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AGROBIOTECNOLOGIA

CURSO 2013
-
Control de malezas y resistencia a herbicidas
Departamento de Biotecnologa Departamento de Biotecnologa
NIDERA S.A
Departamento de Fisiologa, Biologa Molecular y Celular
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
Malezas y su control
Herbicidas
Aplicaciones biotecnolgicas al control de malezas
- Resistencia a glifosato
- Resistencia a glufosinato
- Resistencia a inhibidores de la acetolactato sintetasa
- Inhibidores de la fotosntesis
Sumario
- Inhibidores de la fotosntesis
- Otras resistencias metablicas
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Referencias
Consideraciones sobre el uso de cultivos / herbicidas
Resistencia y tolerancia a herbicidas utilizados indistintamente en la
literatura cientfica.
Comit de plantas resistentes a herbicidas ( Herbicide Resistant Plant
Committee):
Resistencia: capacidad heredable de una poblacin para sobrevivir y
reproducirse luego de la exposicin repetida a una dosis de herbicida
Resistencia vs tolerancia
reproducirse luego de la exposicin repetida a una dosis de herbicida
normalmente letal para el tipo silvestre. Puede ser inducida por tcnicas tales
como la ingeniera gentica o la seleccin de variantes somaclonales o por
mutagnesis.
Tolerancia: capacidad intrnseca de una especie para sobrevivir y
reproducirse luego del tratamiento con un herbicida. Supone que no hubo un
mecanismo de seleccin o induccin de la tolerancia ya que la especie es
naturalmente tolerante al herbicida.
Fuente: Weed Technology Volumen 12, nmero 4 (octubre diciembre) 1998- p. 789.
Malezas Malezas
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Concepto:
- Plantas que crecen en un cultivo y que no corresponden
a la especie o al genotipo cultivado.
Importancia:
- Estn siempre presentes.
- Compiten con el cultivo por luz, agua, nutrientes y espacio.
- pueden ser reservorio de enfermedades y plagas.
. - Secretan sustancias alelotxicas (alelopata).
- Producen prdidas de rendimiento fsico.
- Pueden ser reservorios de plagas y enfermedades.
- Producen prdidas econmicas en la comercializacin.
Malezas
- Producen prdidas econmicas en la comercializacin.
Es crtico conocer la naturaleza y el repertorio
. de las malezas que afectan a un cultivo
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Cultivo de maz con (izquierda) y sin (derecha) malezas
Malezas
Rama negra (Conyza bonaeriensis)
resistente a glifosato en el cultivo de soja
Malezas en lote de girasol convencional
Ejemplos de dao causado por malezas
durante todo el ciclo de cultivo de soja en Argentina:
Especie Densidad Dao (*)

Yuyo colorado (Amaranthus quitensis) 1 planta/m
2
23
Chamico (Datura ferox) 1 planta/m
2
29
Qunoa (Chenopodium album) 1 planta/m
2
35
Grammeas anuales 500 plantas/m
2
50-75
Sorgo de Alepo (Sorgum halepense) 20-24 vstagos/m
2
89
(*): % reduccin de rendimiento
Weedscience.com
Hay actualmente 403 casos nicos (especies por sitios de accin) de
malezas resistentes a herbicidas en el mundo. Las malezas han
desarrollado resistencia a 21 de los 25 herbicidas con sitio de accin
conocido y a 148 diferentes herbicidas y han sido reportadas en 66
cultivos de 61 pases.
Weedscience.com
Hay una gran base de datos de malezas resistentes clasificadas por
pases, herbicidas, sitios de accin, especie, cultivo
Control de malezas Control de malezas
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Manual
- Fue la primera tcnica empleada en la historia
de la agricultura.
- Muchas veces la similitud morfolgica de las malezas
con el cultivo, no permite hacer el control temprano de
las mismas.
- No es compatible con el cultivo de grandes superficies.
- No es compatible con las sociedades modernas ya que
requiere disponer de mucha mano de obra econmica.
Control
de malezas
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
FAO .org
Control
de malezas
Mecnico
-Consiste en el uso de herramientas
arrastradas por un tractor (rastras,
rastras rotativas, escardillos).
-Tiene alto costo energtico.
- Causa problemas de erosin hdrica
o elica, compactacin del suelo y
prdida de humedad.
Qumico
- Consiste en el uso de herbicidas.
- A diferencia de los otros mtodos
permite el control temprano de
Control qumico: aplicacin de herbicida para la preparacin del terreno
para la siembra directa (pre-siembra) o durante el ciclo del cultivo (post-
emergencia)
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de malezas
permite el control temprano de
malezas, lo que evita la alelopata.
Caso de Maz guacho RR dentro de un lote de
soja RR
Con el surgimiento del maz RR tambin aparece el problema del maz
voluntario en lotes de soja RR
El problema de las malezas resistentes a herbicidas es una noticia de la
actualidad..
Suplemento Campo de La Nacin del 21 de Septiembre de 2013
Amaranthus palmeri: resistente a
inhibidores de Ahas (2013)
Biotipos
resistentes
a herbicidas
Red de conocimiento en malezas resistentes
(http://www.aapresid.org.ar/rem/que-es/)
Aunque a partir de las dificultades surgen tambin oportunidades
de negocios..
Herbicidas Herbicidas
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
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Los herbicidas son productos que forman
parte de los denominados pesticidas:
Herbicidas
La FAO (Food and Agriculture Organization) defini pesticidas como:
Cualquier sustancia o mezcla de sustancias destinada a prevenir,
destruir o controlar cualquier peste (plaga) , incluyendo vectores de
humanos o enfermedades de animales, especies no deseadas de
plantas o animales que causan dao o interfieren durante la
produccin, procesamiento, almacenamiento, transporte
comercializacin de alimento, commodities (granos) provenientes de la
agricultura, madera o productos de madera, alimentos para animales o
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de malezas
agricultura, madera o productos de madera, alimentos para animales o
sustancias que puedan ser administradas a animales para el control de
insectos, arcnidos u otras pestes en o sobre su cuerpo. El trmino
incluye sustancias destinadas al uso como reguladores de crecimientos
de plantas, defoliantes, desecantes o agentes para reducir frutos o
prevenir la cada de frutos. Tambin usadas como sustancias aplicadas
a cultivos ya sea antes o despus de la cosecha para proteger el
grano del deterioro durante el almacenamiento o transporte.
Generalmente el trmino pesticida est
asociado slo a los insecticidas
Definiciones:
- Son compuestos orgnicos, generalmente
sintticos, cuyas propiedades fisicoqumicas
(masa molecular < << <500 Da y lipofilicidad)
facilitan su entrada a la clula.
- Interfieren con procesos vitales de las plantas,
y a veces de las bacterias, tales como por
ejemplo la fotosntesis, la sntesis de
Herbicidas
aminocidos o la sntesis de cidos grasos.
- Se busca que el herbicida usado no afecte
al cultivo y que sea fitotxico contra
sus principales malezas. Este aspecto
se denomina selectividad y puede lograrse
por mecanismos fsicos o bioqumicos.
- Su uso se difundi a partir de 1945 (2,4-D) y es
una herramienta clave en la agricultura moderna.
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Aplicaciones
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de malezas
Selectividad
- Los mecanismos bioqumicos de
selectividad implican la existencia de
tolerancia al herbicida por parte del cultivo.
- Los mecanismos fsicos de selectividad se
Herbicidas
- Los mecanismos fsicos de selectividad se
basan en la diferencia entre los volmenes de
herbicida retenidos por el cultivo y por las
malezas. Esto se relaciona al modo de
aplicacin, las circunstancias ambientales,
la estructura de la planta y las propiedades
de las hojas de las malezas.
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de malezas
Los herbicidas pueden ser agrupados por:
Modo de aplicacin:
- Aplicados a la parte area de la planta:
contacto y sistmicos
- Aplicados al suelo: residualidad
Tiempo de aplicacin:
- Antes de la siembra del cultivo: pre-siembra
- Despus de la siembra del cultivo:
Criterios
para la
clasificacin
de herbicidas
- Despus de la siembra del cultivo:
pre-emergencia y post-emergencia
Modo de accin:
- Inhibidores de la sntesis de aminocidos
- Inhibidores de la fotosntesis
- Inhibidores de la sntesis de lpidos
- Inhibidores de la sntesis de pigmentos
- Reguladores de crecimiento de tipo auxnico
- Inhibidores de la divisin celular
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de la biotecnologa
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de malezas
1. Inhibidores de la sntesis de aminocidos
Inhibidores de EPSPS: Glifosato
Inhibidores de ALS: Sulfonilureas
Imidazolinonas
Triazolopirimidinas
Inhibidores de GS: Glufosinato
Bialafos
Grupos de herbicidas segn su modo de accin/sitio blanco
2. Inhibidores de la fotosntesis
Inhibidores del PSI: Bipiridilos
Inhibidores del PSII: Triazinas
Triazinonas
Ureas sustituidas
Uracilos
Hidroxibenzonitrilos
Piridazinonas
Bis-carbamatos
EPSPS: 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintetasa
ALS: actetolactato sintetasa
GS: glutamina sintetasa
PSI: fotosistema I
PSII: fotosistema II
3. Inhibidores de la sntesis de lpidos
Inhibidores de ACCasa: Arilfenoxipropionatos
Ciclohexanodionas
Fenilpirazolinas
Inhibidores de elongacin
de cidos grasos: Tiocarbamatos
4. Inhibidores de la sntesis de pigmentos
Inhibidores de la sntesis
de carotenoides: Amitrol
Grupos de herbicidas segn su modo de accin/sitio blanco
de carotenoides: Amitrol
Norflurazon
Fluridona
Inhibidores de Protox (PPO): Nitrodifenil teres
Feniltalamidas
Saflufenacil
5. Reguladores de crecimiento de tipo auxnico
Acidos fenxicos
Acidos benzoicos
Acidos picolnicos
Acidos carboxlicos
6. Inhibidores de la divisin celular
Inhibidores de la polimerizacin
de tubulinas: Dinitroanilinas
ACCasa: acetil-CoA carboxilasa
Protox: protoporfiringeno oxidasa
(enzima que cataliza el ltimo paso
de la ruta biosinttica de la
porfirina, que produce clorofila)
Fuente: weedscience.com
Los herbicidas para ser comercializados deben estar
evaluados y aprobados por agencias nacionales de
regulacin de pesticidas:
Argentina: Direccin de Agroqumicos y
Biolgicos dependiente de la Direccin Nacional
de Agroqumicos, Productos Veterinarios y
Alimentos del SENASA es el rea que administra
el Registro Nacional de Teraputica Vegetal en el
que estn sujetos a inscripcin todos los
Herbicidas
que estn sujetos a inscripcin todos los
productos fitosanitarios que se usan y
comercializan en la Argentina.
USA: EPA (Environmental protection agency)
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de malezas
Herbicidas
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de malezas
Dos mecanismos principales de tolerancia a herbicidas
1. Tolerancia causada por mutaciones en sitios blanco del
herbicida (target-site tolerance).
Involucra una reduccin en la sensibilidad de enzimas
blanco especficas o protenas. Mayormente monognica.
Ej: mutantes AHAS en soja.
2. Tolerancia causada por mutaciones en sitios no blanco (non
target site tolerance). target site tolerance).
Estn involucrados varios mecanismos, como reducida
absorcin o translocacin del herbicida, aumento en la
tasa de detoxificacin, reduccin en la tasa de activacin,
y transporte del herbicida a vacuolas o apoplasto. Ej:
tolerancia a atrazina en maz.
+ O
2
H
P450
OH
+ GSH
GST
GSH
ABC Transp.
SH
Citoplasma
ATP
AD
P
Vacuola
Non-target-site herbicide tolerance
Aminocidos
ramificados
Aminocidos
ramificados
Target-site herbicide tolerance
Ejemplo: AHAS
Susceptible
Tolerante Aminocidos
ramificados
metribuzin (triazinonas, inhibidor del PSII )
Tomado de: Hain and Schreier, 1996.
La selectividad bioqumica implica
la existencia de una base gentica
Variabilidad natural en la respuesta del tomate al metribuzin
genotipo A
no tratado
tratamiento de pulverizacin correspondiente a 500 g de principio activo/ha
genotipo A genotipo B genotipo C genotipo D
Variedad silvestre susceptible-
USA
Variedad cultivada resistente a IMI en
estado vegetativo
Diversidad gentica para la tolerancia a sulfonilureas en girasol
Variedad resistente a IMI portadora
de modificadores
IMI: imidazolinonas (acta sobre la misma enzima que la sulfonilurea)
girasol
Variedad cultivada susceptible Variedad cultivada confitura susceptible
Metabolismo de xenobiticos en plantas
Las enzimas responsables de la detoxificacin de los xenobiticos estn localizadas en, o asociadas con, distintas
organelas celulares. Las lneas discontinuas representan una ruta propuesta de glicosilacin en el Golgi seguida
por exocitosis al apoplasma.
CT: Transportador de glutatin conjugado; AT: Transportador de xenobiticos aninicos ATP dependiente;
GT: Transportador de glucsidos conjugados; VP: Peptidasa vacuolar.
Reacciones
catalizadas por
Cyt P450
monooxigenasa
[O]
Cyt
P450
[O]
Cyt
P450
1: aril hidroxilacin
2: alquil hidroxilacin
3: N-demetilacin
El atomo de oxgeno que deriva de O
2
se halla subrayado
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Aplicaciones
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al control
de malezas
[O]
Cyt
P450
Ejemplos de reacciones catalizadas por
monooxigenasas P-450 y glutatin transferasas
(sulfonilurea)
(dimetilurea)
[O] representa una oxidacin. Los nmeros (1,3) muestran reacciones
de hidroxilacin o de N-demetilacin que pueden generar sitios de
glicosilacin. GSH representa una reaccin de conjugacin a glutatin
(cloroacetamida)
(sulfonilurea)
(dimetilurea)
Luego de la
Detoxificacin
por
conjugacin
a glutatin
Complejo Metaclor -GS Complejo Metaclor -GS
Herbicida
GSH
Complejo Metaclor-GS Metolachlor- GS
Herbicida
GSH
Metolachlor
(cloracetamida,
inhibidor del la
sntesis lipdica)
Luego de la
conjugacin,
el herbicida
es
transportado
a la vacuola
celular
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Transporte
Modificacin
y deposicin
Vacuola
GS-herbicida
GS-herbicida
Transporte
Modificacin
y deposicin
Vacuola
GS-herbicida
GS-herbicida
Ocurrencia y distribucin de biotipos de malezas resistentes
a herbicidas seleccionados bajo condiciones de cultivo
1
2
2
8
8
N de especies
con biotipos
resistentes
2 1986 Amidas
> 1000 1986 Inhibidores ALS
> 1000 1982 Inhibidores ACCasa
2 1984 Arsenicales
2 1986 Aminotriazoles
N de lugares
conocidos*
Ao de deteccin Clase de herbicida
1
2
2
8
8
N de especies
con biotipos
resistentes
2 1986 Amidas
> 1000 1986 Inhibidores ALS
> 1000 1982 Inhibidores ACCasa
2 1984 Arsenicales
2 1986 Aminotriazoles
N de lugares
conocidos*
Ao de deteccin Clase de herbicida
* Un lugar conocido es el sitio en que se considera que evolucion un fenotipo resistente.
