UNIVERSIDAD TECNOLOGICA METROPOLITANA

DEPATAMENTO DE BIOTECNOLOGIA
Carrera de Ingeniera en Biotecnologa
Curo de Biologa General!
GUIA DE LABORATORIO N" #
MICROSCOPIA $ TAMA%O CELULAR
OB&ETIVOS!
- Familiarizarse con los fundamentos y los principios de la microscopia.
- Conocer el funcionamiento y los componentes de un microscopio de luz.
Aprender su uso y su manejo.
- Observar preparaciones de clulas eucariontes y procariontes. Estimar su
tamao.
INTRODUCCION!
El microscopio de luz, resulta frecuentemente el smbolo de la investi!aci"n y el
descubrimiento cientfico. Este instrumento #a evolucionado durante los $ltimos %&'
aos, desde los trabajos del dans Antonie van (eeu)en#oe* +,-%./,0.%1, #asta lle!ar
a ser uno de los instrumentos de investi!aci"n mas sofisticados de nuestros das.
2odo lo 3ue nosotros entendemos por clula y sus asociaciones, radica en !ran
medida en investi!aciones realizadas en microscopios, como por ejemplo los trabajos de
4eor!e 5alade y Camilo 4ol!i, 3ue les valieron el 6ovel en medicina el ao ,708. Ellos
influyeron decisivamente en toda la idea 3ue tenemos del sistema endomembranoso de
las clulas eucariontes. O bien, los trabajos de 9am"n y Cajal, 3uien ilustr" de manera
muy precisa la estructura del tejido nervioso, trabajos por los cuales es considerado el
padre de la neurobiolo!a moderna, obteniendo el 5remio 6ovel el ao ,7'-.
5or definici"n, el microscopio de luz es un instrumento 3ue crea una ima!en
ma!nificada y detallada de objetos aparentemente invisibles a simple vista, bas:ndose
en los principios de transmisi"n, absorci"n, emisi"n y refracci"n de las ondas luminosas
+,1. (os variados tipos de microscopios 3ue e;isten producen im:!enes de objetos
empleando diferentes estrate!ias. <in embar!o, la producci"n de una ima!en clara e
informativa depende siempre de la ma!nificaci"n del objeto, su contraste con respecto
al medio circundarte y su #abilidad de resolver detalles estructurales.
En t'r(ino generale) *ode(o encontrar lo iguiente ti*o de (icroco*io de
lu+,
=e Campo Claro, Es el m:s com$nmente empleado para trabajos de rutina y
observaci"n simple de muestras, su funcionamiento depende de la absorci"n de
luz. Es el mismo 3ue usted utilizar: durante este pr:ctico.
=e Campo Oscuro. 5ermite la detecci"n de pe3ueos objetos refractantes. >uy
utilizado para observar pe3ueas clulas bacterianas.
=e Contraste de Fase? este microscopio favorece el fen"meno de interferencia
entre los rayos de luz provenientes de la muestra, utilizando un anillo de
difracci"n. Este microscopio convierte las diferencias en el paso "ptico de la luz
dentro de la muestra, en diferencias en el contraste. Es muy utilizado para
observar estructuras subcelulares como las mitocondrias.
=e Interferencia Diferencial de Contraste (DIC), este microscopio utiliza un
doble prisma llamado prisma de @ollaston 3ue separa la luz en dos rayos de luz
polarizada 3ue pasan por la muestra y lue!o conver!en en la ima!en,
favoreciendo el contraste los bordes del objeto en la ima!en. >uy utilizado para
ver clulas vivas y sin tinci"n
=e Luz Polarizada. Atiliza polarizadores. 5ermite observar la birrefrin!encia
producto de la or!anizaci"n supramolecular de los componentes biol"!icos.
