COMPARAO DA PRODUO DE POLIHIDROXIBUTIRATO A PARTIR DE

RESDUO AGROINDUSTRIAIS E GLICOSE PELA BACTRIA Herbaspirillum

seropedicae ESTIRPE SmR1

Fagner Grolli
1
, Fernando H. G. Tessaro
1
, Fernando A. Fovis
2
, Clarice A. Osaku
3

Universidade Estadual do Oeste do Paran
Resumo
Os polihidroxibutiratos (PHBs) tm representado um imenso potencial para
aplicao farmacutica, na rea de liberao controlada de frmacos em virtude
de suas caractersticas de biodegradabilidade e biocompatibilidade. Alm disso,
so estudados intensivamente devido a algumas propriedades fsicas
semelhantes aos plsticos petroqumicos, tendo a vantagem de serem
biodegradveis. Infelizmente, em consequncia do seu alto custo de produo,
este biopolmero no ganha o devido espao no mercado, sendo este, um dos
principais objetivos a serem alcanados para a possvel substituio do PET pelo
PHB. Este trabalho teve como objetivo buscar alternativas para diminuir o custo
da produo de PHB fazendo uso de resduos agroindustriais de baixssimo valor
comercial, na tentativa de torn-lo mais barato e competitivo em relao ao
derivado petrolfero, PET. Foram otimizados os parmetros fsicos pH,
concentrao de glicose e concentrao de amnio para a obteno de PHBs
pela bactria Herbaspirillum seropedicae estirpe SmR1 atravs do uso da
Metodologia de Superfcie e Resposta (MSR) com base no Delineamento
Composto Central Rotacional (DCCR). Observou-se que a varivel concentrao
de glicose influenciou positivamente e a concentrao de amnio influenciou
negativamente a produo de PHB por H. seropedicae. O resultado obtido com a
utilizao foi promissor, alcanou-se a produo do polmero em quantidades de
3,78 mg e 3,26 mg tendo, o meio de cultura, apenas 125 mg de bagao de cana-
de-acar e bagao de cevada, respectivamente:
Palavras-chave: Polihidroxibutiratos, Herbaspirillum seropedicae, DCCR

1
Alunos do curso de Graduao em Farmcia
2
Farmacutico Generalista
3
Docente do Centro de Cincias Mdicas e Farmacuticas/ Cascavel, PR.- Curso de Farmcia
e-mail: fagner.grolli@hotmail.com

Introduo
O uso de polmeros tm se tornado cada vez maior desde o sculo passado no
qual se iniciou as suas primeiras utilizaes. Muitos produtos utilizam os
polmeros como matria-prima para sua confeco. Das garrafas de refrigerantes,
passando pelas hastes de cotonetes, sacos de supermercados, tubos de PVC,
recipientes de poliestireno expandido, revestimentos de panelas e de latas de
conserva, mamadeiras, tintas para paredes, prteses, escovas de dente, pra-
choques de veculos, tapetes, cobertores, pneus ou suportes para componentes
eletrnicos, os polmeros esto presentes em quase a totalidade dos utenslios de
uso cotidiano (ROSA et al, 2002).
Outra aplicao atual o uso de biopolmeros para a composio de formas
farmacuticas para liberao controlada de frmacos em medicamentos e
cosmticos e uso em materiais mdico-hospitalares. Assim, a pesquisa para o
desenvolvimento de novos polmeros sintticos baseou-se exclusivamente nas
caractersticas de inrcia e resistncia biodegradao ao contrrio do que
ocorre com os polmeros naturais como o amido, celulose e protenas. Em
particular, os polmeros formados por hidrocarbonetos so resistentes ao ataque
qumico e biolgico, de tal forma que isso lhes assegura longevidade e outras
propriedades que se mantm por longo tempo (ROSA et al, 2001).
Devido a essa propriedade dos polmeros sintticos, a durabilidade, surge um
grande problema para a sociedade atual: o acmulo de lixo, em grande parte
polmeros e seus derivados. Considerando que o tempo para decomposio de
polmeros sintticos varia de 50 a 500 anos interessante buscar novas
alternativas na tecnologia de obteno de polmeros com menor tempo de
degradao (COUTINHO et al, 2004).
Dessa forma, surge um importante grupo de compostos polimricos, denominados
Polihidroxialcanoatos (PHAs) e Polihidroxibutiratos (PHBs), os quais apresentam
menor tempo de degradao, variando de 6 a 12 meses (BOHMERT et al, 2002).
Estes podem ser obtidos de matrizes renovveis atravs de tcnicas especficas
de produo, dentre elas a obteno biotecnolgica por bactrias e fungos, alm
da produo por plantas como a cana-de-acar, sendo considerados
biopolmeros (COUTINHO et al, 2004).

