CENTRO DE CINCIAS DA SADE CCS

Departamento de Microbiologia e Parasitologia

Disciplina de Microbiologia Geral



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Prof. Daniel Roulim Stainki
UFSM
AULA PRTICA 07 TCNICAS DE SEMEADURA.

1) Material necessrio:

- Tubos de ensaio com caldo simples, Agar simples e Agar semi-slido.
- Placas de Petri com Agar simples.
- Culturas bacterianas em caldo simples, Agar simples (em placa de Petri).
- Ala e agulha de platina.

2) Fundamentao terica:
Meios de cultura
O estudo das bactrias necessita normalmente do seu prvio isolamento e
identificao.
Para tanto diversos meios de cultura so utilizados. Define-se meio de cultura
como uma mistura de nutrientes, incluindo fontes de carbono, nitrognio, sais minerais e
gua, que propiciam o crescimento in vitro de bactrias.
A maioria das bactrias cresce em meios de cultura. Excees so as riqutsias e
clamdias que por serem parasitas intracelulares obrigatrios s se desenvolvem in vitro
em meios celulares (cultivo celular, ovos embrionados), Mycobaterium leprae e
Treponema pallidum.
A inoculao das bactrias em diferentes meios envolve vrias tcnicas de
semeadura. Toda a manipulao de culturas bacterianas, meios e instrumental necessrio
deve ser feita seguindo-se os procedimentos bsicos de assepsia e antissepsia, visando
evitar qualquer tipo de contaminao.

3) Classificao dos meios de cultura
A) Quanto composio:
A.1) Naturais so aqueles de origem vegetal (um pedao de batata, po, frutas) ou
animal (gema de ovo).
A.2) Artificiais so aqueles constitudos de substncias qumicas podendo ser definidos
ou indefinidos (complexos).
Definidos: sabido toda a sua composio qumica.
Indefinidos ou Complexos: desconhecido por si. Sabe-se apenas
aproximadamente sua composio. Os meios utilizados na rotina so complexos.



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B) Quanto ao seu estado fsico:
Lquido so os caldos, desprovidos de Agar. Utilizados para transporte e para
bactrias que j sofreram a ao de antimicrobianos.
Semi-slido so aqueles que apresentam em sua composio at 1% de Agar.
Geralmente utilizados para bactrias microaerfilas.
Slido so aqueles que apresentam em sua composio 1,5 a 2,5% de Agar.
OBS: O Agar um polissacardeo extrado de algas, utilizado para solidificar os
meios e que escolhido por no reagir com nenhuma bactria e por ser altamente
resistente a variaes.

C) Quanto finalidade e caractersticas:
Simples contm apenas componentes bsicos para o crescimento de uma
bactria.
Enriquecido meio que tem aumentada a sua capacidade nutricional para a
bactria pela adio de substncias como gema de ovo, sangue, plasma, soro, leite. De
uso frequente para bactrias de difcil crescimento (fastidiosas).
De enriquecimento meio seletivo que visa inibir o crescimento de bactrias
acompanhantes e permitir o crescimento da bactria alvo que se pretende posteriormente
isolar, aumentando assim a proporo desta em relao s demais. Por ser um meio
lquido no se destina ao isolamento da bactria.
Seletivo contm substncias seletivas que inibem o crescimento de certas
bactrias e permitem o crescimento de outras. So meios slidos e tm como objetivo
isolar culturas puras.
Indicadores meios que permitem a diferenciao visual do crescimento
bacteriano facilitando a sua identificao. Frequentemente os meios seletivos so tambm
indicadores e todos os meios utilizados na confirmao bioqumica dos isolamentos so
indicadores. A indicao mais freqente a alterao de cor do meio por mudana no pH
do mesmo, podendo ainda ser a produo de gs, precipitao de componentes do meio
por atividade proteoltica e lipoltica das bactrias, etc.
Estoque so meios normalmente semi-slidos com a finalidade de preservar
uma cultura bacteriana pura para posteriores utilizaes no laboratrio.

3) Tcnicas de semeadura

A finalidade bsica das tcnicas de semeadura permitir a transferncia
(inoculao) de bactrias ou de uma cultura bacteriana de um material (secreo,
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alimento, etc) ou de um meio de cultura para outro (s) garantindo que apenas os
microrganismos em questo sejam semeados.

Procedimento para remover as bactrias de um meio lquido com a ala de platina.

























De acordo com o tipo de meio de origem e destino bem como da finalidade
especfica da inoculao, diferentes tcnicas so executadas, a saber:






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I - Semeadura em meios slidos.

