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DETERMINAO DAS CONSTANTES CINTICAS DA

INVERTASE EM CLULAS LIVRES E IMOBILIZADAS EM


ALGINATO

Alunos:
Ana Miranda, n25264
ngela Marques, n24141
Cludia Lima, n25267




28 Maro 2014



Alunos:
MESTRADO EM BIOENGENHARIA
LABORATRIOS DE BIOPROCESSOS
MDULO 1

DOCENTE: LGIA RODRIGUES



Universidade do Minho
Escola de Engenharia






Trabalho prtico 1


[INVERTASE CINTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]

1

ndice

Sumrio ............................................................................................................................. 2
Introduo ........................................................................................................................ 3
Cintica Enzimtica ...................................................................................................... 4
Influncia da temperatura e do pH na actividade enzimtica ................................... 6
Imobilizao de enzimas .............................................................................................. 8
Material e Mtodos ........................................................................................................ 11
Resultados e Discusso ................................................................................................... 13
Concluso........................................................................................................................ 21
Bibliografia ...................................................................................................................... 22
Anexos ............................................................................................................................ 23


[INVERTASE CINTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]

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Sumrio

Diversas abordagens so usadas no estudo do mecanismo de aco de enzimas, mas a
abordagem principal determinar a taxa da reaco enzimtica.
Neste trabalho experimental o objectivo era estudar a cintica da enzima invertase da
Saccharomyces cerevisiae, livre e imobilizada em esferas de alginato de sdio, ou seja,
determinar o valor da velocidade mxima (mxima velocidade a que a enzima degrada
o substrato) e determinar o valor do Km que uma medida da afinidade enzimtica
para o substrato (essa afinidade igual a 1/km). Se Km for elevado a afinidade baixa.
A invertase uma enzima que catalisa a degradao da sacarose em glucose e frutose
(Sacarose + H2O Glucose + Frutose).
Inicialmente, recorreu-se ao mtodo de DNS que, atravs de uma reta de calibrao,
permite calcular a concentrao de acar invertido e observar como esta afeta a
atividade enzimtica. Obteve-se a absorvncia e a concentrao dos acares
redutores (tendo-se feito cinco ensaios), de seguida calculou-se a velocidade de reao
para cada concentrao inicial de sacarose. Posteriormente colocaram-se estes
resultados num grfico (velocidade de reao x concentrao de sacarose), obtendo-se
uma curva de Michaelis-Menten. Esta curva descrita pela equao que leva o mesmo
nome.
Este trabalho teve tambm como obejctivo verificar a existencia de limitaes
transferencia de massa interna e determinar os factores de eficincia, assim como a
difusividade da sacarose no gel de alginato. Por ltimo averiguou-se o efeito do
dimetro das esferas nos parametros cinticos e nas limitaes difusionais internas.



[INVERTASE CINTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]

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Introduo

A Biotecnologia atualmente considerada uma alternativa til aos processos
tecnolgicos convencionais nos campos analtico e industrial. Isto porque, ao contrrio
da catlise qumica, os sistemas biolgicos tm a vantagem de conseguir converses
de qumicos complexos sob condies ambientais moderadas com elevada
especificidade e eficincia. Sistemas biolgicos ajudam a obter uma maior eficincia do
processo, um aumento da capacidade fabril e aumento da rentabilidade dos produtos.
Apesar destas vantagens, o uso de enzimas em aplicaes industriais tem sido limitada
por diversos fatores, principalmente pelo seu custo elevado, estabilidade e
quantidades reduzidas disponveis.
Com o desenvolvimento desta rea, fortaleceu-se a ideia de que dentro dos seres
vivos, existem substncias capazes de catalisar de modo muito especfico
determinadas reaces qumicas. Uma enzima um catalisador biolgico, que mesmo
em baixas concentraes aumenta a velocidade da reaco. As enzimas diminuem a
energia de activao sem afetarem o equilbrio da reaco.
Alguns microrganismos so capazes de produzir diversas enzimas de interesse
industrial. Dentro desses microrganismos a levedura Saccharomyces cerevisiae,
popularmente conhecida como fermento de panificao, produz a enzima invertase. A
invertase (-fructofuranosidade) uma enzima que catalisa a hidrlise da sacarose em
acar invertido invertido, isto , numa mistura equimolar dos seus dois monmeros
constituintes: glicose e frutose (fig 1).

O seu substrato preferencial a sacarose porm, tambm, pode hidrolisar ramonose e
estaquiose.

Figura 1 - Hi drolise da sacarose catalisada pel a invertase. A glicose e a frutose
so acares redutores.

[INVERTASE CINTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]

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A invertase est classificada na famlia GH32 de glicosdeos hidrolases, e encontra-se
presente nos animais, mas tambm em plantas superiores, fungos e bactrias.
Leveduras (Saccharomyces sp.) produzem diferentes tipos de invertases:
intracelulares, ligadas parede, e, mais raramente, extracelulares. As enzimas ligadas
parede apresentam uma grande frao glicdica atravs da qual acredita-se que se
liguem a mananas da parede celular. A temperatura tima de atuao 55 C para
solues diludas de sacarose e de 65 C a 70 C para solues com concentrao
superior a 10%. Solues acima de 20% de sacarose apresentam taxas decrescentes de
hidrlise em virtude da reduzida disponibilidade de gua no meio reacional.

