INTEGRANTES

Burgos Tuoque Stefany

Diez Vazquez Sindy
Farro Barbarn Rocio
Gutierrez Armijos Leydi
Lopez Ramirez Kelly
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Practica 4: Mtodo directo de
determinacin de microorganismos
aerobios mesfilos viables
Practica 4
Mtodo directo de determinacin de microorganismos
aerobios mesfilos viables
I. Introduccin
En diversos estudios microbiolgicos (como anlisis de alimentos, de agua de bebida,
de productos farmacuticos o del medioambiente entre otros), se requiere conocer el
nmero de microorganismos presentes en un material con objeto de determinar su
calidad. El procedimiento es esencialmente el mismo que para la medida del
crecimiento de las poblaciones de bacterias El crecimiento de poblaciones microbianas
puede determinarse mediante mtodos de medida de la masa total celular, que
generalmente es directamente proporcional al nmero de clulas, (mtodos de
determinacin del peso, de la actividad del cultivo o mtodos turbidimtricos) o por la
determinacin del nmero de clulas.
Son cuatro los mtodos bsicos utilizados para investigar el nmero total de
microorganismos:

1. Recuento en placa (SPC) para la determinacin del nmero de clulas viables
(entre las que se encuentran el mtodo de la placa vertida, el de superficie y el de
goteo).
2. Mtodo del nmero ms probable (MPN) de grmenes como clculo estadstico
del nmero de clulas viables.
3. Tcnicas de reduccin de colorantes para el clculo del nmero de clulas
viables con capacidad reductora.
4. Recuento microscpico directo (DMC) tanto para clulas viables como para
lasno viables.

El recuento en placa es el mtodo ms utilizado para la determinacin del nmero
declulas viables o unidades formadoras de colonias (u.f.c) en un alimento.
Los recuentos totales deben hacerse en funcin de uno de los siguientes factores:

Mtodo de muestreo utilizado
Distribucin de los microorganismos en la muestra
Naturaleza de la micro flora del alimento
Naturaleza del alimento
Antecedentes del alimento
Adecuacin nutricional del medio de cultivo
Temperatura y medio de incubacin
pH, aw, potencial de xido reduccin del medio
Tipo de diluyente utilizado
Nmero relativo de microorganismos en la muestra

Los recuentos de microorganismos viables se basan en el nmero de colonias que se
desarrollan en placas previamente inoculadas con una cantidad conocida de alimento e
incubadas en unas condiciones ambientales determinadas. Estos recuentos no
puedenconsiderarse como recuentos totales ya que solo son susceptibles del contaje
aquellos microorganismos capaces de crecer en las condiciones establecidas. Se puede
conseguir una amplia gama de condiciones variando la temperatura, la atmsfera, la
composicin del medio y el tiempo de incubacin.
El intervalo de temperaturas en el que crecen los microorganismos es muy amplio: de -
34 C a > 90 C. En funcin de esto se encuadra a los microorganismos en tres grupos

a) Los que crecen bien a 7 C o por debajo de esta temperatura cuya
temperatura: psicrtofos
b) Los que crecen entre 20 30 C, con una temperatura ptima de crecimiento est
entre 30 40 C: mesfilos
c) Los que crecen por encima de los 45 C: termfilos

En el grupo de los mesfilos aerobios se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras
capaces de desarrollarse a 30 C en las condiciones establecidas. En este recuento se
estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos. Refleja la calidad
sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulacin, las condiciones higinicas de
la materia prima. Un recuento bajo de aerobios mesfilos no implica o no asegura la
ausencia de patgenos o sus toxinas, de la misma manera un recuento elevado no
significa presenciade flora patgena. Ahora bien, salvo en alimentos obtenidos por
fermentacin, no son recomendables recuentos elevados.
Un recuento elevado puede significar:
Excesiva contaminacin de la materia prima
Deficiente manipulacin durante el proceso de elaboracin
La posibilidad de que existan patgenos, pues estos son mesfilos
La inmediata alteracin del producto
El recuento de mesfilos nos indica las condiciones de salubridad de algunos alimentos.

II. Objetivos
Conocer los mtodos para determinar el nmero de microorganismos viables
Realizar un recuento de bacterias mesfilas viables en los alimentos como
unindicador microbiano de la calidad del alimento.