Os PHAs so polisteres de cidos hidroxialcanoicos e/ou hidroxialcenicos que
podem ser acumulados por diversos micro-organismos em grandes quantidades
sem afetar a presso osmtica das clulas. Estes micro-organismos acumulam os
polmeros na forma de grnulos intracelulares (que podem chegar a constituir
aproximadamente 80% da massa celular seca). Esse polmero tem como principal
funo servir como reserva de carbono e energia (LEE, 1996).
A diversidade de polmeros da famlia de PHAs e do seu vasto potencial de
aplicao depende da variao do comprimento e da composio das cadeias.
Sendo o polihidroxibutirato (PHB) o principal representante dos PHAs
(COOPERSUCAR, 2009).
As principais caractersticas dos PHAs so a rpida biodegrabilidade e
propriedades termoplsticas, dentre as quais o elevado ponto de fuso, baixa
rigidez, alta resistncia presso e ao alongamento antes da ruptura e alta
resistncia ao impacto e por isso so considerados bons substitutos dos plsticos
de origem petroqumica (COOPERSUCAR, 2009).
Devido a esta falta de competitividade comercial dos polmeros petroqumicos em
relao aos polmeros biodegradveis, justificada pela diferena no custo da
matria-prima, o PHB alvo de extensas pesquisas que procuram desenvolver a
busca por gneros bacterianos que possuam elevada produo do polmero e
utilizem como matria-prima substratos renovveis pela agricultura e de baixo
valor comercial (SILVA et al, 2007).
Uma opo para a realidade brasileira seria a utilizao do bagao de cana-de-
acar. Estima-se que no Brasil, a cada ano, sobrem de 5 a 12 milhes de
toneladas deste resduo onde, as indstrias sucro-alcooleiras, usam de 60 % a 90
% deste volume de resduo para produo de energia trmica e eltrica (FAPESP,
1998).
Este trabalho teve como principal objetivo busca pela produo de biopolmero
utilizando a bactria, gram negativa e fixadora de nitrognio Herbaspirillum
seropedicae estirpe SmR1 a partir de resduos agroindustriais como o bagao de
cana-de-acar, resduo fibroso de mandioca, palha de milho e bagao de
cevada, dejetos agrcolas sem utilizao comercial alm de serem adquiridos com

baixssimo custo. Para poder comparar se a produo com os resduos era vivel,
foi otimizado os parmetros fsicos de pH, concentrao de glicose e
concentrao de amnio para a produo de PHB pela estirpe SmR1 de H.
seropedicae utilizando o planejamento experimental baseado na metodologia de
Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) aliado a metodologia de
superfcie de resposta (MSR).

Material e Mtodos

Micro-organismo
Utilizou-se a estirpe SmR1 de Herbaspirillum seropedicae cedida pelo Ncleo de
Fixao de Nitrognio da Universidade Federal do Paran.

Meio de cultura
Utilizou-se o meio Nfb (Novo Fabio Pedrosa) lquido (KLASSEN et al., 1997), ao
qual foram adicionadas diferentes concentraes de glicose como fonte de
carbono. A composio apresentada na tabela 1.

Tabela 1 Composio do Meio Nfb (KLASSEN et al., 1997).
g/L Componentes g/L
MgSO
4
.7H
2
O 2,0 x 10
-1
Biotina 1,0 x 10
-4

NaCl 1,0 x 10
-1
Na
2
MoO
4
.2H
2
O 2,0 x 10
-3

CaCl
2
2,0 x 10
-2
MnSO
4
.H
2
O 2,35 x 10
-3

cido Nitrilotriactico 5,6 x 10
-2
H
3
BO
3
2,8 x 10
-3

FeSO
4
.7H
2
O 2,0 x 10
-2
CuSO
4
.5H
2
O 8,0 x 10
-5


Em todos os cultivos manteve-se a relao de 1/5 entre o volume do meio e o
volume total do frasco empregado com o objetivo de garantir uma aerao ideal.
Para testar os resduos agroindustriais como fontes de carbono foram adicionadas

ao meio de cultura: bagao de cana; bagao de cevada, resduo fibroso de
mandioca e palha de milho.

