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Resumo
Os metabolitos secundrios das bactrias so uma importante fonte de
produtos naturais dotados de efeitos considerveis sobre a sade, nutrio e
economia das sociedades humanas. Estes compostos abrangem produtos
com utilidade e elevado valor econmico, que desempenham papis impor -
tantes e tm actividades biolgicas de relevo para a medicina e agricultura.
Os microrganismos dos ambientes extremos so especialmente valiosos
enquanto reservatrios de novos compostos bioactivos, uma vez que nestes
locais intocados se promove a existncia dum potencial gentico modelado
pela seleco natural s condies extremas prevalecentes, desenvolvendo
capacidades metablicas nicas. As tcnicas genmicas facilitam a triagem
de metabolitos bacterianos secun drios para a pesquisa de compostos com
interesse, como novas enzimas e antibiticos. Estes compostos tm um
relevo cada vez maior com agudizar de os problemas da resistncia
bacteriana e da necessidade de reduzir o impacto ambiental sem sacrificar o
desenvolvimento tecnolgico. As inds trias agroqumicas necessitam de
novos biocatalisadores que lhes permitam reduzir a concentrao de
compostos antinutricionais e melhorar a digesti bilidade nos alimentos
compostos para animais atravs da adio de enzimas (pectinases,
quitinases e amilases) que permitam a metabolizao completa dos
compostos resistentes digesto. H uma clara necessidade de coorde nar
desenvolvimento tecnolgico e sustentabilidade, um termo que abrange a
necessidade de reduzir o nosso impacto ambiental e lidera os esforos de
conservao ambiental. Os microrganismos que formam tapetes em grutas
lvicas e noutros ambientes extremos tm um enorme valor, at agora prati -
ca mente inexplorado, enquanto fontes de novos compostos bioactivos para
variados fins biotecnolgicos.
Cristina Riquelme
1
,
Antnio Louvado
1,2
e Maria de Lurdes Enes
Dapkevicius
1
mariaenes@uac.pt
1
CITA-A, Departamento de Cincias Agrrias
Universidade dos Aores
2
CESAM, Departamento de Biologia
Universidade de Aveiro
Revelar Tesouros do Patrimnio
Natural dos Aores:
Riqueza Gentica dos
Microorganismos
de Ambientes Extremos
Unravelling natural heritage treasures:
genetic wealth from extreme
environments microorganisms
Abstract
Bacterial secondary metabolites are a rich source of natural
products with major effect on the health, nutrition and
economics of our society. Microbial secondary metabolites
include an enormous range of useful high value products
playing important roles in medically and agriculturally relevant
biological activities. Microorganisms in extreme environments
are especially valuable as reservoirs of new bioactive
compounds for different biotechnological applications since
such pristine locations promote the existence of genes shaped
by natural selection under harsh conditions, developing
metabolic capabilities found nowhere else. Genomic
techniques facilitate the screening of bacterial secondary
metabolites of interest such as novel enzymes and antibiotics.
These compounds are gaining relevance because of two
acute problems in our society; the bacterial resistance to
antibiotics and the need to develop an environmentally
sustainable technological development. Novel biocatalysts for
industrial use in animal feed are a demand in agrochemical
industries to overcome one of their main problems, the
reduction of the anti-nutritional compounds and the
improvement of digestibility by adding enzymes to the animal
feed. Pectinases, chitinases and amylases allow the complete
metabolization of digestion-resistant compounds. There is, at
present, a clear need for a coordinated technology
development and sustainability, a term which covers the need
to reduce our environmental impact and could lead the efforts
in conservation. Microorganisms forming microbial mats in
caves, and in other extreme environments, are especially
valuable as an unexploited source of new bioactive
compounds for different biotechnological applications.
INTRODUO
A biotecnologia microbiana refere-se ao uso de micro -
organismos ou sistemas bioqumicos deles procedentes em
processos de produo de bens ou de prestao de servios.
