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Apenas uma das fitas do DNA transcrita dando origem a uma nica sequncia de mRNA para

cada gene. A indicao de qual fita do DNA deve ser transcrita orientada por uma sequncia especfica
denominada promotor, localizada antes (upstream) da sequncia a ser transcrita, que reconhecida
pela RNA polimerase (enzima sintetisadora de mRNA). Como a RNA polimerase adiciona
sequencialmente monofosfatos de ribonucleosdeo extremidade 3 da cadeia de RNA em crescimento, a
polimerizao ocorre na direo 5 - 3. Isto significa que cada molcula de mRNA ser identica
sequncia nucleotdica da fita de DNA que no transcrita. O mRNA transcrito transportado para os
ribossomos (RNA ribossmico, rRNA) no citoplasma, onde ocorre a sntese protica.
O material gentico de certos virus (retrovirus) o RNA e a informao gentica segue, portanto,
a direo reversa (de RNA para DNA). Este processo conhecido por transcrio reversa, na qual a
sintese de DNA dirigida pelo RNA e a enzima responsvel denominada transcriptase reversa. Essa
enzima tem importante funo no ciclo vital dos retrovrus.

Traduo
A relao entre a sequncia de nucleotdeos do DNA e a sequncia de aminocidos da proteina
correspondente denominada cdigo gentico. Esse cdigo universal e encontrado em todos os
organismos vivos. O cdigo gentico lido em grupos de trs nucleotdeos, cada um codificando um
aminocido (Tabela 1). Cada sequncia de trinucleotdeo denominada codon e a sequncia de
condons que codifica um polipeptdeo especfico denominada cistron.
O processo de decodificao pelo qual a informao gentica presente na molcula de mRNA dirige a
sntese proteica denominado traduo. Esse processo envolve o mRNA, o rRNA e o RNA de
transferncia ou tRNA, encontrado no citoplasma. Cada tRNA tem 70-90 nucleotdeos em comprimento e
de fita simples, mas devido ao pareamento de bases dentro da molcula, adquire a forma de uma folha
de trevo. Dentro dessa estrutura, um trinucleotdeo de sequncia varivel forma o anti-codon que pode
parear com um codon da molcula de mRNA. Na outra extremidade da molcula de tRNA est uma
sequncia para ligao a um aminocido especfico. Portanto, um codon particular no mRNA
relacionado atravs de um tRNA a um dado aminocido. Na traduo, o ribossoma liga-se primeiramente
a um stio especfico na molcula de mRNA (codon de iniciao, ATG) que ajusta a fase de leitura
("reading frame"). O ribossoma, ento, se movimenta ao longo da molcula de mRNA, traduzindo um
codon de cada vez usando tRNAs para adicionar aminocios ao final da cadeia polipeptdica em
alongamento. A traduo finalizada quando o ribossoma reconhece na fita de mRNA o codon de
terminao ("stop codon"). A direo da leitura de 5-3, sendo que a sequncia de nucleotdeos da fita
de DNA corresponde sequncia de aminocidos da proteina traduzida na direo do N-terminal para o
C-terminal.
Em princpio as sequncias de bases nos cidos nucleicos devem ser traduzidas em qualquer
fase de leitura diferente, dependendo onde o processo de decodificao se inicia. Para uma dada
sequncia UUAGCAAAGCUGCGAAUG, as trs fases de leitura possveis so :
UUA GCA AAG CUG CGA A
UAG CAA AGC UGC GAA U
AGC AAA GCU GCG AAU G
Entretanto, o cdigo gentico no se sobrepe, pois a fase de leitura ditada pelas sequncias de
iniciao e de terminao da traduo presentes na molcula de mRNA. A fase de leitura pode ser
alterada por mutaes que removem ou inserem bases na sequncia nucleotdica. Esse tipo de alterao
conhecido como descolamento de fase ("frameshift") e pode causar a perda total da funo da
proteina produzida.
ORGANIZAO DO GENOMA DE EUCARIOTOS, PROCARIOTOS E VIRAL
Estrutura Gnica
Os cromossomas constituem-se de uma longa e ininterrupta sequncia de nucleotdeos na qual
esto dispostos muitos genes. O gene uma unidade de herana constituida por uma sequncia
nucleotdeos que carrega as informaes necessrias para a sntese de um dado polipeptdeo. O gene
uma entidade estvel mas pode sofrer mutaes, sendo que a nova forma do gene herdada de modo
estvel, exatamente como a forma que lhe deu origem. Um gene pode existir em formas alternativas,
denominadas alelos, que determinam a expresso de alguma caracterstica particular.
Embora todos genes funcionais sejam transcritos, a maioria do DNA genmico no
totalmente transcrito. A quantidade total de DNA nuclear no genoma haplide (gamtico) humano
compreende 3 x 10
6
kb. Como a maioria dos genes tem 1 a 20 kb em comprimento, deveria haver 1
milho de genes, mas somente 3000 locos de doena foram identificados. Mesmo considerando todos os
outros genes que conferem as caractersticas normais como altura e inteligncia, uma grande poro do
DNA genmico no tem funo definida. Entretanto, mais e mais tem se observado que este DNA tem
funes importantes, incluindo o controle de ao gnica.