=e Fluorescencia. (a ima!en es !enerada por el fen"meno de misi"n de luz o
fluorescencia, producido por ciertas molculas 3ue tienen la capacidad de
absorber luz a determinada lon!itud de onda y emitirla a una lon!itud de onda
mayor. 2ales molculas son llamadas fluor"foros. En el microscopio, la luz pasa
por una serie de filtros 3ue permiten separar la luz absorbida de la luz emitida.
Este tipo de microscopio es muy utilizado en la actualidad para observar
estructuras y procesos celulares, pudiendo mezclar m:s de un flu"roforo.
Lser o Confocal. Atiliza el fen"meno de la fluorescencia para producir una
ima!en. En este microscopio el espcimen es iluminado por un rayo l:ser 3ue
enfoca en distintos puntos de un plano de la muestra, barrindola en el plano
BC. (a seal de fluorescencia proveniente de los distintos puntos enfocados es
lue!o compuesta en una ima!en en un ordenador. Este microscopio es sin duda
el m:s utilizado en las publicaciones cientficas actuales. (a confi!uraci"n de
este microscopio permite las mejores resoluciones posibles en microscopia de
luz.
Otro tipo de microscopio com$nmente utilizado para investi!aci"n es el
Microscopio Electrnico, el cual utiliza un #az de electrones en ves de un #az de luz
para producir una ima!en. El #ec#o de utilizar electrones en vez de luz le entre!a mayor
poder de resoluci"n respecto al microscopio de luz. (le!ando a un limite de resoluci"n
cercano a los . nm, #asta &''' veces mas potente 3ue un microscopio de luz
convencional. <in embar!o, los principios 3ue !obiernan la ma!nificaci"n y resoluci"n
de una ima!en son similares a los del microscopio de luz, con la diferencia de este
ultimo utiliza lentes "pticos +de cristal1 y el electr"nico utiliza bobinas ma!nticas para
desviar el #az de electrones.
(a primera versi"n del microscopio electr"nico, creada por Ernst 9us*a y >a;
Dnoll entre el ao ,7.& y ,7%' fue el prototipo del microscopio 3ue #oy en da
conocemos como Microscopio Electrnico de ransmisin (EM)! 3ue detecta los
electrones 3ue son transmitidos a travs del espcimen. Es muy utilizado para observar
tejidos, clulas, estructuras subcelulares, or!anelos, membranas biol"!icas, virus y
macromolculas como protenas o :cidos nucleicos. E;iste otro tipo de microscopio de
electrones llamado Microscopio Electrnico de "arrido (#EM), en el cual el #az de
electrones se desplaza a travs del espcimen y son los electrones 3ue c#ocan y se
-igura #! 5artes de un microscopio de
campo claro
reflejan en la superficie de la muestra los 3ue son detectados. 4enerando im:!enes de la
superficie del espcimen.
ESTRCUTURA $ -UNCIONAMIENTO DEL MICROSCOPIO DE LU.
En la fi!ura , se detallan los componentes
de un microscopio de campo claro, el m:s
com$nmente usado en los laboratorios de
biolo!a y el mismo 3ue usted tendr: entre
sus manos durante el pr:ctico.
El microscopio consta de una parte
fija y s"lida llamada columna o $razo, sobre
el cual se mantiene toda la estructura del
microscopio +se recomienda tomar el
microscopio siempre por el brazo ya 3ue es
la parte mas r!ida del instrumento1 y una
plataforma con un orificio central por donde
pasan los rayos luminosos llamada platina.
(a platina esta destinada a sostener y mover
la muestra en el plano BC, para lo cual lleva
un par de pinzas y un carro m"vil 3ue
permite desplazar la muestra utilizando dos
tornillos de control.
A ambos lados del brazo, bajo la
platina se encuentra un jue!o de dos
tornillos de focalizacin! el macrom%trico &
el microm%trico. Ambos tornillos desplazan la muestra en el eje E, lo 3ue permite
enfocar el espcimen. <iendo el primero 3uien permite un enfo3ue !rueso y el se!undo
un enfo3ue fino y preciso.