3 1 1978 Piridazinonas
> 50 7 1983 Ureas sustitudas
> 1.000 57 1968 Triazinas
1 2 1988 Uracilos
1
6
5
2
18
1
1
1 1988 Benzonitrilos
2 1984 Arsenicales
> 20 1973 Dinitroanilinas
70 1988 Carbamatos
> 50 1976 Bipiridillum
1 1988 Picloram
5 1962 cido fenoxiactico
3 1 1978 Piridazinonas
> 50 7 1983 Ureas sustitudas
> 1.000 57 1968 Triazinas
1 2 1988 Uracilos
1
6
5
2
18
1
1
1 1988 Benzonitrilos
2 1984 Arsenicales
> 20 1973 Dinitroanilinas
70 1988 Carbamatos
> 50 1976 Bipiridillum
1 1988 Picloram
5 1962 Acido fenoxiactico
Aplicaciones biotecnolgicas
al control de malezas al control de malezas
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la Biotecnologa
al control
de malezas
- Uso de marcadores moleculares para estudios
de taxonoma y ecologa de malezas.
- Uso de instrumentos genmicos y de la
protemica para la identificacin de blancos
para herbicidas y de los efectos de los
herbicidas.
Aplicaciones
biotecnolgicas
al control
de malezas
- Uso de cultivo de tejidos, seleccin in vitro
y mutagnesis para el desarrollo de cultivos
con tolerancia a herbicidas.
- Uso de ingeniera gentica para el
desarrollo de cultivos con tolerancia
a herbicidas.
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la Biotecnologa
al control
de malezas
- Resolver un problema de malezas para el que
no haya herbicidas disponibles.
- Reemplazar las combinaciones de herbicidas
actualmente en uso por nuevos herbicidas
- Reemplazar un herbicida de altas dosis por uno
de bajas dosis
Objetivos
buscados en
el desarrollo
de cultivos
tolerantes
a herbicidas
- Reemplazar herbicidas con propiedades
ecolgicas superiores y/o toxicolgicas inferiores
- Reemplazar a un herbicida de pre-emergencia
por uno de post-emergencia
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la Biotecnologa
al control
de malezas
Porqu la tolerancia a herbicidas fue una de las primeras
aplicaciones de la ingeniera gentica de plantas?
Cambio de paradigma en el negocio de los herbicidas
- Hasta mediados de los 90
- se probaban las molculas nuevas por todas las
malezas y cultivos y se vea cual era la selectividad.
- Los mecanismos de tolerancia a herbicidas se
conocan, por lo menos parcialmente, a partir
de estudios con aislamientos bacterianos resistentes,
Usos de la
ingeniera
gentica para
desarrollar
cultivos
tolerantes
a herbicidas
de estudios con aislamientos bacterianos resistentes,
seleccin in vitro de clulas vegetales y de
resistencia a campo en cultivos y malezas.
- Resultaba claro que el fenotipo de tolerancia poda
. obtenerse a partir de la introduccin de genes
. individuales. Ej: Resistencia a glifosato Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
- Siglo XXI
-Exista un marcado inters econmico por parte
de un importante grupo de empresas agroqumicas
por diversificarse en forma horizontal hacia el
negocio de semillas. Desarrollo de paquetes
tecnolgicos que consisten en el uso de cultivos
resistentes (mutagnesis, ingeniera gentica) para
ser usado con molculas existentes no selectivas o
nuevas acompaados de propiedad intelectual
Usos de la
ingeniera
gentica para
desarrollar
cultivos
tolerantes
a herbicidas
nuevas acompaados de propiedad intelectual
sobre el gen y el herbicida.
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Cultivos tolerantes a herbicidas Cultivos tolerantes a herbicidas
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la Biotecnologa
al control
de malezas
- La ingeniera gentica permiti la introduccin
de variabilidad gentica til para el mejoramiento
de los cultivos por mtodos no sexuales.
- Se conocan secuencias codificantes de variado
origen que podan conferir tolerancia a ciertos
herbicidas en las plantas que los expresen.
Usos de la
ingeniera
gentica para
desarrollar
cultivos
tolerantes
a herbicidas
La tolerancia a herbicidas jug un papel
fundacional en la biotecnologa de plantas
herbicidas en las plantas que los expresen.
- Se dispona, asimismo, de las herramientas
necesarias para su correcta expresin en plantas
(promotores, pptidos seal, etc.).
- Las plantas transgnicas con tolerancia exclusiva a
herbicidas (soja, maz, colza y algodn) o combinada
con resistencia a insectos (maz y algodn) ocuparon
unos 145 millones de hectreas a nivel mundial en
2012).
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Sitios blancos de herbicidas que afectan las rutas
biosintticas de aminocidos esenciales
- Incrementar la expresin de la protena
blanco del herbicida.
Estrategias
para obtener
cultivos
tolerantes
a herbicidas
mediante
ingeniera
gentica
Existen tres estrategias principales:
- Alterar el sitio de accin del herbicida.
- Introducir genes que permitan
la detoxificacin del herbicida.
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Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Herbicida, blancos primarios y estrategias para
desarrollar tolerancia a herbicidas en plantas
Gen bxn
(bacteria)
-------------------- Protena Qb Bromoxinil
Gen GST
(planta)
Gen psbA mutado
(planta)
Protena Qb Atrazina Fotosntesis
Estrategia para desarrollar tolerancia
Blanco primario Modificacin del blanco Detoxificacin
Herbicida Ruta inhibida
Gen bxn
(bacteria)
-------------------- Protena Qb Bromoxinil
Gen GST
(planta)
Gen psbA mutado
(planta)
Protena Qb Atrazina Fotosntesis
Estrategia para desarrollar tolerancia
Blanco primario Modificacin del blanco Detoxificacin
Herbicida Ruta inhibida
Estrategia para desarrollar tolerancia
Blanco primario Modificacin del blanco Detoxificaci
Estrategia para desarrollar tolerancia
Blanco primario Modificacin del blanco Detoxificaci
Gen tfdA
(bacteria)
-------------------- No conocido 2,4-D Regulacin del
crecimiento
Gen gox
(bacteria)
Amplificacin del gen
EPSPS; gen AroA mutado
(bacteria)
5-enolpiruvil shikimato-
3-fosfato sintasa
(EPSPS)
Glifosato
-------------------- Gen ALS mutado
(planta)
Acetolactato sintasa
(ALS)
Sulfonilurea e
imidazolinona
Gen bar
(bacteria)
Amplificacin del gen GS Glutamina sintetasa
(GS)
Fosfinotricina Biosntesis de
aminocidos
(bacteria)
Gen tfdA
(bacteria)
-------------------- No conocido 2,4-D Regulacin del
crecimiento
Gen gox
(bacteria)
Amplificacin del gen
EPSPS; gen AroA mutado
(bacteria)
5-enolpiruvil shikimato-
3-fosfato sintasa
(EPSPS)
Glifosato
-------------------- Gen ALS mutado
(planta)
Acetolactato sintasa
(ALS)
Sulfonilurea e
imidazolinona
Gen bar
(bacteria)
Amplificacin del gen GS Glutamina sintetasa
(GS)
Fosfinotricina Biosntesis de
aminocidos
(bacteria)
Glifosato
- En 1974 se introdujo al mercado el herbicida Roundup
cuyo ingrediente activo es el glifosato. Este es un herbicida
post-emergente de amplio espectro, no selectivo y seguro
desde el punto de vista ambiental (baja toxicidad para
organismos no blanco, bajo movimiento en el agua
subterrnea y persistencia limitada).