Genes que so responsveis pela sntese de enzimas especficas ou peptdeos so
denominados de genes estruturais, enquanto que os genes reguladores modificam os efeitos dos
genes estruturais.

Controle da expresso gnica
Nas clulas existem mecanismos moleculares que controlam o nmero e a quantidade das
proteinas produzidas. As diferenas na sntese proteica resultam de sinais moleculares que controlam as
taxas em que as molculas de mRNA so transcritas a partir do DNA (controle transcricional) ou
traduzidas (controle traducional)
Processamento ps-transcricional do mRNA
A transcrio e a traduo nos procariotos so processos concomitantes mas nos eucariotos so
processos temporal e espacialmente desconectados. Como vimos, nos eucariotos a transcrio ocorre no
ncleo e a traduo no citoplasma. Durante a passagem do ncleo para o citoplasma, o mRNA transcrito
(denominado pre-mRNA) deve ser processado para que seja obtido o mRNA maduro.
Nos procariotos, a sequncia de nucleotdeos do gene colinear com a sequncia de
aminocidos de uma dada protena, entretanto, nos eucariotos a sequncia codificante geralmente
interrompida por sequncias adicionais.
A maioria dos genes dos eucariotos so compostos por regies codificadoras denominadas
exons e regies no-codificadoras denominadas introns. Estes introns so sequncias posteriormente
removidas durante o processamento do transcrito primrio. Esse processo denominado
processamento do RNA ou RNA splicing. Aps a remoo dos introns, a RNA polimerase II adiciona
uma sequncia AAUAAA extremidade 3 do mRNA, conhecida como poli-A. A maioria dos mRNAs
eucariticos possuem 100 a 200 resduos de adeninas ligadas extremidade 3', denominada cauda de
poli-A, adicionada pela enzima poli-A polimerase. Antes que ocorra a remoo dos introns, o mRNA
sofre a adio de resduos de 7-metil-guanosina (Caps) na extremidade 5, denominada metilao Cap.
Esse processamento sofrido pelo mRNA torna a molcula mais estvel e facilita o seu deslocamento para
o citoplasma. Entretanto, mutaes que ocorrem nas regies de juno dos exons podem modificar o
mRNA processado, produzindo um mRNA maduro que codifica para uma protena diferente da original.
Alguns genes complexos tem molculas de mRNA muito grandes, que so processadas de
diferentes formas para produzir diferentes mRNA maduros que so traduzidos em polipeptdeos
diferentes. Esse processo denominado processamento alternativo (alternative splicing) e ocorre no
mesmo tecido mas em diferentes estgios de desenvolvimento e diferenciao e pode tambm ocorrer
em diferentes tecidos.
Estrutura gnica dos procariotos
Existem regies especficas no DNA, denominadas promotores que identificam o stio de incio
da transcrio do RNA (regio na qual a RNA polimerase se liga para iniciar a transcrio).
Nos procariotos, os genes que codificam as enzimas pertencentes a uma mesma via metablica
so adjacentes uns aos outros e agrupados ("cluster") ao longo do cromossomos junto com sequncias
regulatrias. Este conjunto denominado operon, sendo que a sequncia que regula a expresso desses
genes denominada operador. O operador encontra-se antes (upstream) da sequncia do promotor,
nas posies de -35 a -10 antes do incio da sequencia codificante. Nos procariotos, a regulao destes
operons obedece a condies nutricionais ou ambientais. O estmulo da expresso de uma enzima em
resposta presena de um substrato particular denominada induo. A lactose, por exemplo, pode
servir como fonte de carbono e energia para a Escherichia coli. O metabolismo deste substrato depende
da hidrlise de seus componentes, glicose e galactose, pela enzima -galactosidase. A presena de
lactose (indutor) induz a sntese de -galactosidase por ativao do operon da lactose (operon lac),
aumentando a taxa de ligao da RNA polimerase ao DNA e a taxa de sntese do mRNA da -
galactosidase. Na ausncia do indutor o operon reprimido pela ao do repressor. O repressor liga-se
a uma sequncia especifica no operador, bloqueando a ligao da mRNA polimerase ao promotor,
inibindo assim a sntese de mRNA que codifica para a galactosidase.
Estrutura gnica dos eucariotos
Os promotores dos eucariotos so elementos que sinalizam o stio onde a transcrio deve
iniciar-se e, possivelmente, controlam o nvel de expresso do gene associado. Geralmente esto
localizados cerca de 30 bases upstream do codon de iniciao (ATG) e ompreendemsquencias
denominadas boxes ou motifs. As mais frequentes so as TATA, CAT e CG boxes.
Alm dos promotores, os genes dos eucariotos possuem sequncias regulatrias adicionais
conhecidas como amplificadores ("enhancers"), que podem estar muito distantes do promotor (antes ou
depois, upstream ou downstream) e que potenciam a taxa de transcrio. importante salientar que
estes amplificadores no so especficos e potenciam a transcrio de qualquer promotor que estiver na
sua vizinhana. A eficincia da expresso de um gene em um tecido especfico depende da adequada
combinao e integrao dos amplificadores, dos promotores e das sequencias adjacentes.
O genoma dos eucariotos pode apresentam os pseudogenes que so replicas de genes ativos
mas no produzem um produto reconhecvel, geralmente ocorrem devido a mutaes acumuladas no
gene.
Transposons so elementos genticos mveis que se deslocam de uma regio para outra do
genoma e, enzimaticamente, se integram a estes locais. Desta forma, a localizao destes segmentos de
DNA no genoma instvel. Estes transposons contm os genes que codificam para as enzimas
necessrias sua insero e para remobilizao para outro stio. Geralmente, a insero de um
transposon produz mutao ou rearranjo cromossmico varivel que abole a funo do gene que recebe
esse elemento mvel.

Polimorfismo de DNA
A anlise do DNA humano progrediu na medida em que se conheceu a variabilidade de
sequncias entre os indivduos. Mini e microsatlites so sequncias curtas, repetidas
consecutivamente, que esto distribuidas ao longo dos cromossomas humanos, representando cerca de
40% do DNA. Sua natureza repetitiva faz com que sejam instveis durante a replicao do DNA de
gerao para gerao. A consequncia que o nmero de repeties dentro de uma sequncia varia
largamente entre os indivduos. Em funo dessa variabilidade (polimorfismo de DNA), cada indivduo,
exceto gmeos idnticos, ter um padro ou perfil de DNA pessoal (Fingerprinting). Esses perfis so
usados para estabelecer a identidade dos indivduos em diversas situaes.
As sequncias de microsatlites mais comuns no DNA humano so CA ou GT, dependendo de
qual das fitas de DNA est sendo lida, pois h milhares dessas sequncias espalhadas no DNA humano.
O tamanho da repetio pode ser muito varivel e pode fornecer excelentes marcadores genticos para
estudar o comportamento fenotpido das famlias. A maioria dessas sequncias repetitivas no produz
efeito deletrio, entretanto foi demonstrado que uma forma de retardo mental em homens, a sndrome do
X frgil, causada pela expanso de um triplete (CGG) contendo 6 a 54 repeties. Verificou-se tambm
que disturbios neurolgicos na distrofia miotnica e na doena de Huntington, esto associados a
alteraes no tamanho dos microsattiles. Esta descoberta forneceu a base cientfica para o fenmeno
de antecipao no qual os disturbios genticos tornam-se mais severos nas geraes subsequentes.
IMPORTNCIA DAS ENZIMAS NA BIOLOGIA MOLECULAR

Muitas enzimas que atuam na replicao e transcrio tem sido purificadas e a sua atividade
biolgica usada in vitro para reaes moleculares especficas diretas. A maioria dessas enzimas
isolada de bactrias, fungos, leveduras ou virus. Essas enzimas so utilizadas das mais diversas formas,
a saber: clonagem e amplificao de genes de interesse, preparo de sondas de cidos nucleicos, ensaios
de hibridizao, entre outras aplicaes.
As nucleases representam uma categoria de enzimas especficas de cidos nucleicos que
hidrolizam as ligaes fosfo-diester dos polmeros de cidos nucleicos, uma de cada vez. As nucleases
podem requerer um grupamento hidroxil terminal livre (exonucleases), com especificidade de 3' para 5',
ou podem atuar somente em ligaes internas (endonucleases). As nucleases podem ser especficas
para DNA ou RNA. As nucleases DNA-especficas podem catalizar apenas cadeias nicas (por exemplo,
a S1 nuclease) ou cadeias duplas (DNAse I).
As endonucleases de restrio so nucleases encontradas naturalmente em bactrias e so
denominadas enzimas de restrio porque restringem sua atividade a DNA estranhos. O DNA do
hospedeiro no atacado porque os stios vulnerveis a suas prprias enzimas so protegidos por um
processo denominado metilao do DNA. Cada enzima designada de acordo com o organismo do
qual derivada. A EcoRI, por exemplo, uma enzima obtida de Escherichia coli cepa R e foi a primeira
enzima desse tipo isolada. A maioria das enzimas de restrio reconhecem sequncias de 4, 5 ou 6
nucletdeos. Muito poucas reconhecem sequncias maiores. Algumas so denominadas
isosquisomeros, por clivar em diferentes stios dentro de uma mesma sequncia (Ex. XmaI e SmaI) e
por clivar o mesmo stio mesmo sendo obtidas de diferentes microorganismos (Ex. HindIII e HsuI). Outras
enzimas reconhecem diferentes sequncias com o mesmo stio interno (Ex. BamHI e Sau3A). Para cada
regio da molcula de DNA onde a sequncia especfica ocorre, a enzima de restrio corta ambas as
cadeias de forma reprodutvel, formando extremidades assimtricas ou coesivas (stick-end) ou
simtricas ou cegas (blunted-end). Estas enzimas so utilissmas para cortar duplas fitas de grande
tamanho em fragmentos reprodutveis e para preparar DNA de diferentes fontes utilizado em
procedimentos de clonagem.
As Ligases, como a DNA-ligase usada durante a replicao, catalizam a formao de ligaes
fosfo-diester entre dois segmentos de cidos nucleicos. As DNA ligases requerem a presena de um
molde complementar, no entanto, as RNA ligases no tem essa exigncia para o processamento do
mRNA.
As Polimerases catalizam a sntese do polmero de cido nucleico complementar usando uma
cadeia precursora como molde. Essas enzimas so fundamentais para a clonagem e ampificao de
genes. A Taq DNA polimerase, por exemplo, uma enzima extremamente til para a amplificao do
DNA in vitro pela reao de polimerizao em cadeia (PCR).
A transcriptase reversa, presente apenas nos retrovrus, cataliza a sntese de DNA a partir de
moldes de RNA ou DNA. Essa enzima tem importante funo no ciclo vital dos vrus, mas pode ser usada
in vitro para procedimentos de clonagem e para o preparo de sondas de DNA a partir de mRNA. A
transcrio reversa constitui-se um mtodo til para produzir uma copia complementar de um gene
(denominado cDNA) a partir do mRNA. Dessa forma, o genoma dos retrovirus pode ser identificado em
amostras biolgicas utilizando esse mtodo..
Enzimas de restrio e suas aplicaes
Tecnologia de DNA recombinante
Como vimos, as endonucleases de restrio so enzimas que clivam a molcula de DNA em
stios sequncia-especficos. A especificidade de cada enzima proporcionou o desenvolvimento da
tecnologia de DNA recombinante. Isto significa que fragmentos de DNA de tamanho reprodutvel podem
ser produzidos e esses fragmentos contendo um gene particular, por exemplo, podem ser removidos do
restante da molcula de DNA e ser inseridos em um DNA carreador, produzindo molculas de DNA
recombinado biologicamente funcionais. Nos primeiros experimentos de recombinao foram utilizados
os vetores plasmidiais para carrear fragmentos de DNA estranhos. Plasmideos so pequenos pedaos
de DNA circular extra-cromossmicos que ocorrem naturalmente no citoplasma das bactrias e se
replicam independentemente do DNA bacteriano hospedeiro. Utilizando uma endonuclease particular, o
plasmdeo pode ser aberto e um fragmento de DNA estranho pode ser inserido, por ao de uma DNA
ligase, produzindo um plasmdeo recombinate. Os plasmdeos fornecem veculos teis para carregar
fragmentos de DNA ou genes e, quando transfectados em bactrias (usualmente Escherichia coli), podem
produzir clones que ao serem replicados in vivo, produziro cpias mltiplas do fragmento de DNA
incorporado.

Identificao de genes
O DNA extrado de um fragmento de tecido, de leuccitos ou de clulas do lquido amnitico,
contm milhares de genes, embora em algumas clulas muitos destes genes estejam desligados ou
reprimidos e somente relativamente poucos estejam ativos. A identificao de um gene ou sequncia
nucleotdica especifica em todo esse DNA pode ser realizada atravs do mtodo de Southern blot (E.M.
Southern, 1975). Nesse mtodo, as enzimas de restrio so utilizadas para fragmenttar o DNA e os
fragmentos resultantes so separados por eletroforese e identificados por hibridizao de cidos
nucleicos, utilizando uma sequncia de nucleotdeos especfica (sonda gentica) que capaz de
reconhecer o gene de interesse.

Polimorfismo de restrio
Em muitas doenas, o defeito gentico desconhecido e a produo de sondas gene-
especficas muito difcil ou no possvel. Entretanto, o gene produtor da doena pode estar muito
proximo (ligado) a um stio de reconhecimento de uma enzima de restrio particular. Sabe-se que
variaes nas sequncias de DNA ocorrem aleatoriamente atravs do genoma inteiro e no esto
associados a uma doena especfica. Estas variaes (alteraes de bases) resultam na perda de um
stio de restrio existente ou de aquisio de um novo sitio. Tais alteraes nas sequncias de DNA
significam que os fragmentos, produzidos por uma enzima de restrio particular, tero diferentes
comprimentos entre diferentes indivduos e podem ser reconhecidos por suas mobilidades em
eletroforese. Eles so denominados polimorfismos de tamanho de fragmento de restrio (RFLP) e
so herdados como caractersticas genticas simples obedecendo as leis mendelianas de herana. Se
for demonstrado, em estudos de famlias, que um gene produtor de doena est ligado a um RFLP, este
pode, ento, fornecer um meio de detectar o gene defeituoso sem efetivamente conhece-lo.
EXTRAO DE DNA GENMICO
INTRODUO
O potencial de aplicaes das tcnicas de DNA recombinante em laboratrios de Bioqumica Clnica
esto se tornando altamente evidentes, especialmente para a anlise do diagnstico das vrias doenas
genticas e de outras mais. Correntemente, as anlises de DNA para o diagnstico esto disponveis
somente para algumas desordens genticas, mas o campo de estudo est rapidamente se expandindo e
novas anlises esto sendo desenvolvidas. A maioria dos testes de DNA para o diagnstico envolve a
extrao de DNA dos leuccitos humanos. Tradicionalmente essas tcnicas de extrao consomem muito
tempo e possuem procedimentos pouco eficientes. A maioria dos mtodos populares para esse fim,
envolve digesto com proteinase K, que leva aproximadamente dois dias, e requer um grande volume de
sangue (10-15 ml), ou utilizam solventes orgnicos como o fenol, clorofrmio e lcool isoamlico, os quais
so altamente txicos. Embora esses mtodos consigam recuperar o DNA de alto peso molecular de uma
grande variedade de amostras, eles requerem muitos passos e podem incluir a transferncia dos extratos
de DNA para recipientes adicionais ou procedimentos de lavagem do material utilizando vrios filtros
comerciais ou colunas. Estes passos adicionais permitem o aumento das oportunidades de transferncia
cruzadas de amostras ou a introduo de contaminantes. Tais tcnicas no so bem apropriadas para o
uso na rotina dos laboratrios clnicos. Portanto, um mtodo simples, rpido e econmico necessrio
para a introduo das anlises de DNA nos laboratrios de Bioqumica Clnica.
Os estudos de ligao gentica utilizando a tcnica de polimorfismo de tamanho de fragmentos
de restrio (RFLP), a reao em cadeia da polimerase (PCR), a tcnica de transferncia de DNA
(Southern blot), e outras, necessitam que o DNA extrado esteja em boas condies de uso; ou esteja
livre de contaminantes e interferentes que possam prejudicar a reao.
O uso da tcnica de precipitao salina para a extrao de DNA utilizando como detergente o
Triton X-100, evita o uso dos perigosos solventes orgnicos e o alto custo e demorada digesto da
proteinase K. Esta tcnica envolve a desidratao e precipitao das protenas celulares com soluo de
cloreto de sdio concentrada. O DNA extrado fica livre de RNA, de protenas e da degradao de
enzimas. A quantidade e a qualidade do DNA extrado muito boa comparada com as outras tcnicas de
extrao. O DNA apropiado para as tcnicas de biologia molecular, como as que utilizam o PCR e a
digesto com enzimas de restrio.
PREPARAO E ANLISE DE CIDOS NUCLEICOS

Os mtodos de isolamento e purificao dos cidos nucleicos consistem de trs etapas: (1) lise
das clulas e solubilizao do DNA ou RNA; (2) mdodo enzimtico ou qumico para remover as
protenas contaminantes e outras macromolculas; e (3) precipitao alcolica para isolamento do DNA.
Os protocolos bsicos geralmente so aplicveis a um ampla variedade de materiais.
1. Isolamento de DNA genmico de tecidos e clulas:
O mtodo bsico compreende a ruptura do tecido com um homogeinizador, a lise celular com o
detergente inico SDS, extrao fenlica das proteinas e precipitao etanlica do DNA. Este mtodo
til para preparao de DNA genmico de muitas amostras de tecido ou de linhagens celulares, com um
mnimo de consumo de tempo e trabalho. O DNA genmico produzido adequado para amplificao por
PCR ou para a disgesto com enzimas de restrio e anlise de transferncia de DNA. Uma quantidade
substancial de RNA acompanha o DNA genmico, o que dificulta a quantificao por espectroscopia no
UV. Algumas amostras de DNA no amplificam bem por PCR ou no so completamente digeridas com
enzimas de restrico e devem, portanto, ser reextraidas.
Outro mtodo compreende a solubilizao dos tecidos ou clulas com SDS, que inativa as
DNAses endgenas. A proteinase K usada para digerir as proteinas celulares, seguida de digesto com
Rnase para remover a maioria do RNA celular. O isolamento do DNA segue basicamente o princpio
anterior. Este mtodo adequado para extrair DNA genmico para anlise de DNA por Southern blot ou
construo de bibliotecas genmicas. Porm no adequado para extrair DNA de tecidos pois no h
etapa de ruptura do tecido conectivo..
O protocolo mais adequado rotina laboratorial para avaliao de polimorfismos e mutaes
genticas compreende a lise celular com SDS, remoo das proteinas por precipitao com cloreto de
sdio concentrado (salting-out) e isolamento do DNA genmico por precipitao etanlica.
2. Isolamento de RNA de clulas ou de amostras biolgicas
A maioria dos procedimentos de purificao e concentrao de RNA so semelhantes aos
utilizados na purificao de DNA, exceto que 2,5 volumes de etanol devem ser usados rotineiramente
para precipitao do RNA. essencial que toda gua usada diretamente ou nos tampes seja tratada
com dietilpirocarbonato (DEPC) para inativar as RNases.
O mtodo mais adequado para preparar RNA de boa qualidade envolve a solubilizao
simultanea do tecido ou clulas e inativao de Rnases endgenas na presena de isotiocianato de
guanidina, com subsequente separao do RNA do DNA e das protenas por ultracentrifugao em
gradiente de cloreto de csio. Dois outros mtodos que no requerem ultracentrifugao podem se
utilizados: (1) lise com detergente no-inico para proporcionar um mtodo rpido para preparao de
amostras de RNA citoplasmtico e (2) lise celular com isotiocianato de guanidina, remoo das proteinas
pela extrao fenlica em pH cido, seguida de precipitao do RNA. O segundo mtodo
frequentemente utilizado para isolamento de genoma dos virus RNA a partir de amostras biolgicas
Outros mtodos de isolamento e identificao do RNA podem ser : (1) isolamento do mRNA por
cromatografia com oligo-dT celulose; (2) separao eletrofortica do RNA em gel de agarose contendo
formaldeido para deteco e quantificao de espcies especficas de RNA por Northern blotting e
hibridizao; entre outros.
3. Isolamento de DNA genmico de bactrias
As bactrias de uma cultura lquida saturada so lisadas e as proteinas removidas por digesto
com proteinase K. Os debris de parede celular, polissacardeos e as proteinas remanescentes so
removidas pela extrao fenlica e o DNA genmico recuperado do sobrenadante resultante pela
precipitaao com etanol.
PURIFICAO E CONCENTRAO DE DNA DE SOLUES AQUOSAS
Os procedimentos de isolamento de dsDNA e ssDNA a partir solues aquosas so teis quando
proteinas ou solutos necessitam ser removidos, ou quando solues de DNA necessitam ser
concentradas. O protocolo bsico apropriado para purificao de DNA a 1 mg/mL a partir de volumes
menores que 0,4 ml.
1. Extrao fenlica e precipitao etanlica
Um dos mtodos mais teis e usados para isolamento e concentrao de cidos nucleicos de
solues aquosas a extrao com fenol/clorofrmio seguida de precipitao com etanol. Durante a
extrao orgnica, as proteinas contaminantes so denaturadas e mantidas na fase orgnica ou na
interface entre as fases orgnica e aquosa, enquanto que os cidos nucleicos permanecem na fase
aquosa. O fenol usado nesse protocolo deve ser tamponado para prevenir que os produtos oxidados
presentes no fenol danifiquem os cidos nucleicos. Alcool amlico frequentemente adicionado mistura
fenol/clorofrmio quando ocorre a formao excessiva de espuma durante a extrao.
Durante a precipitao com etanol, os sais e outros solutos como os resduos da extrao
fenol/clorofrmio permanecem em soluo enquanto os cidos nucleicos formam um precipitado que
pode ser facilmente separado por centrifugao. Na presena de altas concentraes de ctions
monovalentes (0,1 a 0,5 M), o etanol induz uma transio estrutural nas molculas de cido nucleico
promovendo a agregao e precipitao das mesmas. Entretanto, como vrios sais e pequenas
molculas orgnicas so solveis em etanol a 70%, a precipitao etanlica e lavagem do sedimento
elimina os sais no DNA. Embora cloreto de sdio, acetado de sdio, e acetato de amonio sejam capazes
de induzir a precipitao, mais difcil remover cloreto de sdio devido a sua baixa solubilidade em etanol
a 70%. O sal recomentado para a maioria das aplicaes de rotina deste mtodo o acetato de sdio a
0,3 M (concentrao final), que mais solvel em etanol que cloreto de sdio a 0,3 M e, portanto, menos
facilmente precipitvel com a amostra de cido nucleico. Para amostras contendo dodecil sulfato de
sdio (SDS), o sal recomendado cloreto de sdio 0.2 M, pois o SDS solvel em etanol nessas
condies.
Solues de DNA diludas: quando solues de DNA esto diluidas (< 10 g/mL) ou quando
menos que 1 g de DNA est presente, deve-se aumentar a proporo de etanol para o volume aquoso
(3:1) e aumentar o tempo de precipitao (4 a 16 horas), incubando-se a -20
o
C (ou em gelo seco). A
centrifugao para separao do DNA precipitado deve ser feita a baixa temperatura para assegurar o
mximo de recuperao do DNA dessas solues.
Pequenas quantidades de DNA (nanogramas): pode-se utilizar um cido nucleico carreador,
como o tRNA de E. coli, levedura ou fgado bovino, em concentraes de 10 g/mL. Nessa condio o
DNA coprecipitado com o tRNA. O tRNA no interfere com a maioria das reaes enzimticas, mas ser
eficientemente fosforilado pela T4 polinucleotdeo quinase e no poder ser usado se esta enzima for
usada em marcaes subsequentes. Recuperao de pequenas quantidades de fragmentos curtos de
DNA e oligonucleotdeos pode ser aumentada pela adio de cloreto de magnsio a uma concentrao
inferior a 10 mM antes da adio do etanol. Entretanto, o DNA precipitado de solues mais
concentradas que 10 mM de ons magnsio ou fosfato so dificeis de dissolver e devem ser dulidas antes
da precipitao com etanol. Se a amostra de DNA est em baixa concentrao em um grande volume, o
volume pode ser reduzido pela extrao repetida com sec-butanol (2-butanol). Cabe lembrar que apenas
a gua removida com essa extrao, todos os solutos e sais so concentrados com os cidos nucleicos.
Aps essa etapa, o cido nucleico deve ser extraido com fenol/clorofrmio e precipitado com etanol.
DNA em grandes volumes aquosos: a extrao pode ser simplesmente ampliada usando o
mesmo procedimento. (tubos de poliestireno no resistem a mistura fenol/clorofrmio). As etapas de
centrifugao temperatura ambiente no podem exceder velocidades de 2500 rpm (1200 x g), pro 5
minutos. O precipitado etanlico deve ser centrifugado em um tubo Corning de parede reforada por 15
minutos em fotor de angulo fixo a 10.000 rpm (8000 x g), a 4
o
C. Tubos de vidro devem ser siliconizados
para facilitar a recuperao de pequenas quantidades de DNA (< 10g).
Remoo de oligonucleotdeos e trifosfatos: Pequenos oligonucleotdeos (< 30 bp) e
nucleotdeos no incorporados usados na marcao ou outras reaes de modificao do DNA podem
ser efetivamente removidos das solues contendo DNA por duas etapas de precipitao com etanol na
presena de acetato de amonia. Este procedimento no suficiente para remover completamente
grandes quantidades de ligadores (linkers) utilizados nos procedimentos de clonagem. Acetato de
amonia no recomendvel se a amostra de cido nucleico for fosforilada na extremidade 5 pela T4
quinase ou na extremidade 3 com a transferase terminal, pois os ons de amonio tesiduais inibem essas
duas enzimas.
Variaes do procedimento de precipitao: O isopropanol pode substituir o etanol, quando
se deseja manter mnimo o volume dos cidos nucleicos precipitados. O isopropanol menos voltil que
o etanol e , portanto, mais difcil de remover por evaporao. Alguns sais so menos solveis em
isopropanol, e podem ser precipitados com os cidos nucleicos. recomendado que a precipitao com
isopropanol seja seguida imediatamente por uma precipitao onvencional com etanol para eliminar
isopopropanol residual e o sal. Alternativamente, cloreto de ltio pode ser usado como o sal de
precipitao, pois o cloreto de ltio muito mais solvel no etanol e o precipitado resultante
relativamente isento de sal. Cloreto de ltio deve ser evitado, entretanto, se o precipitado de RNA for
usado como molde para a transcrio reversa aps precipitao.
Grandes mRNA e rRNA podem ser purificados de dsDNS e pequenos RNAs (tRNA e 5S RNA)
por duas etapas de precipitao seletiva com cloreto de ltio na ausencia de alcool, seguida de uma
precipitao convencional com etanol.
Solues concentradas de cidos nucleicos: se a concentrao de cidos nucleicos muito
alta ( > 300 g/mL), um precipitado pode-se formar sem resfriamento durante a precipitao etanlica. Se
um precipitado visvel formado, no necessrio esfriar a amostra ou aguardar algum tempo antes de
separar o precipitado por centrifugao.
2. Fracionamento dos cidos nucleicos
Geralmente todos os protocolo em biologia molecular requerem, em alguma etapa, o
fracionamento dos cidos nculeicos. Tcnicas cromatogrficas so apropriadas para algumas aplicaes
e podem ser usados para separao dos plasmdeos do DNA genmico, bem como separao de DNA
genmico dos debris no lisado celular. A eletroforese, entretanto, tem muito mais resoluo que mtodos
alternativos e geralmente o mtodo de fracionamento de escolha. As separaes eletroforticas podem
ser analticas ou preparativas e podem envolver fragmentos com peso moleuclar variando de menos que
100 Da a mais que 10
8
Da. Uma variedade de sistemas eletroforticos foram desenvolvidos para
acomodar essa ampla faixa de variao. Alm disso, um fragmento individual pode ser identificado por
tecnica de hibridizao aps a separarao eletrofortica de uma mistura complexa (Southern blot). Este
mtodo tem contribuido grandemente para ao mapeamento e identificao de sequencias de cpia nica
ou mltipla em genomas complexos, e facilitado os experimentos iniciais de clonagem de DNA eucarioto.
3. Purificao e isolamento de DNA
Os protocolos utilizados para purificao de DNA so geralmente divididos em trs categorias:
(1) eluio do DNA de um gel de agarose por dilise, (2) dissoluo do gel de agarose e recuperao do
DNA por ligao a partculas de vidro, e (3) eluio pelo aquecimento da agarose de baixo ponto de fuso
a 70
o
C, e recuperao do DNA pela extrao fenlica e precipitao etanlica ou usando uma matrix que
liga especificamente o fragmento de DNA. Atualmente, h vrios sistemas de purificao de fragmentos
de DNA no mercado. Esses sistemas diferem no tamanho e o tipo de cido nucleico que pode ser
eficientemente isolado; nos efeitos dos sais, dos solventes orgnicos e de outras substncias na
eficincia de ligao da matriz; e no tipo de solvente que usado para eluir o oligonucletdeo ou o
polinucleotdeo da matriz.
Matriz de slica (vidro) - na presena de iodeto de sdio, DNA e RNA ligam-se seletivamente
matriz de slica. Outras substncias presentes (sais, solventes, nucleotdeos, proteinas, nucleotdeos etc)
so lavados com uma soluo de etanol tamponada. O polinucleotdeo ligado eluido em um reduzido
volume de tampo Tris-EDTA (TE) ou gua.
Resina de purificao - uma resina de purificao com propriedades similares aos sistemas de
matriz de slica (Magic
1
, Promega). Esta matriz liga polinucleotdeos de dupla fita mais eficientemente que
os de fita simples, e pouco eficientemente os RNAs pequenos (tRNA), DNA de dupla fita de menos que
220 bp ou oligonucleotdeos.
Adsoro - um sistema de purificao de cidos nucleicos, que contm um adsorvente estvel
(NENSORB 20, DuPont-NEN) que liga quantitativamente proteinas, RNA e DNA, incluindo
oligonucleotdeos contendo menos que 12 resduos. A ligao no afetada por altas concentaes de
sais, ureia, ou outras substncias, mas inibida por alguns solventes orgnicos. O material no ligado
removido com gua e o DNA ou RNA (mas no proteinas) quantitativamente eluido com um solvente
alcolico.
Gel filtrao - os cidos nucleicos podem ser purificados, separados e fracionados usando
colunas de gel filtrao ou colunas de centrifugao (spin columns).
QUANTIFICAO DOS CIDOS NUCLEICOS
A concentrao de DNA ou RNA pode ser estimada por espectrofotometria de absoro no UV
ou a concentrao de DNA pode ser realizada por espectroscopia de fluorescencia. Cubetas de quartzo
devem ser utilizadas para a espectrofotometria no UV, enquanto que as de plstico ou vidro podem ser
usadas para a regio do visvel. Um mtodo alternativo o mtodo de placa de brometo de etdio
agarose. .
PRINCPIOS DE ELETROFORESE
INTRODUO
Eletroforese uma tcnica de separao que envolve o movimento de partculas com cargas em
soluo, sob ao de um campo eltrico. Portanto, qualquer partcula ou molcula carregada pode se
mover nessas condies, e consequentemente podem ser separadas, desde que tenham diferentes
cargas.
A separao eletrofortica das partculas pode ser realizada em meio lquido(eletroforese livre de
Tisellius) ou em um suporte inerte.
A carga eletrica aplicada sob a soluo realizada atravs de eletrodos que so colocadas na
soluo. Um ion migra atravs da soluo na direo ao eletrodo de carga oposta. Portanto, uma
partcula carregada positivamente(catiosn) migra para o polo negativo (catodo), enquanto as partculas
negativas(anions) migram para o polo positivo(anodo).
PRINCPIOS BSICOS DA ELETROFORESE

Terminologia:
nion: partcula carregada negativamente ou on
ction: partcula carregada positivamente
tampo: Uma mistura de substncias que doam e aceitam proton com a funo de manter a
concentrao do proton (pH) constante ou dentro de um valor prximo. Um tampo pode ser feito com
uma mistura de um cido fraco com o respectivo sal. Ex: cido actico e acetato de sdio.
Condutividade: a propriedade de uma substncia conduzir a corrente eltrica. Numa soluo inica, a
soma do produto da concentrao da carga e a mobilidade da mesma.
eletrodos: substncias em contato com um condutor. A substncia esto conectadas a fonte eltrica.
Fonte eltrica: Equipamento que transforma corrente alternada em corrente contnua, que possa ser
controlada por um potenciometro, que permite variar a tenso, a corrente, a carga eltrica que se quer
aplicar no sistema. Esse equipamento, pode medir a tenso eltrica (em Volts), a corrente
eltrica(Amperagem), e a potncia eltrica (Watts).
eletro-osmose; tendncia da soluo se mover em relao a uma substncias estacionria adjacente,
quando uma diferena de potencial aplicada.
fora inica: a soma da concentrao de todos ions na soluo, medido pelo quadrado de suas
cargas.
mobilidade: a velocidade de uma partcula ou ion que dado pela voltagem aplicada. Uma medida
relativa de quanto rpido um ions se movimenta em um campo eltrico.
Mobilidade efetiva: A real mobilidade de uma substncia sob certas condies. Geralmente menor que
a mobilidade devido a menor carga, ou resistncia do suporte ou meio.
poder de resoluo: E a habilidade de separar substncias que migram muito prximas.
gel: uma malha de fibras, ou de polmeros que slida, mas retm uma grande quantidade de
solventes nos poros ou nos canais internos das malhas.