En la parte superior, el brazo sostiene un tu$o! o ca'n, 3ue lleva los lentes
oculares en su e;tremo superior y los lentes objetivos en su parte inferior. An
microscopio convencional lleva un jue!o de al menos 8 objetivos distintos, emplazados
en una estructura rotatoria llamada re(ol(er, la 3ue permite alternar el uso de uno o de
otro lente.
En la parte inferior de brazo se encuentra una plataforma 3ue da sostn a todo el
microscopio, llamada pie. (a fuente de luz, 3ue puede ir desde una ampolleta de
tun!steno a un espejo 3ue refleja la luz solar, 3ueda dispuesta en la superficie superior
del pie. En la trayectoria de los rayos luminosos 3ue provienen de la fuente de luz se
encuentra una estructura llamada diafra)ma o iris, el cual permite re!ular la cantidad de
luz 3ue ilumina el espcimen.
Lo (icroco*io de ca(*o claro generan una i(agen de un o/0eto utili+ando tre
lente ditinto!
El lente condensador, toma los rayos luminosos provenientes de la fuente de luz y los
condensa y proyecta sobre el espcimen. (os rayos luminosos interact$an con la materia
del espcimen, donde pueden ocurrir varios fen"menos, como la absorci"n, la
reflecci"n, la difracci"n, la refracci"n y la dispersi"n de la luz.
5arte de la luz 3ue es transmitida, difractada, refractada o dispersada por el
espcimen es colectada por un si!uiente lente llamado lente o$*eti(o, de cuyas
caractersticas depende en !ran medida el poder de resoluci"n del microscopio. Este
lente proyecta la luz proveniente de la muestra sobre un punto focal +-
#
11. (os rayos
proyectados en el punto focal !eneran una primera ima!en del objeto +I
#
1, la cual se
encuentra invertida y ma!nificada +ver fi!ura .1. (a ma!nificaci"n de un lente depende
de la distancia 3ue e;iste entre objeto y lente +S
#
1 y la distancia entre el lente y la
ima!en enfocada +S
#
11. (ue!o, los rayos de luz 3ue forman la primera ima!en del objeto
son captados y proyectados por un tercer lente, el cual aumenta el tamao de la primera
ima!en focal. Este lente es llamado lente ocular y no tiene !ran incidencia sobre el
poder de resoluci"n del microscopio, pero si en la ma!nificaci"n de la ima!en.
-igura 2! 5aso "ptico de un lente objetivo.
El poder de un microscopio est: dado por dos variables? la ma!nificaci"n +o
aumento1 y la resoluci"n.
MAGNI-ICACION, la ma!nificaci"n de un lente viene dada por la si!uiente
e;presi"n?
M 3 4S#15S#
El aumento de un lente, por lo !eneral viene indicado por un n$mero +como ,'B, .'B,
8'B o ,''B1 escrito en un costado del mismo lente. Como los microscopios de campo
claro adem:s de tener lente objetivo, cuentan con un jue!o de lentes oculares, la
ma!nificaci"n de un microscopio viene dada por la ma!nificaci"n del objetivo
multiplicada por la ma!nificaci"n del ocular +3ue suele ser ,'B1
RESOLUCION, se define como la distancia limitante entre dos puntos a la cual ellos
pueden ser percibidos como distintos el uno del otro. Fiene dada por las propiedades del
lente objetivo y por la lon!itud de onda de la luz utilizada +1.
2odos los lentes objetivos cuentan con un par:metro llamado apertura numrica +AN1,
el cual relaciona el :n!ulo +1 formado por el cono de luz proveniente de la muestra 3ue

Lente objetivo
Muestra

capta el lente +como se muestra en la fi!ura %1 y el ndice de refracci"n +n1 del medio
3ue se encuentra entre el objetivo y el espcimen, se!$n la si!uiente relaci"n?
