INGENIERIA DE SISTEMAS

SEMINARIO DE INVESTIGACION
STEVEN BEDOYA- MARIHELENA AYALA



MONOGRAFA BIOINFORMTICA Y APLICACIN EN LA REACCION EN CADENA DE LA
POLIMERASA






Marielena Ayala Segura 160002706
Martn Steven Bedoya Rodrguez 160002703







Msc. Diana Franco Mora










Seminario de investigacin
Ingeniera de sistemas
Facultad de ciencias bsicas e ingeniera
Universidad de los llanos
Villavicencio Meta
2014

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STEVEN BEDOYA- MARIHELENA AYALA



Bioinformtica


La estructura bsica de un ser vivo parte esencialmente de la clula, cuyo sistema
biolgico se constituye de miles de ella. La composicin qumica de este sistema incluyen
en si los elementos qumicos (Como el carbono, nitrgeno, sodio) y las macromolculas.
Estas se encuentran en cuatro grupos reconocidos, los cuales son los cidos nucleicos,
protenas, lpidos, y glcidos. Los primeros son de carcter esencial para el estudio del ser
vivo. Existen dos tipos bsicos: el ADN y el ARN, lderes en tema de estudio de la
bioinformtica.

La bioinformtica surge cuando se logra comprender la secuencia de ADN y la primera
protena. (Beltr ,2004) A partir de este punto el ser humano emprende una bsqueda
avanzada y profunda acerca del estudio del ser vivo con todos sus componentes. Debido a
la gran cantidad de datos originados durante tantos aos y la excesiva demanda de la
investigacin biolgica se exige la creacin de nuevas herramientas que permiten
entender la informacin contenida y llegar a un punto de conocimiento , para tomar las
decisiones ms adecuadas como por ejemplo conocer el estado actual de una
enfermedad.

La bioinformtica se define como un campo interdisciplinar que se encuentra en la
interseccin de la biotecnologa y las ciencias de la computacin
4
(Voe,2006).
Esta abarca disciplinas como estadstica, matemtica aplicada, ciencias de la computacin,
inteligencia artificial, qumica y bioqumica.
5

Se utilizan herramientas y tecnologas altamente sofisticadas para procesar, almacenar,
organizar y visualizar la informacin adquirida en el proceso de investigacin, capaces de
simular sistemas o mecanismos en tiempo real.

La bioinformtica principalmente se da por la necesidad de despejar las distintas
incgnitas en las ciencias de la vida, mediante los diferentes sistemas que proporcionan
los avances tecnolgicos tras pasar los aos, est impulsada por el genoma humano y la
obligacin de mejorar las condiciones y la calidad de vida de los seres vivos,
6
partiendo
inicialmente de cmo funciona una clula y su desempeo a nivel molecular.





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La bioinformtica da sus primeros pasos gracias a bilogos y bioqumicos quienes se
acercan a la tecnologa computacional para realizar su trabajo, por lo que es complicado
mencionar la historia sin depender de acontecimientos importantes en la biologa y la
computacin.

En la dcada de los 50 se secuencia la primera protena por F. Sanger,
7
y se propone una
estructura tridimensional del ADN, molcula responsable de transmitir la herencia
gentica.
Se resumen los acontecimientos ms importantes en la historia de la bioinformtica
:

En 1965, Margaret Dayhoff cre la primera base de datos de secuencias
biolgicas, en la cual almacen y puso a disposicin de la comunidad cientfica
todas las secuencias de ADN y protenas descritas hasta la fecha.
1953 Watson y Crick los padres del ADN propusieron el modelo de la doble hlice
para explicar su estructura.
1973, se anunci y cre la base de datos ms antigua que se conoce y la cual sigue
vigente, el Protein Data Bank.
En 1978 Margaret Dayhoff fue la encargada de generar la primera matriz de
substitucin de aminocidos, denominada PAM, lo que conllevo al estudio de
evolucin molecular.
Varios grupos de investigacin de prestigio, dieron origen a la base de datos ms
conocida en el mundo, el GenBank34. Dicho proyecto fue financiado por los
National Institutes of Health, United States Departament of Energy y el United
States Department of Defense.
En 1985 se report el algoritmo FASTA o FAST-All de comparacin de secuencias, el
cual directamente operaba como motor de bsqueda de secuencias similares
dentro de la base de datos GenBank.
En 1990, se origin otro de los hitos ms importantes de la bioinformtica: la
implementacin del algoritmo BLAST.
En 1993 se inici la era genmica con la ejecucin del proyecto de secuenciacin
de genoma humano





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Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) & (PCR) en tiempo real

La Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una tcnica "in vitro" que imita la
habilidad natural de la clula de duplicar el ADN, se trata de una tcnica usada para crear
un gran nmero de copias de un segmento de ADN, que utiliza ciclos de desnaturalizacin,
apareamiento con cebadores (primers), y extensin por una ADN polimerasa
termoresistente, desarrollado en 1896 por Kary Mullis. (Ing. Agr. Carlos A. Gonzlez).