Trata-se de uma rea muito extensa que encontra aplicao
numa ampla gama de segmentos industriais (Fig. 1). Os
principais produtos da biotecnologia so produtos da
indstria farmacutica (antibiticos, hormonas, vacinas,
antifngicos, antivirais, antitumorais e imuno-supressores), da
indstria de alimentos humanos e raes (aminocidos, fla -
vorizantes, polissacardeos e gomas xantana) e da indstria
qumica (etanol, acetona, butanol, glicerol, cido lctico, cido
ctrico, polisteres, inseticidas microbianos, algicidas).
A biotecnologia teve o seu primeiro uso comercial com a
produo de insulina humana. Os benefcios para a sade e a
economia desta nova forma de produo foram muito impor -
tantes. Passados 30 anos, pelo menos 50% dos novos
produtos que chegam ao mercado recorrem a pro ces sos
biotec no lgicos e tm origem na natureza. Um nmero signi -
ficativo de produtos naturais so produzidos por micror -
ganismos e essa rea de pesquisa de produtos naturais est
em expanso significativa (1).
Os metabolitos secundrios das bactrias so uma
importante fonte de produtos naturais dotados de efeitos
considerveis sobre a sade, nutrio e economia das socie -
dades humanas. Os microrganismos dos ambientes extremos
so especialmente valiosos enquanto reservat rios de novos
compostos bioactivos, uma vez que nestes locais intocados
se promove a existncia dum potencial gen tico modelado
pela seleco natural s condies extre mas prevalecentes,
desenvolvendo capacidades meta blicas que no se
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Fig. 1_ Setores industriais com enorme impacto da
Biotecnologia
encontram em mais lugar nenhum. A pesquisa de compostos
com interesse, como antibiticos e novas enzimas, tm um
relevo cada vez maior com o agudizar dos problemas da
resistncia bacteriana e da necessidade de reduzir o impacto
ambiental sem sacrificar o desenvolvimento tecnolgico. O
isolamento biogeogr fico, a acessibilidade aos locais com
condies extremas e a sua diversidade bacteriana imensa
fazem dos Aores um excelente cenrio para a pesquisa de
compostos de interesse.
O nosso objetivo geral foi verificar a presena de compostos
bioactivos derivados dos ambientes extremos dos Aores,
tendo em vista a purificao parcial dos mais interessantes ao
nvel de aplicabilidade industrial, dando assim os passos
iniciais para futuros desenvolvimentos na rea da biotec -
nologia pela indstria aoriana atravs do reforo da ligao
entre a indstria e a universidade (Figura 2).
Os objetivos especficos necessrios para consegui-lo so os
seguintes:
Escolher locais de amostragem de acordo com estudos
taxonmicos, privilegiando a existncia de uma grande
diversidade bacteriana, particularmente enriquecida com
alguns taxa j descritos como produtores de biocom postos.
Pesquisar compostos que possam servir para o desen -
volvimento de antibiticos em ambientes extremos vulc -
nicos dos Aores, em resposta s necessidades atuais
impostas pelo aumento da resistncia a antibiticos em
patgenos humanos.
Pesquisa de novos biocatalisadores que permitam s inds -
trias agroqumicas reduzir a concentrao de compostos
antinutricionais nos alimentos compostos para animais e
melhorar a digestibilidade.
Corroborar a necessidade de conservao dos ambientes
vulcnicos, com base na premissa de que eles podem ser
uma fonte de compostos teis para a comunidade.
METODOLOGIA
A metodologia a empregar encontra-se resumida na Fig. 3.
277 ACTAS DAS JORNADAS . 04 . CINCIAS DA VIDA E DA SADE
Fig. 2_ Principais intervenientes biotecnolgicos na
implementao de novos negcios.
Adaptado de Ausbiotech, 2006 (2)
Fig. 3_ Principais etapas da metodologia para a pesquisa de compostos com potenciais aplicaes industriais a partir
de ambientes extremos dos Aores.
Caracterizao do Habitat
O nosso objetivo a obteno de amostras com alto nvel de
diversidade gentica que abranjam o maior nmero de filo -
tipos com propriedades bioativas j descritas e txons
bacterianos promissores (pouco explorados, particularmente
prolficos como produtores de produtos naturais). Com base
nos nossos resultados anteriores sobre a diversidade micro -
biana em tubos de lava nas ilhas Terceira e Pico, foram
selecionados pontos de amostragem.