- El glifosato inhibe, en plantas, bacterias, algas, hongos
y parsitos apicomplejos, la 5-enolpiruvil shikimato-3-
fosfato sintetasa (EPSPS), enzima clave para la sntesis
de aminocidos aromticos (fenilalanina, tirosina
y triptofano). En las plantas, esta ruta biosinttica
Tolerancia
a glifosato
y triptofano). En las plantas, esta ruta biosinttica
(ruta del shikimato) tiene lugar en el cloroplasto.
glifosato
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
N-(fosfonometil)glicina
Ruta de
sntesis del
corismato
a partir de
fosfoenol-
piruvato
y eritrosa
4-fosfato
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Adems de la sntesis de tirosina, fenilalanina y triptofano, la ruta
del shikimato controla la sntesis de muchos compuestos impor-
tantes como la de la lignina, la de los flavonoides y la de algunos
alcaloides.
Mecanismo de accin de la
5-enolpiruvil shikimato-3-fosfato sintetasa
Tolerancia
a glifosato
Enzima: 5-enolpiruvil shikimato-3-fosfato sintetasa
S3P: shikimato-3-fosfato
PEP: fosfoenolpiruvato
EPSP: 5-enolpiruvil shikimato-3-fosfato
El glifosato acta como un inhibidor competitivo
ocupando el lugar del PEP en el complejo enzimtico
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Homologas entre secuencias de EPSP sintetasas
Comparacin entre las secuencias aminocidicas maduras de EPSP sintetasa. Se muestran
las secuencias correspondientes a Petunia hybrida, Arabidopsis thaliana, Escherichia coli y
Saccharomyces cerevisiae. Las secuencias homlogas estn subrayadas. Los aminocidos
crticos estn sealados con un asterisco
La EPSP
sintetasa es
transportada
al cloroplasto
mediante un
pptido seal
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
citoplasma cloroplasto
Comparacin de las secuencias
de los pptidos seal de las
EPSP sintetasas de Petunia
hybrida, tomate y Arabidopsis
thaliana. Se sealan las
regiones de homologa
Estructura
cristalina de
EPSP
sintetasa
Estructura de la EPSP sintetasa de E. coli. Los residuos del
sitio activo estn marcados en azul. La regin en rojo es una
regin altamente conservada. La conversin de la Gly 96
a Ala transforma a la enzima en tolerante a glifosato
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
- Se observ, tanto en bacterias como en cultivos
celulares de plantas, que el incremento en el nmero
de copias del gen codificante para la EPSPS confiere
tolerancia a este herbicida.
- Se obtuvieron plantas transgnicas de petunia
que expresaban un ADNc codificante para
la pre-protena completa EPSPS de esa
misma especie bajo control del promotor 35S
Tolerancia
a glifosato
Desarrollo de plantas transgnicas
. tolerantes a glifosato
misma especie bajo control del promotor 35S
del virus del mosaico del coliflor. Aunque la enzima
sobrexpresada era sensible al glifosato, estas plantas
eran tolerantes al herbicida.
- Otra estrategia explorada fue la bsqueda de formas
variantes de la EPSPS que tuvieran simultneamente
baja afinidad por el glifosato y buena actividad
cataltica. Se demostr que las plantas transgnicas
que expresaban una EPSPS heterloga con estas
caractersticas, tenan muy buena respuesta frente
al herbicida.
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Tolerancia
a glifosato
Catabolismo del glifosato por bacterias del suelo
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
C-P liasa: ruta presente en Pseudomonas
GOX: ruta presente en Gram positivas y Gram negativas
Algunos formulados utilizan polioxietanolamina (POEA)
. como surfactante aninico.
POEA es 5 veces ms txico que el glifosato.
- Se aisl el gen que codifica una EPSPS tolerante a
glifosato de la cepa CP4 de Agrobacterium tumefaciens
(cp4 epsps).
- Se clon el gen gox, que codifica la enzima glifosato
oxidoreductasa (responsable del proceso de degradacin
del glifosato por la ruta del cido aminometilfosfnico) a
partir de la cepa LBAA de Achromobacter sp.
Tolerancia
a glifosato
Desarrollo de plantas transgnicas
. tolerantes a glifosato
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Cultivo
de soja
tolerante
a glifosato
Gentileza Ing. Agr. S. Lorenzatti
Algunas mutaciones
en la EPSPS pueden tornar
a la enzima insensible
al glifosato. La unin
de este herbicida
a la enzima nativa bloquea
su actividad e impide
el transporte del complejo
EPSPS-shikimato 3-fosfato
al cloroplasto. La enzima
producida por el gen mutado
(epsps*) tiene una menor
Tolerancia mediante EPSPS insensible a glifosato
(epsps*) tiene una menor
afinidad por el glifosato
y es catalticamente activa
en presencia del herbicida.
Tomado de Coruzzi and Last, Biochemistry and Molecular Biolgy of Plants, 2000.
Desarrollo de productos comerciales con tolerancia
a glifosato
Mediante las estrategias mencionadas se desarrollaron en
varias especies eventos de transformacin que confieren
tolerancia a glifosato.
Algunos estn disponibles a nivel comercial en varios
pases:
- Soja: promotor 35S / secuencia codificante cp4
epsps (1996).
- Canola: Promotor FMV (Figwort mosaic virus) /
Tolerancia
a glifosato
- Canola: Promotor FMV (Figwort mosaic virus) /
secuencia codificante cp4 epsps y promotor
FMV / secuencia codificante gox (1996).
- Algodn: promotor FMV / secuencia codificante cp4
epsps (versin sinttica con optimizacin de uso
de codones; 1997).
- Maz: promotor de actina 1 de arroz / secuencia
codificante cp4 epsps y promotor 35S /
secuencia codificante cp4 epsps (2001).
-Trigo: en etapas de evaluacin en algunos pases.
Todos los transgenes mencionados contienen la secuencia de
un pptido seal de transporte a cloroplasto en su extremo 5.
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Siembra directa de soja sobre
rastrojo de trigo
Siembra directa de soja sobre
rastrojo de maz
Integracin del uso de plantas transgnicas de soja
tolerantes a glifosato con prcticas de siembra directa
Gentileza Ing. Agr. S. Lorenzatti
http://gmdd.shgmo.org
Disponibilidad de kits para
detectar presencia de ciertas
enzimas de origen transgnico en
muestras de tejido verde, semilla,
harinas .
Ej: Cp4EPSPS
http://cera-gmc.org (Centro para la valoracin de riesgo ambiental)
Descripcin
de eventos
transgnicos,
dossiers, links
a patentes,
etc. etc.
Glufosinato
- El L-glufosinato (L-fosfinotricina) es el ingrediente activo
de herbicidas como Basta o Liberty. Es un herbicida
post-emergente, de amplio espectro, no selectivo y de baja
actividad residual.
- El bialafos es un producto de fermentacin de Streptomyces
hygroscopicus que se comercializa en Japn desde 1984 bajo
el nombre de Herbiace. Este pro-herbicida natural consiste en
L-glufosinato y dos residuos L-alanina. En la clula el bialafos
se convierte en L-glufosinato por accin de endopeptidasas.
- El L-glufosinato es un inhibidor potente de la glutamina
sintetasa, enzima que regula en las plantas la va de asimilacin
Tolerancia
a glufosinato
sintetasa, enzima que regula en las plantas la va de asimilacin
primaria y secundaria del amonio.
L-glufosinato
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
cido 2-amino-4-
(hidroximetilfosfinil)
butanoico
La glutamino
sintetasa es
el sitio de
accin de la
fosfinotricina
La ruta de la glutamina sintetasa/glutamato sintetasa
(GS/GOGAT) constituye el principal mecanismo para
la asimilacin primaria y secundaria del amonio
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Inhibidores competitivos de la glutamina sintetasa
Metionin sulfoximina L-Fosfinotricina Glutamina
. (MSO) (L-PPT)
Metionin sulfoximina L- glufosinato Acido glutmico
. (MSO)
Mecanismo de accin de la glutamina sintetasa
Tolerancia a
glufosinato
GS: glutamina sintetasa
El L-glufosinato acta como un inhibidor
competitivo reversible ocupando el lugar
del L-glutamato en el complejo enzimtico
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Degradacin
ambiental de
glufosinato
El glufosinato tiene una movilidad en el suelo
. considerada baja porque es adsorbido por los
. coloides presentes en los estratos superiores
La principal ruta de eliminacin del glufosinato
. es la degradacin microbiana, Burkholderia
. sacchari, Serratia marcescens, Pseudomonas
. psychrotolerans han sido reportadas como
. fuertes degradadores de glufosinato.
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Los productos de degradacin comprenden al
. cido 3-metilfosfinil propinico y al cido 2-
. metilfosfinil actico, los que a su vez se
. descomponen en PO
4
H
3
, CH
4
, NH
3
, CO
2
y H
2
O.
La persistencia en el suelo, dependiendo de las
. condiciones ambientales, flucta entre 3 y 40 das.
Estrategias para la obtencin de plantas
transgnicas con tolerancia a glufosinato
- Se obtuvieron plantas transgnicas que sobrexpresaban
el gen de glutamina sintetasa bajo un promotor constitutivo.
Estas plantas toleraron al herbicida a pesar de expresar una
enzima sensible a glufosinato.
Tolerancia
a glufosinato
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Plantas transgnicas de tabaco que sobrexpresan el den de la glutamina sintetasa
de alfalfa. Las plantas transgnicas (izquierda arriba) toleran una concentracin
de 20 M de L-glufosinato que resulta letal para la planta control (derecha abajo)
Tomado de Eckes et al., MGG,1989.
Tolerancia
a glufosinato
Estrategias para la obtencin de plantas
transgnicas con tolerancia a glufosinato
- Como estrategia alternativa, a partir de las
bacterias del suelo Streptomyces hygroscopicus
y Streptomyces viridochromogenes se clonaron
los genes bar y pat, respectivamente.
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
. - Ambos genes codifican la enzima fosfinotricin-
. acetil transferasa que convierte al L-glufosinato
en una forma acetilada sin actividad herbicida.
- Esta enzima permite a estas bacterias defenderse
. de la accin txica de la fosfinotricina que ellas
. mismas producen.
Obtencin de plantas transgnicas
con tolerancia a glufosinato
- Las primeras plantas con niveles de tolerancia
a herbicidas suficientes para su uso agrcola
se construyeron expresando constitutivamente
el gen bar (tabaco, tomate y papa).
Tolerancia
a glufosinato
- Los genes bar y pat se encuentran en varios
cultivares transgnicos que actualmente tienen
. status comercial (maz, colza, algodn, soja).
- Los genes han resultado ser marcadores
seleccionables eficientes y por ello son usados
. en muchos protocolos de transformacin
. gentica.
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Evolucin de la acumulacin de NH
4
+
en plantas de tabaco transgnicas
transformadas con el gen bar
Tolerancia a
glufosinato
mediada por
genes de
fosfinotricin-
acetil
transferasas
Tomado de: et al., Nature, 1986?.
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Plantas de
Nicotiana
tabacumno
transgnicas
tratadas con
glufosinato
Plantas de
Tolerancia
a glufosinato
Gentileza Dr. M. Van Montagu
Plantas de
Nicotiana
tabacum
transformadas
con el gen bar
tratadas con
glufosinato
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
El gen bar provee un alto nivel de tolerancia a glufosinato
Plantas transgnicas de Lycopersicon esculentumtransformadas
con el gen bar (izquierda) y plantas control
no transgnicas (derecha) tratadas con glufosinato
Plantas de Solanum tuberosum, transformadas con
el gen bar y plantas control, tratadas con glufosinato
Tolerancia a glufosinato
-El glufosinato no es un herbicida muy difundido en
Argentina aunque el evento tiene liberacin comercial
para soja, maz y algodn. En este ltimo cultivo, este
evento apilado con el de resistencia a glifosato tiene
evaluacin favorable de Conabia pero an no est
desregulado (a Septiembre de 2013, pendientes los
dictmenes favorables de Senasa y Direccin de
Mercados).
-En maz generalmente est acompaando eventos
transgnicos de genes de resistencia a insectos, ya
que puede ser usado como marcador de seleccin
Tolerancia
a glufosinato
que puede ser usado como marcador de seleccin
durante la transformacin.
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Eventos de resistencia a insectos y a glufosinato de
amonio en maz:
BT11
TC1507
Herbicidas que inhiben la acetolactato sintetasa
- La acetolactato sintetasa (ALS; tambin llamada aceto
hidroxicido sintetasa) es una enzima clave en la
biosntesis de aminocidos ramificados (leucina,
valina e isoleucina). Su inhibicin causa la muerte
de la planta.
- La ALS es inhibida por herbicidas que pertenecen
a varios grupos (sulfonilureas, imidazolinonas
y triazolopirimidinas).
Tolerancia
a inhibidores
de la aceto-
lactato
sintetasa
y triazolopirimidinas).
- Los herbicidas que inhiben la ALS son relativamente
recientes. El primero de ellos fue comercializado
en 1982 (chlorsulfuron, una sulfonilurea). Sin embargo,
han tenido una rpida difusin.
- Este grupo de herbicidas es de amplio espectro, tiene
baja actividad residual en suelo y brinda una amplia
ventana de aplicacin para el cultivo. La toxicidad para
mamferos es baja.
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Estructuras qumicas de algunos herbicidas que afectan a la ALS
Tolerancia a inhibidores de la acetolactato sintetasa
chlorsulfuron (herbicida del grupo
de las sulfonilureas)
imazaquin (herbicida del grupo
de las imidazolinonas)
Ruta de
sntesis de
aminocidos
ramificados
La acetolactato sintetasa (o acetohidroxicido sintetasa )
es inhibida por la accin de sulfonilureas, imidazolinonas
y triazolopirimidinas
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Mecanismo de accin de la ALS
Tolerancia
a inhibidores
de la aceto-
lactato
sintetasa
ALS: acetolactato sintetasa (aceto hidroxicido sintetasa)
Las sulfonilureas actan como inhibidores
competitivos del piruvato sobre
el sitio cataltico de la enzima.
Las imidazolinonas actuan como inhibidores
no competitivos con respecto al piruvato.
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Resistencia a inhibidores de la ALS en malezas
- El extenso y reiterado uso de los inhibidores de la ALS
hizo que, a pesar de su reciente difusin, la resistencia
a los mismos haya evolucionado en las malezas.
As, hay actualmente ms especies o biotipos
de malezas resistentes a este grupo de herbicidas
que a cualquier otro.
- La resistencia observada se debe generalmente
a mutaciones en el sitio blanco de estos herbicidas.
Tolerancia
a inhibidores
de la aceto-
lactato
sintetasa
a mutaciones en el sitio blanco de estos herbicidas.
La ALS est codificada por el genoma nuclear
y la localizacin subcelular de la forma madura
de la enzima es el cloroplasto. Los alelos mutantes
se comportan como resistentes frente a los sensibles.
- La resistencia observada en malezas es causada
por mutaciones puntuales que producen la sustitucin
de uno cualquiera de cinco aminocidos conservados.
(alanina 122, Prolina 197, alanina 205, triptofano 574, serina
653; secuencia de ALS de Arabidopsis thaliana)
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Cultivos con tolerancia a campo a inhibidores
de la ALS
- Seleccin de plantas silvestres: se han aislado
plantas tolerantes a sulfonilureas e imidazolinonas en
girasol.
- Seleccin in vitro: Se han obtenido plantas de maz
con resistencia a imidazolinonas mediante cultivo in
vitro de embriones en medio selectivo.
- Mutagnesis: Se han obtenido plantas resistentes
a imidazolinonas mediante tratamientos mutagnicos
Tolerancia
a inhibidores
de la aceto-
lactato
sintetasa
a imidazolinonas mediante tratamientos mutagnicos
de microsporas y posterior cultivo y seleccin in vitro
(colza). Asimismo, se obtuvieron plantas resistentes
a imidazolinonas por mutagnesis qumica
de semillas (arroz, trigo y maz y girasol). Tambin
se ha obtenido soja resistente a sulfoinilureas.
- Plantas transgnicas: Se obtuvieron plantas
transgnicas de algodn (debida a la expresin
de una ALS de tabaco mutagenizada in vitro) , lino
(con expresin de una ALS de Arabidopsis) con
resistencia a sulfonilureas, soja (con expresin de
una ALS de Arabidopsis) y maz (Als de maz
modificado)
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
197
Ahasl1-3 Ahasl1-2 Ahasl1-1 Ahasl1-4
Ahasl1 Ahasl2 Ahasl3
Gentica de la tolerancia a inhibidores de AHAS en girasol
1 200 400 600 (Amino acid number)
Chloroplastic
transit peptide
122
197
205
203
574
Clearfield Plus Sures
ExpressSun
Imisun/Clearfield Air
50
60
70
80
90
100
RHA426
IMI-1
A
b
o
v
e
g
r
o
u
n
d

b
i
o
m
a
s
s

~ 50%
Target-type tolerance
(AHAS activity)
Imr1 or
Ahasl1-1
With
Malathion
Mismo alelo de tolerancia de Ahas Distintos niveles de tolerancia
0
10
20
30
40
50
0 100 200 300 400 500 600 700
-1 Imazapyr dose (g a.i. ha
-1
)
A
b
o
v
e
g
r
o
u
n
d

b
i
o
m
a
s
s

(
%
)
~ 15%
Non-target-type
tolerance (P450 +
others)
Imr2 or
Enhancer
Ref.: Bruniard & Miller, 2001; Sala et al., 2012, Poster # 138 (XVIII Congreso internacional de girasol). Breccia et al., 2012,
Poster # 019 (XVIII Congreso internacional de girasol)
La introgresin de un gen de resistencia desde una variedad silvestre puede traer
aparejada la introduccin de otros genes ligados al gen de resistencia.
Arrastre por ligamiento
Tolerante
X
Susceptible
LG 9
9.4
10.1
13.1
9.4
9.2
LG 9
9.4
10.1
13.1
9.4
9.2
LG 9
9.4
10.1
13.1
9.4
9.2
Variedades tolerantes
9.2
21.4
11.2
9.4
9.4
1.4
3.2
4.7
HA89 1-1 1-2 1-3 1-4 1-5 1-6 1-7 1-8 1-9 1-10 HA425
IMISUN-1
9.2
21.4
11.2
9.4
9.4
1.4
3.2
4.7
9.2
21.4
11.2
9.4
9.4
1.4
3.2
4.7
HA89 1-1 1-2 1-3 1-4 1-5 1-6 1-7 1-8 1-9 1-10 HA425
IMISUN-1
HA89 HA89 1-1 1-1 1-2 1-2 1-3 1-3 1-4 1-4 1-5 1-5 1-6 1-6 1-7 1-7 1-8 1-8 1-9 1-9 1-10 1-10 HA425 HA425
IMISUN-1
Genoma cultivado Genoma silvestre
Fragmento heterocigoto
197
Ahasl1-3 Ahasl1-2 Ahasl1-1 Ahasl1-4
Ahasl1 Ahasl2 Ahasl3
Gentica de la tolerancia a inhibidores de AHAS en girasol
1 200 400 600 (Amino acid number)
Chloroplastic
transit peptide
122
197
205
203
574
Clearfield Plus Sures
ExpressSun
Imisun/Clearfield Air
Desarrollo de resistencia a imidazolinonas en girasol
Aplicacin del herbicida a
la poblacin mutante
Generacin de una poblacin
mutante Ej: EMS
Seleccin de una planta
resistente
Caracterizacin molecular
Desarrollo de la tecnologa
0 40 80 160 320 480
Imazapyr rate (g a.i. / ha)
P
I
5
6
7
8
9 A
B
Comparacin entre la tolerancia de dos diferentes caracteres: Imisun y CLPlus.
Imazapyr rate (g a.i. / ha)
Doses of imazapyr (g.a.i. ha
-1
)
0 40 80 160 240 320 400 480
P
I
0
1
2
3
4
B
C
Fuente: Sala et al., 2012. XVIII Congreso internacional de girasol
PI: Indice de fitotoxicidad
A: susceptible B: Imisun C: CLPlus
Panel de arriba: Imisun
Panel de abajo: CLPlus
CLPlus
Comportamiento bajo condiciones de campo
Imisun
0 1X 2x 4x
Dosis de imazapyr
Fuente: Sala et al., 2012. XVIII Congreso internacional de girasol
Soja resistente a sulfonilureas obtenida por mutagnesis
Sebastin et al. en 1989, obtuvo un mutante W20, que posee un alelo
semidominante del locus 1 de soja, este gen ha sido introgresado en varios
programas de mejoramiento.
Anteedentes en otras plantas tolerantes! "olerania espe#$ia a S%
otorgada por sustituiones de prolina en la posii&n 19' de la en(ima
Se desono#a!
el n)mero de genes Ahas en soja
ul*es de ellos son los que se hallan involurado*s en la tolerania a S%
su loali(ai&n gen&mia
el tipo de mutai&n que on$iere la tolerania
Fuente: Cecilia Ghio. Tesis Ubicacin genmica y secuenciacin del gen que otorga tolerancia a las Ubicacin genmica y secuenciacin del gen que otorga tolerancia a las sulfonilureas sulfonilureas
en el cultivo de la soja en el cultivo de la soja Glycine Glycine max max (L.) (L.) Merr Merr. para la Maestra en Gentica Vegetal ,UNR. Septiembre 2013 . para la Maestra en Gentica Vegetal ,UNR. Septiembre 2013
A travs de un trabajo que consisti en:
1. un anilisis in silico de secuencias para determinar el nde
genes candidatos ahas en soja.
2. un anlisis gentico por medio de mapeo con marcadores
moleculares en una poblacin de mapeo.
3. Comparacin de las secuencias de la lnea tolerante y susceptible
para determinar la mutacin responsable de la tolerancia.
Tolerancia
a inhibidores
de la aceto-
lactato
sintetasa
Als1 ubicado
cromosoma 4
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
4 secuencias Ahas en los cromosomas
4, 6, 13 y 15 con una alta similitud con
las secuencia del gen Ahas de A.
thaliana
Cambio aminoacdico
P197S: Prolina por
Serina
Cultivos transgnicos con resistencia a inhibidores de AHAS
Soja Cultivance : contiene el evento CV127 que brinda resistencia a
imidazolinonas. El evento contiene el gen Als de Arabisopsis thaliana con
la mutacin en la posicin 653. Regulado por el promotor nativo de
A.thaliana.
Maz Optimun GAT : contiene el evento DP-98140 que brinda
resistencia a glifosato y imidazolinonas. El evento contiene el gen als de
maz modificado y el gen de resistencia a glifosato producto de la
recombinacin in vitro de tres genes de Bacillus lucheniformis que
codifican para la N-Acetiltransferasa que acetila al glifosato. Estos genes
estn regulados por promotores de maz. Se comportan como un locus
nico. Liberado comercialmente en Argenitna en el 2011 pero an no es
comercializado por la empresa propietaria del evento.
Herbicidas que afectan la cadena de transporte
de electrones en el aparato fotosinttico
PQ: Plastoquinona
Cyt b6f: Complejo citocromo b6f
PC : Plastocianina
Fdx: Ferredoxina
FNR: Ferredoxina NADP reductasa
CF0 y CF1: Complejos de la ATP sintetasa
Organizacin de los componentes de la cadena de transporte de electrones
del cloroplasto y del aparato de sntesis de ATP en la membrana tilacoidea
Herbicidas
que
afectan
la cadena
de transporte
de electrones
en el
aparato
fotosinttico
Triazinas
Ureas sustituidas
Uracil herbicidas
Bromoxinil
Ioxinil
DCMU, un inhibidor del Fotosistema II
fotosinttico
Ioxinil
Desmedipham
Propanil
Pirazon
Metribuzin
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Paraquat (metil violgeno), un inhibidor
del Fotosistema I
DBMIB, un inhibidor del complejo Cytb
6
f
Herbicidas que afectan la cadena de transporte
de electrones en el aparato fotosinttico
Sitios de accin del 3-(3,4-diclorofenil)-1,1-dimetilurea (DCMU), de la dibromoquinona
(DBMIBl) y del metil violgeno (herbicida bipiridil; Paraquat) en los complejos fotosintticos
atrazina
Q
A
Q
B
: Quinonas A y B
PQ: Plastoquinona
PC: Plastocianina
Pheo: Feofitina
Cytb6f: Complejo citocromo b6f
Fx, FA y FB: Centros Fe-S
Selectividad bioqumica
- La atrazina es uno de los herbicidas ms usados en el mundo
y corresponde al grupo de las triazinas. Se comenz a usar en la
dcada del 50 pero se est dejando de usar.
- Estos herbicidas son inhibidores fotosintticos. Su mecanismo
de accin consiste en unirse a la protena D1 (protena de unin
. a Q
B
, ubicada), impidiendo as su bloqueando el transporte de
electrones hacia el Fotosistema II.
- La atrazina se usa en cultivos como el maz, que son
resistentes al mismo por tener la capacidad metablica de
detoxificarlo. Esto ocurre a travs de los mecanismos
Triazinas
detoxificarlo. Esto ocurre a travs de los mecanismos
enzimticos de proteccin frente a compuestos xenobiticos.
Atrazina
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Selectividad debida a alteraciones en
el sitio blanco del herbicida
- En el contexto de reiterado uso de triazinas en monocultivo de maz, Se
han identificado biotipos de malezas con resistencia a las mismas. Esta
resistencia se basa en la alteracin del sitio blanco de estos herbicidas
. (protena D1).
- La protena D1 est codificada por el gen psb A, que est ubicado en el
plastoma. En varias especies vegetales se ha reportado como base
molecular de la resistencia a triazinas una mutacin de puntual en el
codn 264 del mencionado gen, que produce una substitucin de serina
por glicina en la forma resistente.
En cebada,
Tomado de: Rios et al., TAG, 2003.
Triazinas
En cebada,
a partir de un
genotipo mutado
de cloroplastos,
se aislaron dos
mutantes con
resistencia a la
atrazina.
Lnea madre Mutantes
Ensayo hidropnico en presencia de atrazina
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Anlisis molecular de mutantes de cebada
con resistencia a la atrazina
277 pb
790
BstXI
Comparacin parcial de la secuencia
del gen psbA entre la lnea madre (clon 1)
y una mutante con resistencia a atrazina
(clon 5). La sustitucin de un nucletido
(A por G) crea un sitio de restriccin BstXI.
Deteccin por PCR-RFLP de una mutacin
del gen psbA que confiere resistencia a
triazinas. Un fragmento interno de 277 bp
del mencionado gen fue amplificado por PCR
y posteriormente digerido con la enzima BstXI
y separado en un gel de agarosa de 2%.
Est ndar Cebada sensible
(lnea madre)
Est ndar Cebada resistente
(lnea madre)
Colza
sensible
Colza
resistente
277 pb
190 pb
87 pb
La protena de 32 kDa (protena de unin a Q
B
o D1)
fue identificada como sitio de unin de las triazinas
en Amaranthus hybridus. Esta protena integra el
ncleo del centro de reaccin del Fotosistema II.
En lneas resistentes de Amaranthus, se vio que las
triazinas no se unan a la protena y se encontr una
mutacin puntual de Ser a Gly en la posicin 228.
Se observaron mutaciones similares de la Ser 264
a Gly en la protena de 32 kDa de Chlamydomonas
Tolerancia
a atrazinas
a Gly en la protena de 32 kDa de Chlamydomonas
reinhardtii, Chenopodium album y Solanum nigrum.
La bsqueda de resistencia por ingeniera gentica
se ha orientado a la introduccin de protenas de 32
kDa mutadas en plantas transgnicas y a la
detoxificacin de atrazinas mediante la introduccin
de un gen que codifica glutation-S-transferasa (GST).
El segundo enfoque ha dado mejores resultados.
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Tolerancia a hidroxibenzonitrilos
- Los hidroxibenzonitrilos son inhibidores del Fotosistema
II en las dicotiledneas (protena de unin a Q
B
).
- Se obtuvieron plantas transgnicas de algodn, colza y
tabaco que expresan una secuencia codificante de una
nitrilasa, obtenida de Klebsiella pneumoniae
- Estas plantas son resistentes a campo a los herbicidas
ioxynil y bromoxynil y han sido liberadas comercialmente
en algunos pases.
Tolerancia
a hidroxi-
benzonitrilos
por
detoxificacin
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Herbicidas
que
afectan
la sntesis de
carotenoides
Tolerancia a pirazoles
- Los pirazoles son una familia de herbicidas inhibidores
de la enzima HPPD (4- hidroxifenilpiruvato-dioxigenasa).
- Topramezone es un herbicida selectivo de la familia de
los pirazoles para ser usado en el cultivo de maz.
- Efecto de bleaching en las plantas produciendo la
muerte de las mismas.
- Se obtuvieron plantas transgnicas de soja resistentes
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
- Se obtuvieron plantas transgnicas de soja resistentes
a inhibidores de HPPD.
- Estas plantas son resistentes a campo a los herbicidas
y estn siendo evaluadas para su liberacin
comercial en Argentina.
Efecto del herbicida
sobre plantas de soja
Genes bacterianos detoxificantes
- Se obtuvieron plantas transgnicas de varias especies,
resistentes al cido 2,4-dicloro fenxiactico (2,4-D;
regulador de crecimiento de tipo auxnico) por expresin
de una monooxigenasa con gran especificidad
de sustrato, obtenida de Alcaligenes sp.
- Se obtuvieron plantas transgnicas de varias especies
que expresan una secuencia codificante para
una dehalogenasa, obtenida de Alcaligenes sp.
Otras
tolerancias
metablicas
una dehalogenasa, obtenida de Alcaligenes sp.
que confiere resistencia al herbicida dalapon
(inhibidor de la sntesis de lpidos).
- Se obtuvieron plantas transgnicas de varias especies
que expresan una secuencia codificante para
una carbamato hidroxilasa, obtenida de Alcaligenes sp.
que confiere resistencia al herbicida metolachlor
(pertenece al grupo de las cloroacetamidas que
inhiben la sntesis de lpidos).
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Metabolismo de xenobiticos en plantas
Las enzimas responsables de la detoxificacin de los xenobiticos estn localizadas en, o asociadas con, distintas
organelas celulares. Las lneas discontinuas representan una ruta propuesta de glicosilacin en el Golgi seguida
por exocitosis al apoplasma.
CT: Transportador de glutatin conjugado; AT: Transportador de xenobiticos aninicos ATP dependiente;
GT: Transportador de glucsidos conjugados; VP: Peptidasa vacuolar.
Genes eucariticos detoxificantes
- Se obtuvieron plantas de tabaco que expresan
una glutation S-transferasa de maz, tolerantes
a cloroacetamidas.
- Se obtuvieron plantas transgnicas de papa
con expresin constitutiva de 3 secuencias codificantes
de citocromo-P450 monooxigenasas humanas.
Estas fueron tolerantes a herbicidas de varios grupos.
- Se expres en papa, bajo control de un promotor
Otras
tolerancias
metablicas
- Se expres en papa, bajo control de un promotor
inducible por benzotiadiazol, una secuencia
que codifica la citocromo-P450 monooxigenasa
de rata, sola o fusionada con una de levadura.