III. Materiales
Muestra biolgica: Leche de soja
Medio de cultivo: Agar PlateCount: A. recuento en placa
Placas Petri
Diluyente: agua peptonada al 0.1%
Pipetas
Tubos de dilucin
IV. Procedimiento
a. Para la dilucin (en agua peptonada al 0,1%)
Se deben hacer 6 diluciones, pero para efectos de la prctica solo se realizaran 3
(10-1, 10-2 y 10-3) de las que se tomara 1ml para las placas de siembra en
profundidad, 0.1ml para siembra en superficie y 0.02ml para la siembra por
goteo
Para la dilucin se emplean 10 o 100ml de muestra ms 90 o 900ml de diluyente
respectivamente; para efectos de la prctica las dilucin se hicieron con 27ml de
diluyente y 3ml de muestra


b. Mtodo de siembra en profundidad
Prepararla muestra de alimento, si este es lquido hay que homogenizar, si es
slido hay que licuar o triturar la muestra debe estar en un frasco estril
se realizan 3 diluciones (2 placas petri por dilucin), en cada placa colocar 1ml
de la dilucin, luego agregar medio de cultivo (agar PlateCound de 10-15ml)
Luego mezclamos, la mezcla se realiza haciendo rotar la placa (5 veces sentido
horario, 5 veces de abajo arriba, 5 veces anti horario y 5 veces derecha e
izquierda).
Luego esperamos que solidifique el medio y luego incubamos a 30C por 24- 48
horas (dejamos una placa control).
Realizamos las lecturas a las 24 y 48 h.
Para el recuento de las colonias(a las 24 y 48 horas) se debe elegir placas que
tengan de 30 a 300 colonias.


c. Mtodo de superficie
se utiliza una placa para cada dilucin (son 3 diluciones), se controla en estufa
antes de servir el medio
Servir 0.1 ml de cada dilucin en la superficie de la placa y luego se la expandir
usando la esptula de Drigalsky.
Incubar a 30 C x 24 y 48 horas. Conteo y aumentar una cifra

d. Mtodo por goteo
Se utiliza una placa por dilucin, delimitada en 2 partes.
colocar gotas de la dilucin correspondiente en cada lado de la placa (0.02 ml de
gota).
Resultados contar entre 30 300 colonias.
Si una dilucin 10-2 = 68 colonias los multiplicamos por 102 y por 50 y el
resultado lo igualamos a UFC/ml
Luego llevar a incubar

V. Fundamento terico
Siembra
Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porcin de muestra (inculo) en un
medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y
multiplicacin. Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura
adecuada para el crecimiento.

Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen:
Que se efecten aspticamente
Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estn esterilizados
Que se realicen solo los manipuleos indispensables
Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando
un mechero o bien Flujo laminar.



VI. RESULTADOS
A. Recuento estndar en placa
Elegir las placas que tengan entre 30 y 300 colonias.
Contar utilizando un contador de colonias.
Contar las colonias de cada placa teniendo en cuenta la dilucin. Si la 1
dilucin tiene ms de 300 colonias se desecha.
Tomar la media aritmtica de las dos placas de cada dilucin.
Si hay dos diluciones entre el rango Se cuenta por separado las colonias.
Luego dividimos la dilucin ms alta entre las ms baja.
Si el resultado es mayor que 2 se coge las UFC de la ltima dilucin.
Si el resultado es menor que 2 se coge las UFC de la mayor dilucin.

B. Recuento Estimado
Si todas las diluciones tienen ms de 300 colonias se realiza un estimado
(una aproximacin) dividiendo en cuadrantes la placa, escogiendo 2 o ms
de ellos, se saca el promedio, y finalmente se multiplica por el nmero total
de cuadrantes divididos.
Finalmente para hallar el nmero de aerobios mesofilos viables, se aplica la
frmula:


Solo se informan las 2 primeras cifras Ej.: 1200 = 12 x 10
2
.
El resultado se expresa como UFC/ml. o gr.
Recuento Mtodo de Profundidad






1 LECTURA 24 HORAS 2 LECTURA 48 HORAS
10
-1
926 685 640 800
10
-1
464 960
10
-2
204 213 448 517
10
-1

10
-2

10
-3

Recuento = N de Colonias / Dilucin x inoculo

10
-3



Utilizamos el Recuento estndar, por lo tanto escogemos las diluciones con
lectura de 24h por tener menos de 300 colonias.
10-2/10-3 = 213/193 = 1.10
* Por lo tanto: 213 x 10
2
x 1 =
1. Recuento Mtodo de Superficie








1 LECTURA 24 HORAS 2 LECTURA 48 HORAS
10
-1
300 896
10
-2
180 384
10
-3
64 264
Utilizando el Recuento estndar, escogemos las diluciones con lectura de 24h
por tener menos de 300 colonias.
10-2/10-3 = 180/64 = 2.81
o Por lo tanto: 64x 10
3
x 10 =
2. Recuento Mtodo de Goteo





10
-2
224 575
10
-3
198 193 384 352
10
-3
188 320
10
-1

10
-2

10
-3

22 x 10
3
ufc/
mL
64 x 10
4
ufc/ mL
10
-2
10
-3



Utilizando un Recuento estndar, escogemos las diluciones con lectura de
menos de 300 colonias. Podemos utilizar cualquiera de las diluciones obtenidas.
10-2/10-3 = 8/2 = 2.00
* Por lo tanto: 4 x 10
3
x 50 =

Segn la NORMA TCNICA PERUANANTP
202.0012003.determina como lmite mximo permisible para estos
productos el valor de 10
5
UFC/ml. De los valores obtenidos en los 3
mtodos aplicados en la prctica, solo el mtodo por goteo
sobrepasa los valores permisibles, pero los otros 2 mtodos
utilizados se encuentran dentro de los valores permisibles, por lo
tanto se puede decir que la muestra tiene una regular calidad
microbiolgica. Para descartar se puede repetir la prctica, para una
mayor seguridad.
A lo anterior se debe agregar que los valores fueron calculados por
aproximacin ya que no se trabaj con ms diluciones.
Al trmino de la prctica se ha podido determinar que el alimento
empleado, en nuestro caso LECHE DE SOYA, es regular calidad
debido al cierto crecimiento excesivo de colonias que presento en el
mtodo por goteo.

VII. CONCLUSIONES
Se logr determinar el nmero de bacterias aerobias mesfilas viables a
travs de los 3 mtodos trabajados en prctica.
Se pudo determinar el nmero de microorganismo presentes en la muestra de
mayonesa casera






1 LECTURA 24 HORAS 2 LECTURA 48 HORAS
10
-2
8 10
10
-3
4 6
2 x 10
5
ufc/ mL
VIII. CUESTIONARIO
1. Qu otras sustancias se utilizan como diluyentes para realizar anlisis
microbiolgicos en alimentos?

Adems del Agua Peptona Tamponada (BPW), que es til en diluir muestras de
alimentos permitiendo mantener sus caractersticas sin alterar la muestra; es muy
comn el uso de diluyente Agua de Triptona (Trytone Water: TW) y la solucin
Ringer , cuyas composiciones son las siguientes:

Agua Triptona Solucin Ringer Agua Peptona Tamponada
Triptona 10 g Cloruro sdico 2.250 g Peptona de
carne
10 g
Cloruro de
sodio
5 g Cloruro clcico 0.120 g Cloruro sdico 5 g
Agua
destilada
1000 ml Bicarbonato
sdico
0.050 g Fosfato sdico 3.5 g
Cloruro
potsico
0.105 Fosfato
potsico
1.5 g
Agua destilada 1000 ml Agua destilada 1000 ml

Solucin Ringer :
Es una solucin electroltica balanceada en la que parte del sodio de la solucin
salina isotnica es sustituida por calcio y potasio. Es un medio isotnico ms
equilibrado que la simple solucin salina de cloruro sdico y su composicin
permite su esterilizacin al autoclave sin que se formen precipitados. Se utiliza
rutinariamente, en los estudios sobre bacterias, a una disolucin para obtener
suspensiones celulares o para hacer un banco de soluciones. Al proporcionar una
presin osmtica similar a la que tiene en su interior la clula bacteriana, permite
mantener las bacterias durante un cierto tiempo sin que stas se destruyan.