Nas Furnas de Enxofre, devido falta de dados taxonmicos,
o esforo de amostragem foi guiado por diversos indicadores
de condies especficas fsicas, qumicas, bem como pela
distribuio floral.
Uma vez escolhidos os pontos de amostragem, as culturas da
nossa coleo de bactrias destes ambientes, armazenadas a
- 80C, foram revificadas em meio lquido de Nitrate Broth
(NtB, Fluka Analytical, 72548, Sua) e incubadas a uma
tempe ratura prxima do habitat natural. Posteriormente os
isolados foram cultivados em meio slido R2A (R2A, AES
Labo ratoire, AEB153482, Frana, diludo para meia conc -
entrao) e Nutrient Agar (NA, Biokar Diagnostics, BK185HA,
Frana). O meio R2A foi utilizado por ser um meio baixo em
nutrientes, assemelhando-se desta forma ao ambiente
oligotrfico caracterstico das grutas.
Rastreio de microorganismos
com actividade antimicrobiana
contra microrganismos indicadores
relacionados com a sade humana
A pesquisa de actividade antimicrobiana em culturas bac -
terianas foi efetuada recorrendo a oito microrganismos indica -
dores, por meio de dois mtodos semi-quantitativos, o ensaio
de inoculao cruzada e o ensaio de difuso em agar. Os
microrganismos indicadores foram obtidos de coleces
ATCC (American Type Culture Collection, Rockille, MD)
fornecidos pelo Servio Desenvolvimento Agrrio da Ilha
Terceira (Salmonella typhimurium ATCC 14028, Escherichia
coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853,
Staphylococcus aureus ATCC 29523, Listeria innocua ATCC
33090 and Listeria monocytogenes ATCC 7466) e Labora -
trios de Qumica (Staphylococcus aureus ATCC 9144) e
Microbiologia (Proteus sp.) da Universidade dos Aores.
Os microrganismos indicadores foram conservados em tubos
com Plate Count Agar (PCA, Biokar Diagnostics, BK144HA,
Frana), sob a forma de rampas, e mantidos temperatura de
4C. Periodicamente, as culturas foram repicadas para novas
rampas de PCA. Aquando da utilizao destas culturas, os
microrganismos foram ressus pendidos em Nutrient Broth (NB,
Biokar Diagnostics, BK003HA, Frana) e incubados a 37C.
ENSAIO DE INOCULAO CRUZADA
O teste de inoculao cruzada foi utilizado por permitir fazer
um rastreio rpido do espectro antimicrobiano de cada bac -
tria isolada contra determinados microrganismos indicado -
res, detectando assim a sensibilidade destes microrganismos
a culturas laboratoriais crescidas em biofilme. A metodologia
foi adaptada de Uzair et al. (3).
Este ensaio iniciou-se com a inoculao das amostras isola -
das em NtB e incubao a temperaturas apropriadas, por 3
dias. Aps crescimento em caldo, os isolados foram riscados,
ao longo do dimetro da placa, numa primeira camada de
agar e incubados por alguns dias, at haver crescimento
considervel (210 dias). Posteriormente adicionou-se uma
segunda camada de meio slido na placa para crescimento
dos microrganismos indicadores.
ENSAIO DE DIFUSO EM AGAR
POR INOCULAO EM POOS
A sensibilidade dos microrganismos indicadores s culturas
planctnicas foi avaliada in vitro, utilizando-se o mtodo de
difuso em agar por inoculao em poos, adaptado de Tagg
e McGiven (4).
Os microrganismos indicadores, inoculados previamente em 5
mL de NB e incubados por 1218h a 37C e posteriormente
incorporados em PCA fundido estril (50 L cultura/100 mL
PCA) e o meio foi vertido para as placas de petri (50 mL por
placa), que foram posteriormente guardadas no frio (4C).
Aps o meio estar bem solidificado fizeram-se orifcios com
um dimetro de 7 mm no agar. O fundo do poo foi selado
com uma pequena quantidade de agar (Pastagar B, AES
Laboratoire, AEB175356, Frana).