AN 3 n en
-igura 6! Cono luminoso captado por un lente objetivo
6ormalmente el medio 3ue se encuentra entre el espcimen y el vidrio del lente
objetivo es aire, el cual posee un nG,. Al!unos lentes, llamados lentes de inmersi"n
utilizan un aceite especial +aceite de inmersi"n1 3ue posee un n cercano ,,& muy
semejante al n del vidrio.
El l(ite de reoluci7n de un lente 3ueda dado por la ecuaci"n deducida por el fsico
alem:n Ernst Abbe en ,H0% +ecuaci"n ,1 y posteriormente refinada por (ord 9aylei!#
en ,H7- +ecuaci"n .1, 3ue involucra la teora de la difracci"n de luz desarrollada por el
matem:tico y astr"nomo in!les <ir 4eor!e Iiddell Airy en ,H%&. Estas ecuaciones son?
#8 Li(ite de la Reoluci7n de A//e d 3 5 2AN
28 Li(ite de la Reoluci7n de Ra9leig: d 3 ;!<# 5 NA
>ientras menor sea el valor de d, mayor es la resoluci"n del microscopio. A#ora
podemos notar 3ue si se desea aumentar la resoluci"n de un microscopio es posible, por
un lado, disminuir la lon!itud de onda de la luz utilizada, o por otro lado, aumentar la
A6 del lente. (os mejores lentes objetivos utilizados en la actualidad tienen un valor de
A6 cercano a ,.8.
INSTRUCCIONES,
,.- (a asistencia a los pr:cticos es obli!atoria. En caso de ausencia debe documentar
con certificado mdico avalado por la escuela.
2!4 =ebe utilizar un delantal de laboratorio blanco y limpio. 6o utilice calzado de tela o
3ue e;pon!a la piel de los pies. =e preferencia utilice zapatos de cuero.
6!4 <e realizar: un control de entrada, donde se pre!untar:n temas 3ue est:n en la !ua
correspondiente. El test dura ,& minutos. No e ace*tar=n retrao. <i usted lle!a
tarde, perder: tiempo para realizar su control. (as personas 3ue lle!uen lue!o de
finalizado el periodo del control, no tendr:n opci"n de recuperaci"n y tendr:n la nota
mnima.
8.- (as observaciones en el microscopio 3ue usted realice deben 3uedar re!istradas en
un dibujo dentro de las circunferencias 3ue se encuentran en su #oja de informe. (os
dibujos deben ser de trazos simples, limpios y discernibles. =ebe sealar las estructuras
observadas
&.- A un costado de la circunferencia debe realizar una pe3uea descripci"n de lo
observado. 5oniendo nfasis en lo 3ue el profesor le indica.
-.- 6o debe olvidar anotar el aumento al cual fue visto el espcimen.
0.- (as #ojas de informe deben ser entre!adas al profesor a la salida del pr:ctico.
9ecuerde 3ue los pr:cticos tienen una duraci"n de dos periodos, no se aceptar:n retrasos
de nin!$n tipo.
H.- no olvide escribir su nombre, secci"n y fec#a en cada una de las #ojas de informe
3ue utilice.
ACTIVIDADES PR>CTICAS!
#8!4 Identi?icaci7n de la *arte del (icroco*io. =ebe escuc#ar atentamente las
e;plicaciones del profesor y ponerlas en pr:ctica con el microscopio 3ue tiene delante
suyo. Encindalo e identifi3ue sus componentes. >ueva los tronillos del carro, el
macromtrico y el micromtrico. >ueva el revolver y cambie de lente objetivo.
28!4 Caracteri+aci7n de la i(agen generada *or el (icroco*io! (e ser:
proporcionada una #oja de peri"dico, de la cual usted debe recortar una palabra a
elecci"n. (a palabra recortada lue!o debe ser montada entre una placa porta objeto y
una placa cubre objeto, utilizando una !ota de a!ua. Colo3ue la preparaci"n sobre la
platina y observe. 5rocure 3ue la palabra 3uede en el sentido 3ue usted la pueda leer.