Pero, cmo funciona una PCR?, segn el portal web de la compaa farmacutica Roche,
es un proceso de tres pasos, designado como un ciclo, que se repite un nmero
especfico de veces, en primera instancia, se debe separar la doble hebra del ADN en
dos filamentos, esto se conoce como desnaturalizacin, despus se procede a alinear
los primers, para dar el punto de partida y el final de la secuencia a replicar, finalmente se
extiende la cadena de ADN utilizando diferentes nucletidos libres que replican los
filamentos de ADN, ste proceso se realiza en un termociclador, que es un dispositivo,
programable que permite realizar ciclos de temperatura indispensables para que el
proceso del PCR funcione correctamente, por supuesto, ste proceso puede hacer
artesanalmente, sin embargo, el umbral de errores es muy alto.

Con el tiempo, sta tcnica se ha optimizado utilizando hardware y software avanzado,
con la finalidad de reducir el porcentaje de error, hoy en da se utiliza un tipo de PCR,
llamado PCR en tiempo real o cuantitativo, el cual tiene la ventaja con respecto al PCR
convencional de, rapidez y automatizacin, deteccin de ms de un producto especfico
en una misma reaccin, cuantificacin precisa del ADN, entre otras.(Msc. Luis Guzmn
Masias, 2009), segn Guzman las aplicaciones de sta metodologa, seran el diagnstico
clnico de enfermedades, monitoreo y evaluacin de terapias, la deteccin de mutaciones
en genoma humano, la medicina forense (identificacin de cadveres a partir de ADN),
parentescos, polimorfismo gentico, y gran cantidad de usos en la gentica.

Entonces, cmo funciona Una PCR cuantitativa o en tiempo real?, el servicio de apoyo a
la investigacin en la seccin de biologa molecular de la universidad de Murcia, tiene una
explicacin detallada del proceso optimizado; La herramienta principal es un
termociclador Avanzado un ejemplo es, un 7500 Fast Real Time PCR System, inventado
por la compaa Applied Biosystems, y un software 7500 System SDS para la recoleccin y
anlisis de datos propiedad de la misma compaa, el cual, es un software de pago; El
proceso es prcticamente el mismo sin embargo se debe aadir un reactivo qumico,
TaqMan o SYBR Green, los cuales sirven para aplicar una electroforesis para visualizar el
espectro de fluorescencia del producto del PCR a fin de realizar el respectivo anlisis de
imgenes y determinar los resultados.


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Software y hardware para el mtodo PCR en tiempo real

El software 7500 System SDS controla todo el proceso de ejecucin, los ciclos trmicos en
el dispositivo, la configuracin para el reactivo seleccionado, los anlisis y datos recogidos
adems de permitir enviar los resultados a travs de la red y entre dispositivos
semejantes.

El dispositivo se entrega con una laptop dell y el software instalado, adems incluye el
software Primer Express v3.0, el cual es de pago, su precio oscila entre los $100.000.000
de pesos colombianos.

Otro dispositivo es el, Equipo PCR Tiempo Real MX3000P, Agilent technologies ofrece la
plataforma Stratagene MX para PCR tiempo real. Se trata de los modelos MX3000P y
MX3005P, de 4 y 5 canales respectivamente, la plataforma Mx incluye un cmodo bloque
de 96 pocillos para tubos de 0,2 ml con tapa en domo o bien, strips de 8 tubos o placas de
96 pocillos. Los equipos cuentan con una potente lmpara de luz blanca, como fuente de
excitacin y un sensible fotomutiplicador de 16 bits para la deteccin de emisin,
logrando un rango dinmico de 10 unidades logartmicas y capacidad de deteccin de una
sola copia de ADN.

Los datos adquiridos por tan sensibles sistemas, son analizados por el software MXPro,
que cuenta con funciones de cuantificacin absoluta y relativa segn reglamento MIQE,
pero adems, incluye una funcin de discriminacin allica y SNPs por sondas diagnsticas
y una funcin de lectura fluoromtrica para cuantificar DNA o RNA total. El software
adems cuenta con una funcin de experimentos mltiples, que le permite asociar
distintos ciclos dentro de un solo experimento, el costo del mismo oscila alrededor de los
$60.000.000 de pesos colombianos. (Agilent technologies, 2004)


Izquierda Mxp3000P Imagen tomada de http://www.genexpress.cl/equipo-pcr-tiempo-real-mx3000p/, derecha 7500 Fast PCR
Imagen tomada de http://www.lifetechnologies.com/co/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-instruments/7500-fast-
real-time-pcr-system.html



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Freeware para PCR en tiempo real

Debido a la naturaleza del software privativo, es complicado conocer caractersticas del
software, sin embargo, el centro de investigacin de insuficiencia cardiaca de la
universidad de msterdam, lanz una versin freeware del mismo, llamada LinRegPCR,
capaz de funcionar con cualquier dispositivo PCR del mercado, adems, poseen un buzn
de sugerencias donde los usuarios pueden reportar fallos en la plataforma, cada mes, se
relanza una versin del software corrigiendo los errores reportados.