A. Meio Inclinado em tubos (utilizar ala ou agulhas).


































Em estria sinuosa: semear com ala de platina,
em ziguezague, partindo da base para a
extremidade da superfcie inclinada do meio.
Este tipo de semeadura permite a obteno de
intensa massa de microorganismos.
Em estria reta: semear com agulha de platina,
em estria reta, partindo da base para a
extremidade da superfcie inclinada do meio, ou
em profundidade e superfcie. Este tipo de
semeadura utilizado quando se necessita um
inoculo pequeno de bactrias, como em provas
bioqumicas para identificao bacteriana.
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Procedimento para inocular um meio Agar inclinado a partir de uma Placa de Petri




































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Procedimento para repique de um meio inclinado para outro




































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B. Meios em p (camada alta).

















C. Em Placa de Petri.

C.1. Em superfcie
















Em picada em profundidade: com agulha de
platina perfurar o centro do meio, sem
movimentos de lateralidade e fazer o inoculo
penetrar de 0,5 a 1,0 cm no centro do meio de
cultura. Este tipo de semeadura bastante
utilizado para conservao de bactrias no meio
de cultura e quando o meio utilizado semi-
slido, esta semeadura utilizada para a
verificao da motilidade (As bactrias que
cresceram somente ao redor do pico de
semeadura no so mveis).
Estrias mltiplas ou esgotamento: faz-se o inculo num ponto da
superfcie do meio espalhando-se o mesmo por estrias em toda a
placa, de modo a gradativamente esgotar o material contido no
inculo. Preferencialmente usa-se um esquema de diviso da placa
em 4 quadrantes sendo que a estria de cada quadrante toca no final
da estria do quadrante anterior arrastando bactrias deste ltimo.
Nesse caso, deve-se flambar a ala aps a inoculao de cada
quadrante. Pode-se tambm optar por no tocar no final da estria do
quadrante anterior, no sendo assim necessrio flambar a ala aps
cada quadrante. A estria do ltimo quadrante ocupa a maior parte da
placa. Alternativamente pode-se fazer 3 estrias, a primeira ocupando
metade da placa e as outras duas um quarto da placa cada. Neste
modo as estrias no se tocam. Este tipo de semeadura empregado
para o isolamento de colnias bacterianas e obteno culturas puras.
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Por distenso: com pipeta, colocar no centro da
superfcie do meio 0,1 mL da suspenso e espalhar
uniformemente com swab ou ala de Drigalski.
Com swab, obteremos crescimento confluente,
para realizao de antibiogramas, por exemplo.
Com ala de Drigalski, utilizamos para obteno
de colnias dispostas de modo regular para
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C.2. Em profundidade ou disseminao.
Pour plate (derramanento): depositar na placa de Petri 0,1/ 1,0 mL da
suspenso bacteriana. Adicionar 10 mL do meio fundido (O Agar funde a 85 C) em tubo
de ensaio e resfriado a 45-50 C.
Homogeneizar com movimentos giratrios da placa sobre uma superfcie plana.
Utilizado para isolamento, contagem e identificao bacteriana, conforme o meio de
cultura utilizado.
Pour Plate.




























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Inoculao na Placa de Petri.




































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D. Repique por pescaria: colnia em placa de Petri retirada atravs de uma agulha para
um meio de cultura lquido ou slido. Mtodo empregado para isolamento bacteriano.

II. Semeadura em meios lquidos.

Difuso: com ala de platina ou pipeta, introduzir o inoculo (> 0,1 mL) na massa
do meio, esfregando contra o interior do tubo na rea exposta pela inclinao do mesmo
em 30.
Aps se recolocar o tubo na posio vertical, as bactrias inoculadas se difundem
para o meio. Este tipo de semeadura empregado para obteno do crescimento
bacteriano (o meio fica turvo se houve crescimento). um repique normal.

C) Objetivos:
1- Explanao sobre os principais meios de cultura empregados em laboratrios de
Microbiologia.
2- Identificao das tcnicas de semeadura mais empregadas na rotina bacteriolgica.
3- Cultivo de bactrias com finalidade de obteno de cultura pura, ou seja, uma
populao onde todas as bactrias se originam de uma nica clula bacteriana.

Resultado:










Referncia bibliogrfica:
CERQUEIRA, A.M.F. Apostila de aulas prticas. Medicina veterinria. Universidade
Federal Fluminense UFF, 2002, 68p.



Observaes: