Capitulo 1: Introduccin

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Captulo 1


Introduccin

n este captulo se dar una breve descripcin de lo que son las enzimas y
sus propiedades. Posteriormente, se expondrn aspectos generales de la
enzima AHAS tales como: los organismos en que se encuentra, las
reacciones que cataliza, los cofactores que posee y el ciclo cataltico que hasta el
momento se le ha postulado en literatura. Esto permitir revelar las interrogantes
asociadas a la enzima y as dar paso a la propuesta de trabajo en que est enfocada
esta tesis.
E
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2 2


1.1 Enzimas.

Las enzimas son protenas globulares, de gran tamao y que funcionan como
catalizadores biolgicos. Estn formadas por largas cadenas de aminocidos unidos
a travs de enlaces peptdicos. Estas cadenas de residuos de aminocidos
presentan una secuencia definida, la cual otorga las propiedades especficas que
posee cada enzima. En este sentido las enzimas pueden presentar diferentes
estructuras de ordenamiento: la primera de ellas corresponde a la secuencia de
aminocidos de la cual est constituida la enzima y es lo que se considera como la
estructura primaria. El siguiente nivel de organizacin abarca a las hlices alfa y a la
conformacin beta plegada, estas dos formas estn determinadas por el tipo de
interaccin entre las cadenas laterales de aminocidos de distintos polipeptidos
dentro de la enzima y son las que componen las estructuras secundarias. La
estructura terciaria corresponde a la disposicin tridimensional de todos los tomos
que componen la protena. Por ltimo se encuentra la estructura cuaternaria, la
cual se compone de complejos de ms de una cadena polipeptdica. Estos tipos de
plegamientos estn regidos por las interacciones entre los enlaces no covalentes
presentes en el ambiente enzimtico. Estas interacciones corresponden a enlaces de
hidrgeno, enlaces inicos y a fuerzas de Van der Waals las cuales ayudan a
mantener la forma de las enzimas. Es as como la distribucin de los
aminocidos polares y no polares orientan la forma en que se pliegan las enzimas.
Las cadenas laterales apolares tienden a agruparse en el interior de la enzima,
mientras que las cadenas laterales polares, tienden por s mismas a disponerse cerca
del exterior. En general una enzima siempre se pliega de tal forma que su
estructura adopte la menor energa libre posible. Las diferencias de plegamientos y
formas, definen las llamadas isoenzimas o isozimas. Estas enzimas corresponden a
enzimas que difieren en su secuencia de aminocidos y por ende en su
ordenamiento estructural. Sin embargo se caracterizan principalmente por catalizar
la misma reaccin qumica que otras enzimas, pero mostrando diferentes
parmetros cinticos.

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Cada enzima acta sobre un sustrato especfico y generalmente cataliza
exclusivamente una sola reaccin, aunque esto vara dependiendo de la cantidad de
cofactores que presente cada enzima en su composicin. La regin en que las
enzimas llevan a cabo la reaccin con los sustratos se denomina sitio activo. Las
enzimas en su sitio activo requieren adems de la presencia de molculas no
proteicas para ejercer su actividad cataltica que se denominan cofactores, estas
pueden ser metales divalentes o molculas orgnicas que reciben el nombre de
coenzimas.
En un principio se pensaba que esta interaccin enzima-sustrato ocurra bajo el
modelo de llave cerradura, pero sin embargo este modelo falla al intentar explicar
la estabilizacin de los estados de transicin. Por este motivo Daniel Koshland

sugiere en 1958 el modelo de acoplamiento o encaje inducido, en donde se
establece que las enzimas son estructuras bastante flexibles con lo que el sitio activo
podra cambiar su conformacin estructural debido a la interaccin con el sustrato.
Como resultado, las cadenas aminoacdicas que componen el sitio activo
interactan especficamente con los distintos cofactores y sustratos, permitiendo a la
enzima llevar a cabo su funcin cataltica. Existe un tercer modelo, llamado tensin
sobre el sustrato, que es derivado del modelo de Koshland. En este modelo el
sustrato es tensionado hacia la formacin del producto como resultado de una
transicin conformacional inducida por la enzima, la cual deforma los ngulos de
enlace y activa al sustrato.
Una manera de cuantificar la interaccin enzima-sustrato es a partir de la constante
de Michaelis (Km), obtenida desde la ecuacin de Michaelis-Menten. Esta
constante tiene una gran importancia prctica debido a que es independiente de la
concentracin de la enzima, permite el clculo de la concentracin de sustrato que
conduce a la velocidad correspondiente al 50% de la velocidad mxima de reaccin
y constituye una medida de afinidad de las enzimas por el sustrato. Dentro de este
mbito existen adems otros factores que influyen en la interaccin enzima-sustrato
y que estn directamente relacionados con la actividad enzimtica. Entre ellos se
encuentran la temperatura, la cual cuando aumenta tambin lo hace la velocidad
enzimtica, pero si esta aumenta demasiado se produce la desnaturalizacin del
ambiente proteico, con lo que se anula la actividad enzimtica. Otro factor es el
pH, el cual es especfico para la actividad mxima en cada enzima y basta un
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pequeo cambio para provocar la desnaturalizacin de esta, que en otras palabras
se refiere a la modificacin de todas las estructuras de la enzima, excepto la
estructura primaria. Los diferentes tipos de cofactores, el efecto de la concentracin
de sustrato y de los productos finales, la existencia de isoenzimas, adems de
modificaciones alostricas y covalentes en la estructura proteica de las enzimas,
tambin provocan variaciones de la actividad enzimtica. Uno de los factores ms
importantes que influyen en la actividad enzimtica y que generan un gran inters
debido a sus aplicaciones, es la presencia de inhibidores. Estos pueden clasificarse
segn la forma en que interactan con las enzimas, la cual puede ser de forma
reversible o irreversible. Los inhibidores irreversibles reaccionan con la enzima
para producir una protena que no tiene actividad enzimtica y a partir de la cual es
imposible regenerar la enzima original. En cambio los reversibles se unen
covalentemente a la enzima pero posteriormente puede ser liberado, por lo que se
habla de una unin temporal. Dentro de esta ltima clasificacin estos pueden
subdividirse segn la manera en que intervienen en la reaccin, de forma
competitiva y no competitiva con respecto al sustrato.
En la actualidad se conoce un gran nmero de enzimas, las cuales catalizan una
amplia gama de reacciones en los ms diversos organismos. Por este motivo la
Unin Internacional de Bioqumica y Biologa Molecular ha desarrollado una
nomenclatura para identificar a las enzimas, basada en los denominados nmeros
EC (Enzyme Commission), donde la clasificacin comienza con las letras EC,
seguidas por cuatro nmeros los cuales estn separados por puntos. El primer
nmero indica la clase principal de la enzima y los siguientes son especificaciones
progresivas. Las clases principales se dividen en: 1. Oxidoreductasas: que catalizan
reacciones de oxidorreduccin; 2. Transferasas: que transfieren grupos activos a
otras unidades receptoras, pero no transfieren molculas de agua; 3. Hidrolasas: las
cuales catalizan reacciones de hidrlisis con la consiguiente obtencin de
monmeros a partir de polmeros; 4. Liasas: que catalizan reacciones en las que se
adicionan grupos a dobles enlaces o se forman dobles enlaces a travs de la
eliminacin de grupos H2O, CO2 y NH3; 5. Isomerasas: que transfieren grupos
dentro de la misma molcula para formar ismeros; 6. Ligasas: que catalizan la
degradacin o sntesis de los enlaces C-C, C-S, C-O y C-N mediante el
acoplamiento de molculas de alto valor energtico.
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Dentro de la clasificacin de las transferasas se encuentra una de las enzimas ms
importantes para la vida de organismos tales como bacterias, hongos y plantas. La
enzima acetohidroxi sintasa, conocida comnmente como AHAS o acetolactato
sintasa se denomina con el nmero EC 2.2.1.6. El primer nmero se debe a que la
AHAS participa en las primeras etapas de la ruta biosinttica de los aminocidos de
cadena ramificada valina, leucina e isoleucina, por lo que sus productos son
transferidos a otras enzimas de la ruta biosinttica, (transferasa). El segundo
nmero, el 2, se debe a que las molculas transferidas poseen al menos un grupo
cetnico en su estructura. En tanto el tercer nmero, el 1, denota que la enzima
corresponde a una transcetolasa (transfiere molculas formadas por la
condensacin de dos tomos de carbono). Por ltimo el numero 6 corresponde
solo a un nmero arbitrario de clasificacin para las transferasas.
La produccin de los aminocidos de cadena ramificada en la que est involucrada
la AHAS es de vital importancia para el desarrollo y crecimiento de los organismos
antes mencionados. La inhibicin de esta enzima y por ende de la produccin de
estos aminocidos conduce a la muerte de los organismos. Con esta caracterstica la
AHAS se ha convertido en el principal blanco de inhibidores, entre los que se
encuentran herbicidas, fungicidas y agentes antimicrobianos. Los herbicidas se
utilizan en las plantaciones para la eliminacin de malezas, las cuales son dainas ya
que compiten directamente con los cultivos por el acceso al agua, al sol y a los
nutrientes. En tanto los agentes antimicrobianos se han desarrollado para la
eliminacin de bacterias responsables de enfermedades tales como la
tuberculosis.







