Geison Modesti Costa

Escola de Vero em Farmacognosia

Fevereiro, 2010
Florianpolis
Sugerencias para el uso de equipos
de CLAE
Reservatrio
Bomba
Injetor
Coluna
Detector
Registrador
ESQUEMA DE FUNCIONAMENTO
HPLC
Reservatrio Fase mvel
Cerca de 50% de todos os
problemas de anlise e com o
equipamento tm origem na
Fase Mvel problemas de
diagnstico lento
Reagentes inadequados a
coluna e o equipamento so
sempre os culpados.
Fase mvel: orgnica
Solventes devem ser grau de pureza HPLC
ou HPLC/UV
Graus tcnico, para sntese, resduos de
pesticidas, para anlise (P.A.), UV no
servem.
Isto tem implicaes sobre a garantia do
sistema e das colunas.
X X
Fase mvel: gua
So inadequadas
gua mono-destilada: contaminao de orgnicos
volteis
gua deionizada comum: contaminao alta de
orgnicos devida resina aromtica
gua de osmose reversa: presena de ons e
orgnicos de baixo peso molecular
gua de osmose reversa + eletro-deionizao:
orgnicos de baixo peso molecular.
Fase mvel: gua
gua deve ser grau HPLC (Milli-Q)
Usar gua destilada ou osmose reversa para
alimentar o sistema Milli-Q
Livre de bactrias (esterilizada por membrana
0,22 m)
Resistividade >> 18 megohm (< 1ppb de
ons) Resistividade indica somente o teor de ons
Teor de orgnicos < 20 ppb para anlises
normais
Milli-Q: carvo ativado / 2 cartuchos de troca inica / resina
Fase mvel:
Partculas em suspenso
Partculas maiores que 1/8 do dimetro da partcula da
Fase Estacionria pode entupir os caminhos internos do
leito
Dimetro 5 m dimetro de passagem = 0,625 m.
Dimetro da FE = 5 m
Dimetro da passagem = 0,625 m
Fase mvel: filtrao
Para evitar entupimento do filtro de entrada da coluna (2
m) basta a membrana de 0,45 m
Para colunas com recheios de partcula 4 m basta
0,45 m.
Para recheios < 4 m interessante
considerar o uso de membranas de
porosidade 0,22 m.
Membranas:
compatibilidade qumica
Membrana de steres de celulose: usadas na
microbiologia s servem para gua, gua + tampo,
gua + cido fraco.
Teflon TFE serve para tudo, mas no permite passar
gua e acetonitrila sem ser molhado antes com outro
orgnico (MeOH, THF, EtOH, etc.)
Nylon permite uso de gua e solventes em geral, exceto
clorofrmio, teres (THF), diclorometano e cidos fortes
Fase mvel: Preparo
O correto preparar diariamente a fase mvel
Re-filtrar fase com tampo todos os dias (tendncia a
haver precipitao, crescimento de mofo).
Cuidado com o pH da fase:
Slica comum: faixa de pH = 2-8
CHCl
3
, testar sempre o pH, pois pode se transformar em HCl.
Acertar o pH do tampo aquoso antes de misturar com a
parte orgnica
Fase mvel: Preparo
Adicionar componentes volteis (amnia, trietilamina,
etc.) depois de filtrar com vcuo.
Medir os componentes separadamente e depois
misturar, antes da filtrao.
No juntar um componente com outro, avolumando
para o volume final.
Preparo da fase
mvel
Fase mvel: desgaseificao
Desgaseificao (remoo de O
2
e N
2
)
indispensvel para o bom funcionamento do
sistema
Reprodutibilidade do fluxo (bolhas na bomba
e ar dissolvido na fase)
Estabilidade da linha de base (bolhas no
detector)
Transparncia na faixa de baixa UV.
O
2
absorve < 215nm. rudo da linha de base
Ultra-som: muito lento, pouco eficiente,
requer agitao
Vcuo: lento (mnimo 20 minutos), requer
agitao.
Fase mvel: desgaseificao
Vcuo + ultra-som: total de ~10 minutos
Reaplicar de 12 em 12 horas (ou 24h)
Principalmente para misturas MeOH:H
2
O
Purga com He: contnuo, hlio +caro, vazamentos
aumentaro custo operacional, pouco conveniente.
Degasser: contnuo, remove o ar logo antes de entrar
na bomba; alto investimento inicial. Melhor opo a
longo prazo.