Os sobrenadantes dos isolados em estudo isentos de clulas
e esterilizados por filtrao atravs de filtros de membrana de
polietersulfona (PES) com poros de 0.45 m (Minisart high
flow, 16532, Sartorius Stedim Biotech, Alemanha), foram adi -
cionados a cada poo (60 L de cada amostra). As placas
mantiveram-se no frio (4C) por 4h, de modo a permitir a
difuso dos compostos da amostra e posteriormente foram
278
in cu badas a 37C por 16h. A actividade antimicrobiana mani -
festou-se atravs da presena de halos de inibio ao redor
dos orifcios inoculados.
Procedimentos de triagem
de actividades bioqumicas
dos isolados
Aps isolamento e purificao em meios de cultura, os
isolados mais promissores foram analisados para caracterizar
o seu perfil metablico, incluindo a deteco de fosfatases,
fosfo-hidrolases, glucosidases, por meio do kit API Zym
(BioMrieux,Inc. Durham, NC).
Isolamento e caracterizao das fraces
dotadas de actividade antimicrobiana
para os microrganismos com maior
actividade.
A purificao dos metabolitos de interesse foi realizada por
meio de precipitao fraccionada com sulfato de amnio
assim como por extraco com solvente orgnico. As dife -
rentes fases foram eludas e recolhidas as respetivas fraes
utilizando fast protein liquid chromatography (FPLC). A sensi -
bilidade ao calor, pH e proteases foram tambm avaliadas,
para caracterizar os compostos de interesse e obter
informao preliminar sobre a sua natureza qumica.
RESULTADOS
Caracterizao do Habitat
Existe uma grande diversidade de bactrias, donde um
grande potencial biotecnolgico, nos ambientes extremos dos
Aores (Fig. 4). Seis locais de amostragem foram seleccio -
nados em seis tubos lvicos assim como no campo de
fumarolas em estudo (Fig. 5).
Rastreio de microorganismos
com atividade antimicrobiana
Diversos isolados apresentaram atividades inibitrias nos
testes de inoculao cruzada frente a um amplo espectro de
microrganismos-alvo, incluindo vrios patgenos de interesse
relacionados com a sade humana (Fig. 6).
O teste de difuso em agar (tcnica dos poos) tambm
demonstrou a existncia de inibio dos microrganismos-alvo
em teste pelos sobrenadantes filtrados dos cultivos bacteri -
anos de ambientes extremos. Na Fig. 7, apresenta-se um
exemplo dos resultados deste teste.
Atividades bioqumicas nos isolados
A triagem inicial dos isolados quanto s suas actividades bio -
qumicas revelou a existncia de atividades enzimticas pro -
mis soras para a melhoria da digestibilidade de raes para
animais (Fig. 8).
Purificao e caracterizao de fraes
com propriedades inibitrias
A precipitao com sulfato de amnio e a extrao com buta -
nol-gua resultaram na obteno duma frao dotada de acti -
v i dade antimicrobiana, solvel em butanol e em gua (Fig. 9).
279 ACTAS DAS JORNADAS . 04 . CINCIAS DA VIDA E DA SADE
Fig. 4_ Nmero de sequncias e de OTUs recolhidas nos tubos
lvicos
Fig. 5_ Locais de amostragem estabelecidos no campo de
fumarolas.
Na Fig. 10, apresentam-se os resultados da avaliao da sen -
sibilidade desta frao temperatura, pH e a enzimas de
diversas naturezas. Os resultados indicam a natureza proteica
da frao ativa, que no perde as propriedades inibitrias
mesmo aps tratamento com temperaturas at 80C, nem
quando submetida a valores de pH entre 1 e 8.
FPLC do extracto purificado
Os resultados obtidos at agora mostraram que a meto -
dologia usada permitiu apenas uma purificao parcial dos
sobrenadantes (Fig. 11). A optimizao dos mtodos de puri -
ficao dever conduzir obteno duma frao puri ficada,
que ser sequenciada para conhecer a respetiva sequncia
de aminocidos.
280
Fig. 7_ Exemplo de resultados do teste de difuso em agar
(tcnica dos poos), com Listeria monocytogenes como
microrganismo-alvo.