Aplicaciones principales de la PCR en tiempo real

La PCR en tiempo real tiene amplias aplicaciones en investigacin cientfica y como
herramienta de diagnstico, vale la pena resaltar, que se ha avanzado bastante en el
estudio de virus que afectan al hombre y los animales (Stephen Bustin, 2005) as como en
la investigacin de bacterias y hongos patognicos, pues sta prueba ofrece una gran
sensibilidad y especificidad en menor tiempo y a un menor costo.

Tambin es ampliamente utilizada para la identificacin de mutaciones o polimorfismos
genticos valindose de sondas especficas y sus resultados en el anlisis de los cambios
de la curva de fusin (Mark Valasek & Repa, 2005), asimismo la PCR en tiempo real se
utiliza para acceder a datos relevantes a la biodinmica de los organismos que producen
enfermedades (Clementi, 1993).

Sin embargo uno de los campos de mayor aplicacin de esta tcnica es la investigacin de
cambios en la expresin gentica de clulas a travs de la cuantificacin de su ARNm,
permitiendo asociar dichos cambios a estados fisiolgicos celulares, presencia de
frmacos, agentes infecciosos, etc. (Stephen Bustin, 2005).

Una ventaja adicional de esta tcnica es que para implementarla es suficiente contar con
una cantidad pequea de muestra. Esto la hace ideal cuando se usa conjuntamente con
microciruga lser para hacer biopsias de tejidos o clulas especficas y estudiar, por
ejemplo, el comportamiento de clulas cancerosas (Edwards, 2004; Johnson, 2005).

La PCR en tiempo real tambin se est usando en otros campos como la investigacin
forense y la bioseguridad. En estos casos las investigaciones se basan en la identificacin
con una alta sensibilidad y especificidad de organismos patgenos o saprfitos difundidos
en el medio ambiente. La caracterizacin de pequeas cantidades de material gentico
procedente de tales organismos hace posible conocer su procedencia e identificar
su dinmica (Johnson et al., 2005).

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Otro campo en el que se utiliza la PCR en tiempo real es el de la seguridad alimentaria.
Aqu, la identificacin de organismos genticamente modificados (OGM) en alimentos o
aditivos alimentarios es una necesidad que se puede cubrir utilizando esta tecnologa.
Bajo los principios revisados anteriormente tambin se puede acceder a la cuantificacin
de OGM, recurriendo a genes de referencia para normalizar la cantidad de ADNc
ingresado en los ensayos (Stephen Bustin, 2005).



Conceptos destacados

ADN: cido desoxirribonucleico, abreviado como ADN, es un cido nucleico que contiene
instrucciones genticas usadas en el desarrollo y funcionamiento de todos
los organismos vivos conocidos y algunos virus, y es responsable de su
transmisin hereditaria.

Polimerasa: Es una enzima capaz de transcribir o replicar cidos nucleicos.

Primer: Los oligonucletidos iniciadores o primers son fragmentos complementarios que
se van a unir a cada una de las dos cadenas separadas del templado de ADN.

Termociclador: Tambin conocido como mquina de PCR (Reaccin en cadena de la
polimerasa) o reciclador trmico de PCR es un aparato usado en Biologa Molecular que
permite realizar los ciclos de temperaturas necesarios para una reaccin en cadena de la
polimerasa de amplificacin de ADN.

SYBR Green: Es un agente intercalante que se une al ADN de doble cadena dando un
incremento de la fluorescencia a medida que aumenta la cantidad de producto de PCR.








__________________________________ _____________________________________
Los conceptos fueron extrados del informe PCR de las estudiantes Adriana Cortazar Martnez y Elsa Patricia
Silva del curso MTODOS FSICO-QUMICOS EN BIOTECNOLOGA del instituto de Biotecnologa de la
Universidad Nacional Autnoma de Mxico.

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Conclusiones

Existe una tcnica llamada secuenciacin que es ms efectiva que la PCR, es propia de la
Ingeniera gentica, la cual consiste en la determinacin de la secuencia de nucletidos
de un ADN, sin embargo, tiene un altsimo costo, teniendo en cuenta, que el costo de un
dispositivo para aplicar el proceso PCR es, relativamente alto.