Fase mvel: desgaseificao
Velocidade fluxo
0,1-3,0 mL/min para colunas analticas
> 5,0 mL/min para colunas preparativa
BOMBAS
Presso operao: at 2500-3500 psi para
separaes analticas
Influencia no modelo da bomba!
INJEO:
Preparao da amostra
Clean up da amostra:
filtrao e/ou centrifugao
extrao fase lquida (solventes)
extrao fase slida (SPE)
Usar uma soluo diluda
Injeo:
Preparao da amostra
Dissolver a amostra na fase mvel;
Evitar dissolver a amostra apenas em solventes
orgnicos, principalmente se for mais forte que a FM;
Amostra dissolvida em solvente mais forte que a fase
mvel N e k
Correto:
FM: 30% MeOH; coluna RP-C18
Amostra dissolvida em 0-30% MeOH
Injeo:
Preparao da amostra
Errado:
FM: 30% MeOH; coluna RP-C18
Amostra dissolvida em 100% MeOH
Amostra dissolvida em 30% ACN
Errado:
FM: 60% ACN
Amostra dissolvida em CH
2
Cl
2
5 L N = 10493
10 L N = 4088
Injeo:
Preparao da amostra
Sempre que possvel dissolver a amostra na
Fase Mvel ou em solventes mais fraco
(menor % de orgnico fase reversa)
1000
100
Injeo:
Preparao da amostra
FM: ACN:H
2
O (08:92)
FE: C18 (250 x 4,6mm)
Deteco: UV (210 nm)
Volume mximo de injeo
O volume mximo de injeo para qualquer
coluna deve ser, no mximo, 1% do volume
interno da coluna vazia
V
mx
= ( x r
2
x C) (0,01)
r = raio interno em mm, C = comprimento em mm
Volume interno da coluna
A soluo da amostra miscvel
com a fase mvel?
3 perguntas bsicas antes da injeo:
Qual o volume mximo de injeo
para minha coluna?
Qual o V
0
(volume de coluna ou
volume morto) da coluna sendo usada
(em mL ou em min)?
Volume da coluna
V
0
= Volume (tempo) de eluio de um pico
no retido pela coluna.
Volume mnimo que a bomba precisa bombear para
qualquer amostra chegar at o detector.
Volume de fase mvel contido no sistema entre o
injetor e o detector, inclusive dentro dos poros.
A coluna responsvel por 90-95% deste volume.
Normalmente a 1 perturbao da linha de base.
Volume da coluna
Determinar V
0
por:
Fase reversa: injeo de hidrocarboneto
saturado ou aromtico (tolueno).
Fase normal: Injeo de gua ou acetona.
Clculo aproximado:
V
0
= ( x r
2
x C) (0,5)
r = raio interno em mm, C = comprimento em mm
Erro de 10-20% (3-10m)
V
0
= significado
Quaisquer picos ou grupo de picos que eluem
junto ao V
0
:
No interagiram com a coluna e, contm provveis
impurezas (picos escondidos)
No podem ser reconhecidos pelo tempo de
reteno: afinal no houve reteno!
No podem ser quantificados. No haver exatido
nem preciso na integrao.
Usar tamanho de partcula e comprimento da
coluna suficientes para para separar a
amostra de interesse
10 m 5 m
2x P 4P!!!
PARTCULA
PRESSO
2
COLUNAS
Tamanho da partcula
Tamanho da partcula
FE: Limites de fluxo
Fluxos altos resultam em:
Destruio do suporte do recheio
(velocidade = moagem, quebra)
Presso de trabalho alta e choques de
presso
degradao do leito
desgaste dos selos da bomba e do
injetor
Fluxo timo depende do dimetro de partcula e
do dimetro da coluna
FE: Limites de presso
As colunas so empacotadas numa nica direo sob uma
presso de 9000 psi.
Para uso contnuo, limite colunas de slica 3500 4000 psi.
Presso de operao:
~150 vezes a Atm.
Coluna suja
Bloqueios (sistema filtro, pr-coluna,
tubulao, vlvula/seringa injetor, clula
fluxo do detector)
Solvente muito viscoso
Checar fluxo
Flutuaes de presso
PRESSO MUITO ALTA!
Vazamentos (selos, coneces)
Mal funcionamento da bomba (vlvulas,
pisto)
Ar excessivo no sistema
Sinker do solvente entupido
Checar fluxo
Flutuaes de presso
PRESSO MUITO BAIXA!
