de luz
monocromtica, usualmente un haz de luz lser (A) enva un rayo que es colimado (L1) y enfocado (L2)
por medio de lentes sobre la cmara de flujo laminar (C), luego de atravesar la cmara el rayo de luz
directa es detenido por una pantalla (s), mientras que la luz dispersada es enfocada por otra lente (L3)
sobre un fotodiodo (D1), esto constituye el detector de dispersin frontal (FSC). La luz dispersada
lateralmente y la fluorescencia se enfocan por medio de una lente sobre un espejo dicroico (M) que refleja
la mayor parte de la luz de igual longitud de onda a la producida por la fuente (A), atraviesa un filtro (F1) e
incide sobre un detector. Esto constituye el sistema de deteccin de dispersin lateral (SSC).La luz que
no es reflejada por el espejo dicroico, ya que tiene una longitud de onda diferente a la emitida, lo atraviesa
e incide sobre un filtro interferencial (F2) que puede ser ajustado para una determinada longitud de onda,
discriminando as entre diferentes fluorforos, para finalmente incidir sobre un tubo fotomultiplicador (D3),
esto constituye el detector lateral de fluorescencia (SFL).
Un rayo de luz monocromtico, usualmente de luz lser, es dirigido hacia un finsimo
chorro de lquido hidrodinmicamente enfocado. Se coloca una serie de detectores en el
punto en el que el chorro de lquido atraviesa el rayo de luz. Uno se coloca en lnea con el
rayo de luz (a este detector se lo conoce como FSC, por Forward Scatter o detector de
Dispersin Frontal), y varios angularmente a la trayectoria del rayo (a estos se los conoce
como SSC, por Side Scatter, o detectores de Dispersin Lateral); adems de uno o ms
detectores defluorescencia. Cada una de las partculas suspendidas con un tamao de
entre 0,2 a 150 micrmetros que atraviesan el rayo de luz lo dispersan, y las sustancias
qumicas fluorescentes que se encuentran dentro o adheridas a la partculas son excitadas
hasta emitir luz a una longitud de onda mayor que la de la fuente de luz. Esta combinacin
de de luz dispersada y fluorescencia es recogida por los detectores, y por medio de un
anlisis en la fluctuacin de la intensidad luminosa recogida por cada detector, es posible
derivar varios tipos de informacin acerca de la estructura fsica y qumica de cada
partcula individual.
El detector frontal o FSC brinda informacin acerca del volumen de la partcula, mientras
que los detectores laterales o SSC brindan informacin acerca de la complejidad interna
de la misma (por ejemplo la forma del ncleo celular, la cantidad y tipo de
grnuloscitoplasmticos o la rugosidad de la membrana plasmtica). Esto es debido a que
los componentes internos de las clulas dispersan la luz. Algunos de los citmetros de flujo
presentes en el mercado han eliminado la necesidad de un detector de fluorescencia y
utilizan tan slo la informacin de luz dispersada para las mediciones. Otros citmetros de
flujo son capaces de generar grficos de los datos obtenidos de la fluorescencia de las
clulas, luz dispersada y luz transmitida.


Aspecto del frente de un citmetro de flujo - en este caso se trata delFluorescence activated cell
sorter(FACSCalibur) de Becton-Dickinson
Citmetros de flujo[editar]
Los citmetros de flujo modernos son capaces de analizar varios miles de partculas por
segundo, en tiempo real, y pueden separar y aislar activamente partculas de acuerdo a
propiedades especficas. Un citmetro de flujo es en cierta forma similar a un microscopio,
salvo que, en vez de producir imgenes de las clulas, los citmetros de flujo ofrecen una
cuantificacin automtica de una serie de parmetros con altsima calidad. Para analizar
tejidos slidos es posible preparar en primera instancia una suspensin de clulas.
Un citmetro de flujo tiene cinco componentes principales:
La celda de flujo laminar, donde el lquido circulando en rgimen de flujo
laminaracarrea y pone en lnea a las clulas de modo que pasen a travs del rayo de
luz de a una y en fila.
Un sistema de medicin, los ms comnmente utilizados son la medicin de la
impedancia o conductividad (principio Coulter) y los sistemas pticos.
Un sistema de iluminacin formado ya sea por lmparas de alta luminosidad (de
mercurio, xenn) lseres de alta potencia refrigerados por agua (de argn, de criptn,
de tinturas), lseres de baja potencia refrigerados por aire (de argn 488 nm), lser
rojo de helio-nen ( 633 nm), verde de helio-nen, ultravioleta de helio-cadmio;
lseres de diodo de baja potencia (azul, verde, rojo, violeta).
Un detector y un conversor de seales ADC (anlogo a digital), los cuales registran la
seal producida (sea FSC, SSC, SFL) y la convierten en una seal elctrica que puede
ser procesada por un computador.
Un sistema de amplificacin, lineal o logartmico.
Un ordenador para el anlisis de las seales.
El proceso de recoleccin de datos a partir de las muestras utilizando un citmetro de flujo
es conocido como adquisicin. La adquisicin es mediada por un software presente en un
ordenador fsicamente conectado al citmetro de flujo. Este software es capaz de ajustar
varios parmetros de la medicin, tales como voltaje, compensacin, etc. para cada una
de las muestras analizadas, y adems se encarga de asistir a la presentacin inicial de la
informacin de la muestra mientras se realiza la adquisicin de los datos para asegurar
que los parmetros han sido correctamente ajustados. Los primeros citmetros de flujo
eran en su mayora, dispositivos experimentales, sin embargo los avances tcnicos desde
su origen han permitido que ahora tengan una gran cantidad de aplicaciones tanto clnicas
como de investigacin. Debido a estos desarrollos, se ha producido un considerable
mercado de instrumentos, software de anlisis, y reactivos utilizados tanto en la
adquisicin como en el marcado fluorescente con anticuerpos.
Los instrumentos modernos en general poseen mltiples lseres y detectores. El rcord
actual para un instrumento comercial es de cuatro lseres y 18 detectores de
fluorescencia. Al aumentar el nmero de lseres y detectores, es posible aumentar la
cantidad de anticuerpos fluorescentes utilizados para el marcado, y se hace posible
identificar con mayor precisin la poblacin de inters a travs de sus
marcadores fenotpicos. Algunos instrumentos pueden incluso tomar fotografas digitales
de cada clula, permitiendo analizar si la seal fluorescente se produce dentro o en la
superficie de la clula.
Anlisis de datos[editar]
Gating[editar]


Scatterplot de fluorescencia versus dispersin lateral, de una muestra de sangre entera, el programa ha
separado automticamente las poblaciones basndose en un algoritmo de proximidad a centroides. En
color cian se observa la poblacin de neutrfilos + basfilos, en magenta la de linfocitos, en
verde monocitos, en rojo la de eosinfilos y por debajo lasplaquetas y eritrocitos fantasma
Los datos generados por los citmetros de flujo pueden ser dibujados en relacin a una
variable, en forma de histograma, o en grficos de puntos (dot-plot) de dos dimensiones y
dos o ms variables, o incluso en grficos tridimensionales. Las regiones delimitadas en
estos grficos pueden ser separadas secuencialmente, de acuerdo con la intensidad de la
fluorescencia, para crear una serie de subgrupos llamados "gates" (portales). Existen
protocolos especficos para hacer la separacin en gates, proceso conocido como gating,
tanto para propsitos clnicos como diagnsticos, especialmente en relacin con
la hematologa.
Los grficos de citometra con frecuencia se hacen en funcin de escalas logartmicas. Ya
que los diferentes compuestos fluorescentes utilizados para hacer el marcado poseen
espectros de emisin que con frecuencia se solapan,
5
las seales recogidas por los
detectores deben ser compensadas tanto electrnica como computacionalmente. Los
datos acumulados por los citmetros pueden ser analizados utilizando diferentes
softwares, tales como por ejemplo WinMDI
6
(el nico que es freeware), Flowjo, FCS
Express, VenturiOne, CellQuest Pro, o Cytospec.
7
Una vez que se han recogido los datos,
no se hace necesario que la computadora siga conectada al citmetro, razn por la cual la
mayor parte de las veces el anlisis de datos se hace en otro ordenador. Esto se hace
especialmente necesario en instalaciones centrales donde la utilizacin de estas mquinas
se encuentra bajo alta demanda.
Anlisis computacional[editar]
Los progresos recientes en la identificacin automtica de poblaciones utilizando mtodos
computacionales ha ofrecido una alternativa a las estrategias tradicionales del gating. Los
sistemas automatizados de identificacin podran, potencialmente, ayudar a encontrar
poblaciones extremadamente pequeas, raras, y ocultas. Los mtodos automatizados ms
representativos incluyen al FLOCK
8
en Immunology Database and Analysis Portal
(ImmPort),
9
FLAME
10
GenePattern y flowClust,
11

12

13
en Bioconductor. Los esfuerzos
colaborativos han desembocado en un proyecto abierto llamado FlowCap (Flow Cytometry:
Critical Assessment of Population Identification Methods,
14
) de manera de proveer una va
alternativa para comparar y evaluar los datos obtenidos por los mtodos de agrupamiento
en citometra de flujo, adems de servir para establecer una gua para el uso y aplicacin
ms apropiados para estos mtodos.
Clasificacin de clulas activadas por fluorescencia[editar]

La tcnica de clasificacin de clulas activadas por fluorescencia FACS por sus siglas en
ingls (Fluorescence-Activated Cell Sorting) es un tipo especializado de citometra de flujo.
Esta tcnica provee un mtodo para la clasificacin y seleccin de clulas provenientes de
una mezcla de varias poblaciones en dos o ms contenedores de a una clula por vez,
segn las caractersticas particulares de dispersin y fluorescencia de cada clula. Es un
instrumento cientfico de gran utilidad ya que provee un mtodo de grabacin de datos
provenientes de las seales de fluorescencia de cada clula que es a la vez rpido,
objetivo y cuantitativo; adems permite la separacin fsica de aquellas clulas
pertenecientes a una poblacin de inters. El acrnimo FACS es una marca
registradaperteneciente a Becton, Dickinson and Company.
15
Entre la gran mayora de los
investigadores que utilizan esta tecnologa ya sea para la clasificacin o el anlisis, este
trmino ha pasado a ser genrico en el uso comn, al igual que xerox o kleenex. El
clasificador de clulas fue inventado por Mack Fulwyler en 1965, utilizando originalmente
el principio Coultercomo mtodo de recoleccin de datos, una tcnica relativamente difcil y
que ya casi no se utiliza en los instrumentos modernos. La tcnica fue ampliada luego por
Len Herzenberg, quien fue el responsable de acuar el trmino FACS.
16
Herzenberg gan
el Premio Kyoto en 2006 por su trabajo pionero en citometra de flujo.
La suspensin de clulas es arrastrada hacia el centro de una corriente de lquido
estrecha, que fluye rpidamente. El flujo est dispuesto de manera que existe una gran
separacin entre clulas en relacin con su dimetro. Un mecanismo de vibracin
ultrasnico provoca que la corriente de lquido conteniendo las clulas se rompa en
pequeas gotitas. El sistema se ajusta de modo que haya una baja probabilidad de que
ms de una clula quede contenida en cada gota. Justo antes de que la corriente se
rompa en gotitas, el flujo pasa a travs de una estacin de medicin de fluorescencia,
donde se mide el carcter fluorescente de inters de cada clula. Un anillo capaz de
adquirir una carga elctrica se coloca justo en el punto donde la corriente se rompe en
gotitas. Segn la medicin de la intensidad de fluorescencia recogida para cada clula, el
sistema entrega una determinada carga elctrica al anillo, como consecuencia las gotitas
se cargan elctricamente con un signo contrario al del anillo mientras se desprenden de la
corriente de lquido. Las gotitas cargadas luego caen a travs de un sistema de deflexin
electrosttica que desva las gotas en los contenedores dependiendo de su carga. En
algunos sistemas, la carga se aplica directamente a la corriente de lquido, y como
resultado la gotita que se desprende retiene carga del mismo signo que la aplicada. Luego
de que la gotita se desprende, el anillo recupera una carga neutra.
Marcadores[editar]
Marcadores fluorescentes[editar]
Artculo principal: Fluorforo
Se pueden utilizar un amplio rango de fluorforos como etiquetas para el marcado
fluorescente en citometra de flujo. Los fluorforos se encuentran por lo general
qumicamente unidos a anticuerpos especficos capaces de reconocer una determinada
molcula diana en la superficie o en el interior de la clula. Estas etiquetas fluorescentes
tambin pueden adosarse qumicamente a casi cualquier compuesto qumico que presente
una cierta afinidad por la membrana o alguna otra estructura celular. Cada fluorforo
posee un pico de excitacin caracterstico, y un longitud de onda de emisin tambin
caracterstica. Sin embargo los espectros de emisin de diferentes etiquetas con
frecuencia se superponen, por consiguiente, la combinacin de marcadores que pueden
ser usados depende de la longitud de onda de la lmpara(s) o del lser(es) usados para
excitar los fluorocromos y en los tipos de detectores que se encuentren disponibles.
17
El
nmero mximo de marcadores fluorescentes distinguibles se cree que se encuentra entre
17 o 18, y este nivel de complejidad requiere un laborioso proceso de optimizacin para
limitar los artefactos, as como complejos algoritmos de deconvolucinpara separar los
espectros solapados.
18

Marcadores fluorescentes de unin covalente: Isoticianato
de fluorescena, picoeritrina, rodamina, rojo texas,cianinas.
19