Atilice los lentes objetivos ,'B, 8'B y ,''B para observar. Este $ltimo lente debe ser
utilizado adicionando una pe3uea !ota de aceite de inmersi"n. (as instrucciones ser:n
dadas por el profesor.
=ibuje y describa lo 3ue esta observando. =ebe realizar un dibujo y una descripci"n por
cada aumento utilizado.
68!4 Poder de (agni?icaci7n del (icroco*io! (e ser: proporcionado un cuadrado de
papel milimetrado +,cm
.
1. 5repare la muestra del mismo modo 3ue en la actividad
anterior. Observe con los lentes ,'B, 8'B y ,''B. Observe como las !raduaciones del
papel milimetrado aumentan su tamao en la ima!en !enerada por el microsc"pio.
=ibuje y describa lo 3ue est: observando +realice un dibujo por cada objetivo utilizado1
@8!4 Cali/raci7n de un (icr7(etro ocular Areglilla8! Este instrumento 3ue sirve como
escala o re!la. Este es un disco de vidrio 3ue tiene !rabados una escala con divisiones
uniformemente espaciadas 3ue va dentro del lente ocular. (a re!la puede estar dividida
en &' o ,'' espacios sin valor est:ndar. 5ara usar este instrumento debe ser calibrado
sobre la escal del micr"metro de la platina , #aciendo coincidir los or!enes de ambas
escalas. Ense!uida ubi3ue otro punto en 3ue ambas escalas coincidan. Como cada
divisi"n del micr"metro de la platina mide '.', mm de lon!itud, utilizando la si!uiente
formula, calcule cuanto mide cada subdivisi"n del micr"metro ocular.
D
(o
3 D
(*
5N
(o
=onde D
(*
es la distancia utilizada del micr"metro de la platina, la cual se calcula
mediante la si!uente relacion
D
(*
3 N
(*
B;!;# 2eniendo unidades en milmetros +mm1
N
(*
corresponde a las subdivisiones del micr"metro de la platina utilizadas.
N
(o
corresponde a las subdivisiones del micr"metro ocular utilizadas.
Este proceso debe repetirlo para los aumentos ,'B, 8'B y ,''B. Con esta informaci"n
usted podr: saber cuanto mide cada subdivisi"n del micr"metro ocular para cada lente
objetivo usado, permitindole lue!o estimar el tamao de los especmenes
microsc"picos observados.
C8 Ta(aDo celular!
a8 C'lula *rocarionte! (e ser: proporcionado un matraz de cultivo con bacterias de
una cepa de E. coli. 9ealice un frotis de una pe3uea !ota tomada directamente desde el
cultivo sobre la placa portaobjetos. =eje secar en placa trmica +-'J C1. Adicione una
!ota de azul de metileno y deje secar nuevamente. Ana vez seca, la placa debe ser
lavada con un pe3ueo c#orro de a!ua corriente, cuidando de no desprender la muestra
de la superficie de la placa. Colo3ue la placa cubreobjeto sobre el Fortis con ayuda de
soluci"n de montaje +!licerina y a!ua 7?,1.
Colo3ue la preparaci"n en la platina del microscopio y observe con los objetivos ,'B,
8'B y ,''B. =ibuje y describa o 3ue observa.
/8 C'lula eucarionte! Con el uso de un palillo mondadientes estril o similar, raspe la
parte interna de su mejilla +dentro de la boca1, cuidando de no causarse dao. Con ello
al!unas clulas de su mucosa bucal se desprender:n. Knmediatamente, esparza el
material colectado desde su boca sobre un portaobjetos. =eje secar en placa trmica
+-'J C1. Adicione una !ota de azul de metileno y deje secar nuevamente. Ana vez seca,
la placa debe ser lavada con un pe3ueo c#orro de a!ua corriente, cuidando de no
desprender la muestra de la superficie de la placa. Colo3ue la placa cubreobjeto sobre el
Fortis con ayuda de soluci"n de montaje +!licerina y a!ua 7?,1.