Las plantas fueron tolerantes a herbicidas del grupo
de las fenilureas.
- Se obtuvieron plantas de tabaco y Arabidopsis
con expresin constitutiva de una citocromo-P450
monooxigenasa de topinambur (Helianthus tuberosus).
Estas resultaron tolerantes a fenilureas.
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Adopcin de OGMs en Argentina y en el Adopcin de OGMs en Argentina y en el
mundo
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Argentina: Evolucin de la superficie cultivada con OGM (en miles de hectreas)
Soja TH Maz Bt Maz TH Maz
Bt X TH
Algodn
Bt
Algodn
TH
Algodn
Bt X TH
Total
96/97 370 - - - - - - 370
97/98 1.756 - - - - - - 1.756
98/99 4.800 13 - - 5 - - 4.818
99/00 6.640 192 - - 12 - - 6.844
00/01 9.000 580 - - 25 - - 9.605
01/02 10.925 840 - - 10 - - 11.775
02/03 12.446 1.120 - - 20 0,6 - 13.586
03/04 13.230 1.600 - - 58 7 - 14.854
Fuente: ArgenBio
03/04 13.230 1.600 - - 58 7 - 14.854
04/05 14.058 2.008 14,5 - 55 105 - 16.241
05/06 15.200 1.625 70 - 22,5 165 - 17.082
06/07 15.840 2.046 217 - 88 232 - 18.423
07/08 16.600 2.509 369 82 162,3 124 - 19.846
08/09 17.000 1.536 320 800 72 210 - 19.938
09/10 18.182 1.408 256 992 42,3 47 367 21.294
10/11 18.700 1.599 287 1.640 7,7 55,9 552,3 22.842
11/12 18.800 1.400 400 2.400 - 69 506 23.575
12/13 19.120 1.322 365 2.689 - 52 378 23.926
Argentina: evolucin de la superficie total con OGM
(en millones de hectreas)
0
5
10
15
20
25
9
6
/
9
7

9
7
/
9
8

9
8
/
9
9

9
9
/
0
0

0
0
/
0
1

0
1
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0
2
0
2
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0
3
0
3
/
0
4
0
4
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0
5
0
5
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0
6
0
6
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0
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0
8
0
8
/
0
9
0
9
/
1
0
1
0
/
1
1
1
1
/
1
2
1
2
/
1
3
Fuente: ISAAA/ArgenBio
rea global de OGM, por caracterstica
(sobre 170 millones de hectreas)
TH: tolerante a herbicida
RI: resistente a insectos
TH
59%
TH X RI
26%
RI
15%
rea global cultivada con OGM, por pas
(sobre 170 millones de hectreas)
EEUU
41%
Canad
7%
India
6%
China
2%
Paraguay
2%
Sudfrica
2%
Pakistn
2%
Uruguay
1%
Bolivia
1%
otros
1%
Fuente: ISAAA (International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications) , 2012
41%
Brasil
21%
Argentina
14%
Otros: Filipinas, Australia, Burkina Faso, Myanmar, Mxico, Espaa, Chile, Colombia, Honduras, Sudn,
Portugal, Repblica Checa, Cuba, Egipto, Costa Rica, Rumania, Eslovaquia. Total: 28
Consideraciones sobre el uso Consideraciones sobre el uso
de cultivos / herbicidas
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Criterios a
considerar
para evitar el
surgimiento
de resistencia
en malezas
Transferencia de resistencia del cultivo a malezas
- No se conocen ejemplos de transferencia en 50 aos
de uso intenso de herbicidas. La resistencia a herbicidas
en malezas evoluciona a partir del propio genoma de las
mismas. La transferencia de genes de resistencia
de malezas a plantas cultivadas es generalmente difcil.
- Una especie silvestre no se convierte en maleza
por incorporar un gen de resistencia a herbicidas.
Cultivos que se convierten en malezas
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Cultivos que se convierten en malezas
- Las malezas voluntarias son un problema
anterior al desarrollo de las nuevas biotecnologas
(caso de la colza en Canad).
- Ampliar el espectro de herbicidas a utilizar
en una especie particular para facilitar el control
de malezas voluntarias.
- Reservar un respaldo qumico para el control
de malezas voluntarias.
Enfoques para mitigar la introgresin de genes de
tolerancia a herbicidas desde cultivos a malezas
emparentadas
- Utilizacin de apomixis.
- Seleccin de eventos de transformacin ubicados
en genomas no compatibles con malezas
relacionadas al cultivo.
- Utilizacin de plantas transplastmicas.
- Utilizacin de genes de resistencia a herbicidas
divididos, dirigidos a genomas diferentes y cuyos
Perspectivas
divididos, dirigidos a genomas diferentes y cuyos
productos se ensamblan de manera funcional
por trans-splicing de protenas (intenas).
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Utilizar la ingeniera gentica para reducir el uso
de herbicidas
- Utilizacin de biocontroladores transgnicos
(hongos o insectos que afecten a las malezas)
- Desarrollo de cultivos transgnicos con mayor
expresin de substancias alelopticas
- Desarrollo de cultivos transgnicos de cubierta
auto-destruibles que compitan con las malezas
Perspectivas
Prevencin del surgimiento de resistencia en malezas
- Evitar la utilizacin repetida del mismo herbicida.
- Evitar resistencia cruzada por herbicidas que actan
sobre el mismo blanco (ejemplos, sulfonilureas,
imidazolinonas y triazolopirimidinas sobre ALS).
- No introducir resistencia a herbicidas en un cultivo
si hay malezas que se puedan cruzar con el mismo
(ejemplos, avena cultivada/Avena fatua y sorgo
cultivado/sorgo de alepo) y si estos herbicidas se utilizan
para controlar las mismas malezas en otros cultivos.
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
- Manejo agronmico que incluye rotacin de cultivos,
conocer las malezas existentes en el lote, eleccin correcta
del o los herbicidas, fechas de siembra, densidad de
siembra.
- Apilamiento de genes de resistencia a herbicidas Ej: STS-
RR en soja. Se vienen eventos: RR x LL, 2,4D x FOPs, LL
x Dicamba, RR + herbicidas selectivos (Ej: Kixor en soja),
triples eventos.
1. Duke, S. Weeding with transgenes.Trends in Biotechnology,
21:192-195, 2003.
2. Gressel, J. Advances in achieving the needs for
biotechnologically-derived herbicide resistant crops. Plant
Breeding Reviews, 11:155-198, 1993.
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4. Tranel, P. Weeds and weed control strategies. In: Plant
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D. (eds.), pp. 446-471. Jones and Bartlett Publishers, 2003.
5. Roe R.M., Burton J.D., Kuhr R.J. Herbicide Activitiy:
Referencias
5. Roe R.M., Burton J.D., Kuhr R.J. Herbicide Activitiy:
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6. Gianessi L.P. The increasing importance of herbicides in
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7. Green J.M. The benefits of herbicide-resistant crops. Pest
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8. Deyle C. Unravelling the genetic bases of non-target-site
based resistance (NTSR) to herbicides: amajor challenge for
weed science in the forthcoming decade. Pest Manag Sci.
2013. 69(2):176-87
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
Gracias por su atencin!
Departamento de Biotecnologa de Nidera S.A:
C. Sala
M. Bulos
E. Altieri (ealtieri@nidera.com.ar)
R. Sensolini
A. Marchetti
P. Cufre
E. Romero
J.P. Bizzera
Agrobiotecnologa
Aplicaciones
de la biotecnologa
al control
de malezas
J.P. Bizzera
B. Sedano
J. Roca
J. Pruzzo
J. OBrien
D. Gomez
A. Figueroa
L. Wagner
N. Cabrera
Y. Lazzati
M. Marello
N. Duarte
E.Oliveira