Condiciones de operacin

Las enzimas se obtienen de

microorganismos (bacterias, hongos o
levaduras) seleccionados
por screening y, posteriormente,
cultivados por fermentacin (en
matraz o reactor). A partir de los
caldos de cultivo se procede a
la purificacin de la enzima que
cataliza la reaccin de inters. La
purificacin se lleva a cabo mediante
tcnicas cromatogrficas y se utilizan
tcnicas de concentracin.

Una vez purificada, se procede a
su caracterizacin estructural
mediante tcnicas electroforticas,
MALDI-TOF, ultracentrifugacin
analtica, estudios de espectroscopa.
La caracterizacin funcional se realiza
mediante estudios de estabilidad y
actividad frente al pH y la temperatura, as como estudios de especificidad de
sustrato y determinacin de los mecanismos cintico y qumico y de
estabilidad en las condiciones de trabajo.
Los datos obtenidos permiten abordar estudios de ingeniera de protenas
mediante tcnicas de mutagnesis dirigida, con vistas a su utilizacin
industrial en biorreactores enzimticos.

Por otra parte, se procede al aislamiento, clonacin y secuenciacin del gen
que codifica la enzima, lo que permite su obtencin en grandes cantidades as
como llevar a cabo estudios de ingeniera de protenas.

Si la clonacin e hiperexpresin en Escherichia coli falla por peculiaridades
del genoma o necesidad de procesamientos postraduccionales, se utilizan
otros sistemas de clonacin y expresin puestos a punto en nuestro
laboratorio, disponemos de sistemas de clonacin y expresin
en Streptomyces lividans y Pichia pastoris.

Tanto la enzima salvaje como la enzima clonada y los posibles mutantes con
propiedades notablemente mejoradas se inmovilizan para su posterior
recuperacin y reutilizacin en el proceso. La inmovilizacin se lleva a cabo
mediante diferentes metodologas adaptadas al proceso industrial:
atrapamiento en geles, microencapsulacin, reticulado con reactivos
bifuncionales, adsorcin y unin covalente a soportes inorgnicos u
orgnicos. A continuacin se procede a la optimizacin del proceso de
inmovilizacin con el fin de obtener un biocatalizador de aplicacin industrial.
Por ltimo se determinan las condiciones ptimas del proceso biocatalizado:
determinacin del pH y temperatura ptimas, estabilidad frente a pH y
temperatura, determinacin de parmetros cinticos y reutilizacin en
reacciones sucesivas.
a) Temperatura: Cada enzima tiene una temperatura
ptima en la cual la velocidad de reaccin es mxima.
Suele ser 40C. Si aumenta mucho, la enzima se
desnaturaliza. El calor aumenta la energa cintica
con lo que aumenta la movilidad de las molculas
facilitando su encuentro.

b) pH: Cada enzima presenta unos valores de pH entre
los que son efectivos. Entre ambos existe un pH
ptimo en el que la velocidad de la reaccin es
mxima. Fuera de los lmites la enzima se
desnaturaliza.

c) Concentracin de sustrato: Al aumentar la
concentracin del sustrato se aumenta la velocidad de
reaccin ya que, al haber ms molculas de sustrato,
se facilita el encuentro de estas con el enzima, hasta
alcanzar la velocidad mxima (Vmx), a partir de ese
momento se mantiene constante ya que todas las
enzimas se encuentran en forma de complejo enzima-sustrato. La Vmx
se alcanza cuando toa la enzima est ocupada por el sustrato.

Este hecho hizo que Michaelis y Menten enunciaran la siguiente
ecuacin.

Se conoce como ecuacin de Michaelis-Menten y segn ella, la velocidad
de una reaccin depende de la concentracin del sustrato, de la velocidad
mxima y del Km.

BIBLIOGRAFA
C. Aracebal, I. de la Mata. Universidad Complutense de Madrid.
BIOTECNOLOGA ENZIMTICA Y BIOTRANSFORMACIONES DE
INTERS INDUSTRIAL. [03/05/14].
http://pendientedemigracion.ucm.es/info/otri/complutecno/fichas/tec_cacebal
1.htm