Tabela 1 - Al gumas das propriedades das i nvertases da Saccharomyces cerevisiae.
Fonte: Brenda

Existem actualmente vrias aplicaes desta enzima, principalmente na indstria
alimentar, pois a frutose mais doce que a sacarose (cerca de 40%) e no cristaliza to
facilmente melhorando a textura de doces e gelados.

Cintica Enzimtica

A cintica enzimtica estuda a aco das enzimas, a sua actividade cataltica e seu
estudo feito in vitro. Para esses estudos podem ser usados, como fonte de enzima,
preparaes que a contenham em estado mais ou menos purificado, no entanto,
quanto mais purificada estiver a preparao enzimtica mais fcil ser o seu estudo
cintico.
Enzima Livre Enzima Imobilizada
Km [mM] 41.2 7.43
pH timo 4.6 4.6
Temperatura C 45 65
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K1
K2
K3
Foram Leonor Michaelis e Maud Menten, quem primeiro estudou estas relaes,
apresentando em 1913 um estudo quantitativo das variaes da velocidade de uma
reao de acordo com o aumento da concentrao de substrato na mesma (Fig.2).







Figura 2 Grfico que relaciona a velocidade da reao coma a concentrao de
substrato

Assim, atravs da equao:

Em que E a enzima, S o substrato e E-S o complexo enzima-substrato.
Do estudo desta reaco surge a constante de Michaelis:
[
[][]
[ ]
]


Em que uma constante de equilbrio para a dissociao do complexo E-S, onde [E] a
concentrao de enzima livre, [S] a concentrao de substrato e [E-S] a concentrao
de enzima que se ligou ao substrato. Substituindo na expresso de
[] [

] [ ]
,fica:

[
] [ ][]
[ ]

[
][]
[ ]
[]
[]
[]

[
]
[ ]

[ ]
[
]

[]
[]


[INVERTASE CINTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]

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A velocidade da reaco directamente proporcional concentrao de enzima
ligada, significava que v=k [E- S] e Vmx= k [E
0
] (E
0
a concentrao total de enzima
ligada ao substrato, e velocidade mxima corresponde a do momento em que todas as
enzimas esto ligadas ao substrato) e, portanto,


[]
[]
, que substituindo na expresso de Km fica


[]
[[]


Esta equao, denominada Equao de Michaelis Menten permite no s obter o valor
de Vmax como tambm de Km (valores estes compreendidos entre 10
-8
M e 10
-2
M).
Esta constante permite medir a afinidade da enzima para o substrato, que igual a
1/Km, ou seja, se a afinidade for elevada Km baixo, sendo necessria uma baixa
concentrao de substrato para se atingir a velocidade mxima.
Mais uma vez, obtendo um grfico que relacione a velocidade da reaco com a
concentrao de substrato, deduz-se que:

, entao []
Por outras palavras Km igual concentrao de substrato para qual a velocidade
igual a metade da velocidade mxima.

Influncia da temperatura e do pH na actividade enzimtica

A velocidade da reaco enzimtica condicionada por diversos factores, entre os
quais o pH e a temperatura do meio em que se d a reaco.
O efeito da temperatura na velocidade das reaes enzimticas pode ser mutio
complexo, uma vez que a temperatura pode afetar vrios parmetros da reao, como
por exemplo a estabilidade da enzima, a velocidade da transformao do complexo ES,
a afinidade entre o substrato e a enzima, a ionizao de grupos importantes na catlise
e a afinidade de ativadores e inibidores para a enzima.
A temperatura exerce dois efeitos antagnicos sobre um sistema enzimtico, ou seja,
ao aumentarmos a temperatura aumentamos a constante de equilbrio, e por
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conseguinte a velocidade da reaco. No entanto, a partir de um determinado valor de
temperatura a protena enzimtica comea a desnaturar, diminuindo a sua actividade.
Verifica-se ento que existe uma temperatura ptima para qual a reaco tem
velocidade mxima, e corresponde a um compromisso entre a temperatura que
favorece a reaco e a temperatura de desnaturao da enzima.









Figura 3 - Efeito da temperatura na activi dade enzimtica.

Por outro lado temos o pH do meio, o qual influencia directamente a reaco
enzimtica. Assim, pH extremos (bsicos ou cidos) modificam irreversivelmente a
estrutura da enzima, desnaturando-a ou modificando a ligao entre apoenzima (parte
no proteica do enzima equivalente aos cofactores orgnicos) e coenzima (parte
proteica da enzima). O pH influencia tambm o estado de ionizao do substrato e dos
aminocidos do centro activo em geral.





Figura 4 - Efeito do pH na actividade enzimtica.