Agua Triptona:
Su base nutritiva permite el desarrollo de diversas especies bacterianas. La
triptona presenta alto contenido en triptfano, el cual es el sustrato utilizado por
los microorganismos para la produccin de indol, cido pirvico y amonaco. El
cloruro de sodio mantiene el balance osmtico.

Agua Peptonada Tamponada:
Es un medio utilizado como diluyente y para el pre-enriquecimiento de
microorganismos a partir de diferentes muestras. Es ampliamente utilizado en
los protocolos de control higinico de alimentos para la bsqueda de Salmonella
spp. El Agua Peptonada Bufferada mantiene un pH alto durante el perodo de
pre-enriquecimiento y anula los efectos del dao celular que pueden ocurrir a pH
cido. Esto es particularmente importante en las muestras de vegetales que
tienen una baja capacidad reguladora. Tambin puede ser utilizado para evaluar
alimentos de aves de corral. En el medio de cultivo, la peptona es la fuente de
carbono, nitrgeno, vitaminas y minerales. El cloruro de sodio mantiene el
balance osmtico y los fosfatos forman un sistema buffer que regulan el pH del
medio.

Tambin se podra utilizar Solucin Salina Fisiolgica (SSF) como diluyente,
que como su nombre lo dice sirve para mantener viables las muestras de
contenidos fisiolgicos tales como secreciones. Adems sirve para diluir
muestras fisiolgicas. Slo contiene 0.9 g de Cloruro sdico y 1000 ml de Agua
Destilada.


2. En una preparacin de dilucin como se prepara 10
0
?

Una dilucin 100 es muy utilizada para nombrar la primera dilucin preparada a
partir de una muestra lquida de la cual se obtendrn diluciones decimales
sucesivas, no se considera una dilucin 10-1 debido a que en esta dilucin busca
diluir una muestra slida para su homogenizacin.

3. Ventajas y desventajas de cada tcnica de siembra.

Recuento en Placa por Mtodo de Siembra en Profundidad:
Ventajas:
- Es el mejor mtodo para el desarrollo de microaerfilos.
- Hay un mayor aprovechamiento de nutrientes.
- Mayor cantidad de la muestra.
- Menor error.
- Facilita el aislamiento de algunas especies caractersticas como
Clostridium.

Desventajas:
- La temperatura del agar puede afectar a algunos
microorganismos sensibles al calor.
- Hay dificultades al subcultivar colonias.
- Si no se emplea el medio translucido la visualizacin de
colonias se ve afectada.

Recuento en Placa por Mtodo de Siembra en Superficie:
Ventajas:
- Permite un fcil estudio de las diferentes colonias tanto en su
morfologa como en su recuento.
- Hay facilidad para realizar el subcultivo de colonias.
- No es necesario que el medio sea claro o traslucido.


Desventajas:
- Debido al pequeo volumen de muestra utilizada el alimento
suspendido puede interferir como nutriente o ejerciendo efecto
inhibitorio sobre los microorganismos.

Recuento en Placa por Mtodo de Siembra en Goteo:
Ventajas:
- Es fcil de realizar el estudio morfolgico y la caracterizacin
de los diversos tipos de colonias.
- Se comprueba fcilmente con exactitud del sistema de
dilucin.
- Los microorganismos son inactivos por el calor.
- No es necesario que el medio sea traslucido.

Desventajas:
- Debido al pequeo volumen de muestra utilizada el alimento
suspendido puede interferir como nutriente o ejerciendo efecto
inhibitorio sobre los microorganismos.
- Solo da buenos resultados en muestras demasiado
contaminadas


IX. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.
Adams M. R. y M. O. Moss; 1995; Microbiologa de los Alimentos; Editorial
Acribia; Zaragoza; Espaa; Pg. 388 391.
Doyle B.; 1997; Microbiologa de los Alimentos; Editorial Acribia; Zaragoza;
Espaa.
FRAZIER W.C, WESTHOFF D.C. MICROBIOLOGA DE LOS
ALIMENTOS. 4ta Edit. Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa.1993.
Harrigan B. W.; 1995; Mtodos de Laboratorio en Microbiologa de los
Alimentos y Productos Lcteos; 3
ra
edicin; Editorial Acribia; Zaragoza,
Espaa.