ELECTROFORESIS HORIZONTAL:

Propiedades fsicas de la electroforesis

Durante la electroforesis, las macromolculas son empujadas a travs de los poros, dependiendo
su tasa de migracin por el campo elctrico de los siguientes factores:
Fuerza del campo
Tamao y forma de las molculas
Hidrofobicidad relativa de las muestras
Fuerza inica y temperatura del tampn en que se desplazan las molculas.
Tamao hidrodinmico de la molcula
Forma de la molcula
Tamao de poro del medio en que tiene lugar la electroforesis
Viscosidad del tampn.
Aumento de la tasa de difusin de los iones de la muestra y del tampn, con el consiguiente
ensanchamiento de las muestras separadas
Formacin de corrientes de conveccin, con la consiguiente mezcla de las muestras separadas
Inestabilidad trmica de las muestras, que son bastante sensibles al calor (por ejemplo,
desnaturalizacin del ADN)
Disminucin de la viscosidad del tampn y, por ende, reduccin de la resistencia del medio.

Tipos de geles
Agarosa: Diluidos son bastante rgidos y fciles de manejar. Su tamao de la malla alto hace que se
empleen para separar macromolculas grandes como protenas o DNA. Los geles de poliacramida
sirven para separar ac. Nucleicos de 25 a 2000 bp mientras que los geles de agarosa pueden
separar fragmentos hasta 10 veces ms grandes. As, se pueden separar DNAs .
Geles de poliacrilamida: A diferencia de la agarosa requiere aditivos para ayudar a polimerizar el
gel. El persulfato de amonio es un uniciador, y el tetrametilendiamina (TEMED) es el catalizador de
la reaccin.
Geles de almidn: los introdujo Smithies en 1955 y mas adelante Kohn uso acetato de celulosa.

Tipos de buffers:
Una solucin buffer o tampn o amortiguadoraes una mezcla de un cido dbil y una base dbil, la
cual se puede obtener mezclando un cido dbil con una de sus sales correspondientes, tampn
cido, puesto que el anin del cido es una base dbil. Tambin se puede preparar la solucin
amortiguadora mezclando una base dbil con una de sus sales correspondientes tampn bsico.
El cido dbil reacciona con una cantidad de OH- agregado, mientras que el papel de la base dbil
es consumir el H+ que pueda haberse introducido. Esto impide que se perturbe en mayor grado el
equilibrio: H2O H+ + OH- del cual dependa el PH mayor de la solucin. El efecto amortiguador de
estas soluciones se presenta cuando se les agrega pequeas cantidades de cidos fuertes o bases
fuertes.
Tinciones
Tinciones diferenciales: son aquellas tinciones que se usan para diferenciar de manera mas
explicita los microorganismos. Estas tinciones utilizan los colores antes diferenciales, que se
componen de ms de una sustancia tintrea. En algunas tcnicas de coloracin, las tinciones
diferenciales ms importantes que se emplean en bacteriologa son las de Gram y la tincin cido-
resistente. Ambas tinciones se utilizan para obtener informacin acerca de la composicin de
las capas de la pared celular de las clulas bacterianas.
Latincin de Ziehl-Neelsen(BAAR ) es una tcnica de tincin diferencial rpida y econmica,
para la identificacin de microorganismos patgenos, por ejemplo M. tuberculosis .Fue descrita
por primera vez por dos mdicos alemanes, Franz Ziehl, un bacterilogo y Friedrich Neelsen, un
patlogo

2.2. Colorantes

Los colorantes ms utilizados: azul de metileno, cristal violeta, safranina, son catinicos y se
combinan fuertemente con componentes celulares cargados negativamente, como los cidos
nucleicos y los polisacaridos cidos (las envueltas externas de los microorganismos estn por lo
general cargadas negativamente).

2.3. Tincin diferencial de Gram:

Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la desarroll en
1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos
grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los trminos positivo y negativo no tiene
nada que ver con carga elctrico, sino simplemente designan dos grupos morfolgicos distintos de
bacterias). Descripta en forma breve, la secuencia de la tincin es la siguiente: el Frotis fijado con
calor se tie 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solucin Yodada durante 1 - 2
min. y se lava de nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol etlico/acetona. Escurrir y cubrir
con Safranina (color de contraste) durante 1 2 min. Lavar y secar. Las bacterias gram-positivas y
gram-negativas tien de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de
sus paredes celulares.
Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una solucin de cristal
violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son lavadas despus para quitar el exceso
de colorante. En este estado, todas las clulas, tanto las grampositivas como las gramnegativas,
estn teidas de azul.
Tincin diferencial: Mtodo cido resistente (ZIEHL-NEELSEN) Las paredes celulares de ciertos
parsitos y bacterias contienen cidos grasos (cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos
de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracn con alcohol-cido, despus
de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol resistentes. El frotis se
tie durante unos 5 min con Fucsina fenicada aplicando calor suave. Lavar con agua. Decolorar
con alcohol etlico 95% con un 3% de ClH concentrado. Lavar y teir durante 30-60 seg con Azul
de Metileno (color de contraste). Lavar y secar.

Tincin diferencial para revelar estructuras celulares. Mtodo de Wirtz. Algunos gneros
bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su interior formas de
resistencia denominadas esporas. Se producen cuando las condiciones ambientales son
desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos
txicos, etc.) Formndose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de
esporognesis, la clula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es
favorable, la espora germina gene.

Referencias
http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20ES/Sesi%C3%B3n5.pdf
http://www.fbioyf.unr.edu.ar/evirtual/pluginfile.php/6798/mod_resource/content/0/Electrofores
is.pdf
http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/practico4.pdf