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Imobilizao de enzimas

A imobilizao pode ser definida como o movimento no independente das clulas ou
enzimas na parte aquosa dos sistemas, por estarem alojadas dentro ou na superfcie
de um agente imobilizador.
O uso de sistemas com clulas imobilizadas tem sido considerado como uma
alternativa vivel para se aumentar a produtividade em razo das elevadas densidades
celulares normalmente obtidas.
As enzimas tm, intrinsecamente, excelentes propriedades, como: atividade,
seletividade e especificidade. Estas caractersticas permitem o desenho de processos
de sntese de produtos muito complexos em condies ecossustentadas. Mas, apesar
do elevado potencial de aplicao das enzimas, necessrio serem otimizadas, de
modo a cumprirem suas funes biolgicas com eficcia e eficincia. A catlise de
reaes em processos metablicos complexos pode ser regulada em vrios nveis e,
assim, algumas reaes passam a ter as caractersticas para serem aplicadas em
processos industriais.
O principal interesse em imobilizar uma enzima obter um biocatalisador com
atividade e estabilidade que no sejam afetadas durante o processo, em comparao
sua forma livre. Idealmente, a enzima imobilizada dever exibir uma atividade
cataltica superior. Alm disso, no devero ocorrer alteraes estruturais, bem como
modificaes no centro ativo. A imobilizao pode inibir ou aumentar a atividade e a
estabilidade da enzima, porm no existe uma regra que prediga a manuteno destes
parmetros aps o processo de imobilizao.
Devido ao custo relativamente alto da invertase, o processo enzimtico mais caro do
que a hidrlise cida. Para reduzir o custo do produto final, a aplicao de invertase
imobilizada tem sido considerada uma soluo adequada. Esta enzima imobilizada tem
muitas vantagens, porque pode ser reutilizada vrias vezes permanecendo ativa. Os
processos industriais convencionais envolvem a incubao da mistura desta enzima
assim como do seu substrato. Aps a concluso de cada conjunto de reaes, o
produto formado recuperado por desnaturao enzima. Neste processo ocorre a
perda dos centros ativos da enzima e enzima no pode ser reutilizada. A imobilizao
protege a actividade da enzima de condies desfavorveis, como pH, temperatura,
[INVERTASE CINTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]

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solventes orgnicos e/ou compostos inibidores presentes no meio de fermentao,
promove a separao e recuperao da enzima. A aplicao da invertase imobilizada
proporciona uma considervel reduo nos custos operacionais.
Na seleo de um suporte para uma determinada aplicao, devem ser analisadas as
suas propriedades fsicas e qumicas.
Muitos estudos foram centrados sobre o suporte para a imobilizao da invertase em
diferentes matrizes, como lcool polivinlico (Agkol et al . de 2001), poliacrilamida
(Abdellah et al , 1992; Mansour e Dawoud , 2003) , quitosano e dietilaminoetilcelulose
(Abdellah et al . , 1992) .
A imobilizao pode ocorrer atravs da adsoro (fsica ou inica) ou da ligao da
enzima a um material insolvel, pelo uso de um reagente multifuncional atravs de
ligaes cruzadas, confinamento em matrizes formadas por gis polimricos ou
encapsulao atravs de uma membrana polimrica. A Figura 5 apresenta
esquematicamente a classificao dos mtodos utilizados para imobilizao das
enzimas.

Figura 5 - Classificao dos mtodos de imobilizao de enzimas. (Fonte:
VECCHIA et al., 2004).



[INVERTASE CINTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]

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A imobilizao por meio de aprisionamento em matrizes porosas, como o alginato,
normalmente envolve a sintetizao da matriz porosa em torno do biocatalizador a ser
utilizado. Os poros da matriz formada so menores que as clulas contidas no seu
interior. Este mtodo tem sido extensivamente estudado para a imobilizao de
clulas viveis, devido possibilidade de uso de polmeros hifroflicos.
O alginato um polissacardeo linear extrado de cadeias de algas marinhas. Devido
sua natureza hidroflica, sua no-toxicidade, alta estabilidade mecnica, elevada
porosidade de substracto e difuso de produtos, e sobretudo, sua simplicidade de
requisitos processuais para a imobilizao, o alginato tem a propriedade de tornar a
enzima mais estvel.
Esta propriedade do alginato torna-o como um dos suportes mais utilizados na
imobilizao da inertase.
Como principais desvantagens so citadas: o pequeno volume disponvel para a
conteno das clulas imobilizadas, a perda de clulas para o meio de fermentao e a
instabilidade dos suportes normalmente utilizados, que limita a utilizao dos
agregados por longos perodos.









Figura 6 Encapsulamento da invertase em esferas de alginato


[INVERTASE CINTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]

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Material e Mtodos

Para conseguir determinar as constantes cinticas da invertase em clulas livres,
inicialmente, foi preparada a suspenso de Saccharomyces cerevisiae. Para tal, foi
colocado num gobel, 0,4 g de Saccharomyces cerevisiae dissolvido em 20 ml de
tampo acetato pH 4,5.
De seguida, foram preparadas cinco solues de sacarose num tampo acetato de pH
4,5 contendo 1% de cloreto de clcio, em cinco bales volumtricos de 50 ml,
contendo 10, 20, 50, 100 e 150 g/L. A cada uma destas, por ordem crescente de
concentrao, procedeu-se execuo do ensaio. Para isso, foi colocada a soluo no
reator, previamente termostatizado a 44,5C. Retirou-se uma amostra de 0,1 ml
correspondente ao tempo inicial e colocou-se num eppendorf, adicionando-se de
imediato 0,1 ml de DNS. Mantendo o reator sob agitao, foram adicionados 0,5 ml de
suspenso de clulas, correspondendo ao incio da contagem.
A partir deste momento, foi retirado 0,1 ml a cada minuto at perfazer 5 minutos.
Cada uma destas amostras pipetadas, foram colocadas em cinco eppendorfs diferentes
e acrescentou-se 0,1 ml de DNS. Procedeu-se preparao de um branco com 0,1 ml
de tampo de acetato pH 4,5 e 0,1 ml de DNS. Estas sete amostras foram mergulhadas
num banho de gua a 100 C durante 5 minutos e de seguida arrefecidas em gua
temperatura ambiente. Foi acrescentado 1 ml de gua destilada, a cada uma destas.
Por fim, foi pipetado, de cada uma, 0,2 ml em triplicado para a microplaca e, utilizando
540 nm, foi lida a absorvncia.
Para a elaborao da curva de calibrao, procedeu-se preparao das solues de
glucose em bales volumtricos de 100 ml com concentraes de 0,05, 0,1, 0,2, 0,4,
0,6, 0,8, 1, 2, 3, 4 e 5 g/L. A estas, foram retirados 0,1 ml para 11 eppendorfs diferentes
e adicionou-se 0,1 ml de reagente DNS. Ainda foi preparado um eppendorf com 0,1 ml
de gua destilada e 0,1 ml do reagente, denominado branco. Estes, foram
mergulhados no banho de gua a 100 C durante 5 minutos, arrefecidos em gua
temperatura ambiente e adicionado 1 ml de gua destilada. Retirou-se de cada um 0,2
ml para uma microplaca em triplicado e foi lida a absorvncia a 540 nm. A partir destes
valores procedeu-se elaborao da curva de calibrao (Figura 1 dos anexos).
[INVERTASE CINTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]