Fig. 8._ Resultados da triagem de isolados quanto s suas
actividades bioqumicas.
Fig. 6_ Exemplo de resultados do teste da inoculao cruzada.
Fig. 9_ Efeito da precipitao com sulfato de amnio e da
extrao com n-butanol sobre a atividade antimi -
crobiana do sobrenadante filtrado duma cultura micro -
biana obtida a partir dum ambiente extremo dos Aores.
Fig. 10_ Resultados da avaliao do efeito do tratamento com
enzimas, com temperaturas elevadas e diferentes
valores de pH sobre a atividade antimicrobiana duma
frao ativa contra a L. monocytogenes obtida a partir
dum isolado bacteriano proveniente dum ambiente
extremo dos Aores.
DISCUSSO
Novas espcies microbianas tm sido isoladas de ambientes
extremos aorianos, nas fumarolas na Ilha de So Miguel e em
ambientes hidrotermais ocenicas e algumas atividades enzi -
mticas foram descritas, bem como microrganismos com po -
ten cial antibitico (5 8). Os ambientes extremos dos Aores
so locais inexplorados onde habitam uma enorme quan -
tidade de bactrias das quais podem-se obter biomo lculas
com potencial aplicao em biotecnologia. Tratando-se de
ambientes ainda mal conhecido e pouco ou nada explorado,
importa aumentar o nosso conhecimento sobre esta biodi -
versidade, para promover a sua preservao e aproveita -
mento. O desenvolvimento dos trabalhos de obten o de
mol culas purificadas e caracterizadas na Universi dade dos
Aores, juntamente com o regime jurdico do acesso e utili -
zao dos recursos naturais da Regio Autnoma dos Aores,
so etapas fundamentais para produzir futuros desenvol -
vimentos na rea da biotecnologia com impacto na indstria
aoriana, criando as condies para atingir os objetivos de
utilizao sustentvel e a obteno de benefcios para a
prpria Regio.
CONCLUSES
Os ambientes extremos terrestes dos Aores so locais de
grande diversidade bacteriana e em que se encontram grupos
taxonmicos promissores na produo de biomolculas.
Neste trabalho, foram detetadas atividades enzimticas com
potencial uso industrial e atividade antimicrobiana contra
pat genos humanos e procedeu-se purificao parcial das
fraes antimicrobianas mais relevantes.
O elevado potencial dos ambientes estudados para a
descoberta de produtos com utilidade industrial mais um
argumento para a sua conservao.
Agradecimentos
Este trabalho financiado pela SRECC Secretaria Regional da
Educao, Cincia e Cultura e ao FRC Fundo Regional para
a Cincia atravs da Bolsa de ps-doutoramento
M3.1.7/F/013/2011, no mbito do Programa para a Promoo
do Emprego e Competitividade.
281 ACTAS DAS JORNADAS . 04 . CINCIAS DA VIDA E DA SADE
Fig. 11_ Perfil de FPLC usando como fase mvel Tris-HCl e uma
coluna Superdex 200.
282
REFERNCIAS
1) Newman & Cragg J. Nat. Prod. Rep. 2012, 75, 311
2) http://www.daff.gov.au/agriculture-food/biotechnology/
reports/biotechnology_and_australian_agriculture_-
_towards_the_development_of_a_vision_and_strategy_for_the_appl
ication_of_biotechnology_to_australian_agriculture/6_developing_th
e_strategy
3) Uzair, B., Ahmed, N., Mohammad, F. V., Ahmad, V. U., e Edwards, D.
(2009). Screening of marine bacteria of Pakistan coast for drug
discovery potential. Proc. Pakistan Acad. Sci. 46: 137-144
4) Tagg, J. R. e McGiven, A. R. (1971). Assay System for Bacteriocins.
Appl. Microbiol. 21:943
5) Albuquerque, et al., 2008. International Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology, 58, 773778
6) Fish, SA, and Codd, GA. 1994. World Journal of Microbiology and
Biotechnology 10, 338-341
7) Mendo, et al., 2004. Biotechnology Letters 26: 115119
8) Pettit, RK. 2011. Mar Biotechnol 13:111