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1.2 AHAS.

El acido acetohidroxi sintasa (AHAS; EC 2.2.1.6) es una enzima que se encuentra
en plantas, algas, hongos y bacterias, tal como se mencion anteriormente. Su
funcin es catalizar los primeros pasos comunes que posee la ruta biosinttica de
los aminocidos de cadena ramificada valina, leucina e isoleucina. Las reacciones
que cataliza la AHAS consisten en la condensacin de dos molculas de -ceto
cidos, figura 1. En primera instancia cataliza la descarboxilacion, de forma
irreversible y no oxidativa, de una molcula de piruvato.









Figura 1. Sntesis de (2S)-2-acetolactato y (2S)-2-aceto-2-hidroxibutirato. Los tomos de
carbono en negro, los de oxigeno en rojo y los de hidrgenos en blanco.
Posteriormente la enzima puede formar dos tipos de productos, dependiendo de
cul sea el segundo -ceto cido en reaccionar. Si este corresponde a una segunda
molcula de piruvato, se produce la formacin de (2S)-2-acetolactato (AL), el cual
es el precursor de los aminocidos de cadena ramificada valina y leucina. Pero si el
segundo sustrato corresponde a una molcula de 2-cetobutirato (2-CB) se produce
la formacin de (2S)-2-aceto-2-hidroxibutirato (AHB) el cual es el precursor del
aminocido de cadena ramificada isoleucina.

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N
N
CH2
N
+
S
NH
2
C H
3
CH
3
CH2
CH2
O
P
O
O
O
-
P
OH
O
O
-
H
Mg
2+
1`
1
2
3
4
5
2`
3`
4`
5`
6`
6
7
7`
P

La AHAS pertenece a la familia de las enzimas tiamina dependiente, ya que para su