Determinao de Polihidroxibutirato (PHB)
A determinao do PHB foi realizado de acordo com LAW e SLEPECKY (1960). A
quantidade de cido crotnico foi calculada utilizando-se o coeficiente de extino
molar desta substncia que 1,55x10
4
(SLEPECKY & LAW, 1960 a, b). Dessa
forma calculou-se a concentrao de PHB sabendo-se que a quantidade de cido
crotnico proporcional ao contedo de PHB da amostra.

Otimizao da produo de PHB atravs de Delineamento Composto Central
Rotacional (DCCR)
Foi realizada a otimizao da produo de PHB (varivel dependente) utilizando-
se trs variveis independentes: concentrao de glicose, concentrao de
amnio e pH. O estudo envolveu a aplicao de RSM (Metodologia de Superfcie
de Resposta) com o uso de DCCR atravs do modelo 2
3
fatorial com oito ensaios
lineares (nveis +1 e -1), trs rplicas no ponto central (nvel 0) e seis pontos
axiais (com = 1,68). A equao quadrtica = o + ixi + ixi2 + ijxixj foi
utilizada como modelo, onde o a resposta, o a intercepo, i o coeficiente
linear e ij o coeficiente da interao. O modelo avalia os efeitos lineares,
quadrticos e termos interativos das variveis independentes na varivel
dependente ().

Anlise estatstica
Utilizou-se o software Statistica 7 (StatSoft Inc.) para a anlise de regresso dos
dados experimentais e para obter os grficos da superfcie de resposta.




Resultados e Discusso
Com base na Metodologia de Superfcie de Resposta (BOX et al, 1978) foi
realizada a anlise dos resultados, sendo que o delineamento estatstico (valores
codificados e reais) com os resultados dos ensaios experimentais apresentado
na Tabela 2, onde se observa que as maiores produes de PHB (350,0; 243,89 e
236,48 mg) foram obtidas nos ensaios 13, 4 e 12 respectivamente e as menores
quantidades foram obtidas nos ensaios 1, 6, 9 e 11.
Baseado no modelo dos coeficientes estimados pelas regresses lineares
mltiplas, no intervalo de confiana de 95%, verificou-se que as variveis lineares
concentraes de glicose e amnio foram significativas para a produo de PHB,
sendo que a concentrao de glicose influenciou positivamente e a concentrao
de amnio influenciou negativamente a produo de PHB. A varivel pH linear e
as variveis quadrticas bem como as interaes entre as variveis no obtiveram
significncia estatstica.

Tabela 2: DCCR usado para otimizar os parmetros fsicos para a produo de
polihidroxibutirato (PHB) pela estirpe SmR1 de Herbaspirillum seropedicae.
Nveis
Ensaio x1
pH
x2
Glicose
(mM)
x3
Amnio
(mM)
PHB (mg)
1 -1 (6,0) -1 (30) -1 (5,0) 83,63
2 +1 (8,0) -1 (30) -1 (5,0) 123,59
3 -1 (6,0) +1 (70) -1 (5,0) 174,2
4 +1 (8,0) +1 (70) -1 (5,0) 243,89
5 -1 (6,0) -1 (30) +1 (15) 72,16
6 +1 (8,0) -1 (30) +1 (15) 96,53
7 -1 (6,0) +1 (70) +1 (15) 139,12
8 +1 (8,0) +1 (70) +1 (15) 181,06
9 -1,68 (5,32) 0 (50) 0 (10) 89,11
10 +1,68 (8,68) 0 (50) 0 (10) 212,98
11 0 (7,0) -1,68 (16,4) 0 (10) 74,3
12 0 (7,0) +1,68 (83,6) 0 (10) 236,48
13 0 (7,0) 0 (50) -1,68 (1,6) 350,0
14 0 (7,0) 0 (50) +1,68 (18,4) 106,08
15 0 (7,0) 0 (50) 0 (10) 192,16
16 0 (7,0) 0 (50) 0 (10) 187,62
17 0 (7,0) 0 (50) 0 (10) 189,35


DV: PHB (mg)
200
100
0
-100
5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0
pH
10
20
30
40
50
60
70
80
90
G
lic
o
s
e