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Para a elaborao do ensaio com clulas imobilizadas, preparou-se 100 ml de soluo
de cloreto de clcio a 2% (p/v) e uma matriz lquida com 1g de alginato de sdio e 45
ml de gua destilada. Usando a placa de aquecimento com agitao, aqueceu-se a
matriz liquida, para dissolver o alginato e adicionou-se 2,5 ml de suspenso de clulas.
Utilizando uma seringa, adicionou-se gota a gota 100 ml da soluo de cloreto de
clcio mantendo-a durante 15 minutos na matriz, para completar a gelificao. Lavou-
se as esferas numa soluo de tampo acetato pH 4,5 a 1% (p/v) e secou-se em papel
de filtro. Procedeu-se pesagem de todas as esferas e dividiu-se em cinco pores
iguais, das quais tambm se procedeu pesagem. Ainda foi determinado o dimetro
mdio das mesmas.
Foram preparadas cinco solues de sacarose num tampo acetato de pH 4,5, em
cinco bales volumtricos de 50 ml, contendo 10, 20, 50, 100 e 150 g/L. A cada uma
destas, por ordem crescente de concentrao, procedeu-se ao execuo do ensaio.
Para tal, foi colocada a soluo no reator, previamente termostatizado a 43,5C.
Retirou-se uma amostra de 0,1 ml correspondente ao tempo inicial e colocou-se num
eppendorf, adicionando de imediato 0,1 ml de DNS. Com o meio sob agitao
adicionou-se 0,5 ml de suspenso celular e uma poro de esferas, contendo a enzima
imobilizada. A partir deste momento, retirou-se 0,1 ml a cada 3 minutos at perfazer
um total de 15 minutos de reaco e colocou-se cada uma destas amostras em cinco
eppendorfs com 0,1 ml de DNS. Ainda foi preparada uma soluo de branco com 0,1
ml de tampo de acetato pH 4,5 e 0,1 ml de DNS. Estas sete amostras foram
mergulhadas num banho de gua a 100C durante 5 minutos, arrefecidas em gua
temperatura ambiente e adicionado 1 ml de gua destilada. Por fim, retirou-se 0,2 ml
de cada eppendorf em triplicado e colocou-se numa microplaca para ler a absorvncia
a 540 nm.






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0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
1,600
1,800
2,000
0 50 100 150 200 250 300 350
C
O
N
C
E
N
T
R
A

O

D
E

G
L
U
C
O
S
E

(
G
/
L
)


TEMPO (S)
10 g/L 20 g/L 50 g/L 100 g/L 150 g/L
Resultados e Discusso

Os dados obtidos experimentalmente foram utilizados para a determinao dos
parmetros a estudar e comparar neste estudo.
Foi construda uma reta de calibrao para possibilitar o doseamento dos aucares
redutores na reao da invertase, pelo mtodo de DNS. Atravs dos valores de
absorvncia medidos, para cada ensaio em triplicado, foi calculada a concentrao de
glucose, com recurso equao da reta de calibrao. Atravs de regresses lineares,
para as diferentes concentraes de substrato, com concentrao de glucose em
funo do tempo, obtiveram-se os valores de velocidade (V
0
) respetivos a cada ensaio.
Em anexo encontram-se as tabelas com os parmetros calculados, assim como os
respectivos erros associados. A partir dos valores de V
0
foi possvel calcular os
parmetros alvo deste estudo, utilizando a equao e ajuste no linear de Michaelis-
Menten.
- Comparao da concentrao de glucose em funo do tempo, nos diferentes
ensaios das duas vias catalticas, livre e imobilizada:
As figuras seguintes (Fig 7 e Fig 8), representam graficamente a variao da
concentrao de glucose em funo do tempo, para cada ensaio em diferente
concentrao de substrato.
Figura 7 - Representao grfica da variao da concentrao de gl ucose em
funo do tempo, em enzima livre.
[INVERTASE CINTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]

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-0,100
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0 50 100 150 200 250 300 350
C
O
N
C
E
N
T
R
A

O

D
E

G
L
U
C
O
S
E

(
G
/
L
)


TEMPO (S)
10 g/L 20 g/L 50 g/L 100 g/L 150 g/L

Figura 8 - Representao grfica da variao da concentrao de gl ucose em
funo do tempo, em enzima imobili zada.