actividad cataltica requiere del cofactor tiamina difosfato (ThDP). Pero adems, la
AHAS requiere de la presencia de otros dos cofactores. El primero corresponde al
metal divalente Mg y el segundo corresponde al cofactor flavina adenina
dinucleotido (FAD).
El cofactor encargado de llevar a cabo las reacciones al interior de la enzima es el
cofactor 3-[(4-amino-2-metil-pirimidina-5-il)metil]-5-(2-[hidroxidifosfato]etil)-4-
metil-1,3-tiazolio, el cual es el derivado activo de la vitamina B1 y es conocido
comnmente como ThDP. Este cofactor est formado por un anillo tiazolio y por
un anillo pirimidnico. El anillo pirimidnico se encuentra sustituido en la posicin
2 por un grupo metilo y en la posicin 4 por un grupo amino. Ambos anillos estn
enlazados a travs de un carbono puente con el cual forman los ngulos diedros P
= N3-C7-C5-C4 y T = C2-N3-C7-C5 tal como se muestra en la figura 2. Las
tres conformaciones bsicas que puede adoptar el ThDP debido a la torsin de
estos diedros son: la conformacin tipo F ( 90, 0), la conformacin tipo S (
150, 100) y la conformacin tipo V ( 70, 95), en donde el primer valor
corresponde al diedro p y el segundo al diedro T, respectivamente.




Figura 2. Estructura del cofactor tiamina difosfato con diedros p y T.
La conformacin tipo V es la que confiere la actividad al ThDP, debido a la
cercana existente entre el grupo imino del anillo pirimidnico y el hidrgeno
enlazado al carbono C2 en el anillo tiazolio, entre los cuales existe una distancia
promedio de 3.0 . Esta cercana permite la abstraccin del hidrgeno enlazado al
carbono C2 por parte del grupo imino, produciendo de esta manera la formacin
de la especie activa conocida como iluro, figura 3. Estas etapas de activacin
consideran un equilibrio tautomerico que comienza con la protonacin del
nitrgeno N1 por parte del aminocido altamente conservado acido glutmico
(Glu139 en la AHAS). Con esto el anillo de aminopirimidina pasa de la forma 4-
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aminopirimidina (AP) a la forma 4-aminopirimidinio (APH). Luego, el grupo
amino cuaternario cede uno de sus protones y el anillo queda en la forma 1,4-
iminopirimidina (IP). Por ltimo, el grupo imino del anillo de pirimidina en la
forma IP extrae el tomo de hidrgeno enlazado al carbono C2 formando la
especie altamente reactiva iluro. Se ha postulado que estas etapas de activacin son
comunes para todas las enzimas tiamina dependientes, al igual que los dos
primeros pasos del ciclo cataltico de la AHAS .








Figura 3. Mecanismo de protonacin del cofactor ThDP correspondiente a las etapas de
activacin del cofactor (verde) para formacin del intermediario iluro (azul).
Por otra parte en lo que respecta al anillo tiazolio, ste adems de estar unido al
carbono puente, se encuentra enlazado por su otro extremo a un grupo
etilhidroxidifosfato, el cual a su vez esta unido al metal divalente Mg. Este metal
cumple la funcin de anclar al ThDP al sitio activo de la AHAS al interactuar con
dos aminocidos del ambiente enzimtico, los cuales corresponden especficamente
a un cido asprtico y a una asparraguina.
El otro cofactor presente en la AHAS y que no interacciona con sustratos debido a
que la AHAS no lleva a cabo reacciones de oxido-reduccin, es el cofactor flavina
adenina dinucleotido (FAD). Este cofactor est compuesto por una unidad de
riboflavina (vitamina B2), que est unida a un grupo pirofosfato, el cual que est
enlazado a una ribosa, la que a su vez est unida a una adenina, figura 4. Se ha
postulado que el FAD confiere dos propiedades fundamntales a la AHAS, una de
ellas consiste en el aumento de la actividad cataltica de la enzima cuando este
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N
N
N
N
O
N H
2
O
OH O H
O
P
O
O
O H
P
O
OH
OH
O H
OH
N
NH N
O
O
CH
3
C H
3
cofactor se encuentra presente y la otra es que estimula a la AHAS a adoptar la
conformacin de tetrmero, confiriendo al FAD un rol estructural dentro de la
enzima.