Colo3ue la preparaci"n en la platina del microscopio y observe con los objetivos ,'B,
8'B y ,''B. =ibuje y describa o 3ue observa.
Cuidado 9 Li(*ie+a del Microco*io!
El microscopio es un instrumento de precisi"n, el cual debe estar correctamente
alineado para obtener im:!enes de calidad, por ende son instrumentos MU$
DELICADOS. Cada uno de los estudiantes esco!er: un microscopio +los cuales se
encuentran numerados1 3ue utilizar: durante todo el semestre. Es responsabilidad del
estudiante el estado del microscopio 3ue utiliza. <e llevar: un re!istro detallado da cada
uno de sus usos y los problemas 3ue presente.
A continuaci"n se detallan al!unas buenas pr:cticas para la mantenci"n y uso
adecuado del microscopio.
- 9evise, cada vez 3ue use un microscopio, las condiciones en 3ue este se
encuentra. Knforme a su profesor si encuentra al!una anormalidad y re!strela
en la carpeta del instrumento.
- <KE>59E 2O>E E( >KC9O<CO5KO 5O9 E( I9AEO CO6 A6A
>A6O, <ALE62A6=O(O =E<=E (A IA<E =E( 5KE CO6 (A O29A.
- Colo3ue el microscopio sobre una superficie plana y sin desniveles. El
instrumento nunca debe 3uedar McojeandoN.
- Enc#ufe el instrumento a la toma de corriente elctrica. Ferifi3ue 3ue las
l:mparas enciendan.
- Ferifi3ue 3ue el revolver est en el (E62E OILE2KFO >A< IALO y 3ue
la platina se encuentre lo mas alejada del jue!o de lentes objetivos. As usted
cuidar: de no raspar el lente con la platina o el portaobjeto.
- A5A4AE (A (A>5A9A CA=A FEE OAE 6O A2K(KCE E(
K6<2A>E62O.
- <i utiliza lentes de inmersi"n, limpie el lente con 5A5E( 5A9A (E62E<
cada vez 3ue lo utilice. 6o deje secar lel aceite de inmerson en el ya 3ue
lue!o se deben usar diluyentes or!:ncios para la limpieza, lo cual disminuye
notablemente la vida util del lente.
- Ana vez finalizado el practico, debe dejar el microscopio en posici"n de
descaso?
o El revolver debe estar en el objetivo de menor aumentoP
o (os lentes deben ser limpiados cuidadosamente con papel para lentesP
o (a platina debe estar completamente abajoP
o El cable de la electricidad debe estar enrrollado en el brazo sin tocar
los lentes objetivos.
Bi/liogra?a,
- <pector =. y 4oldman 9. Iasic >et#ods in >icroscopy. 5rotocols and Concepts from
Cells? A (abotory >anual. Cold <prin! Qarbor (aboratory 5ress. 6e) Cor*. A<A.
.''-.
EO&A DE IN-ORME
No(/re, RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR Pr=ctico N" RRR
Secci7n, RRRR -ec:a, RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
ActiFidad, RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
ActiFidad, RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
O/erFacione, RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
Aumento. RRR
O/erFacione, RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
Aumento. RRR
O/erFacione, RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
Aumento. RRR
O/erFacione, RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
Aumento. RRR
ActiFidad, RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
ActiFidad, RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
K>59K>K9 5O9 A>IO< (A=O<. 9ECAE9=E OAE E6 A6 59SC2KCO A2K(KEA9S >S< =E
A6A QOLA =E K6FO9>E, 59OCA9E K>59K>K9 FA9KA<.
O/erFacione, RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
Aumento. RRR