Verificou-se nos ensaios com a enzima livre uma variao irregular dos resultados uma
vez que ao longo de cada ensaio no h um aumento e estabilizao da produo de
glucose. Estes valores reflectem todos os erros associados a pesagens, medies e
diluies. O facto de a reaco ter continuado por mais tempo nos ependorfs devido a
uma possvel aao reduzida do reagente de DNS assim com a temperatura dos banhos
no estar no valor pretendido (100C), contribuiu tambm para o aumento deste erro.
Relativamente aos ensaios com a enzima imobilizada verifica-se tambm valores
bastante discrepantes, justificados pelos erros j referidos. No entanto possvel
perceber que medida que se aumentou a concentrao de substrato, de ensaio para
ensaio, h um aumento de produo de glucose. Apoiando desta forma a teoria
estudada.
Uma vez que os restantes parmetros em estudo foram calculados com base nestes
dados, os erros associados s concentraes propagam-se para as constantes cinticas.


[INVERTASE CINTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]

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- Determinao e comparao das constantes cinticas da invertase da S. cerevisiae
na sua forma livre e imobilizada
De acordo com os estudos realizados em torno da cintica enzimtica, o aumento da
concentrao de substrato leva a um aumento da velocidade da reao at atingir o
ponto de saturao. Isto , quando a concentrao do substrato muito elevada todas
as molculas da enzima estaro ligadas a molculas de substrato, enzima saturada,
neste ponto a enzima funcionar no mximo da sua velocidade.

Os valores de velocidade mxima, de Km e de K2 encontram-se na tabela ?, para o
biocatalizador livre e imobilizado. Os grficos utilizados para obteno destes valores
encontram-se em anexo.


Biocatalizador livre Biocatalizador imobilizado
Vmx (g/L.s) 0,0038 0,0046 0,0020 0,0011
Km (g/L) 10 56,1771 20 39,9942
K
2
(s
-1
) 0,002 0,0110 0,010 0,0207

Segundo os resultados apresentados na tabela 2, verifica-se que o valor de velocidade
mxima da enzima imobilizada inferior ao valor para a enzima livre. Esta diminuio
poder estar relacionada com vrios aspectos, tais como instabilidade do suporte que
leva a alteraes no microambiente dentro do suporte, desprendimento de enzima do
suporte, ou mesmo perda de enzima no manuseamento das esferas de alginato,
resistncia mecnica devido a ligaes entre o alginato e o sdio, assim com a
diminuio da acessibilidade do substrato para o centro ativo da enzima imobilizada.
Do ponto de vista prtico, Km fornece indicaes sobre a eficincia com que a enzima
trabalha com dado substrato. Um Km pequeno indica que, para igual concentrao
Tabela 2 - Constantes cinticas para biocatali zador livre e imobili zado, com os
respectivos erros associados

[INVERTASE CINTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]

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de substrato, a enzima capaz de catalisar a transformao desse substrato a maior
velocidade do que quando o Km grande.
Quando comparados os Km entre a experincia com a enzima livre e imobilizada,
verifica-se um valor de Km superior para a enzima imobilizada. Esta variao explica-se
pelo facto de que quando a enzima se encontra imobilizada existem limitaes
transferncia do substrato, assim o substrato apresenta maior dificuldade em chegar
ao centro ativo e desta forma o valor de Km aumenta.
Uma vez que a enzima e o substrato usado para as duas vias catalticas so o mesmo
ento, esta constante deveria manter-se. Contudo, devido s contrapartidas
adjacentes ao processo de imobilizao (alterao do microambiente dentro do
suporte, limitaes difusionais, etc.), o valor de Km aumenta o que significa que a
enzima atinge metade da velocidade mxima com concentraes maiores de
substrato, relativamente enzima livre.
Verifica-se ainda que o erro associado aos valores de Km bastante elevado,
revelando que os valores calculados podem variar entre um largo espectro. A
justificao para este elevado valor de erro est na propagao de erros ao longo de
todos os clculos efectuados. O Km foi obtido atravs do ajuste no linear das
velocidades iniciais, ajuste esse que s por si tem um erro associado. Para alm disso o
erro j se propaga desde os clculos iniciais para obter essas velocidades, comeando
nos erros associados preparao e diluio das solues utilizadas, depois obteno
da concentrao por meio da equao da reta de calibrao e ainda obteno das
velocidades por meio de regresses lineares.

O K
2
corresponde constante cataltica, revelando o poder cataltico da enzima em
estudo. Analisando os resultados obtidos para este parmetro e comparando o
biocatalizador livre com imobilizado, verifica-se um aumento no biocatalizador
imobilizado. Este aumento reflecte o facto de a enzima, na forma imobilizada
apresentar maior estabilidade. Contudo esta estabilidade no se reflecte nas restantes
constantes pois estes ensaios foram realizados num curto espao de tempo e no foi
possvel simular as condies ideias a este processo.
[INVERTASE CINTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]

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De um modo geral verifica-se que todos os valores esto afectados de erros e os
principais motivos para essas discrepncias so:
a utilizao da levedura proveniente de um fermento de padeiro, torna esta
rica em impurezas que tero interferido no seu desempenho, podendo ter
causado obstruo nos poros da matriz;
a impossibilidade de garantir que ao termostatizar a 45C a soluo de sacarose
estivesse exactamente a 45C, visto que o sistema partilhado por dois grupos
o que pode originar pequenas oscilaes de temperatura, assim como a
impossibilidade de garantir que o banho de gua estivesse a 100C;
o prprio facto de a agitao do reator no ser constante durante tempos
diferentes e entre ensaios pode influenciar o resultado;
a possvel formao de agregados mais ou menos maiores na suspenso de
levedura, uma vez que a agitao antes de a colocar no reator no era
controlada nem uniforme ;
mau manuseamento do material em especial das pipetas. Podem surgir erros
ao pipetar e ao transferir para o recipiente;
o facto de ser impossvel cumprir escrupulosamente com os tempos
estipulados no protocolo;
aproximaes no tratamento dos resultados;
erros de leitura no espectrofotmetro;
o facto de terem sido desprezados vrios pontos no traado das rectas cujo
declive d a velocidade. A escolha dos pontos pode no ter sido a mais
correcta. Como as velocidades foram utilizadas na determinao das
constantes cinticas, ocorreu a propagao de erros.