Figura 4. Estructura del cofactor FAD, las unidades de riboflavina, adenina, ribosa y el
grupo difosfato se muestran con los colores: azul, rojo, verde y amarillo, respectivamente.
El ciclo cataltico de la AHAS postulado hasta el momento se muestra en la
figura 5. Consta de cuatro pasos principales, el primero de estos pasos se compone
de un ataque nucleoflico por parte del carbono C2 del intermediario iluro sobre el
carbono carbonlico de una molcula de piruvato, generando al intermediario (2S)-
2-[(1-carboxi-1-hidroxi)etil]-tiaminadifosfato tambin conocido como 2-lactil-
tiaminadifosfato (L-ThDP). En el segundo paso el L-ThDP sufre una
descarboxilacin dando origen al segundo intermediario del ciclo cataltico: el 2-(1-
hidroxietil)-tiaminadifosfato (HEThDP). Una caracterstica importante de este
intermediario es que sus dos estructuras resonantes correspondientes a la forma de
enamina y la forma activa C2-carbanin poseen diferente reactividad, siendo ms
estable la forma de enamina. En tanto la forma C2-carbanin es la que contina
con el ciclo cataltico de la AHAS, dando origen al tercer paso del ciclo. En este
tercer paso el HEThDP, en su forma aninica, reacciona con el segundo -ceto
cido, el cual puede ser una molcula de piruvato o una molcula de 2-cetobutirato.
En esta etapa el carbono C2 realiza un ataque nucleoflico sobre el carbono
carbonlico de la segunda molcula de sustrato en cuestin, formando el
intermediario (1S,2S)-2-[(2-carboxi-1,2-dihidoxi-1,2-dimetil)-etil]-tiaminadifosfato,
comnmente conocido como 2-acetolactato-tiaminadifosfato (AL-ThDP), cuando
reacciona con una molcula de piruvato, como tambin el intermediario (1S,2S)-2-
[(2-carboxi-1,2-dihidoxi-2-etil-1-metil)-etil]-tiaminadifosfato que comnmente recibe
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el nombre de 2-acetohidroxibutirato-tiaminadifosfato (AHB-ThDP) cuando
reacciona con la molcula de 2-cetobutirato, respectivamente.























Figura 5. Ciclo cataltico de la enzima AHAS reportado en literatura.
De acuerdo a lo postulado en bibliografa, un punto a destacar en este tercer paso
es que al igual que en el paso nmero uno del ciclo, aqu tambin es necesaria la
presencia de algn residuo cercano al cofactor que posea un grupo ionizable capaz
de protonar al oxgeno carbonlico del segundo -ceto cido. Por ltimo, en el paso
nmero cuatro del ciclo cataltico el producto es liberado tras el rompimiento del
enlace C2-C2 y el cofactor ThDP es regenerado en la forma de iluro el cual se
reinserta nuevamente en el ciclo. Pero, adems en este cuarto paso, nuevamente es
necesaria la presencia de algn residuo cercano al cofactor que posea un grupo
ionizable, el cual ahora debe promover la extraccin del hidrgeno ubicado en el
primer hidroxilo formado de los intermediarios AL-ThDP o AHB-ThDP, segn
sea el caso, con el fin de formar los productos (2S)-2-acetolactato y (2S)-2-aceto-2-
hidroxibutirato, respectivamente. Sin embargo, a raz de los anlisis de la
estructura cristalina de la AHAS presentados en literatura, los aminocidos
cercanos al sitio activo de la enzima y principalmente aquellos que se encuentran
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prximos al grupo amino del anillo pirimidnico y al carbono C2 del anillo tiazolio,
no poseen grupos ionizables capaces de realizar estas funciones. Debido a estas
interrogantes, se ha postulado para los pasos nmero 3 y 4 del ciclo, la posibilidad
de que el mecanismo ocurra intramolecularmente sin la presencia de grupos
ionizables pertenecientes a cadenas laterales cercanas al sitio activo.