Mal funcionamento da bomba (bolhas nas linhas
de solventes ou vlvulas)
Bloqueios parciais no sistema
Flutuaes de presso
PRESSO VARIVEL!
Reservatrio solvente vazio
Mal funcionamento da bomba (falha eletrnica ou
na vlvula de proporo)
SEM PRESSO!
Realizar a desgaseificao da FM DIARIAMENTE
Realizar a purga das bombas antes do incio das
anlises
Se possvel, realizar uma mistura prvia entre os
componentes da fase mvel
Sempre que possvel, utilizar sistemas isocrticos
Flutuaes de presso
Como minimizar?
Contaminao da coluna
Contaminao ocorre principalmente na entrada
do leito
Limpeza de coluna
Solventes eficientes para limpeza devem: dissolvem bem a sujeira
(no necessariamente os componentes ativos da amostra);
competir bem com o recheio da coluna para a sujeira.
Procedimentos de limpeza de colunas podem:
Precipitar contaminantes / tampes
Desnaturar protenas
Acabar removendo um pouco da fase qumica ligada (hidrlise)
melhor usar SPE (extrao em fase slida) para limpar a amostra
antes de injetar
Limpeza de colunas:
Fase normal
Coluna de slica: passar uma sequncia de
solventes (30-50 mL cada) pela coluna indo de
apolar para polar e voltando para a fase mvel:
Hexano /octano / heptano
Diclorometano
Isopropanol / acetato de etila / THF
Metanol
Fase mvel
Colunas de fase reversa ligada (C18, C8, fenil, CN)
Para limpar somente tampes, sais: passar H
2
O
Milli-Q (10xV
0
) a 40-50C
Para material orgnico: ACN:H
2
O 80:20 como
fase mvel e fazer injees grandes (100-200uL)
de solventes fortes como THF, acetato de etila.
Pode-se aquecer a coluna a 40-50C.
Limpeza de colunas:
Fase reversa
Para a remoo de material orgnico o melhor
solvente em geral THF, devido a:
Sua grande fora de eluio (polaridade)
Sua gama larga de dissoluo das substncias
mais variadas
Sua miscibilidade com todos as fases
Metanol mesmo puro no um solvente forte para
limpeza de material orgnico lipoflico devido a sua
alta polaridade
Limpeza de colunas:
Fase reversa
DETECTORES:
Manuteno
Lembre-se: lmpadas tm tempo de vida limitado
* Lmpada Deutrio: 500-2.000 horas
No dar flush nas colunas passando pelo detector
Problemas na linha de base podem ser eltricos
(Assistncia Tcnica) ou mecnicos (bolha de ar,
lmpada velha, sujeira na clula de fluxo)
Problemas??
Mudanas no tempo de reteno so geralmente
devidas a problemas na bomba ou vazamento
Mudanas na rea do pico esto geralmente
associadas com injetor, autosampler ou sistema de
tratamento dos dados
Problemas Pico
Resoluo ruim: coluna inadequada, fase mvel
muito forte
Pico largo: coluna inadequada, alargamento banda,
fluxo inadequado.
Pico dividido: co-eluio, problemas entrada coluna
Sem pico: lmpada desligada/ruim, problema injetor,
analito adsorvido
Picos com cauda: interao forte com coluna, coluna
suja, coluna inadequada
Pico com cauda frontal: overloading
Picos extras: coluna/solventes/injetor contaminados,
carry over
Problemas Pico
Rudo: fonte (lmpada) detector velha,
solventes sujos, O
2
no sistema
Background alto: contaminao solvente, cut
off solvente UV
Problemas Linha de Base
Estratgia para Resoluo de
Problemas em HPLC
BOAS PRTICAS DE OPERAO !!!!
Isolar a rea do problema
Mudar um componente de cada vez
Consertar voc mesmo (?)
ou chamar Assistncia Tcnica
Consultar manuais operao/servio
Manuteno preventiva
El equipo funciona?
NO HAY PROBLEMA
Si
No
Usted
lo dao?
No
No
No
No
Si
s um
tonto!
Alguien sabe
que usted lo
hice?
Escondalo
Qudase
contento!
Alguien
puede
culparle?
Si
Si
Si
Puede poner la
culpa en alguien?
LA CAG!
Geison Modesti Costa, MSc.
(geison_costa@yahoo.com.br)
Laboratrio de Qumica Farmacutica
Depto. Cincias Farmacuticas
Universidade Federal de Santa Catarina