[INVERTASE CINTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]

18

- Determinao da atividade especfica da invertase para as duas formas
biocatalticas em estudo
As enzimas possuem normalmente uma alta especificidade em relao s reaes que
catalisam e aos substratos que esto envolvidos nessas reaes. Como foi utilizada a
mesma enzima e o mesmo substrato nas duas vias catalticas, estabeleceu-se no
seguinte grfico a comparao da atividade especfica entre a enzima livre e
imobilizada.




A actividade especfica da invertase maior quando usada na forma livre em relao
imobilizada em esferas de alginato. Uma vez que a atividade especfica diretamente
proporcional velocidade inicial, verifica-se que na enzima imobilizada, a velocidade
menor, logo a sua actividade especfica tambm menor.



0,00E+00
5,00E-04
1,00E-03
1,50E-03
2,00E-03
2,50E-03
3,00E-03
3,50E-03
0 20 40 60 80 100 120 140 160
A
T
I
V
I
D
A
D
E

E
S
P
E
C

F
I
C
A

(
S
-
1
)


[S] (G/L)
enzima livre enzima imobilizada
Figura 9 - Representao grfica da atividade especfica da enzima livre e
imobilizada.
[INVERTASE CINTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]

19


- Determinao dos fatores de eficincia, da difusividade de sacarose no gel de
alginato e efeito do diametro das esferas nas limitaes difusionais internas
Um dos problemas associados transferencia de massa a resistncia do sustrato, ou
seja, o sustrato tem dificuldade em difundir-se na matriz de gel.
Ao mesmo tempo, existe uma resistencia difusional das molculas do produto
formado, que por vezes pode acumular-se prximo do centro do gel, causando a
inibio da enzima por acumulao do produto.
Assim, idealmente, a rede da matriz deve ser espessa o suficiente para que a passagem
do substrato e produto para fora e dentro das esferas ocorra com o menor
impedimento possvel.




Uma vez que o fator de eficincia estabelece uma comparao entre a velocidade da
enzima imobilizada relativamente livre, no possivel analisar com rigor este
parmetro, visto que, existem vrios erros associados determinao das velocidades.
Teoricamente o fator de eficincia deve ser maior para maiores concentraes de
substrato. Apesar da variao dos valores obtidos, de um mode geral, observa-se um
aumento significativo do fator de eficiencia entre o primeiro ensaio, 10 g/L, e o ltimo,
150 g/L.
Relativamente difusividade efetiva, constatou-se um aumento deste parmetro,
justificado pelo aumento da concentrao de substrato do meio. Todavia, registaram-
10 g/L 20 g/L 50 g/L 100 g/L 150 g/L
Fator de
eficincia


0,550 0,559

0,241 0,211

0,500 0,509

0,438 0,297

0,810 0,548
Difusividade
efetiva
Def (cm
2
/s)

4,75E-08 8,95E-08


2,11E-08 3,98E-08

1,90E-07 3,58E-07


1,22E-07 2,29E-07


7,60E-07 1,43E-06

Tabela 3 - Fator de eficincia e difusividade da sacarose em alginato, para cada ensaio a
diferentes concentraes de sacarose
[INVERTASE CINTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]

20

se valores um pouco discordantes deste aumento associados mais uma vez aos erros j
anteriormente mencionados.
A difusividade efetiva do substrato depende da porosidade interna do suporte e da
tortuosidade. Portanto, o aumento do dimetro das esferas causa um aumento da
tortuosidade, que por sua vez leva diminuio da difusividade efetiva do substrato.
O dimetro das esferas utilizado nesta experincia era significativamente elevado
(5mm). Isto explica os baixos valores obtidos para a difusividade.
Em simultneo, foi realizada a mesma experincia com diferentes diametros de
esferas. De um modo geral, os resultados obtidos para a difusividade efetiva nessas
experincias, apoiam as afirmaoes anteriores, isto , para dimetros inferiores a 5mm
a difusividade efetiva apresenta valores superiores.














[INVERTASE CINTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]

21

Concluso

Aps a discuso dos resultados obtidos, averigou-se que: o fermento de padeiro
uitilizado para este experimento, continha enzima com baixa atividade cataltica, o que
influenciou partida todos os resultados; A imobilizao tem efeito significativo nas
constantes cinticas da enzima, Vmx, Km e K2; O fator de eficincia aumenta quando
a velocidade da enzima imobilizada aumenta em relao livre, que por sua vez
aumenta com um aumento do substrato; As limitaes transferncia de massa
interna dependem da difusividade do substrato na matriz, podendo ser compensadas
pelo o aumento da concentrao de substrato no meio; O dimetro das esferas de
alginato est diretamente relacionado com a difusividade efetiva do substrato na
matriz.