1.3 Propuesta de investigacin.

En los ltimos 30 aos se han publicado una gran cantidad de artculos
relacionados con esta enzima, con el fin de comprender en su totalidad los
mecanismos de activacin e inhibicin. Entre los aspectos ms relevantes que se
han publicado se encuentran por ejemplo la obtencin de la estructura cristalina de
la AHAS a partir de extracciones de la enzima realizadas a diversas bacterias, clases
de hongos y tipos de plantas. Adems se han realizado estudios enfocados tanto en
su actividad cataltica, como tambin en la deteccin de los intermediarios
presentes en el ciclo cataltico, para los cuales adems se han determinado las
constantes de velocidad de formacin. Sin embargo, a pesar de esta gran
cantidad de estudios realizados, aun existen interrogantes relacionadas con esta
enzima. Entre estas interrogantes se encuentran aspectos relacionados directamente
con su ciclo cataltico, referentes a la forma en que ocurren los mecanismos de
reaccin que dan paso la formacin de los intermediarios en los distintos pasos del
ciclo cataltico, adems de la ausencia de grupos ionizables cercanos al sitio activo
capaces de promover transferencias protnicas para la formacin de estos
intermediarios. En lo que respecta a estas interrogantes, uno de los pasos del ciclo
cataltico de la AHAS que se ve principalmente afectado por la falta de estos grupos
ionizables y del cual adems se desconoce la forma en que ocurre su mecanismo de
reaccin, es el paso nmero 1 del ciclo cataltico, correspondiente a la formacin
del L-ThDP. Tal como se describi en la seccin anterior, este paso consta de un
ataque nucleoflico por parte del cofactor tiamina difosfato (ThDP) hacia el primer
sustrato incorporado en el ciclo cataltico de la AHAS correspondiente a una
molcula de piruvato cuando el cofactor ThDP se encuentra bajo la forma de iluro,
figura 6.

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Figura 6. Mecanismo de formacin del intermediario L-ThDP en literatura.
Adems, en este paso se requiere de la protonacin del oxgeno carbonlico de la
molcula de piruvato, para la formacin del intermediario L-ThDP. Pero, debido
a que en el sitio activo de la enzima no existe la presencia de algn cido o de un
grupo de similares caractersticas, el origen del protn requerido en esta etapa
del ciclo cataltico es desconocido.
Como una posible respuesta a esta interrogante, en la presente tesis se ha propuesto
un mecanismo para la formacin del intermediario L-ThDP, el cual no requiere de
la presencia de un grupo con carcter cido aledao al sitio activo de la enzima.
Con esto se postula que el origen del hidrgeno requerido en esta etapa del ciclo
cataltico proviene del mismo cofactor ThDP, especficamente del grupo imino
cuaternario presente en el anillo de pirimidina cuando este se encuentra en la
forma de APH, figura 7.




Figura 7. Mecanismo postulado para la formacin del intermediario L-ThDP.





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1.4 Hiptesis y objetivos del trabajo de tesis.

1.4.1 Hiptesis.

La protonacin del oxgeno carbonlico de la molcula de piruvato en la
formacin del intermediario L-ThDP, se lleva a cabo por el grupo 4-imino
del intermediario iluro, cuando este se encuentra con el anillo pirimidnico
bajo la forma de APH.

1.4.2 Objetivos.

Objetivo general: modelar tericamente mediante mtodos mecnico
cunticos el mecanismo de reaccin postulado para la formacin del
intermediario L-ThDP desde el punto de vista de la cintica, reactividad y
termodinmica.

Objetivos especficos:

1. Cintica: explorar el mecanismo de reaccin y determinar la barrera
de activacin para la formacin del L-ThDP, considerando los
sustratos aislados en fase gas, mediante la construccin de una
superficie de energa potencial (SEP) con el anillo pirimidnico en la
forma de APH al momento de realizar la trasferencia protnica.

2. Reactividad: calcular las funciones de Fukui y los ndices atmicos
de Fukui para los reactantes y estado de transicin.

3. Termodinmica: calcular los G en fase gas y en solucin para la
reaccin acido base entre el residuo altamente conservado GLU139
y el intermediario iluro bajo las formas AP y APH, utilizando
solventes con distintos valores de constante dielctrica.