UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES IZTACALA

BIOMOLCULAS


ACTIVIDAD EXPERIMENTAL I: PURIFICACIN DE LA ENZIMA
BADH P. aeruginosa POR CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO
INICO Y ENSAYO DE SU ACTIVIDAD



EQUIPO 02:
ARMENTA DEL CARMEN LUIS ENRIQUE
JALPA PEREA ADRIAN
MONDRAGN PREZ FABIOLA
OREPEZA RODRGUEZ MARTHA ITZEL
HCTOR URIEL


GRUPO: 225
INTRODUCCIN
Las protenas son las macromolculas ms abundantes en las clulas y
constituyen casi la mitad del peso seco de la mayor parte de los organismos, su
estructura se halla compuesta por polipptidos. Dentro de las protenas, las
enzimas, son los catalizadores de las clulas y promueven la secuencia de
reacciones qumicas organizadas (Lehninger, 1991). Es por ello que, para llevar a
cabo el estudio y experimentacin de una protena de inters, sta debe ser
aislada de las dems molculas con la finalidad de obtener datos exclusivos de
dicha protena especfica.
La cromatografa de intercambio inico constituye el mtodo de separacin,
identificacin y determinacin cuantitativa de las cantidades de aminocidos en
una mezcla. sta tcnica, se basa, en gran parte, en las diferencias entre las
protenas con respecto a la densidad y al signo de sus cargas elctricas a un pH
determinado (Lehninger, 1991).
En ste proceso de intercambio inico, los iones que estn unidos en forma
electrosttica a una matriz insoluble y qumicamente inerte se reemplaza de
manera reversible por los iones de la solucin. Las protenas y otros
polielectrlitos (polmeros poliinicos) que portan cargas positivas y negativas
pueden unirse tanto a intercambiadores catinicos como aninicos segn su carga
neta. La afinidad con la que un polielectrlito particular se une a un intercambiador
inico determinado depende de las identidades y concentracin de los otros iones
en solucin (Voet y Voet, 2006).
En la purificacin de una protena dada (o algn otro polielectrlitos), se escogen
el pH y la salinidad de la solucin buffer en la que est disuelta la protena. Se
aplica en un volumen pequeo de la solucin de protena en la parte superior de la
columna que contiene al intercambiador inico y se lava la columna con el mismo
buffer. Las distintas protenas se unen al intercambiador inico con diferentes
afinidades. A medida que se lava la columna con el buffer, lo que se donomina
elucin, las protenas con afinidad relativamente bajas por el intercambiador inico
atraviesan la columna ms rpido que las que tienen afinidades mayores (Voet y
Voet, 2006).
Con el uso de un colector de fracciones, puede purificarse la protena si se
seleccionan slo las fracciones de afluente que la contienen. El contenido de
afluente de la columna puede monitorizarse en forma directa con detectores
montados en ella que miden la absorbancia de luz ultravioleta a una longitud de
onda determinada, por lo general 280 nm para las protenas, ya que las cadenas
laterales aromticas absorben con firmeza a esa longitud de onda (Voet y Voet,
2006).
Sin embargo, para purificar una sustancia debe contarse con una manera de
detectar su presencia de manera cuantitativa. Entre los ensayos proteicos ms
directos se incluyen los destinados a detectar enzimas que catalizan reacciones
con productos fciles de detectar, una posibilidad es que el producto tenga un
espectro de absorbancias caracterstico que pueda monitorizarse (Voet y Voet,
2006). Es importante decir que, la forma reducida del NAD (NADH), tiene un
espectro de absorcin fuertemente a 340 nm (Devlin, 2006).