Marcadores fluorescentes de unin no covalente: Hoechst, DAPI, Naranja de
acridina, yoduro de propidio, rh12. Los marcadores fluorescentes son sensibles al medio
ambiente.
Puntos cunticos[editar]
A veces se utilizan puntos cunticos en lugar de los tradicionales fluorforos debido a que
poseen un pico de emisin mucho ms estrecho.
Marcado isotpico[editar]
Uno de los enfoques utilizados para soslayar el lmite de marcas fluorescentes utilizables,
es utilizar en su lugar istopos delantnidos adosados a los anticuerpos. Este mtodo
podra en teora, permitir el uso de entre 40 y 60 marcadores perfectamente distinguibles, y
ha sido demostrado hasta para 30 etiquetas distintas.
18
Las clulas son ionizadas por
medio de un chorro de plasma permitiendo de esta manera identificar los istopos
asociados por medio de espectrometra de masas de tiempo de vuelo. Aunque este
mtodo permite el uso de un mayor nmero de etiquetas, de hecho posee un menor
rendimiento que la citometra de flujo tradicional. Y adems destruye las clulas
analizadas, impidiendo de esta forma su recuperacin para un proceso de seleccin.
18

Parmetros usualmente medidos[editar]
Esta lista es realmente larga y se encuentra en continua expansin, por citar slo algunos
ejemplos:
Se utiliza para confirmar el diagnstico de leucemia linftica crnica
Volumen y complejidad morfolgica de clulas
Pigmentos biolgicos tales como la clorofila o ficoreritrina
Contenido total de ADN (anlisis del ciclo celular, cintica celular, proliferacin
celular, ploida, aneuploida,endoreduplicacin, etc.)
Contenido total de ARN
Variacin en el nmero de copias de ADN (por medio de la tecnologa Flow-FISH o
BACs-on-Beads)
Anlisis cromosmico y separacin (construccin de libreras, tincin de cromosomas,
etc)
Expresin y localizacin de protenas
Modificaciones proteicas, fosfoprotenas
Presencia de productos transgenicos in vivo, particularmente demostracin de la
presencia de laProtena verde fluorescente o protenas fluorescentes relacionadas
Antgenos celulares de superficie (Marcadores de diferenciacin en clsteres -
marcadores CD))
Varios antgenos intracelulares tales como citoquinas, mediadores secundarios, etc.)
Antgenos nucleares
Actividad enzimtica
pH, calcio inico intracelular, magnesio, potencial de membrana
fluidez de membrana
apoptosis (cuantificacin segn el grado de degradacin del ADN, potencial de
membrana mitocondrial, cambios en la permeabilidad, caspasas, etc
Viabilidad celular
Monitoreo de la electropermeabilizacin de clulas
Estallido respiratorio
Caracterizacin de la resistencia multidroga de clulas cancerosas
Glutatin
Varias combinaciones de ADN/antgenos de superficie
Adherencia celular (por ejemplo adherencia entre clulas hospedadoras y patgenas)
Aplicaciones[editar]
La tecnologa de la citometra de flujo tiene aplicaciones en numerosos campos,
incluyendo la biologa molecular,inmunologa, biologa vegetal y marina. Tiene una amplia
aplicacin en medicina, (especialmente en trasplantes, hematologa, inmunologa tumoral,
y quimioterapia, diagnstico prenatal, gentica y seleccin de esperma para
unapreseleccin de sexo). En biologa marina se ha explotado las propiedades
autofluorescentes del plancton fotosinttico para caracterizar abundancia y estructura
comunitaria. En ingeniera de protenas, se utiliza la citometra de flujo en conjuncin con
tcnicas de expresin en levaduras y expresin en bacterias, para identificar aquellas
protenas expresadas en la superficie celular que posean las caractersticas deseadas.
Vase tambin[editar]
Wikimedia Commons alberga contenido multimedia sobre Citometra de flujo.
Microscopa fluorescente
Citometra
Contador Coulter
Dielectroforesis
Bibliografa[editar]
Flow Cytometry First Principles by Alice Longobardi Givan. ISBN 0-471-38224-8
Practical Flow Cytometry by Howard M. Shapiro. ISBN 0-471-41125-6
Flow Cytometry for Biotechnology by Larry A. Sklar. ISBN 0-19-515234-4
Handbook of Flow Cytometry Methods by J. Paul Robinson, et al. ISBN 0-471-59634-5
Current Protocols in Cytometry, Wiley-Liss Pub. ISSN 1934-9297
Flow Cytometry in Clinical Diagnosis, v4, (Carey, McCoy, and Keren, eds), ASCP
Press, 2007. ISBN 0-89189-548-5
Ormerod, M.G. (ed.) (2000) Flow Cytometry A practical approach. 3rd
edition. Oxford University Press, Oxford, UK.ISBN 0-19-963824-1
Ormerod, M.G. (1999) Flow Cytometry. 2nd edition. BIOS Scientific Publishers,
Oxford. ISBN 1-85996-107-X
Flow Cytometry A basic introduction. Michael G. Ormerod, 2008. ISBN 978-0-
9559812-0-3