[INVERTASE CINTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]

22


Bibliografia

BON, E. P. S.; FERRARA, M. A.; CORVO, M. L. Enzimas em Biotecnologia. Rio de Janeiro:
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Invertase (EC.3.2.1.26) in Alginate Gel and its Kinetics. Food Journal. p.73-78, 2008.



[INVERTASE CINTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]

23


Anexos

- Figura 1















y = 0,2623x + 0,0092
R = 0,9966
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
0 1 2 3 4 5 6
A
b
s
o
r
v

n
c
i
a
s

5
4
0
n
m


Concentrao de glucose (g/L)
erro associado reta de calibrao
0,0138
Figura 1 representao grfica da reta de cal i brao dos aucares redutores.
[INVERTASE CINTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]

24

concentrao de substrato (g/L) 10 0,1206 20 0,1224 50 0,6353 100 0,7310 150 0,6264
0,089 0,082 0,084 0,085 0,072
0,092 0,083 0,083 0,084 0,072
0,094 0,08 0,081 0,088 0,073
media abs - branco 0,036 0,026 0,027 0,030 0,016
desvio padro 0,003 0,002 0,002 0,002 0,001
fator diluio s. d. s.d s.d s.d s.d
0,036 0,026 0,027 0,030 0,016
concentrao de glucose (g/L) 0,101 0,063 0,067 0,078 0,027
erro () 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627
0,11 0,12 0,105 0,097 0,091
0,107 0,12 0,095 0,098 0,091
0,11 0,114 0,094 0,101 0,093
media abs - branco 0,053 0,062 0,042 0,043 0,036
desvio padro 0,002 0,003 0,006 0,002 0,001
fator diluio s. d. s.d s.d s.d s.d
0,053 0,062 0,042 0,043 0,036
concentrao de glucose (g/L) 0,167 0,201 0,125 0,128 0,101
erro () 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627
0,134 0,121 0,114 0,125 0,11
0,11 0,122 0,117 0,125 0,104
0,118 0,12 0,118 0,124 0,104
media abs - branco 0,065 0,065 0,060 0,069 0,050
desvio padro 0,012 0,001 0,002 0,001 0,003
fator diluio s.d s.d s.d 1/2 1/2
0,065 0,065 0,060 0,137 0,100
concentrao de glucose (g/L) 0,211 0,213 0,195 0,488 0,346
erro () 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627
0,108 0,105 0,123 0,127 0,111
0,11 0,107 0,128 0,126 0,113
0,112 0,113 0,125 0,126 0,113
media abs - branco 0,054 0,052 0,069 0,070 0,056
desvio padro 0,002 0,004 0,003 0,001 0,001
fator diluio 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2
0,108 0,105 0,139 0,141 0,113
concentrao de glucose (g/L) 0,377 0,364 0,494 0,501 0,394
erro () 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627
0,128 0,102 0,087 0,15 0,084
0,126 0,258 0,086 0,147 0,082
0,127 0,254 0,087 0,146 0,078
media abs - branco 0,071 0,149 0,031 0,092 0,025
desvio padro 0,001 0,089 0,001 0,002 0,003
fator diluio 1/2 1/2 1/5 1/5 1/5
0,142 0,297 0,153 0,458 0,127
concentrao de glucose (g/L) 0,506 1,098 0,549 1,712 0,448
erro () 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627
0,127 0,1 0,098 0,113 0,091
0,107 0,102 0,099 0,111 0,093
0,115 0,27 0,098 0,112 0,094
media abs - branco 0,060 0,101 0,042 0,056 0,037
desvio padro 0,010 0,098 0,001 0,001 0,002
fator diluio 1/5 1/5 1/10 1/5 1/5
0,302 0,507 0,423 0,280 0,183
concentrao de glucose (g/L) 1,115 1,897 1,579 1,032 0,664
erro () 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627
T
E
M
P
O

3
T
E
M
P
O

4
T
E
M
P
O

5
T
E
M
P
O

0
T
E
M
P
O

1
T
E
M
P
O

2
abs a 540nm
abs a 540nm
abs a 540nm
abs a 540nm
abs a 540nm
abs a 540nm



Tabela 1 valores de absorvncia obti dos e valores de concentrao de glucose
calculados para os diferentes ensaios, com as crescentes concent raes de sacarose,
em enzima livre

[INVERTASE CINTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]