(
m
M
)
A partir dos efeitos das variveis que influenciaram na produo de PHB,
conforme a tabela acima, se elaborou a equao matemtica descrita abaixo para
prever a produo deste biopolmero.
PHB (mg) = 192,2540 + 93,0497 x (Glicose mM) - 80,0636 x (Amnio mM)
Nos ensaios realizados observou-se distribudos aleatoriamente de forma que o
modelo estatstico utilizado baseia-se numa distribuio paramtrica normal.
Dessa forma, foi realizada a anlise de varincia (ANOVA) na qual se verificou
que o valor R
2
(coeficiente de correlao mltipla) foi de 0,82569 indicando que
82,569% da variabilidade na resposta pode ser explicada pelo modelo matemtico
obtido.
Conforme a ANOVA o valor do F
calc
= 3,68 maior do que F
tab
(9;7;0.05) = 3,29,
no intervalo de confiana de 95%, de modo que o modelo matemtico
considerado aceitvel para descrever o comportamento da produo de PHB uma
vez que a relao F
calc
/F
tab
> 1 demonstra que h diferena entre as mdias
quadrticas da regresso e dos resduos.
A superfcie de resposta indicada na Figura 1 pode ser usada para visualizar o
efeito das variveis concentrao de glicose (mM) e pH sobre a produo de PHB
(mg).










Figura 1 - Superfcie de resposta mostrando o efeito das variveis concentrao
de glicose e pH sobre a produo de PHB por H. seropedicae Sm1 aps 50 horas
de cultivo a 30C e 120 rpm.


Podemos visualizar a influncia da varivel pH linear sobre a produo de PHB na
Figura 1 de forma que as maiores quantidades deste polmero foram obtidas nos
ensaios cujo o meio de cultivo apresentou pH inicial mais alcalino (pH acima de
7,0).
A interferncia negativa do amnio sobre a produo de PHA e PHB tambm foi
observada com outros micro-organismos, BRANDL et al (1988) observaram este
fato em Pseudomonas oleovorans, utilizando octanoato como fonte de carbono,
no qual verificaram o efeito de diferentes concentraes de amnio (0, 5, 10, 25 e
50 mM) sobre a produo de PHB por este micro-organismo, sendo que a
produo de PHB foi inversamente proporcional quantidade de amnio
adicionada ao meio de cultivo.
COUTO (2005) evidenciou o envolvimento da protena glnD na regulao por
amnio da biossntese de PHB em H. seropedicae. No entanto, no h estudos
mais acurados sobre a interferncia negativa do amnio sobre o metabolismo do
carbono e a sntese de PHB.
Aps a otimizao com glicose, buscou-se outras fontes de carbono e, analisando
a tabela 3, pode se comparar a produo do PHB em relao a cada resduo
utilizado e observa-se a produo de 3,78 e 3,26 mg de polmero tendo como
fonte de carbono exclusivamente o bagao de cana-de-acar e o bagao de
cevada, respectivamente.

TABELA 3: Quantidade de PHB produzida conforme fonte de carbono utilizada.
Resduo Agroindustrial PHB (mg)
Bagao cana-de-acar 3,78 0,081

Bagao de cevada 3,26 0,004
Resduo fibroso de mandioca 1,67 0,066
Palha de milho 1,85 0,033
RODRIGUES (2005) obteve a produo de PHB utilizando a bactria Cupriavidus
necator e obteve 0,65 mg de PHB por grama de fonte de carbono; em
comparao com os valores obtidos pela bactria H. seropedicae utilizando o
bagao de cana de acar que foi de 3,78 mg de PHB para 125 mg de fonte de

carbono, dando dessa maneira 30,24 mg/g de fonte de carbono o que daria um
rendimento de 46 vezes.

Consideraes Finais
O microorganismo utilizado se mostrou capaz de crescer no meio de cultura tendo
como nica fonte de carbono o resduo agroindustrial. Desta maneira, a produo
de PHB por Herbaspirillum seropedicae pode ainda ser melhorada, aumentando
sua capacidade produtiva e reduzir ainda mais, os custos do biopolmero
tornando-o mais competitivo comercialmente aos polmeros derivados do petrleo.
Em comparao com o processo otimizado utilizando-se a glicose com fonte de
carbono com os resduos agroindustriais, observamos que a produo de PHB foi
pelo menos 90 vezes superior utilizando a glicose, mas comparando com a
literatura observamos que bactria H. seropedicae tem um potencial como
produtora de PHB em relao Cupriavidus necator utilizada por RODRIGUES
(2005).

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