Fig.1 Espectro de absorcion de los coenzimas de nicontinamida y flavina (Devlin, 2006)

De esta manera, como se muestra en el grfico anterior, se puede seguir la
velocidad de reduccin del NAD+ observando el incremento de absorbancia a 340
nm (Devlin, 2006).
OBJETIVO
Purificar a homogeneidad y en un solo paso cromatogrfico la enzima
betana aldehdo deshidrogenasa (BADH) de P. aeruginosa.
MATERIALES Y MTODO
1. Equilibrio de la resina Q-FastSefarosa. Inicialmente se deposit, con la
jeringa de 10 mL, 1 mL de Amortiguador I sobre la resina. Despus, se
colocado el adaptador sobre la columna y se insert en l la jeringa que
contena 9 ml del mismo amortiguador con una velocidad aproximada de 1
gota/2 seg. Luego, una vez concluido el ingreso del amortiguador, se tap
la columna por la parte inferior.
2. Unin de protenas. Se agreg con una micropipeta de 1 ml, 2 mL del
extracto celular (Exp) sobre la resina, permitiendo que el lquido drenara por
s solo y al finalizar, el drenado se recolect en un tubo limpio etiquetado
con letras FT (flow-through, el cual contena las protenas que se unieron
a la resina), del mismo modo, a una velocidad reducida.
3. Lavado de la resina. Con las misma jeringa de 10 mL y una velocidad
aproximada de 1 gota/ segundo, se lav la resina con Amortiguador I.
4. Elucin de protenas unidas. En un acto seguido, se vertieron 6 mL de
Amortiguador II, con la misma jeringa de 10 mL y a una semejante
velocidad de 1 gota/segundo. Se recolectaron, por la parte inferior de la
columna, 10 fracciones de 0.05 mL en tubos eppendorf de 1.5 mL
previamente etiquetados (PE1, PE2 PE10).
5. Identificacin de las fracciones con mayor concentracin de protena. Se
midi en el espectrofotmetro, a una =280 nm, la absorbancia de las 10
fracciones colectadas, utilizando como blanco Amortiguador II. Por una
parte, se recolectaron, en un tubo que fue etiquetada con las letras ENZ,
aquellas fracciones con una absorbancia mayor a 0.2 unidades. Por otro
lado, se midi el volumen total de aquellas fracciones recolectadas.
6. Ensayo de la actividad de la enzima BADH en el ExP, el FT y ENZ.
Primeramente, se prepararon tres cubetas de espectrofotmetro con 500
L del medio de reaccin (MR) que fueron incubadas a una temperatura de
30 C durante 10 minutos. Luego, se traslad una de las cubetas al
espectrofotmetro, se calibr a cero y se midi la absorbancia a una =340
nm, con la finalidad de avalar la nula actividad reductora de la coenzima
NADP+. A continuacin, se utiliz otra cubeta para medir la actividad
enzimtica en el extracto celular (ExP), para llevar a cabo lo anterior, se
agreg 1 L del extracto al medio de reaccin, se agit rpidamente y, de
manera inmediata, se midi el cambio de absorbancia durante 1 minuto. De
la misma manera se utilizaron las dos cubetas sobrantes, para medir la
actividad y registrar el cambio de absorbancia/min en FT y ENZ.
7. Almacn de protenas de ExP Y ENZ a -20C. Se agreg a una alcuota de
200 L, 1L de NADP+ 100Mm (ENZ-N) para estabilizar su conformacin
activa.
8. Elaboracin del perfil de elucin. Finalmente, se obtuvo el perfil de elucin
graficando el nmero de la fraccin (eje X) vs su A
280nm
(eje Y).


RESULTADOS Y ANLISIS (aqu van las dos grficas que nos dijeron)
DISCUSIN
CUESTIONARIO
Por qu se une la protena BADH a la resina?

Debido a que hubo un proceso de intercambio inico, donde cargas
opuestas se atraan dando como resultado la unin de la enzima BADH con
la resina.

Explique Por qu al cambiar de amortiguador la enzima BADH se despega
de la resina y eluye de la columna?


Por qu se mide a una longitud de onda de 280 nm la absorbancia de las
fracciones obtenidas?

Escriba la relacin que cataliza la BADH y explique Por qu cuando se
mide su actividad se registra el cambio de absorbancia en una longitud de
onda de 340 nm?













LITERATURA CITADA
Devlin, T. M. 2006. Bioqumica, libro de texto con aplicaciones clnicas. 4
ed. Editorial Revert. Barcelona-Espaa. 1188p.
Voet D. y Voet G. J. 2006. Bioqumica. 3 ed. Editorial Mdica
Panamericana. Buenos Aires. 1776p.