25






conc substrato (g/l) 10 20 50 100 150
0,117 0,086 0,097 0,101 0,084
0,129 0,086 0,093 0,103 0,087
0,135 0,086 0,091 0,104 0,086
media abs - branco 0,045 0,004 0,012 0,021 0,004
desvio padro 0,009 0,000 0,003 0,002 0,002
concentrao de glucose (g/L) 0,136 -0,020 0,009 0,044 -0,021
erro () 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627
0,087 0,080 0,102 0,113 0,128
0,094 0,080 0,104 0,113 0,121
0,095 0,080 0,095 0,114 0,126
media abs - branco 0,010 -0,002 0,018 0,031 0,043
desvio padro 0,004 0,000 0,005 0,001 0,004
concentrao de glucose (g/L) 0,003 -0,043 0,035 0,084 0,129
erro () 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627
0,084 0,114 0,12 0,112 0,131
0,086 0,117 0,125 0,111 0,134
0,085 0,116 0,122 0,115 0,133
media abs - branco 0,003 0,034 0,040 0,031 0,051
desvio padro 0,001 0,002 0,003 0,002 0,002
concentrao de glucose (g/L) -0,024 0,093 0,119 0,082 0,158
erro () 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627
0,093 0,107 0,139 0,15 0,164
0,093 0,109 0,138 0,158 0,167
0,094 0,107 0,149 0,156 0,163
media abs - branco 0,011 0,026 0,060 0,073 0,083
desvio padro 0,001 0,001 0,006 0,004 0,002
concentrao de glucose (g/L) 0,008 0,063 0,194 0,242 0,280
0,125 0,148 0,149 0,167 0,172
0,124 0,147 0,148 0,168 0,171
0,121 0,148 0,147 0,165 0,171
media abs - branco 0,041 0,066 0,066 0,085 0,089
desvio padro 0,002 0,001 0,001 0,002 0,001
concentrao de glucose (g/L) 0,123 0,215 0,217 0,288 0,306
erro () 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627
0,132 0,175 0,189 0,228 0,222
0,133 0,174 0,189 0,221 0,228
0,129 0,176 0,192 0,221 0,224
media abs - branco 0,049 0,093 0,108 0,141 0,143
desvio padro 0,002 0,001 0,002 0,004 0,003
concentrao de glucose (g/L) 0,153 0,319 0,377 0,504 0,509
erro () 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627
T
E
M
P
O

0
abs a 540nm
abs a 540nm
abs a 540nm
abs a 540nm
abs a 540nm
abs a 540nm
T
E
M
P
O

1
T
E
M
P
O

2
T
E
M
P
O

3
T
E
M
P
O

4
T
E
M
P
O

5
Tabela 2 valores de absorvncia obti dos e valores de concentrao de glucose
calculados para os diferentes ensaios, com as crescentes concentraes de sacarose ,
em enzima imobilizada

[INVERTASE CINTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]

26

- Figura 2


A


B


C

D
y = 0,002x + 0,0196
R = 0,9585
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 100 200 300 400
c
o
n
c
e
n
t
r
a

o

d
e

g
l
u
c
o
s
e

(
g
/
L
)


tempo (s)
10 g/l
y = 0,0058x - 0,0573
R = 0,9435
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
0 100 200 300 400
c
o
n
c
e
n
t
r
a

o

d
e

g
l
u
c
o
s
e

(
g
/
L
)


tempo (s)
20 g/l
y = 0,0026x - 0,0522
R = 0,9171
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 100 200 300 400
c
o
n
c
e
n
t
r
a

o

d
e

g
l
u
c
o
s
e

(
g
/
L
)


tempo (s)
50 g/l
y = 0,0032x + 0,019
R = 0,95
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 100 200 300 400
c
o
n
c
e
n
t
r
a

o

d
e

g
l
u
c
o
s
e

(
g
/
L
)


tempo (s)
100 g/l
[INVERTASE CINTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]

27


E



Tabela 3: valores de V0, com respectivos
erros associados, relativos a cada
concentrao de substrato, para a enzima na
forma livre

[S] (g/L) V
0
(g/L.s) varincia
10 0,0020 0,0013
20 0,0058 0,0043
50 0,0026 0,0024
100 0,0032 0,0014
150 0,0021 0,0006





- Figura 3


A

B
y = 0,0021x + 0,0025
R = 0,9784
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 100 200 300 400
c
o
n
c
e
n
t
r
a

o

d
e

g
l
u
c
o
s
e

(
g
/
L
)


tempo (s)
150 g/l
y = 0,0011x - 0,1605
R = 0,9374
-0,2
-0,15
-0,1
-0,05
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0 100 200 300 400
c
o
n
c
e
n
t
r
a

o

d
e

g
l
u
c
o
s
e

(
g
/
L
)


tempo (s)
10 g/L
y = 0,0014x - 0,1076
R = 0,9775
-0,150
-0,100
-0,050
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0 100 200 300 400
c
o
n
c
e
n
t
r
a

o

d
e

g
l
u
c
o
s
e

(
g
/
L
)


tempo (s)
20 g/L
Figura 2 representao grfica das retas de calibrao das concentraes de glucose em
funo do tempo, para cada ensaio a diferentes concentraes de sacarose (A, B, C, D e E),
para a enzima na forma livre.
[INVERTASE CINTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]

28


C


D


E



Tabela 4: valores de V0, com respectivos
erros associados, relativos a cada
concentrao de substrato, para a enzima na
forma imobilizada

[S] (g/L) V
0
(g/L.s) varincia
10 0,0011 0,0009
20 0,0014 0,0006
50 0,0013 0,0006
100 0,0014 0,0007
150 0,0017 0,0011




y = 0,0013x - 0,0189
R = 0,9796
-0,050
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0,400
0 100 200 300 400
c
o
n
c
e
n
t
r
a

o

d
e

g
l
u
c
o
s
e

(
g
/
L
)


tempo (s)
50 g/L
y = 0,0014x + 0,0116
R = 0,9227
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0 100 200 300 400
c
o
n
c
e
n
t
r
a

o

d
e

g
l
u
c
o
s
e

(
g
/
L
)


tempo (s)
100 g/L
y = 0,0017x - 0,0134
R = 0,9806
-0,100
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0 100 200 300 400
c
o
n
c
e
n
t
r
a

o

d
e

g
l
u
c
o
s
e

(
g
/
L
)


tempo (s)
150 g/L
Figura 3 representao grfica das retas de calibrao das concentraes de glucose em
funo do tempo, para cada ensaio a diferentes concentraes de sacarose (A, B, C, D e E),
para a enzima na forma imobilizada.

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