El mtodo PCR fue inventado por el cientfico Karry Mullis en 1986, luego en 1991 la
compaa Roche adquiere las patentes del mtodo, para as 2 aos ms tarde desarrollar
la PCR en tiempo real (Adriana Cortazar Martnez, 2004) desde entonces es gracias a la
tecnologa informtica que ha sido posible su optimizacin para llegar a aplicativos con
errores casi nulos.

La informtica y la biologa estn dando grandes pasos, a fin de entender el genoma
humano, asimismo, mejorar la calidad de vida del ser, la interdisciplinariedad de las
mismas, proporciona un conocimiento base para futuras investigaciones y protagoniza
logros en telemedicina, oncogenes, patologas, adems la grandiosa posibilidad de
entender la procedencia humana, su creacin y su finalidad.

























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Referencias


Fuentes electrnicas

Acerca de la PCR, Hoffmann-La Roche, consultado el 27 de marzo de 2014
http://www.roche.es/portal/roche-spain/acerca_de_la_pcr

Bioinformtica, consultado el 27 de marzo en
http://es.wikipedia.org/wiki/Bioinform%C3%A1tica

Bioinformtica consultado el 27 de marzo de 2014 en


http://www.ecured.cu/index.php/Bioinform%C3%A1tica

Bioinformtica consultado el 28 de marzo de 2014 en
http://www.unav.es/genetica/bioinfo/concepto.html

Equipo PCR Tiempo Real MX3000P, consultado el 29 de marzo de 2014 en
http://www.genexpress.cl/equipo-pcr-tiempo-real-mx3000p/

LinRegPCR Heart Failure Research Center, Academic Medical Center, section K2 Meibergdreef 9,
PO Box 22660, 1100 DD Amsterdam, The Netherlands, consultado el 29 de marzo de 2014 en
http://www.hartfaalcentrum.nl/index.php?main=files&fileName=LinRegPCR.zip&description=LinR
egPCR:%20qPCR%20data%20analysis&sub=LinRegPCR

Reaccion en cadena de la polimerasa, Universidad autnoma de Mxico, 2004. Consultado el 27
de marzo de 2014 en
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/pcr.pdf

Reaccin en cadena de la polimerasa, Servicio de apoyo a la investigacin en la seccin de biologa
molecular de la universidad de Murcia, consultado el 27 de marzo de 2014 en
http://sbmsaiumu.files.wordpress.com/2012/11/pcrrt311012.pdf

Reaccin en cadena de la polimerasa, Gabinete de Botnica del CNBA (colegio nacional de buenos
aires) Buenos Aires, Argentina, consultado el 27 de marzo de 2014 en
http://www.botanica.cnba.uba.ar/Pakete/Dibulgeneral/PCR/PCR.htm

Reaccion en cadena de la polimerasa en tiempo real, consultado el 28 de marzo de 2014 en
http://www.monografias.com/trabajos64/pcr-tiempo-real/pcr-tiempo-real2.shtml#ixzz2xUOCeEIg





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Reaccion en cadena de la polimerasa en tiempo real, Msc. Luis Guzmn Masias, 2009. INSTITUTO
PERUANO DE BIOLOGA MOLECULAR, consultado el 28 de marzo de 2014 en
http://www.slideshare.net/dianyu/pcr-en-tiempo-real

Ser vivo, consultado el 27 de marzo de 2014 en
http://es.wikipedia.org/wiki/Ser_vivo#Macromol.C3.A9culas

TECNOLOGAS BIOINFORMTICAS PARA EL ANLISIS DE SECUENCIAS DE ADN, Consultado el 30 de
marzo de 2014 en
http://repositorio.utp.edu.co/dspace/bitstream/11059/2455/1/57280285R893.pdf

Termociclador, consultado el 28 de marzo de 2014 en
http://www.equiposylaboratorio.com/sitio/contenidos_mo.php?it=302


Libros

Aplicaciones PCR TR Bustin,S.A. 2005a. Real-Time PCR. In: Encyclopedia of Diagnostic Genomics
and Proteomics M.Podda & J.Fuchs, editors. Marcel Dekker.New York, p. 1131-1135.

Aplicaciones PCR TR Johnson,M., Petrauskene,O., Brzoska.P & Melancon.C. 2005. Using Real-Time
PCR for Pathogen Detection. Genetic Engineering News 25.

Bioinformtica: Simulacin, Vida Artificial E Inteligencia Artificial, Lahoz-Beltr. (2004).


Bioqumica, pp. 200. Lahoz-Beltr. (2004).